ШТАММ Lactobacillus fermentum Z, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИЧЕСКИХ МОЛОЧНОКИСЛЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Изобретение относится к медицине, а именно к профилактике и лечению инфекционной патологии у человека и других млекопитающих. Штамм Lactobacillus fermentum Z обладает антагонистической активностью к патогенным грамположительным и грамотрицательным бактериям, а также к грибам. Штамм Lactobacillus fermentum Z относится к штаммам молочнокислых бактерий, применяемым в медицинской и пищевой промышленности. Его преимуществом является отсутствие у штамма антагонистической активности по отношению к лактобациллам, энтерококкам и бифидобактериям, что делает возможным использовать его совместно с этими молочнокислыми бактериями в лекарственных препаратах и продуктах питания. Штамм Lactobacillus fermentum Z внесен в коллекцию отдела молекулярной микробиологии Учреждения Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН под №10.

Создание и разработка препаратов для лечения инфекционных заболеваний остается актуальным вопросом. Заболевания, вызванные стрептококками, стафилококками, энтеробактериями, псевдомонадами, клебсиеллами, клостридиями, хеликобактериями, микобактериями, вирусами герпеса, иммунодефицита человека, патогенными грибами и простейшими, требует поиска новых противомикробных препаратов [Руководство «Инфекционные болезни» под ред. Лобзина Д.К., Покровского В.И. 2007, с.456, Postgrad. Med. J. 2003 79(934), P.428-32].

В терапии инфекционных заболеваний используют антибиотики и химиопрепараты - вещества естественного происхождения, а также частично или полностью синтезированные [«Рациональная антимикробная терапия». - под ред. Яковлева В.П., Яковлева С.В.М: «Литера» том II. - 2003. - 1008 с.]. Применяют также пробиотики - живые культуры микроорганизмов и их метаболиты [Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Москва: Издательство «ГрантЪ», 2001, том III. - 288 с.; Журн. Микробиол. 2004. №1, С.84-92].

Эти препараты влияют на рост и жизнеспособность патогенных микроорганизмов, но их эффективность часто бывает недостаточной. У антибиотиков отмечается побочное действие, а ассортимент пробиотиков невелик.

Разработка новых антимикробных препаратов пробиотиков, содержащих новые, нетоксичные, биодоступные штаммы микроорганизмов, которые можно в виде моно- и смешанных культур использовать в составе пробиотических или симбиотических (комплексных) препаратов и пищевых продуктов, является актуальной и важной задачей.

Пробиотические культуры (штаммы) микроорганизмов:

1) спорообразующие бактерии, 2) эшерихии, 3) молочнокислые бактерии, 3) сахаромицеты - чаще всего бывают выделены из пищевых продуктов или из организма человека или животных. Каждая пробиотическая культура отличается по спектру и по силе действия, адгезивности, чувствительности к антимикробным препаратам, устойчивости к действию желчи, пищеварительным ферментам, особенностям роста на питательных средах, способности сквашивать молоко [Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. - Москва: Издательство «ГрантЪ». - 2002. - 296 с.].

Известен препарат "Споробактерин" [Журн. Микробиол. 2002, №3, С.113-119]. В его состав входит живая культура штамма Bacillus subtilis N 534. Он используется в медицинской практике при лечении инфекционных заболеваний. Но к недостаткам спорообразующих пробиотических бактерий относится их способность к транслокации, т.е. распространению по всему организму, за пределы слизистых оболочек в месте введения, а также их низкая антагонистическая активность по отношению к грамотрицательным бактериям, как указано в перечне свойств препарата биоспорин [патент РФ №1722502, оп. 30.03.1992].

Эшерихии, входящие в состав препаратов "Колибактерин" "Бификол" (Россия), "Симбиофлор" (Германия), обладают узким спектром действия. Они, в основном, ингибируют размножение грамотрицательной микрофлоры. Препараты, содержащие эшерихии, не рекомендованы детям первых лет жизни [Биопрепараты. - 2001. - №1, с.2-4].

Известны пробиотические молочнокислые бактерии, ими являются бифидобактерии, энтерококки и лактобациллы.

Известен штамм Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1578 [патент РФ, №2152993, оп. 20.07.2000]. Он используется для приготовления бактериальных препаратов и продуктов питания, обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным микроорганизмам. Культура Bifidobacterium bifidum ВКПМ AC-1578 устойчив к условиям внешней среды, к воздействию экстремальных факторов, но этот штамм трудно культивировать, при его производстве возникают технологические сложности, связанные с многокомпонентностью питательных сред, требуемых для его выращивания и необходимостью создания анаэробных условий.

Известен штамм Enterococcus faecium NCIMB 40371. Это пробиотик, содержащий Enterococcus faecium strain NCIMB 40371 [патент Канады, №2064954, Canada 2008]. Штамм применяют в лечебно-профилактических целях, используя различные концентрации бактерий. Энтерококки используют в концентрации от 10⁴ до 10¹⁰ на 1 грамм продуктов. Концентрация зависит от назначения (пищевые, лечебные продукты), от формы выпуска (жидкие, сыпучие, таблетированные). Штамм эффективен при желудочно-кишечных расстройствах (лечебный эффект). Штамм NCIMB 40371 обладает способностью створаживать молоко, образуя питательные и целебные молочнокислые продукты. К недостаткам штамма относятся сравнительно узкий спектр действия, невысокая эффективность при коррекции нарушений микробиоценоза, чувствительность ко многим антибиотикам.

Безвредность пробиотических энтерококков поставлена под сомнение, так как некоторые из них способны вызывать гнойно-воспалительные заболевания [Журнал Гастроэнтерология Санкт-Петербурга, 2002, №4, С.36-38].

Поиск пробиотиков и изучение свойств различных культур привели к выводу, что лучшие результаты показывают штаммы бактерий рода Lactobacillus, выделенные из молочнокислых или растительных продуктов, а также из организма человека или иных млекопитающих. Известно, что лактобациллы, присутствующие в ротовой полости, желудочно-кишечном тракте, урогенитальном тракте здоровых людей, других млекопитающих, оказывают существенное влияние на метаболизм, иммунитет, процессы регенерации, а главное, обеспечивают колонизационную резистентность к патогенным микроорганизмам и способствуют поддержанию гомеостаза в организме человека и животных. Это позволяет использовать лактобациллы для профилактики и лечения дибиозов и инфекционных заболеваний, дизентерии, псевдомембранозного колита, язвенной болезни, связанной с наличием хеликобактерий, кампилобактериоза, анаэробного вагиноза, стоматита, энтеровирусных инфекций [Can. Farm. Physician, 2005, Vol.51. N11, P.1487-1493, Postgrad. Med J. 2003, Vol.79(934), P.428-32, Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и фунциональное питание. 1998, Т.2. Москва: Издательство «ГрантЪ». М., 416 с.]. Показано, что лактобациллы представляют гетерогенную популяцию бактерий, отличающихся по биохимическим, культуральным, антигенным характеристикам. Различные штаммы лактобацилл оказывают как типичное для других молочнокислых бактерий, так и специфическое влияние на макроорганизм. Они обладают неодинаковой по силе и спектру антимикробной активностью. Отрицательной стороной действия некоторых штаммов лактобацилл является подавление роста других представителей нормальной микрофлоры, в том числе и облигатных [Бюллетень Восточно-Сибирского центра СО РАМН. - 2004. - №1. - С.177-183]. Кроме того, при введении этих бактерий могут возникать побочные эффекты, проявляющиеся в атопии, возникновение воспалительных процессов, вплоть до развития «лактобациллезов" и сепсиса [Pediatrics, 2005, Vol.111, N 1, P.178-181, Медицина XXI. - 2007-5 (6), С.41-48, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2001, P.35-39].

Известен штамм Lactobacillus fermentum AD1 - гетерологичный пробиотик, выделенный из фекалиев собаки. Он при введении способствует увеличению количества лактобацилл в организме человека и животных, стимулирует фагоцитарную активность лейкоцитов у животных и птиц. Этот штамм обладает высокой адгезивностью. Однако адгезия максимально проявляется к клеткам кишечника животных. Этот гетерологичный штамм, в отличие от других штаммов лактобацилл, являющихся представителями нормальной микрофлоры человека, по-видимому обладает более высокой биодоступностью по отношению к животным. L.fermentum AD1 не является бактериоциногенным [Vet. Med. - Czech, 2005, Vol.50, (9), P.415-420].

Известен штамм Lactobacillus sanfranciscensis, [WO/2002/050311, PCT/EP2001/014732] рекомендованный для питания людей и домашних животных, а также для производства косметических средств. Он отличается от других лактобактерий способностью продуцировать леван. Это соединение может иметь значение при рассмотрении иммуномодулирующих свойств данного штамма. Однако этот вид лактобактерий способен при введении в организм провоцировать выработку специфических антител, так как бактерии этого вида являются нетипичными для микробиоты людей и животных.

Известен штамм Lactobacillus casei GG [Канада, P.Nos 4839281 и 5032399; Appl. Enviromental. Microbiol. 1977, Vol.62, P.513-518]. Данный штамм обладает рядом пробиотических свойств. Он эффективен при диареях, энтероколитах у детей и взрослых, обладает широким спектром антагонистической активности, стимулирует местный иммунитет. Однако штамм GG очень требователен к условиям роста и составу питательной среды, что осложняет его культивирование. Кроме того, при использовании этого препарата у ослабленных больных отмечено возникновение сепсиса, эндокардита и других осложнений [Pediatrics, 2005 Vol.111, N 1., P.178-181].

Известен рекомбинантный штамм Lactobacillus sp.54 [Патент WO 2004/046346], растет только при добавлении в питательную среду тимидина или при введении в макроорганизм этого нуклеозида. В организме человека при помощи факторов роста можно регулировать количество данной пробиотической культуры. Это позволяет использовать пробиотический препарат на основе этого штамма не только как профилактическое, но и как лечебное средство [WO 2004/046346]. Но этот штамм не обладает стабильностью культуры, у него недостаточно высокая антимикробная активность, что возможно связано с отсутствием у него генов, обеспечивающих продукцию бактериоцинов, идентифицировать до вида этот штамм не удалось.

Известен штамм L.plantarum 8A-P3, [патент РФ №2071339], входящий в состав препарата «Лактобактерин». Штамм обладает выраженной антагонистической активностью не только по отношению к патогенным бактериям и грибам, но и к лактобациллам, в том числе и к культуре L.fermentum 90T, которая часто производителями добавляется при приготовлении препарата «Лактобактерин». На примере L.plantarum 8A-P3 можно отметить еще одно негативное свойство многих пробиотических лактобацилл: штамм L.plantarum 8A-P3 содержит в геноме бактериофаг и две плазмиды. Это может привести к нестабильности свойств, присущих этому штамму, легко утрачиваемых в случае элиминации плазмид. Действие бактериофага проявляется в том, что он вызывает лизис культуры [Gene. 2005 Vol.28, N 348, P.45-54].

Известен штамм L.fermentum 90-Ts-4 [РФ №98110985], являющийся прототипом заявляемого. Он входит в состав препарата «Лактобактерин». Он агглютинируется в присутствии конканавалина-А и обладает высокими адгезивными свойствами к влагалищному эпителию. Однако этот штамм обладает низкой скоростью роста, не растет на обычных питательных средах для лактобактерий без специальных добавок. Штамм проявляет низкую антагонистическую активность по отношению к патогенным микроорганизмам. Учитывая особенности адгезии этого штамма, его используют для профилактики и лечения дисбиоза влагалища, в частности бактериального вагиноза [Акушерство и гинекология. - 1995, N6, с.13-16., A.C.№ №1491884, WO 89/09607, WO 93/09793, EP 0353581 27.02.90., Журн. Микробиол. 1975, N8, с.77-81].

Целью данного изобретения было выделить чистую культуру нового вида лактобацилл и охарактеризовать весь спектр биологической активности нового штамма, относящегося к роду Lactobacillus, чтобы использовать его в медицинских целях и для получения продуктов питания (пищевой промышленности), а также для использования в ветеринарии.

Сущностью изобретения является оригинальный метод для селекции полезных бактерий - селекция в организме человека, а также свойства нового штамма, делающие его универсальным штаммом для лечения ряда заболеваний и для использования его в качестве пробиотика, применяемого в медицинской практике и пищевой промышленности.

Заявляемый штамм молочнокислых бактерий выделен из микрофлоры влагалища женщины после лечения метронидазолом в сочетании с вакцинацией препаратом СолкоТриховак ("Солко", Швейцария). Женщина вылечена от основного заболевания, но в ее организме под действием использованных лекарственных средств произошли популяционные изменения молочнокислых бактерий. В результате получена популяция лактобацилл с новыми свойствами, выделен, изучен и охарактеризован штамм Lactobacillus fermentum. Штамм приобрел и обладает ярко выраженной антимикробной активностью по отношению к патогенным грамотрицательным (энтеробактерии, псевдомонады, протей) и грамположительным (стрептококки, стафилококки, листерии) бактериям, а также - к грибам. Штамм не ингибирует размножение пробиотических лактобацилл, энтерококков и бифидобактерий. Штамм биосовместим с лактобациллами (других видов), в том числе, выделенных из влагалища и желудочно-кишечного тракта здоровых женщин, что делает возможным включение его в лекарственные препараты для лечения гинекологических и кишечных заболеваний. Штамм имеет в геноме гены, обеспечивающие продукцию лактоцина F. Он не токсичен, применим в пищевой биотехнологии в качестве пробиотического штамма молочнокислых бактерий. Штамм обладает улучшенными характеристиками бактерий рода Lactobacillus. Штамм обозначен в дальнейшем описании как Lactobacillus fermentum Z.

Источник и способ выделения штамма Lactobacillus fermentum Z

Заявляемый штамм Lactobacillus fermentum Z выделен из влагалища женщины после терапии бактериального вагиноза одним курсом метронидазола с последующей коррекцией дисбиоза вакциной "СолкоТриховак", в состав которой входят 8 различных инактивированных (нежизнеспосособных) штаммов Lactobacillus spp. кокковидной формы (в эквивалентном соотношении в количестве не менее 7×10⁹:3 штамма L.rhamnosus, 3 штамма L. vaginalis, 1 штамм L.fermentum, 1 штамм L.salivarius). Курс метронидазола составляет 7 дней с ежедневной дозой 0,5 г per os. Курс вакцинации СолкоТриховаком продолжается 6 недель с введением вакцины внутримышечно по 0,5 мл на следующий день после последнего приема метронидазола, затем еще дважды с интервалом в 2 недели. Перед введением антибактериальных средств, а также на различных этапах терапии у пациентки проводили исследование микробиоты влагалища при помощи микроскопических и бактериологических методов.

Аналогичное лечение было проведено у 40 женщин с бактериальным вагинозом. Была изучена их микрофлора до и после терапии. После вакцинотерапии у всех женщин произошли сходные изменения в микрофлоре влагалища, что сопровождалось, прежде всего, появлением более типичных палочковидных лактобацилл, формирующих на плотной питательной среде колонии двух типов: беловато-серых с ровным краем и сероватых кружевных. Принадлежность этих бактерий к роду Lactobacillus подтверждалась наличием у них соответствующих морфологических, культуральных и биохимических свойств. Лактобациллы (80 штаммов) были исследованы на антагонистическую активность и способность размножаться в аэробных условиях. При пересевах на питательные среды жизнеспособность многих выделенных штаммов была потеряна. В результате из 80 штаммов, изолированных из урогенитального тракта пациенток, были отобраны сначала 20, способных культивироваться в аэробных условиях на стандартных питательных средах для лактобактерий и сохраняющих жизнеспособность после пересевов. Из этих 20 штаммов был выбран один обозначенный нами Z, который обладал наиболее выраженной антагонистической активностью. В дальнейшем этот штамм был идентифицирован при помощи рибонуклеотипирования и исследован в экспериментах in vitro и in vivo.

Предлагаемый метод для селекции бактерий является оригинальным. В известных публикациях было рекомендовано для селекции полезных лактобацилл обрабатывать пул выделенных лактобактерий аутосывороткой, полученной из крови человека, из кишечника которого были выделены эти микроорганизмы. Метод обеспечивает положительную селекцию лактобацилл с полезными свойствами, к которым в организме в процессе жизни сформировалась иммунологическая толерантность [Патент РФ №2139070, з-ка 99105814/13, оп. 10.10.99].

Выделенный новый штамм после идентификации назван Lactobacillus. fermentum Z, помещен в коллекцию отдела молекулярной микробиологии Учреждения Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН под №10. Свидетельство о депонировании прилагается.

Штамм Lactobacillus fermentum Z отличается от штаммов аналогов и прототипа биодоступностью, способностью выступать как синергист при использовании с культурой пробиотических энтерококков и лактобацилл. Важным свойством штамма является его способность расти в молоке, в питательном бульоне, и на поверхности, и в толще плотных питательных сред, в присутствии других лактобактерий, не ингибируя рост этих культур и не являясь сильным кислотообразователем.

Преимуществом нового штамма Lactobacillus fermentum Z является его высокая технологичность: он сохраняет жизнеспособность в диапазоне температур от 37° до 41°С, способен расти на питательных средах для лактобацилл различного состава без добавления дополнительных факторов роста (глюкозы), относительно устойчив к желчи и к низким значениям рН (до 4.0). Штамм устойчив к замораживанию и оттаиванию в среде с добавками сыворотки и глицерина (10%), сохраняет жизнеспособность и биологические свойства после сушки при помощи лиофилизации более 3 лет. В молоке сохраняет жизнеспособность в течение 1 года при хранении в условиях заморозки -30°С, 2 месяца и более при хранении в условиях +4°С.

Указанные выше свойства позволяют рассматривать этот штамм для производства пробиотического молочнокислого продукта с приятными органолептическими характеристиками, не противопоказанного, в отличие от иных заквасок, имеющих низкий рН (<4,6), для употребления больными с язвенной болезнью и гиперацидным гастритом.

Штамм Lactobacillus fermentum Z обладает устойчивостью к фторхинолонам, аминогликозидам и тетрациклинам, что позволяет осуществлять сонацию организма от патогенных микроорганизмов и одновременно нормализовать микробиоценоз организма человека после тяжелых инфекций и лечения антибиотиками, цитостатиками или радиацией, например, после лечениия опухолевых заболеваний.

Кроме того, сохранение спектра чувствительности к антибиотикам может рассматриваться как маркерный признак, что имеет особенное значение при биотехнологических процессах.

Характеристика штамма Lactobacillus fermentum Z

Штамм Lactobacillus fermentum Z характеризуется следующими морфологическими, культуральными, биохимическими и другими биологическими признаками.

Морфологические признаки

Клетки штамма Lactobacillus fermentum Z - грамположительные бактерии средних размеров, имеют палочковидную форму с закругленными концами, располагаются по одной или в виде коротких цепочек (по 2-3 бактерии), неподвижны. Капсулы, фимбрии, жгутики не образуют. Размер клеток - 0,5-1,2×0,5-1,5 мкм. Особенности ультраструктуры культуры Z, выросшей в толще среды МРС представлены на рис.1.

Фиг.1. Электронограмма Lactobacillus fermentum Z

Ультратонкий срез культуры, выросшей в толще МРС среды.

Увеличение в 600 раз.

Культуральные признаки

Температурный оптимум +37±2°С. Слабый рост при 41°С. Растет на средах, предназначенных для роста лактобактерий (таблица 1), а также триптозном агаре и плохо - на кровяном агаре. В анаэробных условиях (анаэростат, «Oxoid», Англия) растет быстрее с образованием более крупных колоний на поверхности плотных питательных сред. Результаты испытаний сред для роста штамма представлены в таблице 1.

Таблица 1 Характеристика роста штамма L.fermentum Z на различных питательных средах (в аэробных условиях, при +37°С) Питательная среда Фирма производитель Характер роста Особенности колоний Триптозно-соевый агар Ferrax, Германия Хороший рост уже через 24 часа инкубации Бесцветные колонии, мелкие, круглые с ровным краем Кровяной агар Основа - Himedia, Индия Пылевидный, едва заметный рост через 48 часов инкубации Бесцветные почти микросопические колонии МРС4 НИЦФ, Россия Отчетливый рост через 24-48 часов Нежные серо-белые с волнистым краем, средних размеров Капустный агар НИЦФ, Россия Отчетливый рост через 48 часов Нежные кружевные МРС жидкая (MRS) Himedia, Индия Придонный рост с густой мутью в надосадочной части через 24 часа - МРС1 НИЦФ, Россия Рост в течение 48 часов, есть осадок - Молоко Россия Сбраживает через 12-24 часа с образованием творожистого неплотного сгустка белого цвета без образования сыворотки -

На рис.2 представлены кривые роста культуры Lactobacillus fermentum Z в среде MRS. Как видно на рис.2, культура штамма достигает стационарной фазы роста спустя 8 часов инкубации.

Фиг.2. Рост культуры Lactobacillus fermentum Z в среде MRS

А - по изменению числа клеток, Б - по изменению оптической плотности.

Биохимические признаки штамма

Штамм Lactobacillus fermentum Z - каталазоотрицательный, цитохромоксидазо-отрицательный; перекись не продуцирует, нитраты не редуцирует, желатину не разжижает, сероводород и индол не продуцирует. Метаболизм бродильного типа (O/F-тест на модифицированной среде Хью-Лейфсона положительный). Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная.

Сахаролитическая активность:

Облигатный сахаролитик. Ферментирует лактозу, мальтозу, галактозу, глюкозу, фруктозу, сахарозу, меллибиозу. Не ферментирует рибозу, рамнозу, ксилозу, рафинозу, арабинозу, целлобиозу, сорбит, манит, эскулин. Конечное значение рН на ферментируемых сахарах 4,5-5,0. В результате сбраживания сахаров образуется молочная кислота, но не газы.

Штамм Lactobacillus fermentum Z является умеренным кислотообразователем. В таблицах 2 и 3 приведены сравнительные данные по изменению рН и продукции молочной кислоты, полученные при культивировании штамма Lactobacillus fermentum Z и иных пробиотических штаммов и на среде MRS.

Таблица 2 Изменение рН среды MRS при культивировании Lactobacillus fermentum Z и пробиотических штаммов Штамм pH среды через 8 часов культивирования через 24 часа культивирования Lactobacillus fermentum Z 5,58±0,21 4,9±0,23 Lactobacillus plantarum 8A-P3 ("Лактобактерин", Россия) 4,88±0,24 4,22±0,29 Lactobacillus acidophilus 317/402 ("Наринэ", Россия) 4,55±0,34 4,12±0,40 Enterococcus faecium L3 ("Ламинолакт" Россия) 5,58±0,28 4,95±0,28 Enterococcus faecium SF68 ("Бифиформ", Дания) 5,50±0,23 5,00±0,28 Enterococcus faecium M74 ("Линекс", Словения) 5,84±0,29 5,19±0,27 Lactobacillus acidophilus D75-76 ("Витафлор", Россия) 5,87±0,29 4,77±0,26 Примечания: рН (MRS)=5,92

Таблица 3 Продукция молочной кислоты при росте на среде MRS штаммом Lactobacillus fermentum Z и иными лактобактериями Штамм Концентрация молочной кислоты в супернатанте культуры (мммоль/1)* через 8 часов культивирования через 24 часа культивирования Lactobacillus fermentum Z 51,63±10,49 70,99±16,20 Lactobacillus plantarum 8A-P3 ("Лактобактерин", Россия) 82,26±16,65 85,40±21,08 Enterococcus faecium L3 ("Ламинолакт", Россия) 49,44±10,89 71,97±11,20 Enterococcus faecium SF68 ("Бифиформ", Дания) 67,23±18,25 72,80±12,76 Enterococcus faecium M74 ("Линекс", Словения) 4,66±0,93 70,19±14,44 Lactobacillus acidophilus D75-76 ("Витафлор", Россия) 2,23±0,93 89,6±20,92 Примечания: * - данные получены с использованием тест системы «Лактат-Витал», Vital Diagnostica, Россия

Чувствительность к антибиотикам

Штамм Lactobacillus fermentum Z характеризуется высокой чувствительностью к цефалоспоринам и пенициллинам. Он устойчив к действию аминогликозидов, фторхинолонов и тетрациклинов. Результаты определения чувствительности к антибактериальным препаратам штамма Lactobacillus fermentum Z и других пробиотических лактобактерий приведены в таблице 4.

Таблица 4 Чувствительность штамма Lactobacillus fermentum Z и иных лактобацилл к антибиотикам Антибиотики Зоны задержки роста лактобацилл (мм) L.fermentum Z L.acidophilus («Наринэ») L.acidophilus («Вита-флор») L.acidophilus («Ацилакт») L.plantarum («Лакто-бактерин») Цефуроксим 15 0 >40 0 0 Цефоперазин 20 0 >40 0 19 Цефаклор 29 15 >40 0 23 Оксациллине 23 0 0 0 18 Амоксиклав 35 25 >40 25 н.д. Гентамицин 0 12 н.д. н.д. н.д. Канамицин 0 0 0 0 0 Нетилмицин 0 0 22 12 12-14 Доксициклин 9 н.д. н.д. н.д. н.д. Ципрофлоксацин 0 0 0 0 0 Офлоксацилин 0 н.д. 0 0 0 Норфлоксацин 0 0 0 0 0 Амикацин 11 н.д. н.д. н.д н.д.

Обозначения: Н.д. - нет данных

Чувствительность штамма к действии» желчи

Устойчивость пробиотических штаммов к желчи - свойство, необходимое для перорального использования препаратов и пищевых продуктов, содержащих живые лактобактерии. Кроме того, эти свойства важны в диагностическом плане. Результаты исследования этой характеристики для штамма Lactobacillus fermentum Z и пробиотических энтерококков (как правило, более устойчивых к желчи по сравнению с другими лактобактериями) приведены в таблице 5.

Таблица 5 Концентрация клеток исследуемых культур, выросших на среде с различным содержанием желчи Концентрация желчи, % Оптическая плотность суспензии клеток (бООнм) Lactobacillus fermentum Z Enterococcus faecium L3 25 - 0,016 10 - 0,188 5 0,12 0,333 2,5 0,156 0,447 1,25 0,182 0,542 0,625 0,18 0,598 0,3 0,161 0,669 0,15 2,451 0,745 0 0 0

Идентификация

В настоящее время для идентификации пробиотических молочнокислых бактерий используются: микроскопия, бактериологическое исследование, с анализом биохимических, культуральных, антигенных свойств и тестирование на чувствительность к антибиотикам. Несмотря на существование большого количества методов для исследования лактобацилл, дифференциация видов этих бактерий представляет значительные трудности и в практических лабораториях нашей страны не осуществляется. Существует методика идентификации лактобацилл на основе морфометрических характеристик колоний. Предложен газохроматографический метод определения видовой принадлежности лактобацилл при наличии отдельных колоний на плотной среде. Предпринимались попытки серологической идентификации молочнокислых бактерий. Однако все эти разработки не получили практического использования [Медицина XXI. - 2007 - №5 (6) - С.41-48]. Для ускоренной идентификации группы молочнокислых бактерий на основании их биохимической активности используются диагностические системы API 50CHL французской фирмы «Bio-Merieux», аналогичные тест системы разработаны в Нижнем Новгороде [Дисс. канд. мед. Наук Лихачевой А.Ю., Н-Новгород. - 1992. - 199 с]. Однако более точные данные при идентификации лактобацилл обеспечивают молекулярно-генетические методы DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) фрагментов ДНК, полученных при помощи PCR амплификации V₂-V₃ региона 16 SrRNA, а также секвенирования и идентификации генов при помощи BLAST анализа, сопоставления с данными GenBank [APMIS 2002; 10. - Р.802-810].

Генетические особенности

При помощи рибонуклеотипирования штамм L.fermentum Z был идентифицирован. В результате секвенирования ПЦР продуктов и сопоставления с данными GeN BANK культура Z отнесена к виду fermentum. Последовательность нуклеотидов выделенного при помощи ПЦР участка, кодирующего 16S субъединицу рибосом в штамме Lactobacillus fermentum Z, представлена на рис.3.

Фиг.3. Последовательность нуклеотидов выделенного при помощи ПЦР участка, кодирующего 16S субъединицу рибосом в штамме Lactobacillus fermentum Z.

Анализ генома штамма Lactobacillus fermentum Z на наличие генов бактериоцинов и факторов, регулирующих их экспрессию и устойчивость к ним продуцента, проводился при помощи ПЦР, используя праймеры. приведенные в таблице (табл.6). Как видно на фиг.4, у штамма Z в геноме обнаружены гены (lafa и p.i), обеспечивающие продукцию лактоцина F и иммунитет продуцента к данному антимикробному пептиду. Следует отметить, что при генетическом исследовании и фенотипически в штамме Lactobacillus fermentum Z не обнаружены плазмиды и бактериофаги.

Таблица 6 ДНК праймеры, использованные для выявления бактериоциногенности лактобацилл Название гена Функция Последовательность праймеров lafa Предшественник лактоцина F gAgTCTTggCAACggAAgA AgT gATgCggCTTAACTgTTCgATA lafi. Белок иммунитета лактоцина F TCTCACTTCCAggTgaTgA САА CgTAACCAgCCTgTTCAAgTTC lasX лактоцин S ggAAgggAggTggAACAgT ATg CAgACgCAgTTggCAATAATCC lab Лактоцин В gTTAAggACCAATTgCCA gACC ATgTCTTCgTCAgTTTCgTggA plan плантарицин CCACCTgTgAACTAgCAg CA AgCTgCTgCgTACCAAgATT

Фиг.4. Результаты ПЦР-анализа ДНК штамма L.fermentum Z на присутствие генов бактериоцинов

Пробы: 1 - маркер молекулярного веса (100-1000 н.п.), 2 - плантарицин S, 3 - лактацин B, 4 - лактацин F, 5 - лактоцин S

Другие выявленные биологические свойства

Антагонистическая активность по отношению к микроорганизмам

Большинство исследователей, занимающихся изучением антагонистической активности лактобацилл и энтерококков, в качестве индикаторных микроорганизмов выбирают стафилококки. С одной стороны, это невероятно важный с точки зрения практической медицины объект, часто обладающий множественной антибиотикоустойчивостью. С другой стороны, такой тест очень удобен для отбора наиболее перспективных штаммов антагонистов.

Таблица 7 Зоны задержки роста при исследовании антагонистической активности лактобацилл и энтерококков по отношению к стафилококкам (методом штриховых посевов) Антагонисты Индикаторные культуры S.aureus ATCC 25922 S.aureus 209 Lactobacillius fermentum Z 26 24 L.plantarum 8A-P3 («Лактобактерин») 33 32 L.case idefensisDN-114000 (йогурт «Актимель») 28 30 E.faecium L3 («Ламинолакт») 28 25 E.faecium SF68 («Бифиформ») 24 25

В таблицах 7 и 8 приведены данные, полученные при использовании метода штриховых посевов [фармакопейная статья PC 42-252 ВС89. Срок введения с 1/IV-1989 по 1/IV 1994]. Культуры антагонистов засевали штрихом посередине чашки Петри со средой МРС4, подсев стафилококков осуществляли после 72 часов инкубации лактобактерий. Установлено, что исследованные штаммы молочнокислых бактерий обладают неодинаковой антагонистической активностью. Максимальную способность подавлять рост S.aureus проявил штамм L.plantarum 8A-P3, несколько меньшую - Lactobacillius fermentumZ, L.casei, E.faecium L3 и E.faecium SF68 (таблица 7). Более низкой антагонистической активностью обладали остальные штаммы лактобактерий, представленные в таблице 8.

Таблица 8 Зоны задержки роста при исследовании антагонистической активности лактобацилл и энтерококков по отношению к стафилококкам (методом штриховых посевов) Антагонисты Индикаторные культуры S.aureus ATCC 25922 S.aureus 209 L.acidophilus EP3 17/402 («Наринэ») 6 8 L.acidophilus 75 и 76 («Витафлор») 4 4 Lactobacillus sp.62 (*клинические изоляты их урогенитального тракта) 12 12 Lactobacillus sp.64* 0 0 Е.faecium SF68 («Бифиформ») 24 25

Также проводили исследование антагонистической активности лактобацилл и энтерококков методом двухслойного агара [Журн. Микробиол., 2004, 5, С.94-98], определяя показатель МИКА - минимальной ингибирующей концентрации бактерий антагонистов в lg КОЕ/мл. Полученные результаты отражены в таблице 9.

Также проводили исследование антагонистической активности лактобацилл и энтерококков методом двухслойного агара [Журн. Микробиол., 2004, 5, С.94-98], определяя показатель МИКА - минимальной ингибирующей концентрации бактерий антагонистов в lg КОЕ/мл. Полученные результаты отражены в таблице 9.

Таблица 9 Антагонистическая активность (МИКА) различных штаммов LAB к стафилококкам Штаммы LAB S.aureus 25922 S.aureus 209 Lactobacillus fermentum Z 3,83(4,83) 3,83(4,83) L plantarum 8A-P3 2,54(3,54) 1,54(3,54) L.acidophilus EP 317/402 3,37(4,57) 3,37(4,57) L.casei defensis DN-1140001 2,57(3,57) 2,57(3,57) L.acidophilus 75 и 76 «Витафлор» 4,68(5,68) 4,68(5,68) Lactobacillus sp.62 5,72(7,72) 4,72(6,72) Lactobacillus sp.64 (выделен из влагалища) 7,04(8,04) 7,04(8,04) Lactobacillus sp.62 (выделен из влагалища) 4,77(5,77) 3,77(4,77)

Заявляемый штамм обладает антагонистической активностью равной или превышающей антагонистическую активность клинических изолятов и даже некоторых пробиотических лактобактерий. Аналогичные данные были получены при исследовании антагонистической активности нового штамма по отношению к листериям, стрептококкам, псевдомонадам, клебсиеллам, ацинетобактерам, эшерихиям. В то же время, в отличие от многих других пробиотических штаммов, Lactobacillus fermentum Z не ингибирует рост лактобактерий, в том числе Е.faecium L3. В таблице 10 приведены данные по исследованию антагонистической активности моно- и смешанных культур, энтерококков и различных лактобацилл, пробиотических и клинических изолятов.

Таблица 10 Антагонистическая активность смешанных культур Enterococcus faecium L3 и различных пробиотических лактобацилл Антагонисты Индикаторные микроорганизмы S.aureus 209 S.aureus АТСС 25923 E.coli АТСС 25922 E.faecium L3 L.fermentum Z+Е.faecium L3 27 26 36 2 L.fermentum Z 25 24 33 2 L.plantarum 8A-P3 35 33 >35 2 E faecium L3 22 20 >35 2 L.plantarum 8A-P3+E faecium L3 35 33 32 2 L.acidophilus EP 317/402 34 4 4 2 L.acidophilus EP 317/402+E.faecium L3 32 22 5-6 2 L.casei defensis DN-1140001 >35 >35 12 2 L.cacsei defensisDN-1140001+E.faecium L3 19 20 8 15

Из таблицы видно, что антагонистическая активность смешанных культур проявляется в большей степени по сравнению с монокультурами только при использовании штамма L.fermentum Z.

Способ, условия и состав сред для хранения штамма:

Штамм Lactobacilllus fermentum Z хранят в стерильном молоке, таком как "Клевер», «Тема» и другие (Россия), а также "Supro Plus 2640" (Protein Technologies International, США) при - 70°C в течение нескольких лет, в случае необходимости - осуществляют пересев ежегодно или ежемесячно (периодичность пересевов 1 раз в 20-30 дней). Культуру хранят также в сублимированном виде в запаянных ампулах (длительность хранения 2 года и более).

SUPRO PLUS 2640 - высококачественный сухой белковый продукт, который обладает повышенной пищевой ценностью по сравнению с обычным сухим цельным молоком и жидким цельным молоком. Продукт имеет эквивалентное пищевое качество в отношении витаминов А и D в обогащенном сухом молоке, плюс дополнительное количество витамина А (2640 ME), железа, йода. В состав продукта входят: влага - 3,0%, белок - 26,0%, жир - 26%, зола - 7,0%, углеводы - 38,0%, кальций - 0,9 г, фосфор - 0,8 г. SUPRO PLUS 2640 может быть использован во всех продуктах, где традиционно используется сухое цельное молоко.

Для лиофильного высушивания культуры Lactobacilllus fermentum Z используют культуру в стационарной фазе, выращенную в среде MRS, ресуспендированную после центрифугирования в специальной защитной среде. В состав защитной среды входят: сахароза 10%, желатин 1%, рН 7,0±0,2.

Свойства штамма стабильны и не меняются при хранении, в процессе культивирования и при воздействии экстремальных факторов, что позволяет судить о его промышленной применимости. Особенностью данного штамма по сравнению с прототипом является его свойство сохранять высокую степень жизнеспособности после контактной сушки с использованием крахмала, жиров или сахаров. При этом бактерии сохраняют 90% жизнеспособности при температурах от -20°С до +10°С не менее 6 месяцев.

Стабильность сохранения полезных свойств при длительном культивировании Lactobacillus fermentum Z

Длительное культивировании штамма на жидких питательных средах (не менее 20 пересевов) не приводило к изменению устойчивости к антибиотикам, спектра и силы антагонистической активности к патогенным микроорганизмам, а также других признаков штамма, перечисленных выше. У штамма Lactobacillus fermentum Z не был выявлен вирулентный бактериофаг при помощи генетических и культуральных методов исследования.

Острая токсичность

Степень токсичности препарата определяли при помощи введения per os, per vaginum, intra peritoneum суспензии бактерий в фосфатном буфере и молочнокислой закваски, приготовленных на основе культуры Lactobacillus fermentum Z [Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. - М.: 2000, с.23]. При пероральном введении беспородным белым мышам самцам и самкам весом 12-17 г культуры штамма Lactobacillus fermentum Z в количестве до 10, 6 lg КОЕ/мл все животные (по 12 мышей в каждой группе) сохранили жизнеспособность. В таблице 11 приведены данные, полученные при внутрибрюшинном введении суспезии культуры Lactobacillus fermentum Z в фосфатном буфере. Коэффициент летальности даже в случае внутрибрюшинного введения был низким и более чем в 1000 раз превышал терапевтическую дозу, вводимую per os.

Интравагинальные введения крысам-самкам породы Вистар (вес 180-200 г) в течение 7 дней до 500 мкл 10⁸ не вызывало патологических изменений по клиническим параметрам, а также при контроле гистологических препаратов, полученных из влагалища и матки крыс.

Таблица 11 Показатели острой токсичности при внутрибрюшинном введении Lactobacillus fermentum Z мышам Штаммы Доза заражения (lg КОЕ/мл) Заражено Погибли % летальности ±m Коэффициент летальности Lactobacillus fermentum Z 10,61 6 4 33±21 0,29 Контроль Фосфатный буфер 6 0 0 0

Вирулентность

Исследования нового штамма на вирулентность проводились на лабораторных мышах и лабораторных крысах в соответствии с принятыми стандартами [Фармакология и токсикология. 1999, №4, с.497-502]. Показано, что штамм Lactobacillus fermentum Z является безвредным для животных. Данный штамм Lactobacillus fermentum Z в 100-кратной дозировке по сравнению с предполагаемой дозой приема препаратов и продуктов на его основе (9- lg КОЕ/мл) вводился лабораторным животным в течение одного месяца. Ни у одного из исследованных животных не возникало патологических изменений: происходило нормальное нарастание веса, не менялся стул, сохранялся цвет и характер шерстяного покрова. Вскрытие лабораторных животных после окончания эксперимента также не выявило никаких патологических изменений в системах и органах.

ВЫВОДЫ

Таким образом, на основании лабораторных исследований установлено, что предлагаемый штамм Lactobacillus fermentum Z не обладает вирулентностью и токсичностью, проявляет существенное антимикробное действие. Штамм Lactobacillus fermentum Z отличается от штаммов прототипа и иных рассмотренных пробиотических молочнокислых бактерий биодоступностью, способностью выступать как синергист при использовании с культурой пробиотических энтерококков и лактобацилл. У штамма Lactobacillus fermentum Z отмечается более широкий спектр устойчивости к антибиотикам (причем, к таким сильнодействующим как аминогликозиды, фторхинолоны, тетрациклины). Благодаря этим качествам заявляемый штамм может использоваться совместно с антибиотиками для санации организма от патогенных бактерий и грибов и одновременно нормализовать микробиоценоз организма человека после тяжелых инфекций, воздействия антибиотиками, цитостатиками или радиацией.

Антимикробные свойства штамма Lactobacillus fermentum Z связаны не с перекисью водорода и не с кислотообразованием, а с продукцией других антимикробных факторов, по-видимому, антимикробных пептидов, таких как лактоцин F. Низкий уровень кислотности при росте этого штамма в питательных средах позволит применять продукты и препараты на основе культуры Lactobacillus fermentum Z в питании и при лечении больных с язвенной болезнью желудка и гиперацидным гастритом. Преимуществом нового штамма является его высокая технологичность. Он быстро и эффективно заквашивает молоко, с образованием приятного органолептического продукта. Культура Lactobacillus fermentum Z стабильна при пересевах и хранении, устойчива к перепадам температур, низким рН, желчи и другим факторам. Заявляемый штамм Lactobacillus fermentum Z по сравнению с известными аналогами имеет широкую сферу применения в качестве основы как для лечебно-профилактических препаратов, так и для профилактических пищевых продуктов.

Изобретение поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Lactobacillus fermentum Z

Пример 1. Выделение штамма лактобацилл в результате селекции в организме женщины на фоне терапии вагиноза

Штамм выделен из влагалища женщины после терапии бактериального вагиноза одним курсом метронидазола с последующей коррекцией дисбиоза вакциной "СолкоТриховак", в состав которой входят 8 различных инактивированных (нежизнеспосособных) штаммов Lactobacillus spp. кокковидной формы (в эквивалентном соотношении в количестве не менее 7×10⁹:3 штамма L.rhamnosus, 3 штамма L.vaginalis, I штамм L.fermentum, 1 штамм L.salivarius). Курс метронидазола составляет 7 дней с ежедневной дозой 0,5 г per os. Курс вакцинации СолкоТриховаком продолжается 6 недель с введением вакцины внутримышечно по 0,5 мл на следующий день после последнего приема метронидазола, затем еще дважды с интервалом в 2 недели. Перед введением антибактериальных средств, а также на различных этапах терапии у пациентки проводили исследование микробиоты влагалища при помощи микроскопических и бактериологических методов.

После вакцинотерапии у женщины произошли изменения в микрофлоре влагалища, что сопровождалось появлением более типичных палочковидных лактобацилл, формирующих на плотной питательной среде колонии двух типов: беловато-серых с ровным краем и сероватых кружевных. Принадлежность этих бактерий к роду Lactobacillus подтверждалась наличием у них соответствующих морфологических, культуральных и биохимических свойств. Исследована антагонистическая активность штамма, его способность пассироваться в лабораторных условиях. Выделен, идентифицирован и охарактеризован штамм Lactobacillus fermentum Z, описание полезных свойств которого приведены в документации ниже (паспорт).

Пример 2. Результаты выращивания жидкой культуры штамма Lactobacillus fermentum Z в условиях микробиологической лаборатории

Посевной материал получают выращиванием микробной взвеси штамма Lactobacillus fermentum Z на поверхности среды МРС4 (НИЦФ, Россия). Эта среда, называемая средой для выделения лактобактерий ,содержит в 1 литре следующие ингредиенты: гидролизата казеина ферментационного 17,5 г; дрожжевого экстракта сухого 3,5 г; глюкозы 2,5 г; пептона 10,0 г; печеночной воды 100 мл; цистеина 0,2 г; аммония лимоннокислого 2,0 г; натрия уксуснокислого 1,5%; твина 80 1 мл; сульфата магния 0,2 г; сульфата марганца 0,05 г; двухзамещенного фосфата калия 1 г; агара микробиологического 15,0 г; дистиллированной воды до 1 литра, рН 5,7. Засев производится методом истощающего штриха, инкубация - в термостате при ±37°С 24-48 часов.

Индивидуальные клоны штамма Lactobacillus fermentum Z, выросшие на поверхности агара, помещают в бактериологические пробирки, содержащие 5 мл среды MRS, "Supro Plus 2640" или молока и выращивают в термостате при +37°С 24-48 часов. Оптимальным и максимально стандартизованным является бульон MRS (Himedia, Индия). Данная среда названа «бульоном для лактобацилл МРШ (М 369)», приготовлен в соответствии с прописью de Man Rogosa Sharpe. Эта среда содержит: 10 г протеинозного пептона, 10 г говяжьего экстракта, 5 г дрожжевого экстракта, 20 г декстрозы, 1 г Твин 80, 2 г цитрата аммония, 5 г ацетата натрия, 0,1 г сульфата магния,, 0,05 сульфата марганца, 2 г двухзамещенного фосфата на 1 л воды. рН 6,5±0,02 при 25°.

Из аликвот, взятых из ночной культуры, готовят мазки, которые окрашивают по Граму. В мазках обнаруживаем грамположительные палочки. В препаратах не находим никакой посторонней микрофлоры. Колонии и жидкая культура оксидаза- и каталаза -. Количество живых бактерий штамма Lactobacillus fermentum Z определяем методом титрования. Концентрация живых бактерий штамма Lactobacillus fermentum Z составляет не менее 1×10⁹ колониеобразующих единиц на грамм жидкой питательной среды.

Бактериальная стартовая биомасса применима для выращивания больших объемов биомассы для производства жидких молочнокислых заквасок на основе штамма Lactobacillus fermentum Z или сухих бактериосодержащих продуктов.

Пример 3. Результаты исследования штамма Lactobacillus fermentum Z по характеру антагонизма к патогенным бактериям

Исследование антагонизма нового штамма Lactobacillus fermentum Z к патогенным бактериям проводим методом перекрестного посева на агаризованных питательных средах. Культуру лактобацилл в количестве 5,5·10⁸ КОЕ/мл наносят петлей (диаметром 3,5 мм) по середине чашки Петри со средой МРС4. Позже, через 48 часов инкубации на эти же среды засевают индикаторные микроорганизмы Staphylococcus aureus ATCC 25923 E. faecalis ATCC 29212, Escherichia.coli ATCC, Pseudomonas aeruginosa ATCC, в концентрации 5,5·10 КОЕ/мл специальной мерной петлей (диаметр 1,75 мм) перпендикулярно зоне роста антагониста, не касаясь ее. Индикаторные бактерии в виде инокулюмов хранятся при холодильнике -20°С.

Спустя 24 часа определяют наличие зон задержки роста бактерий и их величины. Зоны задержки роста колеблются в пределах 10-35 мм в зависимости от индикаторных культур. Полученные результаты исследования антагонистической активности свидетельствуют о стабильности данного признака у используемой культуры.

Пример 4. Получение молочнокислой закваски на основе Lactobacillus fermentum Z

Посевной материал - инокулюмы 1) в стеклянных флаконах (объем 2 мл, высушенные путем лиофилизации, хранящиеся при -20°С) или 2) в криовиалах (1 мл, Sarstedt, Германия), взятые из морозильной камеры -70°С, содержат 9 lg КОЕ культуры штамма Lactobacillus fermentum Z. 1 мл суспензии, растворенной в молоке, помещаем в теплое стерильное молоко 100 мл в стеклянном флаконе объемом 200 мл. Инкубация 8-12 часов приводит к заквашиванию молочного продукта. Для получения большего объема смеси «первичную» закваску добавляем в стеклянные бутыли с молоком, эмалированные или алюминиевые бидоны или ферментер с засевной дозой 1-5% от конечного объема. Инкубирование проводим в термостате при +37°С в течение 6-12 часов, до достижения концентрации культуры 9 lgKOE/мл, рН 5.

В качестве сырья можно использовать молоко «Клевер». Коммерчески приобретенное молоко «Клевер» с 1.5% жирности доводят до рН 7,0 и стерилизуют 20 минут автоклавированием при давлении 0.5 атм и температуре +110-120°С. Для приготовления молочной среды на основе "Supro Plus 2640" к 15 г порошка добавляют 1 литр воды, доводят рН до 7,0 и стерилизуют автоклавированием под давлением 1 атм 20 минут при +110°С.

К сожалению, при исследовании антимикробной активности пробиотических штаммов и претендентов на зачисление в эту группу до сих пор не существует стандартного набора индикаторных культур микроорганизмов. Поэтому штамм, полученный нами искусственно, был исследован на наличие антагонистической активности в отношении следующих выбранных нами и наиболее часто использующихся культур: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus spp. и Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans, Cryptococcus neoformens. При этом мы старались, чтобы спектр исследованных индикаторных микроорганизмов был достаточно широким.

Штамм L.fermentum Z эффективен в производстве молочнокислой закваски, но изучение его биологических характеристик было направлено на выявление лечебно-профилактических свойств. В силу этих причин, полученную с использованием штамма Z молочнокислую закваску можно рассматривать в качестве пробиотического продукта с определенными биологическими эффектами.

Интересным свойством, выявленным у штамма L. fermentum Z, является особенности спектра его антимикробного действия. В частности, данный штамм обладает антагонистической активностью по отношению к грибам.

Доказательства антимикотической активности L.fermentum Z

Нами при исследовании влияния L.fermentum Z на рост грибов был использован метод двухслойного агара. Показано, что большинство исследованных штаммов молочнокислых бактерий не обладают антимикотической активностью (таблица 12). Заявляемый штамм Z обладает промежуточной антагонистической активностью по отношению к грибам родов Candida и Cryptococcus, минимальное ингибирующее рост индикаторной культуры количество антагониста (МИКА) составляло 4,17 lg КОЕ/ мл.

Таблица 12 Антагонистическая активность (МИКА) LAB по отношению к грибам рода Candida и Cryptococcus Штаммы антагонистов МИКА С.albicans ATCC МИКА Cryptococcus neoformens L.fennentum Z* 4,17±0,38 4,17+0,381 L.plantarum 8A-P3 4,61±0,21 3,61±0,18 L.acidophilus EP 317/402 6,61±0,23 6,61±0,23 L.acidophilus D75-76 >7 >7i Lactobacillus sp.64 >7 >7 Lactobacillus sp.62 >7 >7 Примечания: * - подчеркнуты штаммы, выделенные из урогенитального тракта женщин

Вывод: антимикотическая активность штамма L.fermentum Z существенно больше, чем у других лактобацилл, выделенных из урогенитального тракта женщин, больше или почти равна антимикотической активности пробиотических штаммов; в частности, существенно больше по сравнению со штаммом L.acidophilus D75-76.

Доказательства антибактериального эффекта культуры L.fermentum Z в системе in vivo

Цель данного этапа исследования состояла в изучении влияния L.fermentum Z на микробиоту и некоторые функциональные характеристики кишечника в условиях дисбиоза, вызванного введением антибиотиков. С 1 по 3 день крысам однократно перорально вводили ампициллина тригидрат и метронидазол в дозах 15 мг и 10 мг соответственно, растворенные в 0,5 мл дистиллированной воде. Эти дозы соответствуют средним терапевтическим при данном весе крыс. Начиная с 3 и по 8 день, крысам перорально вводилась исследуемая молочнокислая закваска или молоко (таблица 13).

Таблица 13 Схема исследования влияния пробиотиков при дисбиозе Группы Характер воздействия 1-3 дни (11.00 час 1 раз день) 3-8 дни (11.00 час 1 раз в день, 3-ий день - в 17.00 час) К Дистиллированная вода Молоко Z 15 мг ампициллина и 10 мг метронидазола Молочнокислая закваска L.fermentum Z

После введения ампициллина и метронидазола отмечались следующие симптомы: полифекалия, понос, запор, метеоризм или их чередование, изменение консистенции стула, ухудшение аппетита, снижение веса. Как видно из таблицы 14, диспепсические симптомы появлялись через 18-24 часов после введения препаратов и сохранялись у некоторых животных контрольной группы (получавших молоко) в течение всего периода наблюдений. Следует отметить, что более динамично исчезали клинические симптомы дисбиоза кишечника у крыс, получавших молочнокислую закваску с L.fermentum Z (уже через 24-48 часов ее использования).

Как видно из данных, представленных в таблице 15, после введения антибактериальных препаратов на 2-3 дни исследования крысы теряли в весе в среднем до 11 г. В дальнейшем крысы, получавшие молочнокислую закваску с Z, восстанавливали и увеличивали свой вес быстрее животных из контрольных групп (p<0,005). В контрольной группе животных отмечалось снижение веса. В конце эксперимента средний вес крыс, получавших молочнокислую закваску, был на 26 г больше, в контрольной группе, напротив, на 24 г меньше, по сравнению с исходными показателями.

Таблица 14 Клинические симптомы проявления дисбиоза у крыс в различные сроки эксперимента Анализируемые диспепсические симптомы Исходно После воздействия антибиотиками После введения молочнокислой закваски с L.fermentum Z После введения молока Характер стула Без отклонений 12 из 12 Маслянистая консистенция, кашицеобразный через 18-24 часов Нормализация через 24-48 часов у 6 из 6 Нормализация через 48-96 часов Частота и количество Без отклонений 12 из 12 Полифекалия
Понос 3 из 8, чередование запора и поноса 2 из 8 через 18-24 часов Нормализация через 24-48 часов у 6 из 6 Нормализация через 48-96 часов у 2 крыс понос

Таблица 15 Изменение веса животных различных групп в ходе эксперимента Дни наблюдений 1 2 3 4 5 6 7 8 Группы животных L.fermentum Z 300±5 295±7 289±7 291±8 292±8 300±8 301,48±7 326±9 Молоко 301±8 296±9 290±4 271±8 279±6 283±9 281±6 277±8

В таблице 16 представлены объединенные данные по нескольким экспериментам, доказывающие, что после воздействия антибактериальными препаратами, в фекалиях крыс увеличивалось количество бактерий родов Klebsiella и Proteus, а также Escherichia coli с низкой ферментативной активностью, снижалось количество облигатных представителей микробиоты (лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков).

Таблица 16 Изменения микробиты крыс под воздействием антибактериальными препаратами Компоненты микробиоты До воздействия антибиотиками После воздействия антибиотиками Lactobacillus spp. 7,16±0,43 5,25±0,17 Bifidobactrium spp. 8,37±0,67 5,95±0,55 Enterococcus spp. 4,16±0,18 2,49±0,37 E.coli* 0 0,88±0,22 Proteus spp. 0,25±0,13 2,14±0,23 Klebsiella spp. 0 2,92±0,21

Таблица 17 Изменения микробиоты крыс с дисбиозом, получавших молоко или молочнокислую закваску с L.fermentum Z* Компоненты микробиоты L.fermentum Z Молоко Lactobacillus spp. ↑2,33±0,13 ↑1,25±0,19 Bifidobactrium spp. ↑2,l±0,3 ↑1±0,29 Enterococcus spp. ↑1,33±0,21 ↑0,25±0,ll E.coli* ↓0,33±0,17 ↑0,76±0,36 Proteus spp. ↓3,16±0,28 ↑0,17±0,l Klebsiella spp. ↓0,33±0,14 ↑1±0,23 Примечания: * сравнение 5 и 8 дня исследований, lg КОЕ/мл ** - неферментирующие Е. coli ↑ - увеличение количества бактерий, ↓ - уменьшение количества бактерий.

Молочнокислая закваска с L.fermentum Z в отличие от молока, способствовала снижению количества протея и клебсиелл, заселению кишечника крыс бифидобактериями, лактобациллами и энтерококками.

Таким образом, в серии экспериментов с введением штамма L.fermentum Z удалось выявить его способность устранять клинические последствия дисбиоза, оказывать в системе in vivo избирательное ингибирующее действие на рост протея и клебсиелл, способствовать быстрому восстановлению содержания в кишечнике лактобацилл.

Штамм Lactobacillus fermentum Z получен в результате естественной селекции лактобацилл микрофлоры женщины с вагинозом в процессе лечения заболевания сочетанным действием метронидазола и вакцины СолкоТриховак. Штамм обладает антагонистической активностью к патогенным грамположительным и грамотрицательным бактериям, а также к грибам. Штамм Lactobacillus fermentum Z хранится в коллекции бактериальных культур ГУ НИИЭМ СЗО РАМН под №10. Изобретение обеспечивает отсутствие у штамма антагонистической активности по отношению к лактобациллам, энтерококкам и бифидобактериям, что дает возможность использовать его в производстве пробиотических молочнокислых продуктов. 4 ил., 17 табл.

Штамм Lactobacillus fermentum Z, коллекционный номер №10, хранится в коллекции бактериальных культур Учреждения Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, используемый для производства пробиотических молочнокислых продуктов.