СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МОЧЕКАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 G01N27/447 

Изобретение относится к областям медицины, в частности к урологии, нефрологии и курортологии, позволяет своевременно выявлять патологию и назначать соответствующее лечение.

Известен способ определения мочевой кислоты в биологическом образце с использованием специфичности ферментативной реакции и разделительной способности капиллярного электрофореза [патент США №5,858,644]. Способ включает проведение реакций аналита с ферментами с последующим анализом продукта реакции методом капиллярного электрофореза, все это заметно усложняет процесс получения информации. Способ не применен для диагностики мочекаменной болезни и описывает возможность определения ограниченного набора аналитов.

Известен «Способ определения ионов оксалата в моче» [патент РФ №2410692]. Ионы оксалата в моче определяют путем жидкостной хроматографии, анализируемую пробу подщелачивают до рН 10-11, используя колонку с сорбентом силикагель, в качестве элюента используют растворы серной кислоты и ацетонитрила при определенном градиенте концентрации последнего, скорость подачи элюента и его объем определенные, температура хроматографической колонки 35°С. Способ не позволяет точно диагностировать мочекаменную болезнь за счет определения только одного компонента, кроме того, используемый метод является затратным за счет дорогостоящей аппаратуры, больших объемов органических растворителей, наборов колонок с различными сорбентами.

Известен «Способ определения метаболитов мочи (щавелевой, лимонной, мочевой кислот и креатинина) методом капиллярного электрофореза», выбранный за прототип [Munoz J.A., Lopez-Mesas M., Valiente M // Talanta. 2010. V.81. P.392]. Способ описывает электрофоретический метод определения пар оксалат / цитрат и мочевая кислота / креатинин в образцах мочи.

Для анализа используют кварцевый капилляр. Во время анализа используют термостатирование капилляра, ввод пробы осуществляют давлением (30 мбар) 5 сек трижды. Для определения оксалата и цитрата применяют обращенную полярность -30 кВ, для мочевой кислоты и креатинина - положительную полярность +30 кВ. Устанавливают длину волны детектирования: 195 нм (определение оксалата и цитрата), 234 нм (определение мочевой кислоты и креатинина). В качестве пробоподготовки образец мочи разбавляют раствором соляной кислоты (40 ммоль/л) в 5 раз для определения оксалата и цитрата и в 20 раз для определения мочевой кислоты и креатинина; полученные растворы фильтруют через фильтр (пористостью 0,22 мкм). Перед проведением работ осуществляют кондиционирование кварцевого капилляра 2 мин водой и 10 мин буферным электролитом. После каждого анализа промывают кварцевый капилляр 1 мин 0,1 моль/л NaOH, 1 мин водой и 2 мин буферным электролитом. В качестве буферного электролита используют: 50 ммоль/л дигидрофосфат калия, рН 6,5 (доводят с помощью 1 моль/л NaOH). Время анализа пары оксалат/цитрат составляет 9 мин, а пары мочевая кислота/креатинин - 8,5 мин. Недостатком является то, что для точной и достоверной диагностики мочекаменной болезни требуется количественное определение широкого спектра разных маркеров. Кроме того, разработанная методика была применена лишь к 6 образцам мочи здоровых доноров, что не позволяет говорить о диагностике мочекаменной болезни.

Задачей является повышение достоверности и точности ранней диагностики мочекаменной болезни за счет количественного определения выделяющихся с мочой неорганических солей и органических кислот и аминов-маркеров.

Для решения поставленной задачи предложен способ диагностики мочекаменной болезни, включающий выбор в качестве объекта суточной мочи, которую непосредственно перед анализом разбавляют дистиллированной водой, после чего проводят количественный анализ методом капиллярного электрофореза с УФ-детектированием. Предварительно кварцевый капилляр последовательно кондиционируют раствором гидроксида натрия, дистиллированной водой и буферным электролитом, при этом выбирают полярность режима капиллярного электрофореза, длину волны детектирования и состав буферного электролита в зависимости от аналитической формы и структуры маркеров. Далее количественно определяют маркеры и сопоставляют полученные данные со значениями «нормы», после чего диагностируют патологические изменения.

Маркерами мочекаменной болезни являются неорганические соли и органические кислоты и амины (цитрат, оксалат, мочевая кислота (урат), креатинин, аммоний, калий, натрий, магний, кальций, хлорид, сульфат, фосфат).

Для определения цитрата и оксалата выбирают обращенную полярность, длину волны детектирования 190-210 нм и буферный электролит, содержащий:

дигидрофосфат натрия - 180-200 ммоль/л (рН 5,5),

ацетонитрил - 2-5% по объему буферного электролита.

Ввод пробы осуществляют гидродинамически 50 мбар 30 с.

Для определения мочевой кислоты и креатинина выбирают нормальную полярность, длину волны детектирования 220-230 нм и буферный электролит, содержащий дигидрофосфат натрия - 50-60 ммоль/л (рН 6,0). Ввод пробы осуществляют гидродинамически 50 мбар, 20 с.

Для определения катионов неорганических солей выбирают нормальную полярность и непрямое детектирование при длине волны 250-260 нм и буферный электролит, содержащий:

бензимидазол - 5-7 ммоль/л,

винную кислоту - 30-35 ммоль/л,

18-краун-6 - 2-4 ммоль/л.

Ввод пробы осуществляют гидродинамически 30 мбар 5 с.

Для определения анионов неорганических солей выбирают обращенную полярность и непрямое детектирование при длине волны 250-260 нм и буферный электролит, содержащий:

оксид хрома (VI) - 5-10 ммоль/л,

диэтаноламин - 18-22 ммоль/л,

цетилтриметиламмонийбромид 1,55-1,70 ммоль/л.

Ввод пробы осуществляют гидродинамически 30 мбар 10 с.

Для проведения количественного определения маркеров строят градуировочные зависимости площади пика от концентрации аналита по каждому компоненту пробы [Основы аналитической химии. Золотов Ю.А., М.: Высшая школа, 2000].

Полученные данные (погрешность определения составляет 3-5%) сопоставляют с референсными значениями нормы, при этом диагностируют патологии, связанные с повышением маркеров-промоторов камнеобразования (оксалат, урат, кальций, аммоний, фосфат) и снижением маркеров-ингибиторов камнеобразования (цитрат, магний). Калий, натрий, хлорид, сульфат отвечают за общий солевой фон мочи, а креатинин - за эффективность функции почек.

Большое количество маркеров и их количественные показатели позволят более точно оценить отклонения от нормы в объекте исследования и повысить достоверность ранней диагностики заболевания.

Длину волны детектирования выбирают на основании интенсивности поглощения молекулой УФ-света в конкретном диапазоне длин волн для каждого маркера, а для непоглощающих в УФ-свете маркеров длина волны выбирается на основании интенсивности поглощения компонентов буферного электролита. Роль буферного электролита в зависимости от аналитической формы и структуры маркеров позволяет воздействовать на собственную скорость движения молекул и скорость электроосмотического потока, которые в ряде случаев движутся сонаправленно, а в некоторых разнонаправлено, что позволяет достичь высокой эффективности и селективности разделения.

Совокупность отличительных признаков является существенной и необходимой для выполнения поставленной задачи

Для определения цитрата и оксалата разбавление образца мочи в 5-20 раз обусловлено диапазоном концентраций данных маркеров в моче (0,1-9,0 ммоль/сут). При меньшем разбавлении происходит перекрывание сигналов мешающими матричными компонентами, также поглощающими в данном диапазоне длин волн, при большем разбавлении недостаточно чувствительности для количественного определения оксалата и цитрата.

Длина волны детектирования 190-210 нм обусловлена максимумом поглощения оксалата и цитрата, равным 200 нм.

Дигидрофосфат натрия - 180-200 ммоль/л с рН раствора 6,0 позволяет достичь необходимых условий для определения оксалата и цитрата в режиме обращенной полярности, при которых скорость электроосмотического потока минимальна, а ток достаточно высок. Увеличение концентрации нецелесообразно из-за очень высоких токов и соответственно перегрева кварцевого капилляра, а при уменьшении не достигаются требуемые условия.

Ацетонитрил - 2-5% по объему буферного электролита также влияет на снижение скорости электроосмотического потока. При меньшей концентрации не достигаются требуемые условия, а использование большей нецелесообразно из-за возникновения микроэмульсии.

Для определения мочевой кислоты и креатинина разбавление образца мочи в 20-50 раз обусловлено диапазоном концентраций данных маркеров в моче (0,5-30,0 ммоль/сут). Меньшее разбавление нецелесообразно, а при большем разбавлении недостаточно чувствительности для количественного определения мочевой кислоты и креатинина.

Длина волны детектирования 220-230 нм выбрана на основании значений максимумов поглощения креатинина - 20 нм и мочевой кислоты - 290 нм и выбрана средняя для возможности одновременного детектирования.

Дигидрофосфат натрия - 50-60 ммоль/л в данном случае влияет на 1 скорость электроосмотического потока, этот диапазон обеспечивает: эффективное одновременное определение креатинина в форме катиона и мочевой кислоты в форме аниона. рН раствора 5,5 в данном случае позволяет отделить сигнал креатинина от нейтральных компонентов пробы, элюирующихся вместе с электроосмотическим потоком.

Для определения катионов и анионов неорганических солей разбавление образца мочи в 200-400 раз обусловлено диапазоном концентраций данных маркеров в моче (1-500 ммоль/сут). Меньшее разбавление нецелесообразно, а при большем разбавлении недостаточно чувствительности для количественного определения кальция и магния.

Длина волны 250-260 нм для определения катионов и анионов неорганических солей выбрана на основании максимумов поглощения компонентов буферного электролита, обеспечивающих фоновое поглощение (бензимидазол - 5-7 ммоль/л для катионов и оксид хрома (VI) - 5-10 ммоль/л для анионов).

За рН среды в случае катионов отвечает винная кислота, диапазон концентраций 30-35 ммоль/л обеспечивает достижение требуемого рН 5,0, для анионов - диэтаноламин, диапазон концентраций 18-22 ммоль/л обеспечивает достижение требуемого рН 8,5.

Использование комплексообразующей добавки 18-краун-6 (2-4 ммоль/л) при определении катионов неорганических солей позволяет добиться разрешения сигналов калия и аммония за счет специфических взаимодействий с краун-эфиром. При меньшей концентрации 18-краун-6 не достигается необходимый эффект, а использование большей концентрации нецелесообразно.

Использование поверхностно-активного вещества цетилтриметиламмонийбромида (1,55-1,70 ммоль/л) отвечает за обращение электроосмотического потока за счет модификации поверхности кварцевого капилляра, что позволяет обеспечить электромиграцию анионов к детектору. При меньшей концентрации цетилтриметиламмонийбромида не достигается необходимый эффект, а использование большей концентрации может привести к образованию мицелл.

Заявляемый способ диагностики мочекаменной болезни осуществлен методом капиллярного электрофореза на системе «Agilent 1100 CE-DAD» с диодно-матричным детектором (190-600 нм) с использованием капилляра длиной 400-700 мм, диаметром 50-75 мкм, напряжение на электродах 12-25 кВ, температура кассеты 20-25°С с УФ-детектированием. Образец суточной мочи пациента Х непосредственно перед анализом разбавляют дистиллированной водой. Полученные растворы тщательно перемешивают и дегазируют центрифугированием. Капилляр предварительно кондиционируют по 5 мин раствором гидроксида натрия (1 моль/л) и дистиллированной водой, а затем 10 мин буферным электролитом. Одновременное определение маркеров в суточной моче проводят в режиме капиллярного зонного электрофореза, при этом выбирают полярность режима капиллярного электрофореза, длину волны детектирования и состав буферного электролита в зависимости от аналитической формы и структуры маркеров. Для количественного определения маркеров строят градуировочные зависимости площади пика от концентрации аналита по каждому компоненту пробы [Основы аналитической химии. Золотев Ю.А. М.: Высшая школа, 2000].

Одновременное определение цитрата и оксалата в суточной моче проводят при обращенной полярности. В состав буферного электролита входит дигидрофосфат натрия и ацетонитрил в качестве органической добавки. Время ввода пробы - 30 сек, давление - 50 мбар, напряжение - 12 кВ, температура кассеты 25°С (Таблица 1).

Обработка данных проводится с учетом уравнений градуировочных кривых, разбавления и диуреза (Таблица 2).

Одновременное определение урата (мочевой кислоты) и креатинина в суточной моче проводят при нормальной полярности. В состав буферного электролита входит дигидрофосфат натрия. Время ввода пробы - 20 сек, давление - 50 мбар, напряжение +30 кВ, температура кассеты 20°С (Таблица 3).

Обработка данных проводится с учетом уравнений градуировочных кривых, разбавления и диуреза (Таблица 4).

Одновременное определение катионов неорганических солей (калий, натрий, магний, аммоний, кальций) в суточной моче проводят при непрямом детектировании и нормальной полярности. В состав буферного электролита входит бензимидазол (обеспечивающий фоновое поглощение электролита), винная кислота, 18-краун-6 (наличие комплексообразующего агента 18-краун-6 в составе буферного раствора обеспечивает разделение ионов аммония и калия за счет образования комплексов по типу «гость-хозяин»). Время ввода пробы - 5 сек, давление - 30 мбар, напряжение +20 кВ, температура кассеты 25°С (Таблица 5).

Обработка данных проводится с учетом уравнений градуировочных кривых, разбавления и диуреза (Таблица 6).

Таблица 6 Количественный расчет Маркер Уравнение градуировочной кривой Площадь пика, S Концентрация, ммоль/л, С Разбавление Диурез, л Результат, ммоль/сут Аммоний S=11,067·С 13,69 1,237     371 Калий S=13,092·С 3,36 0,257     77 Натрий S=18,235·С 11,12 0,61 300 1 183 Магний S=43,143·С 0,086 0,002     0,65 Кальций S=39,427·С 0,906 0,023     6,8

Одновременное определение анионов неорганических солей (хлорид, сульфат, фосфат) в суточной моче проводят при непрямом детектировании и обращенной полярности. В состав буферного электролита входит хромат (обеспечивающий фоновое поглощение электролита), диэтаноламин и цетилтриметиламмонийбромид (в качестве поверхностно-активного вещества, обращающего направление электроосмотического потока за счет модификации поверхности кварцевого капилляра). Время ввода пробы - 10 сек, давление - 30 мбар, напряжение - 17 кВ, температура кассеты 20°С (Таблица 7).

Обработка данных проводится с учетом уравнений градуировочных кривых, разбавления и диуреза (Таблица 8).

Приведенные в Таблицах 1, 3, 5, 7 количественные результаты содержания 12-ти маркеров в моче пациента Х позволяют диагностировать следующие патологии: гипероксалурия, гиперурикурия, гиперкальцийурия, гипомагнийурия, гипераммонийурия. Достоверность определения не менее 95%, коэффициент вариации при определении в биообразце не более 5%, а общее время анализа каждой методики, включая пробоподготовку, не более 12 мин.

Таким образом, способ позволяет с высокой достоверностью и точностью проводить раннюю диагностику мочекаменной болезни.

Изобретение относится к областям медицины, в частности к урологии, нефрологии и курортологии, и позволяет своевременно и с большой точностью диагностировать мочекаменную болезнь. Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики мочекаменной болезни, предложен комплексный подход, включающий определение мочевой кислоты, креатинина, цитрата, оксалата, катионов и анионов неорганических солей, включающий пробоподготовку образцов мочи, количественный анализ указанных маркеров методом капиллярного электрофореза с УФ-детектированием в условиях определенной полярности, длины волны детектирования и состава буферного электролита в зависимости от аналитической формы и структуры маркеров с предварительным кондиционированием кварцевого капилляра. Большое количество маркеров и их количественные показатели позволяют более точно оценить отклонения от нормы в объекте исследования и повысить достоверность ранней диагностики мочекаменной болезни. 8 табл., 1 пр.

Способ диагностики мочекаменной болезни, включающий пробоподготовку образцов мочи, количественный анализ маркеров - цитрата, оксалата, креатинина и мочевой кислоты методом капиллярного электрофореза с УФ-детектированием в условиях определенной полярности, длины волны детектирования и состава буферного электролита в зависимости от аналитической формы и структуры маркеров, с предварительным кондиционированием кварцевого капилляра, отличающийся тем, что дополнительно проводят количественный анализ анионов и катионов неорганических солей, при этом для определения цитрата и оксалата проводят разбавление образца мочи в 5-20 раз дистиллированной водой, ввод пробы осуществляют при давлении 50 мбар в течение 30 с, выбирают обращенную полярность, длину волны детектирования 190-210 нм и буферный электролит, содержащий:
дигидрофосфат натрия - 180-200 ммоль/л,
ацетонитрил - 2-5% по объему буферного электролита,
для определения мочевой кислоты и креатинина проводят разбавление образца мочи в 20-50 раз дистиллированной водой, ввод пробы осуществляют при давлении 50 мбар в течение 20 с, выбирают нормальную полярность, длину волны детектирования 220-230 нм и буферный электролит, содержащий, ммоль/л:
дигидрофосфат натрия 50-60,

для определения маркеров катионов неорганических солей проводят разбавление образца мочи в 200-400 раз дистиллированной водой, ввод пробы осуществляют при давлении 30 мбар в течение 5 с, выбирают нормальную полярность, непрямое детектирование при длине волны 250-260 нм и буферный электролит, содержащий, ммоль/л:
бензимидазол 5-7 винную кислоту 30-35 18-краун-6 2-4,
для определения анионов неорганических солей проводят разбавление образца мочи в 200-400 раз дистиллированной водой, ввод пробы осуществляют при давлении 30 мбар в течение 10 с, выбирают обращенную полярность, непрямое детектирование при длине волны 250-260 нм и буферный электролит, содержащий, ммоль/л:
оксид хрома (VI) 5-10 диэтаноламин 18-22 цетилтриметиламмоний бромид 1,55-1,70,
количественное определение маркеров проводят методом абсолютной градуировки и сравнивают полученные результаты со значениями «нормы», после чего при отклонении полученных результатов от значений «нормы» диагностируют мочекаменную болезнь.