Способ получения лекарственного растительного сырья с противовирусной активностью Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии, фармакологии, физиологии растений и может быть использовано для индустриального производства высокоценного сырья с целью получения лекарств, биологически активных добавок, функциональных пищевых продуктов, лечебно-профилактической косметики и индивидуальных биологически активных веществ.

Заболеваемость и смертность от респираторных заболеваний высоки во всем мире. 90% респираторных инфекций вызывают вирусы, большинство из которых представляют собой РНК-вирусы, такие как ортомиксовирусы, парамиксовирусы, коронавирусы и риновирусы. Аденовирусы представляют собой ДНК-вирусы. Ортомиксовирусы включающие вирус гриппа A (IAV) и вирус гриппа В (IBV), характеризуются сегментарной РНК, вариабельностью, гемагглютинацией и отсутствием гемолиза. К парамиксовирусам относятся респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус парагриппа, вирус кори и вирус эпидемического паротита, они имеют низкую частоту мутаций РНК в разных сегментах и проявляют гемагглютинацию и гемолитическую активность. К коронавирусам относятся новые коронавирусы SARS-CoV-2, SARS-CoV и MERS-CoV, которые обладают высокой патогенностью и изменчивостью (Li В-Н, Li Z-Y, Liu М-М, Tian J-Z and Cui Q-H (2021) Progress in Traditional Chinese Medicine Against Respiratory Viruses: A Review. Pharmacol. 12:743623. doi:10.3389/fphar.2021.743623)

Вирусные заболевания, представляющие серьезную угрозу для общества, встречаются часто, а профилактика и лечение вирусных инфекций стали серьезной научной проблемой. Изменчивость вирусов, лекарственная устойчивость и высокие риски, связанные с исследованиями и разработкой лекарств, привели к тому, что существует лишь несколько препаратов для лечения вирусных заболеваний. В настоящий момент большинство противовирусных препаратов с доказанным эффектом производится за рубежом. Поэтому исследования в этой области, направленные на импортозамещение, востребованы и имеют важный стратегический потенциал.

Известен способ получения противовоспалительного средства с иммуномодулирующими и антигипоксическими свойствами, обладающее низкой токсичностью, из распространенного растительного сырья простыми технологическими приемам путем экстракции. В качестве сырья используют траву касатика молочно-белого, экстракцию проводят 35-45% водным этанолом в течение 10-12 ч при соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12). Экстракты объединяют, концентрируют и сушат с получением целевого комплекса. Полученный комплекс, обладая низкой токсичностью (ЛД₅₀=7000 мг/кг), проявляет более высокую противовоспалительную и антигипоксическую активность (Патент 2123349 (РФ). Способ получения комплекса, обладающего противовоспалительным, иммуномодулирующим и антигипоксическим действием / С.А. Минина, Т.В. Астахова, Н.И. Пряхина, Л.В. Пастушенков, Е.Е. Лесиовская, Т.И. Мельникова, Н.Ю. Фролова, В.А. Вавилова/20.12.1998).

Недостатком данного способа (аналога) является отсутствие этапа выращивания Iris lactea Pall., с целью получения растительной биомассы.

Наиболее близким (прототипом) является способ получения растительного сырья ириса сибирского (Патент РФ №2677921 МПК: А01Н 4/00 «Способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) методами биотехнологии» / Тихомирова Л.И., Базарнова Н.Г., Ильичева Т.Н. Заявитель: ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный университет», Заявка на патент №2017142221 от 21.11.2017, патент опубликован 22.01.2019). Данный способ предполагает получение растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) клональным микроразмножением и выращиванием в условиях гидропоники. Биологическую активность полученного биотехнологического сырья I. sibirica (растений-регенерантов и гидропонного сырья) в отношении простого герпеса человека изучали в сравнении с активностью традиционного сырья (интактных растений). Все исследованные экстракты I. sibirica проявили противовирусную активность в отношении вируса простого герпеса. При невысокой токсичности и традиционное сырье, и биотехнологическое имеет относительно высокий индекс селективности. Особо следует отметить, что данные, полученные для традиционного сырья и биотехнологического сырья сопоставимы: все показатели отличаются не более чем в 2 раза, что не превышает ошибку метода. Наиболее сильное ингибирующее действие оказывает водный экстракт растений-регенерантов.

Недостаток данного способа (прототипа) - выращивание растительного сырья с противовирусной активность одного вида растений (I. sibirica).

Задачей заявляемого изобретения является выращивание методами биотехнологии растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.), душицы обыкновенной (Origanum vulgare L.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.), получение экстрактов последовательным извлечением в аппарате Сокслета растворителями различной полярности (гексан, водно-спиртовые растворы, водно-глицериновый), определение противовирусной активность, полученных субстанций, в отношении аденовируса серотипа 5 и вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1)pdm09. Способ реализуется в два этапа.

1 этап (получение биотехнологического растительного сырья).

В качестве эксплантов для введения в культуру ткани душицы обыкновенной (Origanum vulgare L.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) используют семена из коллекции Южно-Сибирского ботанического сада. Перед стерилизацией семена промывают под проточной водой в течение 15-25 минут. Стерилизацию проводят в условиях ламинар-бокса 1% раствором сульфохлорантина в течение 10 минут. Затем трижды промывают стерильной дистиллированной водой. Этот способ стерилизации позволяет получить 70% эксплантов стерильными и жизнеспособными.

Питательные среды готовят по прописи MS (Мурасиге и Скуга), содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводят фитогормоны в концентрациях 0,25 мкМ НУК (α-нафтилуксусной кислоты) в сочетании с 2 мкМ Кн (кинетина). рН среды доводят до 5,8-5,9 и добавляют 0,6% агара. Среды разливают в пластиковые контейнеры (по 30 мл в каждый) или в культуральные флаконы (по 10 мл в каждый). Автоклавируют приготовленные питательные среды в течение 20 мин. при 120°С. Экспланты культивируют в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24 - 26°С. Через 30 суток в ткани эксплантов развиваются вегетативные побеги, достаточной величины для пересадки на среды размножения.

На этапе собственно микроразмножения питательные среды готовят на основе MS+(1,0-10,0)мкМ Кн+0,5 мкМ НУК. Укоренение проводят на питательной среде MS, дополненной 1 мкМ НУК. Способность к укоренению на данной среде составляет 100%.

Растения-регенеранты вынимают из культуральных сосудов, отмывают корни в дистиллированной воде от агара, затем растения помещают в трехъярусную универсальную аэропонную установку, разработанную в ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии (автор и разработчик Ю.Ц. Мартиросян), заполненную питательным раствором по прописи Мурасиге-Скуга с концентрации мкро-, микросолей, кальция хлористого и хелата железа с добавлением 10,0 мкМ БАП+1,0 мкМ НУК+0,1 мкМ. Выращивание растительного лекарственного сырья осуществляют при температуре 24-26°С, режим освещения: 16 часов день, 8 часов ночь (таблица 1).

2 этап (получение растительных экстрактов)

Исчерпывающую экстракцию из биотехнологического сырья проводили в аппарате Сокслета. Точную навеску измельченного сырья с диаметром частиц не более 1 мм помещали в патрон, сделанный из фильтровальной бумаги. В аппарат Сокслета наливали гексан (соотношение сырье:экстрагент 1:20), помещали патрон и вели экстракцию в течение 6 часов. Полученный экстракт фильтровали через беззольный фильтр и переносили в плотно закрытую склянку из темного стекла. Патрон с той же навеской сырья заново помещали в аппарат Сокслета, в качестве растворителя выступал этиловый (70%) (соотношение сырье:экстрагент 1:20), экстракцию вели так же в течение 6 часов. Экстракт фильтровали. Далее патрон помещали в аппарат Сокслета с растворителем 30% водно-глицериновой смесью, экстракцию вели в течение 6 часов. Полученные экстракты фильтровали через беззольный фильтр и переносили в плотно закрытые флаконы из темного стекла, хранили при температуре +4°С в условиях холодильника. Определение содержания экстрактивных веществ проводили в соответствии с ОФС.1.5.3.0006.15 Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах (ОФС 1.5.3.006.15 Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах // ГФ РФ XIV. 2018. Т.2. С. 2355-2360) (таблица 4).

Работа, по определению противовирусной активности полученных экстрактов, проведена в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», р.п. Кольцово, Новосибирская область (Россия). Исследование показало, что все растительные экстракты проявляют прямое противовирусное действие на аденовирус серотипа 5. Наиболее эффективны ирис сибирский (гексановый и этанольный экстракты), водно-глицериновый экстракт душицы, этанольные экстракты шалфея и кровохлебки. Лечебный эффект наиболее выражен у водно-глицериновых экстрактов душицы и ириса сибирского и гексанового экстракта душицы (таблица 2).

Спиртовой экстракт душицы и спиртовой экстракт кровохлебки показали выраженную антивирусную активность в отношении вируса гриппа A/California/04/09 H1N1 pdm09 в культуре клеток MDCK. Гексановый и спиртовой экстракты шалфея обладали противовирусным действием при разведении от 1:20 до 1:80 (в зависимости от схемы эксперимента), но из-за относительно высокой токсичности имели низкий терапевтический индекс. Водно-глицериновые экстракты не показали противовирусной активности (таблица 3).

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения лекарственного растительного сырья с противовирусной активностью, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, размножение, укоренение и выращивание растительного сырья в условиях трехъярусной универсальной аэропонной установки, заполненной питательным раствором по прописи Мурасиге-Скуга с концентрации макро- и микросолей, согласно изобретению выращивают сырье душицы обыкновенной (Origanum vulgare L.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.), получают экстракты последовательным извлечением в аппарате Сокслета растворителями различной полярности (гексан, водно-спиртовые растворы, водно-глицериновый), определяют противовирусную активность полученных субстанций в отношении аденовируса серотипа 5 и вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1)pdm09. Изобретение может быть использовано для индустриального производства высокоценного сырья с целью получения лекарств, биологически активных добавок, функциональных пищевых продуктов, лечебно-профилактической косметики и индивидуальных биологически активных веществ. 4 табл.

Способ получения лекарственного растительного сырья с противовирусной активностью, включающий введение эксплантов в культуру in vitro, культивирование на питательной среде MS для получения регенерантов, размножение, укоренение и выращивание растительного сырья в условиях трехъярусной универсальной аэропонной установки, заполненной питательным раствором по прописи Мурасиге-Скуга с концентрации макро- и микросолей, отличающийся тем, что выращивают сырье душицы обыкновенной (Origanum vulgare L.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) с добавлением 10,0 мкМ цитокинина 6-бензиламинопурина + 1,0 мкМ α-нафтилуксусной кислоты + 0,1 мкМ 3-индолилуксусной кислоты, увеличивающих накопление вторичных метаболитов в растительном сырье, получают экстракты последовательным извлечением в аппарате Сокслета растворителями различной полярности (гексан, водно-спиртовые растворы, водно-глицериновый), определяют противовирусную активность полученных субстанций в отношении аденовируса серотипа 5 и вируса гриппа A/California/04/09 (H1N1)pdm09.