Штамм бактерий Bacillus sp. ВКМ В-2815D - деструктор нефти и нефтепродуктов Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/07 

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм бактерий Bacillus sp. ВКМ B-2815D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в широком диапазоне температур от +10 до +37°С.

Уровень техники.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Zb52 (1. Патент KZ №27045. Штамм бактерий Bacillus subtilis Zb52, предназначенный для биоочистки сточных вод. А4, C12N 1/20, C12N 9/56, C12R 1/125. Заявка: 2012/1351.1. Опубликовано: 14.06.2013, бюл. №6. Авторы: Сармурзина З.С.; Ануарбекова С.С; Кулмамбетова Г.Н.; Алмагамбетов К.Х. Патентообладатель: Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения "Республиканская коллекция микроорганизмов" Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан), предназначенный для биоочистки сточных вод.

Штамм активно расщепляет животные жиры, однако не обладает окисляющей активности по отношению к нефти и нефтепродуктам, что не позволяет оценить его деструктирующую способность по отношению к нефтяным углеводородам.

Известны штаммы: Pseudomonas putida 36 (2. Авторское свидетельство СССР N1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.); Acinetronacter sp. НВ-1 (3. Патент RU N2077579. Штамм бактерий Acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1: 01, C12N 1/20, В09С 101:00. Заявка: 94043331/13, 06.12.1994. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. Авторы: Жиркова Н.А., Кобелев B.C., Холоденко В.П. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии); Pseudomonas alcaligenes Е7 (4. Патент RU N2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробилогии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробилогии).

Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м3 (5. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ").

Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18+22°С, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+10°С).

Известен нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliguefaciens, Micrococcus varians (6. Архипченко И.А., Загвоздкин В.К. Очистка нефтезагрязненных почв с помощью препаратов на основе микробных удобрений // Экология и промышленность России. Спецвапуск. 2004. С. 16-18).

Недостатком является то, что нефтедеструктирующая активность клеток микроорганизмов не достаточна для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis Колыма 7/2 (7. Патент RU №2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. C2. B09C 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти в почве до 0,48% в течение 3 месяцев летнего периода.

Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +10 до +37°С.

В качестве прототипа служат штаммы: Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 (8. Патент RU 2482179. Штамм бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 - деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/57. Заявка №2012114907/10 от 04.2012 г. Опубликовано 20.05.2013 г. Бюллетень №14. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН) и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 (9. Патент РФ №2525930. Штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017-деструктор нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/07. Заявка: 2013113813/10, 27.03.2013. Дата начала отсчета срока действия патента 27.03.2013. Дата подачи заявки: 27.03.2013. Опубликовано: 20.04.14 г. Бюл. №11. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН), обладающие высокой утилизирующей эффективностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Недостатком известных штаммов является то, что для наращивания биомассы из клеток штаммов Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 и Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 требуется специальная среда с добавлением перфторуглеродов в виде дефицитного и дорогостоящего препарата «Перфторан», что не экономично и усложняет процедуру накопления клеточной биомассы штаммов, используемых для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, кроме того, не известна их способность утилизировать бензин и керосин авиационный.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению, как к нефти, так и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +10 до +37°С, которые могут быть использованы для очистки воды и почвы, как от нефти, так и от нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Поставленная задача решена тем, что получен новый бактериальный штамм бактерий Bacillus sp. ВКМ B-2815D, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин).

Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, масло гидравлическое, керосин авиационный, бензин), в широком диапазоне температур от +10 до +37°С, в относительно короткие сроки (7-60 суток).

Заявляемый штамм бактерий Bacillus sp. ВКМ B-2815D (авторский номер LER-1) выделен из мерзлотного нефтезагрязненного почво-грунта, трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь-Тихий Океан» 1351,5 км, Ленский район, Республика Саха (Якутия).

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером ВКМ B-2815D.

Полученный штамм Bacillus sp. ВКМ B-2815D характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Грамположительные палочки с центрально-расположенными овальными спорами.

Культуральные характеристики.

На мясопептонном агаре (МПА) (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2) и ГРМ агаре (на основе гидролизата рыбной муки), масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; рН 7,1-7,5, формирует суховатые, матовые, крупные, непрозрачные, сероватые колонии с неровной шероховатой поверхностью и неровными краями, диаметром до 5 и более мм.

На среде Сабуро (состав, г/л: пептон - 10,0 мальтоза - 40,0; агар - 12,0±2,0; вода очищенная до 1 л), формирует матовые, крупные, непрозрачные, сероватые колонии с неровной шероховатой поверхностью и неровными краями, диаметром до 5 и более мм. Консистенция суховатая.

На агаризованной среде Мюнца (10. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат, бензин, керосин авиационный) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; К₂ НРО₄ - 0,14; КН₂ PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, рН - 7,2, растет в виде серых суховатых колоний диаметром 1-3 мм.

В мясо-пептонном бульоне промышленного производства образует суховатую пленку поверх бульона.

Растет при рН 6,5-8,0 при температуре от +10 до +37±1°С.

Отношение к кислороду: облигатные аэробы.

В анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее.

Используемые источники углерода: сорбит.

Проверенные не используемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия.

Другие проверенные тесты: оксидаза-отрицательный, каталаза-положительный, не декарбоксилирует лизин и орнитин, не способен расщеплять фенилаланин, индол-отрицательный, сероводород не продуцирует, активен в отношении инозита, уреаза-отрицательный, тест с β-галактозидазой - отрицательный.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм не патогенен для растений (проверка на фитотоксичность проведена на семенах овса посевного ( sativa) сорт «Скакун», пшеницы (Triticum) сорт «Приленская-19» и клевера лугового (Trifolium pretense).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном МПА или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

Штамм может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), по адресу: 677980, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, 1.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Bacillus sp. ВКМ B-2815D

Штамм бактерий Bacillus sp. ВКМ B-2815D выделен из мерзлотного нефтезагрязненного почво-грунта методом накопительных культур на минеральной среде с нефтью с последующим пересевом на МПА.

Для этого, соблюдая правила асептики, 1 г почвы, предварительно просеянной и освобожденной от корней и других посторонних включений, растирают в ступке и вносят в колбы емкостью 250 мл, с содержанием 100 мл, заранее подготовленной минеральной средой следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное, рН 7,2.

В качестве единственного источника углерода и энергии используют нефть, которую вносят в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды.

Инкубация проводится в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°С.

Рост бактерий наблюдают через 7 суток инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА (масс. %): ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах (+10, +20, +30 и +37 (±1)°С).

Через 72 ч при культивировании штамма при температурах от +10 до +37°С на поверхности МПА наблюдали появление суховатых, матовых, непрозрачных серых колонии с неровной шероховатой поверхностью и неровными краями, диаметром до 5 и более мм., которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SpPHK и ключевых фенотипических признаков, согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (11. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.). идентифицированы, как штамм Bacillus sp.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Результаты определения родовой принадлежности штаммов и процента сходства с ближайшими известными видами, представлены в таблице №1.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Bacillus sp. ВКМ B-2815D

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевают на скошенный МПА и инкубируют 48-72 часов при температуре +20±1°С. Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду с нефтью (нефтепродуктами) следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; К₂НРО₄ - 0,14; КН₂РО₄ - 0,06; нефть (нефтепродукты) - 1,0; вода дистиллированная -остальное; рН среды - 7,2 и культивируют в колбах в качалочных условиях в течение 48-72 часов, при температуре плюс 20±1°С, при 200 об/мин.

Получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Bacillus sp. ВКМ B-2815D с титром 1-5×10⁹ клеток/см³, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы или воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Bacillus sp. ВКМ B-2815D

Клетки штамма Bacillus sp. ВКМ B-2815D смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного МПА (по примеру 2), готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Bacillus sp. ВКМ B-2815D культивируют в водной среде с минеральным составом (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти (нефтепродуктов).

Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1×10⁹ клеток/см³.

В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь.

Опыт проводят в трех повторностях.

Колбы культивируют при температурах +10°С; +20°С; +30°С; +37°С в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-0,25» (12. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117. Методка выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-0,25»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм Bacillus sp. ВКМ B-2815D на 7-е сутки культивирования в условиях постоянной аэрации утилизирует от 3,4 до 4,8% - нефти и нефтепродуктов при температуре +10°С; от 43,37 до 47,78% - при температуре +20°С; от 53,7 до 56,97%) - при температуре +30°С; от 63,4 до 65,0% - при температуре +37°С (таблица 2).

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Bacillus sp. ВКМ В-2815D

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре.

В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти (нефтепродукта) и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Bacillus sp. ВКМ B-2815D, приготовленного по примеру 2, содержащего 1,0-10⁹ клеток/см³ суспензии.

В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм с добавлением 30000 мг нефти (нефтепродукта) и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 60 суток, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°С.

Полученные результаты (таблица 3) показали, что в воде, деструкция нефти под влиянием штамма Bacillus sp. ВКМ B-2815D за 60 суток составила 67,55% для нефти и 67,58% для дизельного топлива.

Деструкция в контрольной емкости существенно не изменилась (таблица 3).

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 7 до 60 суток), в широком диапазоне температур от +10 до +37°С, который может быть использован для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, керосин авиационный, бензин).

Изобретение относится к области микробиологии. Штамм бактерий Bacillus sp. LER-1, обладающий способностью утилизировать нефть и нефтепродукты в широком диапазоне температур, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ В-2815D. Штамм бактерий Bacillus sp. ВКМ B-2815D может быть использован для очистки почв и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами при широком диапазоне температур от +10 до +37°С. Изобретение позволяет повысить степень очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. 3 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Bacillus sp. ВКМ B-2815D - деструктор нефти и нефтепродуктов.