СПОСОБ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ И ВОДНОЙ СРЕДЫ СПОРООБРАЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ BACILLUS ATROPHAEUS ВКПМ В-10592 Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/07 

Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к способам очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Для очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов в загрязненные субстраты вносят суспензию штамма бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592. Изобретение позволяет за короткие сроки добиться высокой степени очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов (дизельного топлива).

Уровень изобретения

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (1. Клюшникова T.M., Смирнова Г.Ф., Куберская С.Л., Слабоспицкая А.Т., Залевский B.C., Касаткина Т.П., Елисеева Г.С. Способ очистки подсланцевых сточных вод от нефтепродуктов. А.с. SU №1493666. Заявка №4280617 от 09.07.1987. Опубл. 15.07.1989) и Flavobacterium tirrennicum (2. Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова С.И. Штамм бактерий Flavobacterium tirrennicum. А.с. SU №1409594. Заявка №4066152 от 15.07.1986. Опубл. 15.07.1988), используемые для очистки подсланевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов.

В первом изобретении повышение качества очистки воды от нефтепродуктов осуществляется за счет внесения в сооружения с активным илом культур микроорганизмов, обладающих высокой нефтеокисляющей активностью, хорошей физиологической совместимостью. Способ заключается в том, что в качестве ассоциации используют смесь специально селекционированных штаммов бактерий RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS ВКПМ B-3078 (36а-1), RHODOCOCCUS LUTEUS ВКПМ B-3077 (25) и MICROCOCCUS FLAVUS ВКПМ B-3079 (53) при следующем соотношении культур: (0,5-1,5):(0,5-1,5):(0,5-1,5).

Во втором случае для очистки промышленных вод, загрязненных нефтью, используется штамм бактерий Flavobacterium tirrenicum ВКПМ Б-3369, способный более активно по сравнению с известными штаммами разлагать нефть различного состава. При содержании в 1 л среды 4 г нефти в условиях аэрации после 24 ч с момента введения штамм разлагает 81,1% парафинистой, 40% метано-нафтено-ароматической и 80,3% метано-нафтеновой нефти.

Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы Pseudomonas putida 36 (3. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н. Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. АС СССР № 1076446. Заявка №3474745 от 22.07.1982. Опубл. 28.02.1984); Acinetronacter sp.НВ-1 (4. Жиркова Н.А., Кобелев B.C., Холоденко В.П. ШТАММ БАКТЕРИЙ ACINETOBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент RU №2077579. Заявка №94043331 от 06.12.1994. Опубл. 20.04.1997); Acinetronacter sp.JN-2 (5. Ушков СБ., Ильинская Н.В. ШТАММ ACINETOBACTER SPECIES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент RU №2064017. Заявка №93009595 от 23.02.1993. Опубл. 20.07.1996); Pseudomonas alcaligenes E7 (6. Патент RU №2134723, 1999 г.) и Pseudomonas alcaligenes B-1 (7. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES В-1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ. Патент RU №2133770. Заявка №98105709 от 25.03.1998. Опубл. 27.07.1999).

Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (8. Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.И., Ильинский В.В. СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ. Патент RU 2019527. Заявка 93017464 от 30.04.1993. Опубл. 15.09.1994), но процесс биодеградация нефти при использовании указанного штамма протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры ускоряется.

Близким по существу к заявляемому способу является способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis (9. Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. СПОСОБ ОЧИСТКИ МЕРЗЛОТНЫХ ПОЧВ ОТ НЕФТИ СПОРООБРАЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ BACILLUS SUBTILIS. Патент RU 2446900. Заявка №2010 от 13.07.2010. Опубл. 10.04.2012), обладающими способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, в течение 3-х месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и только в почве в условиях модельного эксперимента и не способен осуществлять очистку водной среды от нефти и утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +8 до +37°C.

Осуществление изобретения

Задачей изобретения является получение способа очистки мерзлотных почв и водной среды не только от нефти, но также и от нефтепродуктов (дизельное топливо) в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +8 до +37°C.

Решение поставленной задачи достигается путем внесения в загрязненные нефтью или нефтепродуктами (дизельное топливо) мерзлотные почвы и водную среду микробного препарата на основе штамма бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592.

Технический результат изобретения достигается следующим образом.

Используют суспензию штамма бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 с содержанием живых клеток в концентрации не менее 1·10⁹ КОЕ/мл.

Штамм бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 депонирован во Всероссийской коллекции непатогенных промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика - ВКПМ, 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В-10592. Штамм бактерий является перспективным для восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв и очистки водной среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельным топливом).

Штамм бактерий может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), 677890, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, дом 1.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение бактериальной суспензии штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592

Штамм бактерий Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 выращивают на мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) при температуре +30°C в течение 2-х суток, затем смывают в 0,9% растворе NaCl в концентрации не менее 1·10⁹ КОЕ/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича. Полученную таким образом бактериальную суспензию штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 используют для очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов.

Пример 2. Определение нефтеокисляющей способности штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592

Бактериальную суспензию штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592, полученную способом, описанным в примере 1, вносят в минерализованную водную среду следующего состава (г/дм³): KNO₃-4,0; MgSO₄·7Н₂O-0,8; NaCl-1,0; K₂ HPO₄-1,4; KH₂ PO₄-0,6; агар-20,0; вода дистиллированная 1,0 дм³, загрязненную нефтью или нефтепродуктами в количестве 1000 мг на 100,0 см³ субстрата, и экспонируют при температурах +8°C; +20°C; +30°C в течение 7 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025» (10. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратометра «ИКН-025»).

Данные эксперимента показывают, что в минерализованной водной среде штамм Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 через 7 суток при температуре +8°C утилизировал 56,4% нефти; при +20°C - 96,5% нефти; при +30°C - 97,13% нефти (таблица 1).

Таблица 1 Степень утилизации нефти и нефтепродуктов в минерализированной водной среде штаммом Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 через 5 суток Вариант опыта t°C Ксенобиотик, мг/дм³ Срок +8 +20 +30 Нефть до опыта 1000,0 1000,0 1000,0

  после опыта 405,78 34,32 28,64   % деструкции 56,42 96,56 97,13

Пример 3. Очистка воды от нефти штаммом Bacillus atropheus ВКПМ В-10592

В эксикатор объемом 3,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, 30 г сырой неочищенной нефти и 30,0 см³ бактериальной суспензии штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592, приготовленного по примеру 1. В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30 г нефти и без внесения бактериальной суспензии штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592.

Таблица 2 Динамика деструкции нефти в воде штаммом Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 Вариант опыта Количество нефти до внесения клеток штамма, г Количество нефти через 2 месяца после внесения клеток штамма, г Степень утилизации нефти, % Вода + нефть + штамм Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 30 0,4718 98,42 Вода + нефть 30 30 0,0

Эксперимент проводят в течение 2-х месяцев, при комнатной температуре (+20 +22°C).

Полученные результаты показали, что в воде деструкция нефти под влиянием штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 за 2 месяца составила 98,42% (табл.2).

Пример 4. Очистка мерзлотной почвы от нефти штаммом Bacillus atropheus ВКПМ В-10592

Эксперимент по очистке мерзлотной почвы, загрязненной нефтью, проведен в условиях открытой экосистемы. Температура почвы, в течение всего периода постановки эксперимента, на глубине 20 см составляла в среднем +8°C; на глубине 10 см - +14°C.

Бактериальную суспензию штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592, полученную по примеру 1, вносят в почву, загрязненную нефтью, из расчета 1 литр суспензии на 1 м² нефтезагрязненной почвы. Почву тщательно перемешивают с помощью лопаты и экспонируют в течение 60 суток.

Содержание нефтепродуктов в почве определяют в соответствии с РД 52.18.647-2003. (11. РД 39-0147098-90 Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома).

Таблица 3 Динамика деструкции нефти в почве, обработанной препаратом на основе штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 Вариант опыта Содержание нефти до внесения штамма, мг/кг Содержание нефти, через 60 суток после внесения штамма, мг/кг Деструкция нефти, % Почва + нефть + штамм Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 186079 80343 56,82 Почва + нефть 5960 5561 6,69

Результаты исследований показывают, что в течение 2 месяцев, при средней температуре почвы +8 +14°C, деградация сырой нефти под влиянием штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 составила 56,82% в то время, как естественные потери нефти в мерзлотной почве, не обработанной препаратом, составила 6,69% (таблица 3).

Пример 5. Очистка мерзлотной почвы от дизельного топлива штаммом Bacillus atropheus ВКПМ В-10592

Эксперимент по очистке мерзлотной почвы, загрязненной дизельным топливом, проведен в условиях открытой экосистемы. Температура почвы, в течение всего периода постановки эксперимента, на глубине 20 см составляла в среднем +8°C; на глубине 10 см - +14°C. Глубина проникновения нефти до 15 см.

Бактериальную суспензию штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592, полученную по примеру 1, вносят в почву, загрязненную дизельным топливом, из расчета 1 литр препарата на 1 м нефтезагрязненной почвы с глубиной проникновения нефти до 15 см. Почву тщательно перемешивают с помощью лопаты и экспонируют в течение 45 дней.

Содержание нефтепродуктов в почве определяют в соответствии с РД 39-0147098-90 (11. РД 39-0147098-90 Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома).

Таблица 4 Деструкция дизельного топлива после очистки почвы штаммом Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 Схема опыта pH Влажность % Содержание НП, мг/кг Деструкция НП через 45 дней, % до очистки после очистки   Почва + дизельное топливо 6,99 49,5 25823 21247 17,7 Почва + дизельное топливо + штамм Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 7,01 46,8 23420 2450 89,53

Результаты исследований показали, что через 45 дней загрязнение в почве очищаемого объекта снизилось в 9,5 раз, деструкция дизельного топлива составила 89,53% (табл.4).

Пример 6. Очистка минерализированной водной среды от дизельного топлива штаммом Bacillus atropheus ВКПМ В-10592

В колбочки объемом 200,0 см³ разливают по 100,0 см³ стерильной водопроводной воды с минеральными компонентами следующего состава (масс.%): KNO₃-0,4; MgSO₄·7H₂O-0,08; NaCl-0,1; K₂ HPO₄-0,14; KH₂ PO₄-0,06; вносят бактериальную суспензию штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592, полученную по примеру 1, в количестве 10-15% от объема воды и добавляют 1% дизельного топлива.

В качестве контроля используют такую же колбу со средой и дизельным топливом, но без бактериальной суспензии (для определения общих (естественных) потерь). Опыт проводят в трех повторностях. Колбы экспонируют в качалочных условиях, при температуре +20°C в течение 7 суток.

Содержание нефтепродуктов в среде определяют с помощью концентратомера «ИКН-025» (10. ФР. 1.31.2007.03234).

Результаты, приведенные в табл.5, показывают, что в воде с минеральными компонентами при температуре +20°C деструкция нефтепродуктов при внесении бактериальной суспензии штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 составила 55,86% за 7 суток.

Таблица 5 Степень утилизации дизельного топлива в минерализованной водной среде под влиянием штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 t°C, + До опыта, мг Через 7 суток, мг Деструкция, % 20 1000,0 558,64 55,86 Контроль 1000,0 1000,0 0,0

Таким образом, подтверждается высокая степень очистки мерзлотных почв и воды от нефти и нефтепродуктов предлагаемым способом.

Преимуществом штамма Bacillus atropheus ВКПМ В-10592 является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам (дизельному топливу) в относительно короткие сроки (от 7 суток до 2-х месяцев) в широком диапазоне температур от +8 до +30°C, который может быть использован как для очистки почв, так и для очистки водной среды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо).

Предлагаемый способ может быть использован для реабилитации нефтезагрязненных территорий в условиях Крайнего Севера.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Выращивают штамм бактерий Bacillus atrophaeus ВКПМ В-10592 и готовят из него суспензию, которую вносят в мерзлотную почву и водную среду. Выдерживают при заданных параметрах от 7 до 60 суток и определяют количественное содержание нефти и нефтепродуктов в мерзлотной почве и водной среде. Изобретение позволяет сократить сроки денатурации нефти и нефтепродуктов и снизить их концентрацию в мерзлотной почве и водной среде. 5 табл., 6 пр.

Способ очистки мерзлотной почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов (дизельного топлива), отличающийся тем, что для очистки загрязненных субстратов используют бактериальную суспензию штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-10592.