ШТАММ БАКТЕРИЙ Lactobacillus rhamnosus, ОБЛАДАЮЩИЙ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМ МИКРООРГАНИЗМАМ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 A23C9/127 A61K35/74 A23L1/29 C12R1/225 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве препаратов, содержащих живые бактерии, биологически активных добавок к пище, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов.

В настоящее время актуальной и важной задачей является разработка новых антимикробных препаратов пробиотиков, содержащих новые, нетоксичные, биодоступные штаммы микроорганизмов, которые можно в виде моно- и смешанных культур использовать в составе пробиотических препаратов и пищевых продуктов. Пробиотические культуры различаются между собой по спектру и по силе действия, адгезивности, чувствительности к антимикробным препаратам, устойчивости к действию желчи, пищеварительным ферментам, особенностям роста на питательных средах, способности сквашивать молоко и т.д.

При долечивании различных острых кишечных инфекций и при дисбактериозах различной этиологии широкое применение находит пробиотический препарат Лактобактерин, в основе которого лежит штамм Lactobacillus plantarum 8A-P3 [Журн. микробиол. 2004. №1. С.84-92] Однако при лечении острых кишечных заболеваний данный препарат недостаточно эффективен.

Известен ряд пробиотических штаммов Lactobacillus salivarius (RU 2302458). Данные штаммы выделены из резецированного и промытого ЖКТ человека и обладают антагонизмом по отношению к L.innocua, L.fermentum KLD, P.fluorescens, E.coli V 157. Штаммы характеризуются чувствительностью к ряду антибактериальных препаратов (ампициллин, амоксациллин, цефтаксим, цефтриаксон, ципрофлоксацин, цефрадин, рифампицин, хлорамфеникол), резистентны к физиологическим концентрациям соляной кислоты и желчи, обладают способностью адгезироваться к эпителиальным клеткам ЖКТ. Однако спектр их антагонистической активности не включает дрожжеподобные грибы рода Candida, что является актуальным на сегодняшний день.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих антагонистической активностью.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Lactobacillus rhamnosus 38к, отличающийся высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, в том числе по отношению к дрожжевым грибам рода Candida.

Штамм Lactobacillus rhamnosus 38к выделен из фекалий здорового юноши в возрасте 17 лет, который на момент обследования был клинически здоров, не имел в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний желудочно-кишечного тракта и других систем органов, путем выделения чистой культуры путем раститровки исследуемого материала и посева на оптимальные питательные среды (MRS агар, лакто-агар, MRS бульон). Культивирование осуществляли без использования методов генетической модификации при температуре 37°C 24 часа в эксикаторе со свечой при повышенном содержании CO₂ на базе бактериологической лаборатории кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Тверская ГМА Министерства здравоохранения и социального развития России.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (Москва, 1-й Дорожный пр., д.1) и имеет регистрационный номер ВКПМ В-11155.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

При микроскопировании клетки неподвижные, крупные палочки правильной формы с округлыми концами, одиночные, окружены капсулой. В молодой культуре встречаются клетки в парах.

Размеры клеток варьируют при росте на различных питательных средах в интервале 0,5-1,2×1,0-10 мкм. Грамположительные.

При выращивании на MRS агаре (Difco™ Lactobacilli MRS Agar) и лакто-агаре (ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии г.Оболенск) при 37±1°C в анаэробных условиях с использованием микроанаэростата и системы GasPak+, в эксикаторе со свечой при повышенном содержании CO₂, так и в аэробном режиме в течение 24-48 часов колонии S-формы 1-2 мм, выпуклые, гладкие, белого цвета с ровными краями.

При выращивании на MRS бульоне (Difco™ Lactobacilli MRS Broth) при температуре 37±1°C в течение 24-48 часов в аэробных условиях рост - в виде помутнения бульона и выпадения бело-серого осадка на дне.

На белковых средах (МПА, МПБ, молоке) рост отсутствует (иногда наблюдается очень слабое развитие). Крахмал не гидролизует. Желатин не разжижает.

Физиолого-биохимические признаки

Мезофил, рост возможен в интервале 20-40°C, оптимальная для роста температура 37±1°C.

Факультативный анаэроб. При глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем воздуха/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.

Оптимально для роста pH=6,5±0,2.

Отношение к источникам углеводов.

Хорошо растет на: D-глюкозе, D-сахарозе, D-фруктозе, D-мальтозе, D-галактозе, D-рибозе, D-маннозе, L-рамнозе, D-лактозе, D-целлобиозе, N-ацетилглюкозамине, метил-D-гликопиранозиде, эскулин цитрата железа, салицин, арбутине, амигдалине, D-трегалазе, D-мелезитозе, гентиобиозе, D-туранозе, D-тгатозе.

Не растет на: метил-D-маннопиранозиде, D- и L-ксилозе, D-арабинозе, L-арабинозе, метил-D-ксилопиранозиде, L-сорбозе, D-мелибиозе, инулине, D-раффинозе, амидоне, D-ликсозе, D- и L-фукозе, D- и L-арабитоле.

Из спиртов усваивает: D-сорбит, D-маннит, глицирин, инозитол, лактат.

Из спиртов не усваивает: эритрит, D-адонитол, дульцитол, ксилит.

Расщепляет: K-глюконат.

Не расщепляет: К 2-кетоглюконат, К 5-кетоглюконат, гликоген.

Не усваивает цитрат, целлюлозу, этанол, бутанол.

Створаживают молоко через 12-14 часов.

Исследуемый штамм фенотипически апатогенный, т.е. не обладает гемолитической, протеолитической, летициназной, гиалуронидазной, антилизоцимной, ДНК-ной и РНК-ной активностью.

Антагонистическая активность

Исследование антагонистической активности проводили методом, описанным в (Блинкова Л.П. Получение томицида нового бактерийного препарата и изучение его биологической активности. Автореф. дис. д-ра биол. наук. М., 1986. С.25) на тест-штаммах Staphylococcus aureus АТСС 25923, Candida albicans АТСС 885-653, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtillis 534, Escherichia coli 25922. Klebsiella pneumoniae K₁ 5054. Учет результатов проводили через 24-48 часов инкубирования при 37°C в термостате по величине зоны отсутствия роста тест-культуры. Степень антагонизма определяли по следующим критериям: 10 мм и менее - низкая, 10-20 мм - средняя, 21 мм и более - высокая.

Показано, что исследуемый штамм подавляет рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов: S.aureus, B.subtilis, E.coli, Sh.sonnei I фазы, P.aeruginosa, Klebsiella pneumoniae и дрожжеподобных грибов С.albicans (табл.1).

Отношение штамма L.rhamnosus 38к к антимикробным препаратам (качественнно) изучали в соответствии с методиками, рекомендованными научно-исследовательским центром фармакотерапии (НИЦФ) www.nicf.spb.ru

Исследования показали, что заявляемый штамм обладает чувствительностью к ампициллину, стрептомицину, тетрациклину, доксициклину, рифампицину, меропенему, линезолиду, а также промежуточной чувствительностью к эритромицину (табл.2).

Культура Lactobacillus rhamnosus 38к длительно хранится в криопробирках на триптиказо-соевом бульоне (ТСБ) (TSB: Difco Laboratories, Detroit, Mich.) с 15% глицерина в морозильной камере при температуре -80°C 5 лет или -20°C до 3-6 месяцев, а также в лиофилизированном виде более 10 лет. Заявленное решение иллюстрируется следующими фигурами.

Фиг.1 Чувствительность штамма Lactobacillus rhamnosus 38к к соляной кислоте.

Фиг.2 Чувствительность штамма Lactobacillus rhamnosus 38к к желчи.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Lactobacillus rhamnosus 38к в лабораторных условиях.

Штамм Lactobacillus rhamnosus 38к выращивают в колбах на жидкой питательной среде MRS бульон (Difco™ Lactobacilli MRS Broth) при температуре 36±1°C в течение 24-48 часов в аэробных условиях. Объем питательной среды 500 мл. Посев петлей одной изолированной колонии. Через 24 и 48 часов наблюдается рост в виде помутнения бульона и выпадения бело-серого осадка на дне. Для определения количества жизнеспособных лактобацилл проводят раститровку выращенных бактерий на изатоническом растворе хлорида натрия с шагом 10 и последующим высевом из разных разведений по 0,3 мл на плотную среду MRS или лактоагар. Через 24 часа культивирования при 36±1°C в аэробных условиях проводят подсчет колоний и рассчитывают количество жизнеспособных микроорганизмов - колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл жидкой питательной среды (MRS бульоне). В результате определения установлено, что через 24 часа культивирования количество выросших лактобацилл составило 4·10⁸-1,7·10⁹ КОЕ/мл. Через 48 культивирования - 1,3-2·10⁹ КОЕ/мл.

Пример 2. Исследование свойств штамма Lactobacillus rhamnosus 38к.

Кислотообразующая способность.

Активность кислотообразования определяют титрометрическим методом (Лянная A.M., Гончарова Г.И., Высоцкий В.В. Морфология бифидобактерий в светооптическом и электронно-микроскопическом уровне и их биологические свойства // Микробиология. - 1979. №6. - С.54-58). Измерения проводят в течение 72 часов, используя питательные среды без глюкозы и с добавлением глюкозы и отбирая образцы культуральной жидкости каждые 24 часа. Результат выражают в градусах Тернера (Т° - величина, выражающая количество 0,1 Н щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца).

Полученные результаты (табл.3) показывают, что в течение первых суток происходило закисление среды культивирования без глюкозы (кислотность 30°T). В последующем происходит постепенное увеличение кислотности, которая составила ко 2 суткам 34°T и к 3 суткам 40°T. После добавлении в среду глюкозы в качестве питательного субстрата были получены следующие данные: к концу первых суток кислотность составила 30°T, к концу вторых суток кислотность повысилась до 34°T, к третьим суткам до 36°T.

Способность к адгезии

Степень адгезии микроорганизмов определяют, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу Брилис В.И. (Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. и др Методика изучения адгезивного процесса // Лаб. дело. - 1986. - №4. - С.210-212) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+.

Исследования показывают, что степень адгезии штамма L.rhamnosus 38к составляет 2,5±1,3, что является средним показателем.

Способность к аутоагрегации

Аутоагрегация лактобацилл определяют методом A.Andreu et al. (Andreu A., Stapleton, A., Fennell C., Hillier S., and Stamm E. Hemagglutination, adherence and surface properties of vaginal Lactobacillus species. J. Infect. Dis. - 1995. - 171: 1237-1243). Аутоагрегация оценивают как способность формировать скопления (агрегаты) в течение 2 минут. Исследования показывают, что штамм L.rhamnosus 38к имеет высокий показатель аутоаггрегации.

Способность к поверхностной гидрофобности

Поверхностную гидрофобность лактобацилл изучают по тесту солевой агрегации (ТСА) (Andreu A., Stapleton A., Fennell С., Hillier S., and Stamm Е. Hemagglutination, adherence and surface properties of vaginal Lactobacillus species. J. Infect. Dis. - 1995. - 171: 1237-1243). Исследования показывают, что штамм L.rhamnosus 38к обладает средней поверхностной гидрофобностью (ТСА 1,5 моль/л).

Способность к коагрегации

Способность лактобацилл к коаггрегации определяют методом G. Reid et al. (Reid G., Mac Groarty J., Chow A., Bruce A., Eisen A., and Costerton W. Coaggregation of urogenital bacteria in vitro and in vivo. Curr. Microbiol. 1990, 20: 47-52). В качестве тестовых культур для данной методики используют следующие патогенные и условно-патогенные штаммы Staphylococcus aureus 209, Candida albicans 531, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella typhimurium 11, Shigella flexneri 26, Bacillus subtilis 534. Тест на коагрегацию считается положительным, если исследуемая культура образовывает агрегаты с другим видом микроорганизмов. Исследования показывают, что штамм L.rhamnosus 38к коагрегирует с Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis.

Чувствительность к соляной кислоте и желчи

Чувствительность штамма к соляной кислоте и желчи, которая во многом определяет его способность к персистентции в ЖКТ, определяют по изменению оптической плотности (ОП) суточной бульонной культуры, в зависимости от концентрации соляной кислоты или желчи (Casey PG, Casey GD, Gardiner GE et al. (2004) Isolation and characterization of anti-Salmonella lactic acid bacteria from the porcine gastrointestinal tract. Lett Appl Microbiol 39: 431-438). Измерения проводят на спектрофотометре КФК-3 при длине волны 590 мкм или 600 мкм соответственно. В качестве контроля используют чистую суточную бульонную культуру.

Результаты показывают, что минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соляной кислоты составляет 1,25% (табл.4 и фиг.1), а желчь в различных концентрациях (табл.5, фиг.2) не только не ингибирует, но стимулирует размножение и рост бульонной культуры штамма L.rhamnosus 38к, при этом наиболее выраженным воздействием обладает концентрация желчи 10%.

Таким образом, заявляемый штамм L.rhamnosus 38к ВКПМ В-11155 отличается высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам: S.aureus АТСС 25923, B.subtilis 534, E.coli АТСС 25922, Sh.sonnei I фазы 941, P.aeruginosa АТСС 27853, Klebsiella pneumoniae K₁ 5054, и дрожжеподобных грибов C.albicans АТСС 885-653. Кислотопродукция, выраженная в градусах Тернера, колеблется от 30 до 40°T в среде без глюкозы и от 30 до 36°T при добавлении глюкозы в питательную среду. L.rhamnosus 38к обладает чувствительностью к ампициллину, стрептомицину, эритромицину, тетрациклину, доксициклину, рифампицину, меропенему, линезолиду. Исследуемый штамм фенотипически апатогенный, т.е. не обладает гемолитической, протеолитической, летициназной, гиалуронидазной, антилизоцимной, ДНК-ной и РНК-ной активностью. L.rhamnosus 38к обладает средними показателями адгезии (2,5±1,3) и поверхностной гидрофобности (1,5 моль/л), высокими показателями ауто-аггрегации и коаггрегации (коаггрегирует с Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis). Минимальная ингибирующая концентрация соляной кислоты для L.rhamnosus 38к составляет 1,25%. Желчь в различных концентрациях стимулирует размножение и рост бульонной культуры штамма L.rhamnosus 38к.

Штамм высокотехнологичен, на искусственных питательных средах быстро накапливает биомассу с высокой концентрацией лактобактерий

Все это позволяет предложить штамм L.rhamnosus 38к ВКПМ В-11155. для использования в производстве пробиотических бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, обеспечивающих пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов.

Отношение к антибактериальным препаратам

Таблица 2 Чувствительность штамма Lactobacillus rhamnosus 38к к антибактериальным препаратам № п/п Наименование антибиотика Степень чувствительности 1. Бензилпенициллин У 2. Ампициллин Ч 3. Ванкомицин У 4. Гентамицин У 5. Стрептомицин Ч 6. Эритромицин П 7. Тетрациклин Ч 8. Доксициклин Ч 9. Ципрофлоксацин У 10. Левофлоксацин У 11. Рифампицин Ч 12. Левомицетин У 13. Фурадонин У 14. Меропенем Ч 15. Линезолид Ч Примечание: Ч - чувствительный, П - промежуточный, У - устойчивый.

Таблица 3 Кислотопродуцирующая способность штамма Lactobacillus rhamnosus 38к Штамм 1 сутки, T° 2 сутки, T° 3 сутки, T° L.rhamnosus 38к без добавления глюкозы 30 34 40 с добавлением глюкозы 30 34 36

Таблица 4 Чувствительность штамма Lactobacillus rhamnosus 38к к соляной кислоте   Концентрация HCL, % Контроль МИК 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 0,15625 ОП 0,009 0,012 0,011 0,029 0,025 0,079 0,095 1,25

Таблица 5 Чувствительность штамма Lactobacillus rhamnosus 38к к желчи   Концентрация желчи, % Контроль 20 10 5 2,5 1,25 0,625 ОП 0,196 0,496 0,297 0,102 0,4 0,091 0,092

Изобретение относится к биотехнологии. Получен штамм Lactobacillus rhamnosus 38к, обладающий антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, в том числе по отношению к дрожжевым грибам рода Candida, средними показателями адгезии и аутоаггрегации, высокой поверхностной гидрофобностью, средним показателем коаггрегации, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11155 и может быть использован в производстве пробиотических бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов. 5 табл., 2 ил.

Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus ВКПМ В-11155, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.