ЛИНИИ КЛЕТОК ПОЧКИ СОБАКИ МАЙДИН-ДЭРБИ (MDCK), ПОДДЕРЖИВАЮЩИЕ РОСТ ВИРУСОВ ДО ВЫСОКИХ ТИТРОВ, И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ ЭТИХ КЛЕТОК В БИОРЕАКТОРЕ Российский патент 2013 года по МПК C12N5/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточных технологий и вирусологии. Описаны новые штаммы клеток почки собаки Майдин-Дэрби (MDCK). Штаммы используются для размножения вирусов, в частности вируса гриппа, в культуре клеток до более высокого титра по сравнению с ранее достигавшимися титрами. Клетки MDCK могут быть адаптированы к культуральной среде без сыворотки. Также описан способ получения вирусов гриппа в культуре клеток, в которых используют клетки MDCK по настоящему изобретению. 3 н. и 25 з.п. ф-лы, 20 ил., 20 табл., 14 пр.

1. Линия клеток почки собаки Майдин-Дэрби (MDCK), депонированная в коллекции АТСС под номером РТА-7909 и поддерживающая репликацию адаптированного к холоду вируса гриппа до выраженной десятичным логарифмом величины средней инфицирующей культуру ткани дозы на миллилитр (log₁₀ TCID₅₀/мл), составляющей по меньшей мере примерно 7,8 или выше, или до выраженного десятичным логарифмом количества единиц флуоресцентного фокусирования на миллилитр (log₁₀ FFU/мл), составляющего по меньшей мере примерно 7,8 или выше; причем композиция культуры клеток этой линии включает множество клеток MDCK и среду для культивирования клеток, которая не содержит сыворотки, выбранную из группы, состоящей из сред MediV-105, MediV-105 с добавлением глюкозы, М-32, М-32 с добавлением глюкозы, MediV-107, MediV-107 с добавлением глюкозы.

2. Линия клеток MDCK по п.1, причем клетки MDCK являются агрегированными, неопухолеродными и/или незлокачественными.

3. Линия клеток MDCK по п.1 или 2, причем вирус гриппа аттенуирован.

4. Линия клеток MDCK по пп.1, 2 или 3, причем вирус гриппа чувствителен к температуре.

5. Линия клеток MDCK по любому из пп.1-4, где вирус гриппа включает один или несколько генных сегментов штаммов вируса гриппа A/Ann Arbor/6/60 или B/Ann Arbor/1/66.

6. Линия клеток по п.1, где средой для культивирования клеток является среда MediV-105 или MediV-105 с добавлением глюкозы.

7. Линия клеток почки собаки Майдин-Дэрби (MDCK), депонированная в коллекции АТСС под номером РТА-7910 и поддерживающая репликацию адаптированного к холоду вируса гриппа до выраженной десятичным логарифмом величины средней инфицирующей культуру ткани дозы на миллилитр (log₁₀ TCID₅₀/мл), составляющей по меньшей мере примерно 7,8 или выше, или до выраженного десятичным логарифмом количества единиц флуоресцентного фокусирования на миллилитр (log₁₀ FFU/мл), составляющего по меньшей мере примерно 7,8 или выше; причем композиция культуры клеток этой линии включает множество клеток MDCK и среду для культивирования клеток, которая не содержит сыворотки, выбранную из группы, состоящей из сред MediV-105, MediV-105 с добавлением глюкозы, М-32, М-32 с добавлением глюкозы, MediV-107, MediV-107 с добавлением глюкозы.

8. Линия клеток MDCK по п.7, причем клетки MDCK являются агрегированными, неопухолеродными и/или незлокачественными.

9. Линия клеток MDCK по п.7 или 8, причем вирус гриппа аттенуирован.

10. Линия клеток MDCK по пп.7, 8 или 9, причем вирус гриппа чувствителен к температуре.

11. Линия клеток MDCK по любому из пп.8-10, где вирус гриппа включает один или несколько генных сегментов штаммов вируса гриппа A/Ann Arbor/6/60 или B/Ann Arbor/1/66.

12. Линия клеток по п.11, где средой для культивирования клеток является среда MediV-105 или MediV-105 с добавлением глюкозы.

13. Способ репликации вируса гриппа в системе биореактора однократного применения (SUB), включающий:
(а) культивирование клеток почки собаки Майдин-Дэрби MDCK по любому из пп.1-5 и 7-11 в системе биореактора однократного применения (SUB) в присутствии микроносителя при культуральных условиях, которые предусматривают перемешивание, и продуцирование, таким образом, культивируемых клеток,
(б) инфицирование клеток вирусом гриппа с получением инфицированных клеток,
(в) инкубирование инфицированных клеток в условиях, допускающих репликацию вируса гриппа.

14. Способ по п.13, причем условия для культивирования не являются бессывороточными.

15. Способ по п.14, в условия культивирования включают среду для культивирования клеток, которая выбрана из группы, состоящей из сред MediV-105, MediV-105 с добавлением глюкозы, М-32, М-32 с добавлением глюкозы, MediV-107, MediV-107 с добавлением глюкозы.

16. Способ по п.15, в котором среда для культивирования клеток включает MediV-105 или MediV-105 с добавлением глюкозы.

17. Способ по любому из пп.13-16, где скорость перемешивания составляет от 80 об/мин до 120 об/мин.

18. Способ по п.17, где скорость перемешивания составляет от 90 об/мин до 100 об/мин.

19. Способ по любому из пп.13-18, в котором свежую среду или дополнительные компоненты среды вносят в культуру клеток до, в течение или после стадии (а).

20. Способ по п.19, в котором свежая среда или дополнительные компоненты среды включают протеазу.

21. Способ по п.20, в котором протеазой является сериновая протеаза.

22. Способ по п.21, где протеазой является трипсин.

23. Способ по любому из пп.13-18, в котором некоторое количество среды для культивирования клеток удаляют или не удаляют, и замещают свежей средой перед стадией (б) или на стадии (б).

24. Способ по любому из пп.13-23, в котором стадию (б) проводят при множественности заражения (МЗ) примерно от 0,00001 до примерно 0,003 FFU/клетку.

25. Способ по п.24, в котором стадию (б) проводят при множественности заражения (МЗ) примерно от 0,001 до примерно 0,003 FFU/клетку.

26. Способ по п.13, где протеазу добавляют в биореактор однократного применения до, одновременно с или после этапа (б).

27. Способ по п.26, в котором протеазой является сериновая протеаза.

28. Способ по п.27, где протеазой является трипсин.