ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus atropheus - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/26 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/57 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки воды и почвы от нефти.

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (SU 1493666), Flavobacterium tirrennicum (SU 1409594), которые осуществляют деструкцию нефтепродуктов в воде, но не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы Acinetronacter sp. НВ-1 (RU 2077579); Acinetronacter sp. JN-2 (RU 2064017), Pseudomonas alcaligenes E7 (RU 2134723), Pseudomonas putida 36 (SU 1076446), пригодные для очистки почвы от нефти, но процесс утилизации резко замедляется при понижении температуры ниже 20°C, что затрудняет их использование в условиях Севера.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (RU 2019527), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Bacillus atropheus IPNG-ELA-2, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур (от +8 до +30°C).

Штамм бактерий Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 выделен из нефтезагрязненной почвы территории Филиала Амгинской нефтебазы (п.Амга, Амгинский район, Республика Саха Якутия) с глубины 10 см.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (ВКПМ) (Москва, 1-ый Дорожный пр., д.1) под регистрационным номером ВКПМ В-10592.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки.

Грамположительные споровые палочки, размером 0,8-1,5 мкм, образующие центрально расположенные эндоспоры, располагаются поодиночке или короткими цепочками.

На мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) с добавлением 1% глюкозы растет в виде крупных, плоских, матовых бежевого цвета колоний, диаметр которых составляет 0,3-6,0 см. Край колоний слабоволнистый, с мелкими развитыми складками в центральной верхней части. Через несколько дней (3-4) колонии выделяют в питательный субстрат коричневый пигмент. В старых культурах колонии также окрашиваются в темный (коричневый) цвет.

На среде Сабуро (масс.%: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3) образует крупные округлые морщинистые колонии кремового или грязно-белого цвета, максимальный диаметр которых составляет 1,5 см.

Штамм растет на минеральной среде Мюнца с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо) следующего состава: (масс.%) KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; KH₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или дизельное топливо - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, в виде суховатых непрозрачных матовых колоний, диаметром 1-3 мм, кремового или грязно-белого цвета.

В мясопептонном бульоне (масс.%: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2) растет в виде морщинистой пленки поверх бульона.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет при температуре от +8 до +37°C, в аэробных условиях. В анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. Оптимум роста +30°C. Растет при pH 6,0-8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl. Обладает каталазной активностью. Гидролизует желатину и казеин. Лецитиназу не образует. Не гидролизует крахмал. Окисляет глицерол, гликоген, салицин. Не ферментирует D-арабинозу, инулин, маннитол.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или на минеральной среде с нефтью и нефтепродуктами или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при 4°C.

Для хранения штамма можно также использовать метод иммобилизации суспензии микроорганизмов на поверхность цеолитовой крошки фракцией 1,0-3,0 мм. Иммобилизованные микроорганизмы хранят при температуре +4°C в холодильнике в течение 24 месяцев. Контрольные пересевы проводят 4 раза в год (каждые 3 месяца), предварительно эмульгируя фракции цеолита с иммобилизованными бактериями в стерильной дистиллированной воде (1 г цеолитовой крошки с иммобилизованными микроорганизмами на 9 мл стерильной воды). Посев проводят в чашки Петри на поверхность 3% МПА.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592.

Штамм Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592 выделен из нефтезагрязненной мерзлотной почвы территории Филиала Амгинской нефтебазы ОАО «Саханефтегазсбыт» (п.Амга, Амгинский район, Центральная Якутия) с глубины 10 см, следующим образом:

1,0 г почвы вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца следующего состава (масс.%): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0 08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; вода дистиллированная - остальное; pH среды - 7,2. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду в количестве 0,16 масс.%. Инкубацию проводили 14 суток на термостатируемой качалке УВМТ-12-250 при 200 об/мин и 29±1°C. Рост бактерий наблюдали через 7-10 дней инкубации по образованию беловатой эмульсии и исчезновению маслянистых пятен нефти.

Чистую культуру бактерий получали путем культивирования (при вышеперечисленных условиях) и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с агаром из гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар) с добавлением 1% глюкозы. Посевы инкубировали в стационарных условиях в термостате при температуре +30°С. Через 48 часов на поверхности ГРМ-агара наблюдали появление суховатых кремового оттенка колоний, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам анализа сиквенсов вариабельных участков 16S рДНК идентифицированы, как штамм Bacillus atropheus IPNG-ELA-2.

Пример 2. Приготовление бактериального изолята и препарата на основе клеток штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592

Изолированные колонии, полученные в примере 1, пересевают на скошенный мясопептонный агар и инкубируют 48 часов при температуре +30°C. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M.Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую питательную среду Степина (RU 2053293) следующего состава, мас.%: солянокислый гидролизат казеина - 1,4; экстракт кормовых дрожжей - 0,3; MgSO₄·7H₂O - 0,020; NaCl - 0,4; (NH₄)₆·Mo₇O₂₄·4H₂O - 0,05; дистиллированная вода - остальное, pH 7,3-7,4. Среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин. В стерильных условиях в 100,0 см³ готовой среды вносят 2,0 см³ эмульсии препарата «Перфторан» (ОАО НПФ «Перфторан», Россия) и 10,0 см³ суспензии бактериального изолята и культивируют в колбах на качалке в течение 48 часов, при температуре 29±1°C. Получают жидкую мутноватую культуру клеток штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592, с титром не менее 1×10⁹ клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592 в отношении сырой неочищенной нефти.

В колбочки объемом 200,0 см³, содержащие по 100,0 см³ минеральной среды Мюнца, вносят суспензию бактериального изолята, полученного по примеру 2, доводят концентрацию до 1×10⁹ микробных клеток на 1 см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M.Тарасевича и добавляют 1% нефти.

В качестве контроля используют такую же колбу со средой, нефтепродуктом, но без бактерий (для определения общих (естественных) потерь). Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин, при температурах +8°C; +20°C и +30°C в течение 7 дней.

Содержание нефтепродуктов в среде определяют с помощью концентратометра «ИКН-025» (ФР.1.31.2007.03234). Степень деградации нефтепродуктов рассчитывают как отношение разницы исходного и остаточного содержания нефтепродуктов в воде к их исходному содержанию, выраженное в процентах.

Результаты, приведенные в табл.1, показывают, что в минеральной среде предлагаемый штамм уже на пятый день при температуре +8°C утилизирует 56,4% нефти; при +20°C - 96,5%; при +30°C - 97,13%.

Таблица 1 Степень утилизации нефти через 7 суток культивирования штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592 t°C, + До опыта, мг Через 7 суток, мг Деструкция, % 30 1000,0 28,64 97,13 20 1000,0 34,32 96,56 8 1000,0 405,78 56,42 Контроль 1000,0 1000,0 0,0

Пример 4. Очистка ледовой воды от сырой нефти с помощью клеток штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ ледовой воды, 30 г сырой неочищенной нефти и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 (по примеру 1), содержащего 1,0·10⁹ клеток/см³ суспензии. В качестве контроля используют ледовую воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30 г нефти и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Таблица 2 Динамика деструкции нефти в воде после внесения препарата на основе штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 В-10592 Вариант опыта Количество нефти до внесения клеток штамма, г Количество нефти через 2 месяца после внесения клеток штамма, г Степень утилизации нефти, % Вода + нефть + клетки штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 30 0,4718 98,42 Вода + нефть 30 30 0,0

Эксперимент проводят в течение 2-х месяцев, поддерживая температуру воды в интервале +15-20°C.

Полученные результаты (таблица 2) показали, что в ледовой воде деструкция нефти под влиянием штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 за 2 месяца составила 98,42%. Деструкция в контрольной емкости отсутствовала (таблица 2).

Пример 5. Очистка почвы от нефти с помощью клеток штамма бактерий Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592

Эксперимент по очистке мерзлотной почвы, загрязненной нефтью, проведен в естественных условиях на нефтезагрязненной территории филиала Амгинской нефтебазы ОАО «Саханефтегазсбыт» (п.Амга, Центральная Якутия). Температура почвы, в течение всего периода постановки эксперимента, на глубине 20 см, составляла в среднем +8°C; на глубине 10 см - +14°C.

Жидкий препарат, полученный по примеру 2, содержащий культуру клеток штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592, с титром не менее 1×10⁹ клеток/см³ вносят в почву, загрязненную нефтью из расчета 1 литр препарата на 1 м² нефтезагрязненной почвы с глубиной проникновения нефти до 30 см. Почву тщательно перемешивают с помощью лопаты и экспонируют в естественных условиях в течение 2 месяцев.

Содержание нефтепродуктов в почве определяют в соответствии с (РД 52.18.647-2003. Методические указания определения массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика измерений гравиметрическим методом).

Таблица 3 Динамика деструкции нефти в почве, обработанной препаратом на основе штамма Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 В-10592 Вариант опыта Содержание нефти до внесения штамма, мг/кг Содержание нефти, через 2 месяца после внесения штамма, мг/кг Деструкция нефти за 2 месяца, % Почва + нефть + клетки штамма Bacillus atropheus
IPNG-ELA-2 186079 80343 56,82 Почва + нефть 5960 5561 6,69

Результаты исследований (табл.3) показывают, что предлагаемый штамм Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592 в течение 2 месяцев, при средней температуре почвы +8-14°C, осуществляет деградацию сырой нефти на 56,82% в то время, как естественные потери нефти в мерзлотной почве, не обработанной препаратом, составила 6,69% (таблица 3).

Пример 6. Очистка почвы от дизельного топлива с помощью клеток штамма бактерий Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 ВКПМ В-10592

Эксперимент по очистке мерзлотной почвы, загрязненной дизельным топливом, проведен в естественных условиях на аварийной территории Момского филиала ГУП «ЖКХ в PC (Якутия)» (с.Хонуу, Северо-Восточная Якутия). Температура почвы, в течение всего периода постановки эксперимента, на глубине 20 см, составляла в среднем +8°C; на глубине 10 см - +14°C. Глубина проникновения нефти до 15 см.

Препарат по примеру 2 вносят в почву, загрязненную нефтепродуктом, из расчета 1 литр препарата на 1 м² нефтезагрязненной почвы. Почву тщательно перемешивают с помощью лопаты и экспонируют в естественных условиях в течение 45 дней.

Результаты исследований, приведенные в табл.4, показывают, что через 45 дней деструкция нефтепродуктов составила 89,53%.

Таблица 4 Деструкция дизельного топлива после очистки почвы Вариант опыта pH Влажность, % Содержание нефтепродуктов, мг/кг Деструкция через 45 дней, % до очистки после очистки Почва + дизельное топливо + штамм бактерий Bacillus atropheus IPNG-ELA-2 В-10592 7,01 46,8 23420 2450 89,53 Почва + дизельное топливо 6,99 49,5 25823 21247 17,7

Таким образом, заявляемый штамм достаточно быстро утилизирует нефть и нефтепродукты, в частности дизельное топливо, в воде и почве в широком диапазоне температур (от +8 до +30°C).

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Bacillus atropheus IPNG - ELA-2, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-10592 и может быть использован для очистки воды и почвы от нефти. Изобретение позволяет сократить сроки утилизации нефти и нефтепродуктов. 4 табл., 6 пр.

Штамм бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 - деструктор нефти и нефтепродуктов.