СПОСОБ ПОДБОРА ПРОБИОТИЧЕСКИХ И АУТОПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ЦИТОСТАТИКАМ ПРИ ТЕРАПИИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 A61K35/74 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и фармакологии и может быть использовано для разработки медицинских технологий лечения онкологических заболеваний.

Онкологические заболевания являются одной из лидирующих причин смертности в мире. С каждым годом количество выявляемых случаев рака растет. Зачастую применение химиопрепаратов предшествует оперативному вмешательству у онкологических больных. В ходе химиотерапии у пациентов развивается ряд побочных эффектов, которые значительно сказываются на их качестве жизни. Большое количество этих побочных эффектов связано с тем, что, помимо опухолевых клеток, цитостатики влияют на микробиоту пациентов и вызывают дисбиоз, который и так неминуемо присутствует при онкопатологии (Cammarota G., Ianiro G. Gut microbiota and cancer patients: a broad-ranging relationship // Mayo Clinic Proceedings. - Elsevier, 2017. - T. 92. - №. 11. - C. 1605-1607.). Одним из наиболее важных последствий химиотерапии при колоректальном раке (КРР) является кишечный мукозит. Известно, что в развитие мукозита непосредственно вовлечена микробиота кишечника. (Li Н. L. et al. Alteration of gut microbiota and inflammatory cytokine/chemokine profiles in 5-fluorouracil induced intestinal mucositis // Frontiers in cellular and infection microbiology. -2017. - T. 7. - C. 455; Yeung C.Y. et al. Amelioration of chemotherapy-induced intestinal mucositis by orally administered probiotics in a mouse model // PloS one. - 2015. - T. 10. - №. 9. - C. e0138746). Кишечный мукозит провоцирует развитие таких симптомов, как потеря веса, диарея, стул с примесью крови.

Для терапии КРР наиболее часто используется комбинация цитостатиков FOLFOX (FOLinic acid, Fluorouracil, OXaliplatin) (Mohelnikova-Duchonova В., Melichar В., Soucek P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy // World journal of gastroenterology: WJG. - 2014. - T. 20. - №. 30. - C. 10316.).

При исследовании на мышах одного из препаратов системы FOLFOX, фторурацила, указанные выше симптомы ярко проявлялись у испытуемых животных, по сравнению с группой контроля. (Li Н.L. et al. Alteration of gut microbiota and inflammatory cytokine/chemokine profiles in 5-fluorouracil induced intestinal mucositis // Frontiers in cellular and infection microbiology. - 2017. - T. 7. - C. 455).

Для предотвращения развития дисбиоза в ходе химиотерапии, а также после нее, требуется назначение пациенту пробиотиков. Их положительная роль в коррекции микробиоты, нарушенной в результате применения цитостатиков, доказана рядом исследований - как на лабораторных животных, так и на пациентах (Quaresma М. et al. Probiotic mixture containing Lactobacillus spp.and Bifidobacterium spp.attenuates 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice // Nutrition and Cancer. - 2020. - T. 72. - №. 8. - C. 1355-1365., Yeung C.Y. et al. Amelioration of chemotherapy-induced intestinal mucositis by orally administered probiotics in a mouse model // PloS one. - 2015. -T. 10. - №. 9. - C. e0138746; Tooley K.L. et al. Oral ingestion of Streptococcus thermophilus diminishes severity of small intestinal mucositis in methotrexate treated rats // Cancer biology & therapy. - 2006. - L. 5. - №. 6. - C. 593-600., Osterlund P. et al. Lactobacillus supplementation for diarrhoea related to chemotherapy of colorectal cancer: a randomised study //British journal of cancer. - 2007. - T. 97. - №. 8. - C. 1028-1034).

Однако, используемые пробиотики не всегда эффективны для борьбы с последствиями химиотерапии, что может быть объяснено подавлением роста некоторых пробиотических культур цитостатиками. Известно, что чувствительность к химиопрепаратам различных штаммов даже внутри одного вида микроорганизма может значительно различаться (Сержантов И.А., Жиркова А. Г., Шаповал О.Г. Чувствительность пробиотических штаммов лактобактерий к доксорубицину // Международный журнал экспериментального образования. - 2016. - №. 10-2. - С. 261-26; Typlyns^' ka K.V., Sovetova О. V., Gorchakov V. Y. The adaptation of disk method for express evaluation of resistance to cytostatics // Naukovi visti NTUU-KPI. - 2009. - T. 2009. - №.1; Bodet 3rd C.A, Jorgensen J.H., Drutz D.J. Antibacterial activities of antineoplastic agents //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1985. - T. 28. - №. 3. - C. 437-439.; Hamilton Muller J.M.T. Antimicrobial activity of 21 antineoplastic agents. Br. J. cancer 1984. 49:367-369; V Peiris, В A Oppenheim Antimicrobial activity of cytotoxic drugs may influence isolation of bacteria and fungi from blood cultures J. Clin Pathol 1993; 46: 1124-1125; В.В. Орлова, E.И. Ермоленко, С.А. Ковалис, A.H. Суворов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. -2023. - Т. 25, №S1. - С. 44. - EDN MHZXB).

При отборе микроорганизмов в качестве потенциальных пробиотиков к ним предъявляются определенные требования (Новик, Г.И., Самарцев Л.Л., Астаповнч Н.И., Каврус М.Л. Биологическая активность микроорганизмов пробиотиков // Прикл. биохим. и микробиол. - 2006 - Т. 42, №2. - С. 187-194.; Шендеров, Б.А. Пробиотики и функциональное питание/ Б.А. Шендеров - М.: Грантъ, 2001. - 288 с.). Предпочтение обычно отдается штаммам, обладающим рядом специфических свойств - таких, как устойчивость к фенолу, желчи и низким значениям рН среды. По результатам оценки, в частности, указанных свойств, происходит отбор штаммов микроорганизмов с выраженными пробиотическими свойствами (Китаевская С.В. Современные тенденции отбора и идентификации пробиотических штаммов молочнокислых бактерий // Вестник Казанского технологического университета. - 2012. - Т. 15. - №. 17. - С. 184-188.; Сушкова В.И., Устюжанинова Л.В. Изучение пробиотических и технологических свойств лактобактерий // Всероссийская ежегодная научно-техническая конференция "Общество, наука, инновации" (НТК-2012). -2012. - С. 48-52).

В клинической практике отсутствуют стандартные и простые методы оценки устойчивости микроорганизмов, в том числе пробиотических, к цитостатикам. Мало исследованным остаются свойства аутопробиотиков, принципиально новых средств, на основе индигенных полезных микроорганизмов, отличающихся безопасностью и длительностью действия (Ермоленко Е.И. Оптимизация микробной терапии дисбиотических состояний посредством аутопробиотиков / Е.И. Ермоленко, А.Л. Лапидус, А.Н. Суворов // Санитарная и клиническая микробиология. Материалы XI съезда ВНПОЭМП, Москва, 16-17 ноября 2017 года. - 2017. - С. 925).

Цель изобретения - разработка подхода для подбора пробиотических и аутопробиотических средств при терапии КРР, отличающиеся устойчивостью к используемым цитостатикам.

В качестве аналогов можно рассматривать методы оценки чувствительности пробиотических бактерий к различным лекарственным препаратам и другим веществам, которые могут угнетать размножение полезных микроорганизмов при их введении в организм с терапевтической целью. Известно несколько методов определения чувствительности пробиотиков к антибиотикам, которые чаще всего используются для исключения передачи штаммами генов зистентности представителям микробиоты пациента (табл. 1). В то же время, знания об устойчивости к отдельным антибиотикам пробиотических штаммов делают возможным их более эффективное использование на фоне антибиотикотерапии.

Сухоруковой М.В. с соавторами была исследована чувствительность к антибиотикам чистых культур пробиотических микроорганизмов, выделенных из препарата «Линекс», методом серийных разведений, в соответствии с рекомендациями Европейского комитета по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (EUCAST) (Сухорукова М. В. и др. Чувствительность к антибиотикам штаммов бактерий, входящих в состав пробиотика "Линекс" // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2012. - Т. 14. - №. 3. - С. 245-251.). По результатам посева определялась минимальная ингибирующая концентрация (МИК) антибактериальных препаратов в отношении пробиотических культур. Для определения чувствительности лактобацилл была применена методика микроразведений в бульоне LSM (90% бульона Iso-Sensitest, OXOID, 10% бульона M.R.S., OXOID, рН 6,7). Для оценки антибиотикорезистентности бифидо бактерий применялась та же питательная среда, что и для лактобацилл, с добавлением 0,03%) L-цистеина. Планшеты с бифидо бактериями инкубировали в анаэробных условиях в течение 40-48 часов. Чувствительность энтерококков оценивалась с помощью стандартного метода разведений в среде Мюллера-Хинтона. За МИК принималась минимальная концентрация препарата, при которой отсутствовали признаки роста микроорганизма. Использование различных сред, предложенных автором, исключает универсальность исследования в одном эксперименте различных пробиотических культур. Высока погрешность при визуальном анализе наличия роста и определении МИК.

Помимо метода серийных разведений, чувствительность пробиотических микроорганизмов к антибиотикам оценивается с помощью диско-диффузионного метода. Было проведено исследование чувствительности пробиотических лактобацилл к наиболее часто применяемым в практике врача антибиотикам. В предварительно растопленный МРС-агар были внесены суспензии исследуемых лактобацилл. Для исследования были использованы стандартные диски, пропитанные антибиотиками, которые размещали на поверхности МРС-агара. Результаты оценивали по зонам задержки роста бактериальных культур вокруг дисков с антибиотиками. (Бруслик Н.Л. и др. Оценка лекарственной устойчивости пробиотических лактобацилл // Антибиотики и химиотерапия. - 2015. - Т. 60. - №. 3-4. - С. 6-13). Метод позволяет исследовать только лактобациллы, трудоемок, так как необходимо перемешивание культур в питательном агаре при узком диапазоне температур.

Определение чувствительности про биотического штамма E.coli к желчи и соляной кислоте проводилось в ветеринарной исследовательской работе. Штамм E.coli культивировали в мясопептонном бульоне с добавлением 1,5, 10, 20, 30 и 40% медицинской желчи, полученной у крупного рогатого скота. Пробы культивировали в течение 24 и 48 часов. Количество жизнеспособных колониеобразующих единиц оценивалось в результате высева разведений образца на мясопептонный агар, по количеству выросших колоний микроорганизма. Также штамм культивировали в мясопептонном бульоне, содержащем 0,1%), 0,2%, 0,5%, 0,8%), 1,0%, 1,2%, 1,5%, 1,8%, 2,0%) и 2,5% соляной кислоты. Посевы инкубировали в течение 24 и 48 часов. Результат оценивали фотокалориметрически по изменению оптической плотности бульонных культур (Бияшев К.Б., Киркимбаева, Ж.С. Бияшев Б.К., Б.К. Ермагамбетова, С.Е. Жолдасбекова, А. Устойчивость аттенуированного штамма е. coli 64 г к желчи и соляной кислоте. - 2013 http://acagor.kz:8080/xmlui/handle/123456789/64). Метод трудоемкий и длительный, не позволяет оценить устойчивость к желчи и соляной кислоте других пробиотических микроорганизмов, кроме E.coli.

Succi М. и соавторами предложен метод серийных разведений в жидкой среде с контролем жизнеспособности для выявления чувствительности пробиотических лактобацилл к желчи и соляной кислоте (Succi М. et al. Bile salt and acid tolerance of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from Parmigiano Reggiano cheese // FEMS microbiology letters. - 2005. - T. 244. - №. 1. - C. 129-137.). Культивирование бактерий проводили в MRS-бульоне с добавлением разных концентраций желчи и соляной кислоты в течение 48 часов, с многоэтапным контролем количества жизнеспособных лактобацилл, которые культивировали на MRS-arape 7 дней.

Китаевской С.В. с соавторами (Китаевская С.В. Современные тенденции отбора и идентификации пробиотических штаммов молочнокислых бактерий // Вестник Казанского технологического университета. - 2012. - Т. 15. - №. 17. - С. 184-188.) предложен метод оценки выживаемости исследуемых лактобацилл при стрессовых значениях рН и в присутствии желчи, соляной кислоты в максимальных концентрациях, с которыми встречаются клетки бактерий в кишечнике.

Указанные методы нацелены на поиск устойчивых к лекарственным препаратам штаммов, которые обладают большей эффективностью и преимуществом перед чувствительными к действию желчи и соляной кислоты полезным бактериям. Однако каждый из них отличается трудоемкостью, длительностью проведения и отсутствием количественных критериев оценки.

При использовании цитостатиков следует оценивать не только их влияние на представителей микробиоты, патогенных и условно-патогенных микробов (Bodet 3rd С.A., Jorgensen J. Н., Dratz D. J. Antibacterial activities of antineoplastic agents // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1985. - T. 28. -№. 3. - С 437-439.), но и устойчивость к ним пробиотических штаммов, вводимых для нивелирования побочных эффектов химиотерапии. Известно несколько методов определения чувствительности микроорганизмов к цитостатикам (табл. 2).

В исследовании 1985 года авторы (Bodet С.A., Jorgensen J. Н., Drutz D. J. Antibacterial activities of antineoplastic agents // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1985. - T. 28. - №. 3. - С 437-439.) изучали антибактериальную активность химиопрепаратов в отношении 101 изолята аэробных и анаэробных микроорганизмов, представляющих микробиоту человека и отдельные условно-патогенные микроорганизмы.

В основе исследования лежал метод серийных разведений антимикробного агента в питательном агаре. Для культивирования аэробных бактерий авторами был выбран агар Мюллера-Хинтона с добавлением 5% бараньей крови, для анаэробных бактерий - агар Вилкинса-Чалгрена без добавления крови. Данное исследование не позволяет определять чувствительность к цитостатикам пробиотических и аутопробиотических штаммов бактерий, в частности, лактобацилл и энтерококков, нет возможности оценить МИК цитостатиков. Кроме того, метод достаточно трудоемкий ввиду необходимости разведения химиопрепаратов в питательном агаре в узком диапазоне температур.

В 1984 году была исследована антимикробная активность нескольких цитсотатиков, включая митомицин-С, 5-фторурацил, доксорубицин, метотрексат и др., в отношении грамположительных и грамотрицательных аэробных и анаэробных бактерий, а также грибов Candida albicans. Препараты вводили в состав питательной среды изосенситест агар (с добавлением лошадиной крови при культивировании анаэробов), затем на поверхность наносили культуры микроорганизмов в концентрации 5 lg КОЕ/мл. Результаты роста оценивали полуколичественно по интеренсивности роста культур на поверхности агара. Наибольшая антимикробная активность была отмечена для митомицина-С. (Hamilton-Miller J. М. Antimicrobial activity of 21 anti-neoplastic agents // British journal of cancer. - 1984. -T. 49. - №. 3. - C. 367.)

Метод не позволяет полноценно измерить МИК цитостатиков, а также не предусматривает оценку антимикробной активности химиопрепаратов в отношении пробиотических и аутопробиотических штаммов бактерий.

В исследовании 1993 года V. Peiris и соавторы (Peiris V., Oppenheim В. A. Antimicrobial activity of cytotoxic drags may influence isolation of bacteria and fungi from blood cultures // Journal of clinical pathology. - 1993. - T. 46. - №. 12. - C. 1124-1125.) проводили инокуляцию флаконов с пробами крови больных с добавлением терапевтические дозы цитостатиков циклофосфамида, винкристина и адриамицина тремя 10-кратными разведениями 20-часовых бульонных культур каждого микробного изолята: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus sanguis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans. Количество жизнеспособных микробных клеток в каждом из использованных разведений определяли методом визуального подсчета колоний на чашках с кровяным агаром после высева на него исследуемых проб. В качестве флакона для культивирования крови использовали стеклянный универсальный контейнер с 18 мл питательного бульона. В каждый флакон помещали 1 мл разведенного цитотоксического препарата и 1 мл соответствующей крови пациента. Флаконы инкубировали при 37°С и наблюдали за мутностью с 12-часовыми интервалами в течение 84 часов. По истечении этого времени несколько флаконов, включая контрольные, были подвергнуты субкультивированию, чтобы проверить, что отрицательные флаконы были стерильными, а положительные содержали только привитый организм. Каждую комбинацию микроорганизма-инокулята и цитотоксической концентрации химиопрепарата повторяли три раза для обеспечения воспроизводимости. Регистрировали среднее время до получения положительного результата.

Предложенный Peiris V. с соавторами метод является длительным по времени исполнения, трудоемким и трудновопроизводимым, особенно в практической лаборатории.

Сержантов И.А. с соавторами (Сержантов И.А., Жиркова А.Г., Шаповал О Г. Чувствительность пробиотических штаммов лактобактерий к доксорубицину // Международный журнал экспериментального образования. - 2016. - №. 10-2. - С. 261-262.) изучали чувствительность лактобацилл, выделенных из четырех коммерческих пробиотиков, к химиопрепарату доксорубицину, противоопухолевому антибиотику из группы антрациклинов, использующемуся для лечения многих опухолевых заболеваний - гемобластозов, рака молочной железы, рака легкого, остеогенных сарком, сарком мягких тканей и других. Для этого доксорубицин двукратно разводили в среде Hi Isosensitivity Test Broth (Himedia, Индия) с микробной нагрузкой 5×10⁵ КОЕ/мл с конечным объемом для каждого разведения 5 мл. Пробы инкубировали в аэробных условиях при температуре 370С в течение 48 часов. Затем производили высев образцов на лактоагар с целью выявления бактерицидного или бактериостатического действия химиопрепарата и установления МИК. Установлено, что диапазон минимальных ингибирующих концентраций доксорубицина составил 0,75-3 мкг/мл Метод предусматривает изучение противомикробный активности доксорубицина в отношении только лактобацилл, кроме того, не дается конечная рекомендация по выбору того или иного пробиотика для назначения в ходе химиотерапии. Также метод усложняется ввиду необходимости высева пробиотических лактобацилл после инкубации с цитостатиком для оценки МИК.

Ранее, в 2009 году (Typlyns' ka К.V., Sovetova О.V., Gorchakov V.Y. The adaptation of disk method for express evaluation of resistance to cytostatics // Naukovi visti NTUU-KPI. - 2009. - T. 2009. - №. 4), определяли чувствительность пробиотических штаммов семейства Lactobacillaceae, а также некоторых сапрофитных и условно-патогенных бактерий к цитостатикам доксорубицину, цисплатину и метотрексату с помощью диско-диффузионного метода. Для исследования были использованы питательные среды МРС для лактобацилл и МПА для прочих микроорганизмов. Исследуемые микроорганизмы культивировали в течение 72 часов, после чего оценивали зоны задержки роста культур вокруг дисков, пропитанных цитостатиками. По утверждению авторов, данная методика позволяет отследить чувствительность большого числа пробиотических штаммов к цитостатикам, однако не указывается необходимость с помощью данного метода персонального подбора пробиотиков для пациентов. В данном изобретении впервые предлагается метод индивидуального подбора пробиотика и/или аутопробиотика, который можно рекомендовать для введения пациенту в процессе лечения цитостатиками для нивелирования побочных эффектов последних.

Прототипом изобретения можно считать метод оценки активности цитостатиков в отношении пробиотических и аутопробиотических и референс-штаммов бактерий (Влияние цитостатиков на пробиотические, аутопробиотические и референс-штаммы бактерий / В.В. Орлова, Е.И. Ермоленко, С.А. Ковалис, А.Н. Суворов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2023. - Т. 25, №S1. - С. 44. - EDN MHZXBG). Среди исследуемых штаммов присутствовали также клинические изоляты условно-патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae. Антимикробная активность химиопрепаратов фторурацила, оксалиплатина и лейковорина исследовалась с целью оценки влияния цитостатиков на различных представителей микробиоты кишечника путем капельного нанесения разведений указанных цитостатиков на плотные питательные среды Мюллера-Хилтона и MRS, на поверхности которых были газоном засеяны бактериальные культуры. Проводилось измерение зон задержки роста на месте и вокруг капель цитостатиков, нанесенных в разных концентрациях. Устойчивыми считали культуры с зоной задержки роста менее 10 мм. Метод имеет высокую степень погрешности при визуальной оценке зон задержки роста, а также низкую чувствительность, может использоваться как ориентировочный при сравнении штаммов с ярко выраженными различиями в устойчивости к цитостатикам.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа подбора пробиотических и аутопробиотических штаммов, устойчивых к цитостатикам (фторурацила, оксалиплатина и лейковорина), использующимся при химиотерапии колоректального рака.

Сущность изобретения заключается в том, что проводят выбор устойчивых штаммов пробиотических и аутопробиотических бактерий, которые вводятся перорально пациенту во время курса химиотерапии, не испытывая существенного воздействие на их рост фторурацила, оксалиплатина и лейковорина.

Способ реализуется следующим образом. Предварительно выращивают чистые культуры аутопробиотических и пробиотических штаммов на MRS агаре и полученную биомассу бактерий разводят в изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации 8 lg КОЕ/мл, используя стандарт мутности Макфарланда 0,5.

В лунки плоскодонного (96-луночного или другого) планшета, вносят 90 мл среды с цитостатиком (либо без него, в случае положительного и отрицательного контроля). При этом в каждую лунку, за исключением отрицательного контроля вносят с десятикратно разведенные цитостатики (фторурацил, оксалиплатин и лейковорин) для создания концентраций 0,5 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,005 мг/мл и 0,0005 мг/мл каждого препарата отдельно. Затем в лунки вносят также суспензии чистых культур в количестве 5% от общего объема среды, проводят культивирование в планшете в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов, после чего при помощи спектрофотометрии с длиной волны 630 нм измеряют оптическую плотность проб, сравнивают их с оптической плотностью проб, не содержащих цитостатиков, определяют для каждого цитостатика минимальную ингибирующую концентрацию, изменившую оптическую плотность среды при росте индигенных или пробиотических чистых культур не более, чем на 10%, по сравнению контролем (рост культур без добавления химиопрепаратов) и выбирают для терапевтических целей бактериальные культуры, проявившие максимальную устойчивость ко всем цитостатикам.

Пример 1.

Проведено сравнительное исследование пробиотических и аутопробиотических штаммов бактерий к цитостатикам, позволившее дать рекомендации по выбору штаммов, наиболее устойчивых к цитостатикам при химиотерапии КРР.

Предварительно были приготовлены инокулюмы чистых культур пробиотических штаммов энтерококков и лактобацилл, а также аналогичных таксонов аутопробиотических штаммов, выделенных из фекалий пациентов с колоректальным раком, получая таким образом четыре вида чистых культур. Эти культуры были выращены (11 аутопробиотических и 2 пробиотические культуры лактобацилл, а также 9 аутопробиотических и 2 пробиотичские культуры энтерококков) на MRS агаре, разведены в изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации 8 lg KOE/мл, затем в каждую лунку плоскодонного 96 луночного планшета для микрокультивирования последовательно были внесены по 90 мкл MRS бульона, раздельно десятикратные разведения цитостатиков, а именно фторурацила, оксалиплатина и лейковорина, а также суспензии чистых культур в количестве 5% от общего объема среды. После культивирования планшета в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов в аэробных условиях при помощи спектро фотометрии с длиной волны 630 нм были проанализированы показатели оптической плотности проб, сравнивают их с оптической плотностью проб, не содержащих цитостатиков. Для каждого препарата и отдельно для каждой культуры бактерий были определены МИК. МИК устанавливали по наибольшему разведению цитостатиков, которое изменяло оптическую плотность среды при засеве индигенных или пробиотических чистых культур не более, чем на 10% по сравнению контролем (рост культур без добавления химиопрепаратов). МИК для всех исследованных штаммов пробиотических и аутопробиотических лактобацилл и энтерококков представлены в таблице 3.

Было определено, что пробиотические штаммы бактерий в целом более устойчивы к действию цитостатиков, чем аутопробиотические штаммы. Однако выявлены существенные штаммовые различия в устойчивости к химиопрепаратам. Энтерококки оказались более устойчивы к действию используемых цитостатиков, особенно к оксалиплатину, по сравнению с лактобациллами, как показано в табл. 4.

Все исследованные штаммы бактерий оказались устойчивы к действию лейковорина, что указывает на наименьшую противомикробную активность у данного химиопрепарата, по сравнению с другими. Наиболее устойчивыми штаммами E.faecium L3 и Lactiplantibacillus plantarum 8R-A3 (пробиотик «Лакто бактерии»).

Пример 2.

У пациента У., возраст 47 лет, с диагнозом колоректального рака, состоянием после оперативного вмешательства по удалению опухоли назначено химиотерапевтическое лечение. До проведения операции у пациента был выделен аутопробиотический энтерококк Е. faecium №А1240, для которого характерны наиболее высокие МИК цитостатиков (0,5, 5 и 5 мг/мл для фторурацила, оксалиплатина и лейковорина, соответственно) среди аутоштаммов. Высокие МИК химиопрепаратов также были отмечены для промышленных пробиотических штаммов L.plantarum 8R-A3 и E.faecium L3, однако для терапии был выбран более физиологичный для пациента аутопробиотический штамм энтерококка. Больной был успешно пролечен данным аутопробиотиком в дозе 8 lg КОЕ/мл, получил 2 курса: первый курс начат на 3 день после оперативного вмешательства, затем 20 дней перерыв и 2 курс - с первого дня химиотерапии, продолжительность каждого курса составила 10 дней. Был использован аутопробиотик в жидкой форме.

На фоне приема индигенного Е. faecium у пациента первый самостоятельный стул нормальной консистенции (4 типа по Бристольской шкале) после операции появился на 4 день, что считается быстрым восстановлением стула после резекции толстой кишки. Прим аутопробиотика позволил обеспечить стабильность состояния пищеварительной системы на фоне химиотерапевтического лечения: не отмечено ухудшения по результатам опросников для оценки диспепсии (шкала оценки гастроэнтерологических жалоб (GSRS - Gastrointestinal Simptom Rating Scale) и шкала гастроинтестинальных симптомов диспепсического типа (Gastrointestinal Symptom Score - GIS) [Revicki DA, Wood M, Wiklund I, Crawley J. Reliability and validity of the Gastrointestinal Symptom Rating Scale in patients with gastroesophageal reflux disease. Qual Life Res. 1998 Jan; 7(1):75-83. doi: 10.1023/a:1008841022998. PMID: 9481153, Adam B, Liebregts T, Saadat-Gilani K, Vinson B, Holtmann G. Validation of the gastrointestinal symptom score for the assessment of symptoms in patients with functional dyspepsia. Aliment Pharmacol Ther. 2005 Aug 15;22(4):357-63. doi: 10.1111365-2036.2005.02572.x. PMID: 16098003]. Пациент отметил переносимость химиотерапевтического лечения как удовлетворительную, при обследовании повышения АЛТ, ACT, признаков мукозита и/или учащения стула более 3 раз в день в течение нескольких дней подряд зафиксировано не было. На третий день лечения были отмечены диарея до 3-5 раз в сутки, на 1 час - сужение полей зрения, урчание, вздутие живота, которые купировались самостоятельно и были расценены как побочные эффекты химиотерапии.

Анализ состава фекальной микробиоты методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) показал значимое улучшение состояния пациентов. На фиг. 1-2 представлен образец заключения о составе фекальной микробиоты пациента У. На фиг. 1 до терапии и на фиг. 2 после терапии.

Второй курс химиотерапии пациент получил без аутопробиотической поддержки, на второй день курса появились диарея до 15-20 раз в сутки, боль в животе, признаки мукозита. Для стабилизации состояния пациент госпитализирован.

Данный клинический случай демонстрирует высокую эффективность индигенных энтерококков в отношении снижения частоты и выраженности побочных эффектов химиотерапевтического лечения, что дополнительно подчеркивает важность коррекции нарушений кишечной микробиоты у пациентов с КРР во время курса терапии комплексом цитостатиков FOLFOX.

Пример №3.

У пациента И., возраст 54 года, с диагнозом колоректального рака, состоянием после оперативного вмешательства по удалению опухоли назначено химиотерапевтическое лечение. До проведения операции у пациента был выделен аутопробиотический энтерококк Е. faecium API5, для которого характерны относительно высокие значения МИК для оксалиплатина и лейковорина, 0,5 и 5 мг/мл, соответственно), но низкие - для фторурацила (0,0005 мг/мл). В связи с этим пациенту вместо индигенных штаммов энтерококков назначен промышленный штамм Е. faecium L3, обладающий высоким спектром устойчивости к цитостатикам, МИК ко всем цитостатикам 5 мг/мл. Больной был успешно пролечен данным пробиотиком в дозе 8 lg КОЕ/мл, получил 2 курса: первый курс начат на 3 день после оперативного вмешательства, 2 курс - с первого дня химиотерапии, продолжительность каждого курса составила 10 дней. Был использован пробиотик в жидкой форме.

На фоне приема Е. faecium L3 у пациента первый самостоятельный стул нормальной консистенции (3 типа по Бристольской шкале) после операции появился на 5 день, что считается быстрым восстановлением стула после резекции толстой кишки. На фоне приема пробиотика проявления кишечной диспепсии после операции по шкале оценки диспепсии GIS составили 2 балла из 40 возможных [Revicki DA, Wood М, Wiklund I, Crawley J. Reliability and validity of the Gastrointestinal Symptom Rating Scale in patients with gastroesophageal reflux disease. Qual Life Res. 1998 Jan;7(l):75-83. doi: 10.1023/a:1008841022998. PMID: 9481153, Adam B, Liebregts T, Saadat-Gilani K, Vinson B, Holtmann G. Validation of the gastrointestinal symptom score for the assessment of symptoms in patients with functional dyspepsia. Aliment Pharmacol Ther. 2005 Aug 15; 22(4):357-63. doi: 10.1111/j. 1365-2036.2005.02572.x. PMID: 16098003], а по данным шкалы оценки гастроэнтерологических жалоб суммарный балл составил 16 из возможных 105.

Прием пробиотика совместно с первым курсом химиотерапии позволил обеспечить стабильность состояния пищеварительной системы на фоне химиотерапевтического лечения: не отмечено статистически значимого ухудшения по результатам опросников для оценки диспепсии (GSRS-Gastrointestinal Simptom Rating Scale) и шкала гастроинтестинальных симптомов диспепсического типа (Gastrointestinal Symptom Score - GIS). Пациент отметил переносимости химиотерапевтического лечения как удовлетворительную, при обследовании повышения АЛТ, ACT больше, чем в 2 раза от верхней границы нормы, признаков выраженного мукозита и/или учащения стула более 3 раз в день в течение нескольких дней подряд зафиксировано не было.

Анализ состава фекальной микробиоты методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) показал значимое улучшение состояния пациента. На фиг. 3-4 представлен образец заключения о составе фекальной микробиоты пациента И. На фиг. 3 до терапии и на фиг. 4 после терапии.

Данный клинический случай демонстрирует эффективность персонифицированного подхода к выбору пробиотического препарата для комплексной терапии с целью уменьшения осложнений КРР, связанных с операцией и химиотерапевтическим лечением. В данном случае при наличии вероятности инактивации индигенного штамма цитостатиками для пациента был выбран промышленный пробиотик Е. faecium L3, который показал высокую эффективность в профилактике послеоперационных осложнений и негативных последствий приема цитостатиков. Это дополнительно подчеркивает важность коррекции нарушений кишечной микробиоты у пациентов с КРР устойчивыми к цитостатикам пробиотическими или аутопробиотическими штаммами, которые можно использовать во время химиотерапии.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ подбора пробиотических и аутопробиотических штаммов микроорганизмов по устойчивости к цитостатикам при терапии колоректального рака, заключающийся в том, что предварительно готовят инокулюмы чистых культур пробиотических штаммов энтерококков и лактобацилл и аналогичных таксонов аутопробиотических штаммов, выделенных из фекалий пациентов с колоректальным раком, выращивают на MRS агаре, разводят в изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации 8 lgКОЕ/мл, затем в каждую лунку плоскодонного планшета для микрокультивирования последовательно вносят MRS бульон, раздельно десятикратные разведения цитостатиков: фторурацила, оксалиплатина и лейковорина, и суспензии чистых культур в количестве 5% от общего объема среды, культивируют 24 ч при 37°С и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 630 нм, сравнивают с оптической плотностью проб, не содержащих цитостатиков, определяют для каждого цитостатика минимальную ингибирующую концентрацию, изменившую оптическую плотность среды при росте индигенных или пробиотических чистых культур не более чем на 10%, и выбирают для терапевтических целей бактериальные культуры, проявившие максимальную устойчивость ко всем цитостатикам. Изобретение обеспечивает индивидуальный подбор пробиотика и/или аутопробиотика для введения пациенту при лечении цитостатиками. 4 ил., 4 табл., 3 пр.

Способ подбора пробиотических и аутопробиотических штаммов микроорганизмов по устойчивости к цитостатикам при терапии колоректального рака, заключающийся в том, что предварительно приготавливают инокулюмы чистых культур пробиотических штаммов энтерококков и лактобацилл, а также аналогичных таксонов аутопробиотических штаммов, выделенных из фекалий пациентов с колоректальным раком, получая таким образом четыре вида чистых культур, выращивают их на MRS агаре, разводят в изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации 8 lgКОЕ/мл, затем в каждую лунку плоскодонного планшета для микрокультивирования последовательно вносят MRS бульон, раздельно десятикратные разведения цитостатиков, а именно фторурацила, оксалиплатина и лейковорина, а также суспензии чистых культур в количестве 5% от общего объема среды, проводят культивирование в планшете в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего при помощи спектрофотометрии с длиной волны 630 нм измеряют оптическую плотность проб, сравнивают их с оптической плотностью проб, не содержащих цитостатиков, определяют для каждого цитостатика минимальную ингибирующую концентрацию, изменившую оптическую плотность среды при росте индигенных или пробиотических чистых культур не более чем на 10%, и выбирают для терапевтических целей бактериальные культуры, проявившие максимальную устойчивость ко всем цитостатикам.