Бессывороточная питательная среда для культивирования клеток MDCK или Vero или вакцинных штаммов вирусов кори или гриппа Российский патент 2019 года по МПК C12N5/02 

Область техники

Изобретение относится к технологии получения питательных сред для культивирования клеток и вирусов и может быть использовано в биотехнологической и фармацевтической промышленности для производства вакцин, лечебно-профилактических и диагностических препаратов.

Предшествующий уровень техники Важнейшими условиями успешного культивирования вирусов следует считать подбор соответствующей чувствительной клеточной системы и обеспечение ее высокой жизнеспособности и продуктивности в течение всего срока, необходимого для наработки вируссодержащего материала. Первостепенное значение при этом имеют три обстоятельства: природа и свойства клеток, среды, на которых осуществляется их культивирование, и метод культивирования. После извлечения клеток из ткани или организма и помещения их в культуру культуральная среда должна обеспечивать все внешние условия, которые клетки имели in vivo. Только в этом случае возможны выживание клеток, их пролиферация и дифференцировка. Внеклеточная среда должна обладать всем необходимым для выживания и роста, т.е. обеспечивать клетки питательными и гормональными факторами, а также факторами стромы.

Классические среды для культур клеток были разработаны как среды основные. Питательные среды в подавляющем большинстве включают воду, неорганические соли, низкомолекулярные синтетические вещества, сывороточные или серозные компоненты. Неорганические соли создают необходимое осмотическое давление, ионный баланс, определенный рН и буферную емкость среды. Группа компонентов с низкой молекулярной массой, растворимых в воде, число которых в ряде прописей сред достигает 60, содержит энергетический источник, как правило, глюкозу, необходимые аминокислоты и витамины. В более сложные среды включают также незаменимые аминокислоты, расширяют круг витаминов, вводят коэнзимы, промежуточные метаболиты, микроэлементы. Подбор состава этих компонентов строится на основе учета особенностей метаболизма клеток в культуре и их сбалансированного взаимодействия.

Необходимой составной частью большинства питательных сред продолжает оставаться группа компонентов, входящих в состав сыворотки. Несмотря на длительные усилия многочисленных групп исследователей, создание полностью химически определенной питательной среды, которая была бы способна поддерживать рост разнообразных клеток в течение длительного времени, остается невоплощенной мечтой. Сыворотка необходима как для роста, так и для длительного прикрепления клеток к стеклу/пластику, и выполняет целый набор важных функций: стимулирует усвоение регуляторных молекул; воздействуя на клеточную мембрану, участвует в регуляции плотности культуры и контактной ингибиции; стимулирует синтез ДНК; регулирует внутриклеточное содержание необходимых для роста клеток питательных компонентов; регулирует уровень внутриклеточных циклических нуклеотидов, посредством чего, в частности, стимулирует фосфорилирование ядерных белков; активирует ассоциированные с мембраной системы протеаз; играет роль носителя для низкомолекулярных компонентов и др. Различные клетки могут нуждаться в разных компонентах сыворотки - глобулинах, стероидных гормонах, инсулине, фетуине.

Природа ростовых факторов сыворотки пока не раскрыта, и добавление 5-10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, новорожденных телят, сыворотки лошадей, т.е. сывороток, оказавшихся оптимальными для выращивания клеток и вирусов, остается неизбежной необходимостью. Это особенно беспокоит специалистов по производству вакцин, т.к. в результате вакцинные препараты содержат примеси не только в виде белков сыворотки, но и белки вирусов, контаминирующих сыворотку, а затем и культуры клеток. Кроме потенциальной возможности контаминации, использование сыворотки во время процесса клеточной пролиферации имеют место и др. недостатки, такие, как вариация качества и высокая цена. Поэтому требования чистоты и безопасности биологических продуктов, предъявляемые различными ведомствами, могут быть эффективно достигнуты только с помощью бессывороточных технологий. В связи с этим в последние два десятилетия наблюдается большой прогресс в развитии бессывороточных питательных сред для культур клеток млекопитающих. Использование бессывороточной среды для культивирования клеток позволяет сделать процесс более контролируемым и значительно уменьшить риск контаминации.

Идеальная бессывороточная среда должны иметь определенный химический состав, быть автоклавируемой, поддерживать рост многих видов клеток. Однако универсальной бессывороточной среды для всех типов клеток не существует. Накопленный опыт показывает, что должны быть исследованы потребности для каждой клетки, для каждой культуры и культуральной системы в отдельности. Поэтому для каждого типа клеток разрабатываются специальные среды. Состав используемой культуральной среды является фактором, оказывающим огромное влияние на клеточный метаболизм и, следовательно, на выход вируса. Если состав основных вирусологических питательных сред (MEM, ДМЕМ, 199, F-12, RPMI, 199 и др.) известен и приводится в каталогах большинства коммерческих компаний, то прописи специализированных бессывороточных сред являются предметом собственности компаний (Gibco, JREIbiosciences, HyClone, др.) и недоступны для широкого использования.

Известна питательная среда, не содержащая белки и сыворотку для культивирования клеток млекопитающих (Патент RU 2380412, МПК C12N 5/00, опубл. 27.01.2010 г.) [1], которая включает способ культивирования клеток в синтетической среде 199, RPMI или ДМЕМ/F-12, содержащей дополнительно от 0,1 до 100 г/л гидролизата сои и смесь аминокислот, и повышение продукции рекомбинантных белков клетками за счет использования такой среды.

Недостатком указанной питательной среды является то, что в ней используют такую добавку, как гидролизат сои, который представляет собой смесь аминокислот и низкомолекулярных пептидов, имеет нестандартный состав, вследствие чего каждая серия среды будет отличаться от предыдущей по составу основных компонентов и соответственно от серии к серии среды будут отличаться рост клеток, наработка белка и характеристика готового продукта.

Известны бессывороточные среды MDSS2 для культивирования клеток MDCK и Vero, которые на сегодняшний день являются наиболее перспективным субстратом для производства гриппозных вакцин, причем в составе этих сред используются пептоны животного происхождения (Merten O.-W., Wu R., Couve R. Evaluation of the serum-free medium MDSS2 for the production of poliovirus on Vero cells in bioreactor. Cytotechnology, 1997, v. 25, pp 35-41.) [2]. Использование такой среды позволяет культивировать клетки MDCK и Vero в биореакторах в бессывороточной среде без добавления сыворотки, и таким образом вируссодержащая жидкость свободна от контаминантов, которые могут присутствовать в сыворотке животных.

Однако, пептоны животного происхождения могут содержать белки вирусов, контаминирующих указанную питательную среду.

Известна бессывороточная химически охарактеризованная питательная среда и добавки для культивирования клеток для использования в производстве биопрепаратов (Патент США №9068970, МПК C12N 5/00, опубл. 30.06.2015 г.) [3]. Данная среда может содержать 100 и более компонентов, в т.ч. смесь аминокислот, неорганических соединений, микро- и макроэлементов, сахаров, жирных кислот, витаминов, спермин, спермидин и др. Использование такой среды приводило к росту пролиферации клеток СНО и продуктивности культуры.

Недостатком указанной питательной среды является использование более 100 компонентов в составе питательной среды, в т.ч. дорогостоящих, что соответственно приводит к росту стоимости как самой среды, так и продукта, получаемого с использованием такой среды.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения бессывороточной питательной среды MDSS2N (коммерческое название Axcevir-Vero) для культивирования клеток млекопитающих, где пептон животного происхождения заменен на растительный экстракт. Эта среда эффективно поддерживала рост клеток MDCK и продукцию вируса гриппа, рост клеток BHK-21 и продукцию вируса бешенства, рост клеток Vero и продукцию вируса полиомиелита (Merten O.-W., Kallel Н., Manuguerra J.-C., Tardy-Panit M., Crainic R., Delpeyroux F., Van der Werf S., Perrin P. The new medium NDSS2N, free of any animal protein supports cell growth and production of various viruses. Cytotechnology, 1999, N 30, pp 191-201.) [4].

Недостатком указанного способа является то, что в нем используют такую добавку, как растительный экстракт, который представляет собой смесь аминокислот и низкомолекулярных пептидов, имеет нестандартный состав, вследствие чего каждая серия среды будет отличаться от предыдущей по составу основных компонентов и соответственно от серии к серии среды будут отличаться рост клеток, наработка вируса и характеристика готового продукта.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание более стандартизированной бессывороточной питательной среды для культивирования клеток MDCK и Vero и вакцинных штаммов вирусов кори и гриппа с одинаковыми характеристиками компонентов заявляемой среды и сохранением ростовых свойств и продуктивности выращиваемых культур клеток от серии к серии.

Указанный технический результат достигается тем, что в бессывороточной питательной среде для культивирования клеток MDCK и Vero и вакцинных штаммов вирусов кори и гриппа, согласно изобретения, она содержит натрий хлористый, калий хлористый, кальций хлористый водный, магний хлористый 6-водный, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, D-глюкоза, феноловый красный водорастворимый (аммонийная фенолсульфофталеина) или натриевая соль фенолсульфофталеина, натрий углекислый кислый, пируват натрия, L-цистин, L-тирозин, L-гистидин гидрохлорид, L-изолейцин, L-лейцин, L-метионин, L-фенилаланин, L-треонин, L-триптофан, L-валин, L-лизин гидрохлорид, L-глутамин *, L-аргинин моногидрохлорид, L-пролин, L-аспарагиновая кислота, L-аспарагин, L-аланин, L-цистеин гидрохлорид 0,025, глутатион, холина хлорид, фолиевая кислота, никотинамид, тиамин гидрохлорид Витамин В₁, рибофлавин Витамин В₂, мио-инозитол, пиридоксин гидрохлорид Витамин В₆, цианокобаламин Витамин В₁₂, DL-альфа-Токоферол Витамин Е, олеиновая кислота, инсулин человека рекомбинантный, кадмий хлористый 2,5 водный, кобальт хлористый 6 водный, цинк сернокислый 7 водный, никель (II) сернокислый 7 водный, натрий селенистокислый (двунатриевая соль селеновой кислоты Na₂SeO₃), натрий молибденовокислый 2 водный (NaMoO₄), вода для инъекций или вода очищенная при следующем количественном содержании указанных компонентов (г/литр): натрий хлористый 6,8; калий хлористый 0,4; кальций хлористый 6-водный 0,58; магний хлористый 6-водный 0,2; натрий фосфорнокислый однозамещенный 2- водный 0,16; D-глюкоза 1,0; феноловый красный водорастворимый (аммонийная фенолсульфофталеина) или натриевая соль фенолсульфофталеина 0,02; натрий углекислый кислый 2,2; пируват натрия (0,04-4,0); L-цистин 0,024; L-тирозин 0,036; L-гистидин гидрохлорид 0,042; L-изолейцин 0,052; L-лейцин (0,035-0,077); L-метионин 0,015; L-фенилаланин (0,035-0,072); L-треонин 0,048; L-триптофан (0,035-0,072); L-валин 0,046; L-лизин гидрохлорид (0,035-0,072); L-глутамин (0,1-1); L-аргинин моногидрохлорид 0,126; L-пролин (0,001-1,5); L-аспарагиновая кислота (0,001-1,5); L-аспарагин (0,001-1,5); L-аланин (0,001-1,5); L-цистеин гидрохлорид (0,001-1,5); Глутатион (0,001-1,5); Холима хлорид 0,001; Фолиевая кислота 0,001; Пикотинамид 0,001; Тиамин гидрохлорид Витамин В₁ 0,001; Рибофлавин Витамин В₂ 0,0001; Мио-инозитол 0,002; Пиридоксин гидрохлорид Витамин В₆ 0,001; Цианокобаламин Витамин В₁₂ (0,0001-0,1); DL-альфа-Токоферол Витамин E (0,0001-0,1); Олеиновая кислота (0,000005-0,5); Кадмий хлористый 2,5 водный (0,00001-4,0); Кобальт хлористый 6 водный (0,00001-4,0); Цинк сернокислый 7 водный (0,00001-4,0); Никель (II) сернокислый 7 водный (0,00001-4,0); Натрий селенистокислый (двунатриевая соль селеновой кислоты Na₂SeO₃) (0,00001-4,0); Натрий молибденовокислый 2 водный (NaMoO₄) (0,00001-4,0); Вода для инъекций или вода очищенная до 1 л.

Кроме того, бессывороточная питательная среда дополнительно содержит инсулин человека рекомбинантный в количестве (г/литр) (0,000025-0,025).

Стоимость заявляемой питательной среды сравнима со стоимостью основной вирусологической питательной среды Игла МЕМ, а ростовые свойства и продуктивность клеток для вирусов кори и гриппа сравнимы с применением бессывороточной среды SFM4MegaVir (HyClone, США), используемой в производстве вирусных вакцин.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлены данные о влиянии состава ростовой питательной среды на жизнеспособность клеток MDCK. На фиг. 2 приведены данные о влиянии добавок жирных кислот в ростовой питательной среде на жизнеспособность клеток MDCK. На фиг. 3 приведена диаграмма влияния добавок аминокислот в ростовой питательной среде на жизнеспособность клеток MDCK. На фиг. 4 представлена диаграмма влияния добавок микроэлементов и пирувата натрия в ростовой питательной среде на жизнеспособность клеток MDCK. На фиг. 5 приведена диаграмма влияния на жизнеспособность клеток в зависимости от содержания сыворотки в питательных средах.

Варианты осуществления изобретения Ниже приведены примеры 1-4 составов питательной среды.

Пример 1. Состав бессывороточной питательной среды с оптимальным содержанием компонентов (г/литр):

Натрий хлористый 6,8 Калий хлористый 0,4 Кальций хлористый 6-водный 0,58 Магний хлористый 6-водный 0,2 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,16 D-глюкоза 1,0 Феноловый красный водорастворимый (аммонийная фенолсульфофталеина) или натриевая соль фенолсульфофталеина 0,02 Натрий углекислый кислый 2,2 Пируват натрия 0,055 L-цистин 0,024 L-тирозин 0,036 L-гистидин гидрохлорид 0,042 L-изолейцин 0,052 L-лейцин 0,077 L-метионин 0,015 L-фенилаланин 0,057 L-треонин 0,048 L-триптофан 0,035 L-валин 0,046 L-лизин гидрохлорид 0,072 L-глутамин 0,292 L-аргинин моногидрохлорид 0,126 L-иролин 0,025 L-аспарагиновая кислота 0,025 L-аспарагин 0,025 L-аланин 0,025 L-цистеин гидрохлорид 0,025 Глутатион 0,025 Холина хлорид 0,001 Фолиевая кислота 0,001 Никотинамид 0,001 Тиамин гидрохлорид Витамин В₁ 0,001 Рибофлавин Витамин В₂ 0,0001 Мио-инозитол 0,002 Пиридоксин гидрохлорид Витамин В6 0,001 Цианокобаламин Витамин В₁₂ ,0001 DL-альфа-Токоферол Витамин Е 0,0001 Олеиновая кислота 0,000005 Кадмий хлористый 2,5 водный 0,00013 Кобальт хлористый 6 водный 0,00017 Цинк сернокислый 7 водный 0,000863 Никель (II) сернокислый 7 водный 0,00015 Натрий селенистокислый (двунатриевая соль селеновой кислоты Na₂SeO₃) 0,0005 Натрий молибденовокислый 2 водный (NaMoO₄) 0,00015 Вода для инъекций или вода очищенная до 1 л.

Пример 2. Состав бессывороточной питательной среды с оптимальным содержанием компонентов и добавлением инсулина (г/литр):

Натрий хлористый 6,8 Калий хлористый 0,4 Кальций хлористый 6-водный 0,58 Магний хлористый 6-водный 0,2 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,16 D-глюкоза 1,0 Феноловый красный водорастворимый (аммонийная фенолсульфофталеина) или натриевая соль фенолсульфофталеина 0,02 Натрий углекислый кислый 2,2 Пируват натрия 0,055 L-цистин 0,024 L-тирозин 0,036 L-гистидин гидрохлорид 0,042 L-изолейцин 0,052 L-лейцин 0,077 L-метионин 0,015 L-фенилаланин 0,057 L-треонин 0,048 L-триптофан 0,035 L-валин 0,046 L-лизин гидрохлорид 0,072 L-глутамин 0,292 L-аргинин моногидрохлорид 0,126 L-пролин 0,025 L-аспарагиновая кислота 0,025 L-аспарагин 0,025 Е-аланин 0,025 Е-цистеин гидрохлорид 0,025 Глутатион 0,025 Холима хлорид 0,001 Фолиевая кислота 0,001 Никотинамид 0,001 Тиамин гидрохлорид Витамин B₁ 0,001 Рибофлавин Витамин В₂ 0,0001 Мио-инозитол 0,002 Пиридоксин гидрохлорид Витамин В₆ 0,001 Цианокобаламин Витамин В₁₂ 0,0001 DE-альфа-Токоферол Витамин Е 0,0001 Олеиновая кислота 0,000005 Кадмий хлористый 2,5 водный 0,00013 Кобальт хлористый 6 водный 0,00017 Цинк сернокислый 7 водный 0,000863 Никель (II) сернокислый 7 водный 0,00015 Натрий селенистокислый (двунатриевая соль селеновой кислоты Na₂SeO₃) 0,0005 Натрий молибденовокислый 2 водный (NaMoO,₄) 0,00015 Инсулин человека рекомбинантный 0,005 Вода для инъекций или вода очищенная до 1 л.

Пример 3. Состав бессывороточной питательной среды с минимальным содержанием некоторых компонентов и добавлением инсулина (г/литр):

Натрий хлористый 6,8 Калий хлористый 0,4 Кальций хлористый 6-водный 0,58 Магний хлористый 6-водный 0,2 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,16 D-глюкоза 1,0 Феноловый красный водорастворимый (аммонийная фенолсульфофталеина) или натриевая соль фенолсульфофталеина 0,02 Натрий углекислый кислый 2,2 Пируват натрия 0,04 L-цистин 0,024 Е-тирозин 0,036 L-гистидин гидрохлорид 0,042 L-изолейцин 0,052 L-лейцин 0,035 L-метионин 0,015 L-фенилаланин 0,035 L-треонин 0,048 L-триптофан 0,035 L-валин 0,046 L-лизин гидрохлорид 0,035 L-глутамин 0,1 L-аргинин моногидрохлорид 0,126 L-пролин 0,001 L-аспарагиновая кислота 0,001 L-аспарагин 0,001 L-аланин 0,001 L-цистеин гидрохлорид 0,001 Глутатион 0,001 Холина хлорид 0,001 Фолиевая кислота 0,001 Никотинамид 0,001 Тиамин гидрохлорид Витамин В₁ 0,001 Рибофлавин Витамин В₂ 0,0001 Мио-инозитол 0,002 Пиридоксин гидрохлорид Витамин В₆ 0,001 Цианокобаламин Витамин В₁₂ 0,0001 DL-альфа-Токоферол Витамин Е 0,0001 Олеиновая кислота 0,000005 Кадмий хлористый 2,5 водный 0,00001 Кобальт хлористый 6 водный 0,00001 Цинк сернокислый 7 водный 0,00001 Никель (II) сернокислый 7 водный 0,00001 Натрий селенистокислый (двунатриевая соль селеновой кислоты Na₂SeO₃) 0,00001 Натрий молибденовокислый 2 водный (NaMoO₄) 0,00001 Инсулин человека рекомбинантный 0,000025 Вода для инъекций или вода очищенная до 1 л.

Пример 4. Состав бессывороточной питательной среды с максимальным содержанием некоторых компонентов и добавлением инсулина (г/литр):

Натрий хлористый 6,8 Калий хлористый 0,4 Кальций хлористый 6-водный 0,58 Магний хлористый 6-водный 0,2 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,16 D-глюкоза 1,0 Феноловый красный водорастворимый (аммонийная фенолсульфофталеина) или натриевая соль фенолсульфофталеина 0,02 Натрий углекислый кислый 2,2 Пируват натрия 4,0 L-цистин 0,024 L-тирозин 0,036 L-гистидин гидрохлорид 0,042 L-изолейцин 0,052 L-лейцин 0,077 L-метионин 0,015 L-фенилаланин 0,072 L-треонин 0,048 L-триптофан 0,072 L-валин 0,046 L-лизин гидрохлорид 0,072 1.-глутамин 1,0 L-аргинин моногидрохлорид 0,126 L-пролин 1,5 L-аспарагиновая кислота 1,5 L-аспарагин 1,5 L-аланин 1,5 L-цистеин гидрохлорид 1,5 Рлутатион 1,5 Холима хлорид 0,001 Фолиевая кислота 0,001 Никотинамид 0,001 Тиамин гидрохлорид Витамин В₁ 0,001 Рибофлавин Витамин В₂ 0,0001 Мио-инозитол 0,002 Пиридоксин гидрохлорид Витамин В₆ 0,001 Цианокобаламин Витамин В₁₂ 0,1 DL-альфа-Токоферол Витамин Е 0,1 Олеиновая кислота 0,5 Кадмий хлористый 2,5 водный 4,0 Кобальт хлористый 6 водный 4,0 Цинк сернокислый 7 водный 4,0 Никель (II) сернокислый 7 водный 4,0 Натрий селенистокислый (двунатриевая соль селеновой кислоты Na₂SeO₃) 4,0 Натрий молибденовокислый 2 водный (NaMoO₄) 4,0 Инсулин человека рекомбинантный в количестве (г/литр) 0,025) Вода для инъекций или вода очищенная до 1 л

Ниже приведены результаты исследования бессывороточной среды для культивирования клеток MDCK и Vero и вакцинных штаммов вирусов кори и гриппа.

Изучение жизнеспособности и пролиферативной активности клеток, культивируемых в различных средах

Культивирование клеток. В работе использовали перевиваемые линии клеток почки нормальной взрослой самки коккер-спаниеля MDCK и почки зеленой мартышки Vero из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Культуры клеток культивировали в 96-луночных планшетах (Costar, США) и культуральных флаконах объемом 250 мл, в качестве ростовой питательной среды использовали среду Игла MEM (производство ФБУН ЕНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) с 1-5% сыворотки крови плодов коровы (Gibco, США). После прикрепления клеток проводили смену среды на питательные среды SFM4MegaVir (HyClone, США), RPMI-1640, ДМЕМ, Игла MEM, ДМЕМ/F-12, 199М (производство ФБУН ЕНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) с разным содержанием сыворотки и продолжали культивировать клетки в течение 72 часов.

Конструирование бессывороточных питательных сред. Для получения бессывороточных сред в питательную среду Игла MEM или ДМЕМ/F-12 вводили различные жирные кислоты (янтарная, олеиновая, стеариновая, фумарановая, бегеновая, пальмитиновая, малеиновая, линолевая, кето-глутаровая (Sigma, США) в концентрации 0,000005-0,5 г/л, аминокислоты (серим, цистидин, валин, гистидин, аргинин, треонин, метионин, аспарагин, др. (Panreac, Applichem, Еермания) в концентрации 0,0025-0,08 г/л, микроэлементы, глюкозу, витамины и др. компоненты.

Определение жизнеспособности и пролиферативной активности клеток.

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста. Культуру клеток MDCK в концентрации 5×10³ в 100 мкл среды Игла MEM, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, помещали в 96-луночный планшет (Costar, США) и инкубировали 24 ч при 37°С в СО²-инкубаторе. После прикрепления клеток к подложке проводили смену среды на перечисленные выше питательные среды, клетки инкубировали в течение 48 ч при тех же условиях. Затем в лунки вносили по 5 мкл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (Sigma, США), инкубировали 4 ч. По окончанию инкубации добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида (Вектон, Россия) и определяли жизнеспособность клеток по интенсивности окраски раствора формазана, измеряя его оптическую плотность в лунках на микропланшетном ридере Tecan Sunrise (Tecan, Австрия) при длине волны 492 нм.

Сравнительное изучение пролиферативной активности клеток проводили при культивировании в различных питательных средах с добавлением и без добавления сыворотки. Клетки культивировали во флаконах вместимостью 250 мл (ТРР, Швейцария). Посевная концентрация составляла 1,0×10⁵ клеток в 1 мл, кратность рассева 1:3-1:4. Для пересева культур клеток в качестве диспергента применяли 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор Версена (производство ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в соотношении 1:2. Культуры клеток инкубировали при температуре 37°С в течение 72-96 ч. Оценивали морфологию клеток, индекс пролиферации, сроки формирования и состояние клеточного слоя.

Проведено сравнительное изучение жизнеспособности и пролиферативной активности клеток при культивировании в течение 4-х пассажей в различных поддерживающих питательных средах. В результате проведенных экспериментов было установлено, что максимальная пролиферативная активность клеток в течение 4-х пассажей была зарегистрирована при использовании питательных сред ДМЕМ/F-12 и SFM4MegaVir при разных концентрациях сыворотки (от 0 до 10%), поэтому в дальнейших экспериментах использовали эти питательные среды в качестве контрольных. На фиг. 1 представлены данные о влиянии состава ростовой питательной среды на жизнеспособность клеток MDCK.

Следующим этапом исследовали образцы питательной среды Игла MEM с добавками разных жирных кислот. В качестве контроля использовали среды ДМЕМ/F12 и SFM4MegaVir без добавления сыворотки и с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы, поскольку известно, что жирные кислоты обладают пролиферативным действием на клетки. Были оценены с помощью МТТ-теста такие кислоты, как янтарная, олеиновая, стеариновая, фумарановая, бегеновая, пальмитиновая, малеиновая, линолевая и кето-глутаровая в концентрациях, в тысячу раз превышающих концентрации, используемые в прописях известных питательных сред.

Проводили ряд разведений с шагом в 10. Высокие концентрации жирных кислот показали токсичность для культуры клеток, а концентрации в 0,05-0,005 мг/л оказывали влияние на рост пролиферативной активности клеток. В результате было установлено, что наибольшее влияние на пролиферативную активность клеток оказывала олеиновая кислота. На фиг. 2 приведены данные о влиянии добавок жирных кислот в ростовой питательной среде на жизнеспособность клеток MDCK.

Далее был проведен скрининг аминокислот. Концентрации были взяты в 5 раз больше в среднем от стандартных прописей питательных сред с шагом разведения в 2 раза. Наилучшие результаты показало введение в питательную среду цистеина. При трехкратном увеличении концентрации метионина индекс пролиферации повысился на 0,5 по сравнению с контролем. При двухкратном увеличении концентрации глутамина и триптофана индекс пролиферации увеличился на 0,8 и 0,9 соответствии в сравнении с контролем, а такие аминокислоты, как глицин, гистидин, пролин значительных результатов не показали. На фиг. 3 представлены данные о влиянии добавок аминокислот к ростовой питательной среде на жизнеспособность клеток MDCK.

Было изучено влияние микро- и макроэлементов на жизнеспособность клеток. Влияние добавок оценивали путем подсчета клеток после окрашивания трипановым синим в камере Горяева. Было показано, что введение таких микроэлементов, как железо, магний, медь, марганец, стронций, не влияют на пролиферативную активность клеток, тогда как введение в среду солей кадмия, кобальта, цинка, лития, никеля, селена, молибдена, а также пирувата натрия увеличивает пролиферативную активность клеток. На фиг. 4 представлены данные о влиянии добавок микроэлементов и пирувата натрия к ростовой питательной среде на жизнеспособность клеток MDCK.

Конструирование бессывороточной питательной среды

На основе проведенных исследований был определен состав и изготовлена бессывороточная питательная среда. Питательная среда бессывороточная жидкая представляет собой растворенную в очищенной воде смесь неорганических солей, аминокислот, витаминов, глюкозы, микроэлементов, индикатора фенолового красного и др. компонентов, простерилизованную фильтрованием через систему мембранных фильтров с конечным размером пор не более 0,22 мкм. Питательная среда бессывороточная жидкая антибиотиков и консервантов не содержит.

Для изготовления Питательной среды бессывороточной жидкой применяются следующие ингредиенты (из расчета на 1 л Питательной среды бессывороточной жидкой), приведенные в таблице 1.

Примечания:

* Все реактивы с №1 по №45 могут быть также производства фирм Fluka, Sigma-Aldrich, Amresco, Gibco, Ну Clone, Acros Organics, Merk.

Контроль бессывороточной питательной среды

По показателям качества Питательная среда бессывороточная жидкая соответствует требованиям и нормам, указанным в таблице 2.

Сравнительное изучение жизнеспособности культур клеток MDCK и Vero при культивировании в бессывороточной питательной среде, разработанной ГНЦ ВБ «Вектор», и среде SFM4MegaVir

Сравнительное изучение жизнеспособности клеток в бессывороточной питательной среде, разработанной в ГНЦ ВБ «Вектор», и бессывороточной среде SFM4MegaVir оценивали с помощью МТТ-теста. Показано (фиг. 5), что жизнеспособность клеток в бессывороточной среде, разработанной в ГНЦ ВБ «Вектор», сравнима с коммерческой бессывороточной средой SFM4 MegaVir и превосходит среды Игла MEM и ДМЕМ/F-12.

Сравнительное изучение пролиферативной активности клеток MDCK, культивируемых в средах с добавлением и без добавления сыворотки крови плодов коровы. Проведена оценка пролиферативной активности клеток MDCK, культивируемых в средах с добавлением и без добавления сыворотки крови плодов коровы. Данные приведены в таблице 3.

При культивировании в питательных средах Игла MEM и бессывороточной среде, разработанной в ЕНЦ ВБ «Векторе, с добавлением 5% и 1% сыворотки ростовая активность клеток MDCK сопоставима, клетки формируют монослой на 2-3 сутки роста, монослой состоит из эпителиоподобных клеток с крупными ядрами овальной и крупной формы, в ядре от 1 до 5 ядрышек, цитоплазма мелкозернистая.

При культивировании клеток в среде SFM4 MegaVir с добавлением 5% и 1% сыворотки наблюдается изменение морфологии клеток, клетки увеличиваются в размерах, цитоплазма ячеистая с темными включениями, клетки образуют тяжи, пролиферативная активность культуры снижена.

Культура клеток MDCK, пассируемая в питательной среде Игла MEM без добавления сыворотки, монослой не образовывала, клетки оседали, но не прикреплялись к подложке, при этом наблюдались единичные распластанные и делящиеся клетки, процесс пролиферации отсутствовал. В то же время, использование питательной среды SFM4 MegaVir хотя и приводило к изменению морфологии культуры клеток, монослой был представлен тяжами крупных распластанных на подложке клетках, пролиферативная активность которых составляла 2,0.

Бессывороточная питательная среда, разработанная в ГНЦ ВБ «Вектор», при культивировании клеток MDCK обеспечивает рост клеток, клетки имеют типичную для данной культуры морфологию, формируют монослой на 2-3 сутки роста, сохраняют высокую пролиферативную активность (индекс пролиферации культуры клеток составляет 3,2).

Поскольку культуры клеток MDCK и Vero применяют в качестве субстрата при получении вакцин, а сбор вируссодержащей жидкости проводят многократно каждые 3 суток до тех пор, пока на поверхности подложки сохраняется до 50% клеток, нами были проведены исследования по определению длительности сохранения монослоя. Клетки выращивали в питательной среде Игла MEM с добавлением сыворотки, после образования монослоя через каждые 3 суток проводили смену среды на SFM4 MegaVir или бессывороточную среду, разработанную ГНЦ ВБ «Вектор». В процессе работы было получено 7 сливов. Длительность сохранения монослоя клеток MDCK на подложке была одинаковой как для среды SFM4 MegaVir, так и для бессывороточной питательной среды и составляла 25 суток. При этом морфология клеток не изменялась для бессывороточной среды, в то время как в среде SFM4 MegaVir клетки увеличивались в размерах и образовывали тяжи.

Продукция вакцинного штамма Л-16 вируса кори в клетках Vero в бессывороточной питательной среде, разработанной ГНЦ ВБ «Вектор», и среде SFM4MegaVir

Культуру клеток Vero культивировали в 96-луночных планшетах (Costar, США), в качестве ростовой питательной среды использовали среду Игла МГМ (производство ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») с 5% сыворотки крови плодов коровы (Gibco, США). После прикрепления ростовую среду сливали, клетки заражали вакцинным штаммом вируса кори Л-16 с множественностью заражения 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/0,5 мл и далее продолжали культивирование клеток в питательной среде SFM4MegaVir (HyClone, США) или бессывороточной питательной среде, разработанной ГНЦ ВБ «Вектор». На 8 сутки проводили учет специфической активности вируса кори по цитопатическому действию (ФС.3.3.1.0032.15 «Вакцина коревая культуральная живая»). Полученные результаты представлены в таблице 4. В результате экспериментов было показано (таблица 4), что продукция вируса кори в культуре клеток в бессывороточной среде, разработанной ГНЦ ВБ «Вектор», была сравнима с продукцией вируса в среде SFM4MegaVir и среде Игла MEM, содержащей 5% сыворотки эмбрионов плодов коровы.

Продукция вакцинного штамма вируса гриппа в клетках MDCK в бессывороточной питательной среде и среде SFM4MegaVir

Культуру клеток MDCK культивировали в 96-луночных планшетах (Costar, США), в качестве ростовой питательной среды использовали среду Игла MEM (производство ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») с 5% сыворотки крови плодов коровы (Gibco, США). После прикрепления ростовую среду сливали, клетки заражали вакцинными штаммами вируса гриппа

А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1), А/17/Швейцария/2010/1 (H3N2) и В/60/Пхукет/2013/26 с множественностью заражения 0,01-0,001 ЭИД₅₀/0,5 мл и далее продолжали культивирование клеток в питательной среде SFM4MegaVir (HyClone, США) или бессывороточной питательной среде, разработанной ГНЦ ВБ «Вектор». На 3 сутки проводили учет специфической активности вируса гриппа по цитопатическому действию (ФС.3.3.1.0027.15 «Вакцина гриппозная живая»). Полученные результаты представлены в таблице 5.

В результате экспериментов (таблица 5) было показано, что продукция вируса гриппа в культуре клеток MDCK в бессывороточной среде, разработанной ГНЦ ВБ «Вектор», была сравнима с продукцией вируса в среде SFM4MegaVir и среде Игла MEM, содержащей 5% сыворотки эмбрионов плодов коровы.

Таким образом, результаты экспериментальных данных, представленных в описании к заявке на изобретение, подтверждают достижение заявляемого технического результата заключающегося в создании более стандартизированной бессывороточной питательной среды с одинаковыми характеристиками ее компонентов и сохранением ростовых свойств и продуктивности выращиваемых культур клеток от серии к серии.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к бессывороточной питательной среде, и включает основной компонентный состав питательной среды Игла MEM, а также дополнительно содержит микроэлементы (соли кадмия, кобальта, цинка, никеля, селена, молибдена) в концентрации 0,00001-4,0 г/л, пируват натрия в концентрации 0,04-4,0 г/л, витамины B₁₂ и Е в концентрации 0,0001-0,1 г/л, олеиновую кислоту в концентрации 0,000005-0,5 г/л, цистеин, глютатион, пролин, аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту в концентрации 0,001-1,5 г/л, (всего 45 компонентов), рекомбинантный инсулин человека в концентрации 0,000025-0,025 г/л, а также увеличена концентрация лейцина, фенилаланина, триптофана, лизина до 0,035-0,072 г/л. Бессывороточная питательная среда при культивировании клеток MDCK обеспечивает рост клеток, клетки имеют типичную для данной культуры морфологию, формируют монослой на 2-3 сутки роста, сохраняют высокую пролиферативную активность (индекс пролиферации культуры клеток составляет 3,2). Продукция вируса кори в культуре клеток Vero и вирусов гриппа в культуре клеток MDCK в заявляемой бессывороточной среде сравнима с продукцией этих вирусов в бессывороточиой среде SFM4MegaVir. Изобретение позволяет создать более стандартизированную бессывороточную питательную среду для культивирования клеток MDCK или Vero или вакцинных штаммов вирусов кори или гриппа с целью создания вакцин. 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 табл.

1. Бессывороточная питательная среда для культивирования клеток MDCK или Vero или вакцинных штаммов вирусов кори или гриппа, отличающаяся тем, что она содержит натрий хлористый, калий хлористый, кальций хлористый водный, магний хлористый 6-водный, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, D-глюкозу, феноловый красный водорастворимый (аммонийная фенолсульфофталеина) или натриевую соль фенолсульфофталеина, натрий углекислый кислый, пируват натрия, L-цистин, L-тирозин, L-гистидин гидрохлорид, L-изолейцин, L-лейцин, L-метионин, L-фенилаланин, L-треонин, L-триптофан, L-валин, L-лизин гидрохлорид, L-глутамин, L-аргинин моногидрохлорид, L-пролин, L-аспарагиновую кислоту, L-аспарагин, L-аланин, L-цистеин гидрохлорид 0,025, глутатион, холина хлорид, фолиевую кислоту, никотинамид, тиамин гидрохлорид - Витамин В₁, рибофлавин - Витамин В₂, миоинозитол, пиридоксин гидрохлорид - Витамин В₆, цианокобаламин - Витамин B₁₂, DL-альфа-Токоферол - Витамин Е, олеиновую кислоту, инсулин человека рекомбинантный, кадмий хлористый 2,5-водный, кобальт хлористый 6-водный, цинк сернокислый 7-водный, никель (II) сернокислый 7-водный, натрий селенистокислый (двунатриевая соль селеновой кислоты Na₂SeO₃), натрий молибденовокислый 2-водный (NaMoO₄), воду для инъекций или воду очищенную при следующем количественном содержании указанных компонентов (г/л):

Натрий хлористый 6,8 Калий хлористый 0,4 Кальций хлористый 6-водный 0,58 Магний хлористый 6-водный 0,2 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,16 D-глюкоза 1,0 Феноловый красный водорастворимый (аммонийная фенолсульфофталеина) или натриевая соль фенолсульфофталеина 0,02 Натрий углекислый кислый 2,2 Пируват натрия 0,04-4,0 L-цистин 0,024 L-тирозин 0,036 L-гистидин гидрохлорид 0,042 L-изолейцин 0,052 L-лейцин 0,035-0,077 L-метионин 0,015 L-фенилаланин 0,035-0,072 L-треонин 0,048 L-триптофан 0,035-0,072 L-валин 0,046 L-лизин гидрохлорид 0,035-0,072 L-глутамин 0,1-1 L-аргинин моногидрохлорид 0,126 L-пролин 0,001-1,5 L-аспарагиновая кислота 0,001-1,5 L-аспарагин 0,001-1,5 L-аланин 0,001-1,5 L-цистеин гидрохлорид 0,001-1,5 Глутатион 0,001-1,5 Холина хлорид 0,001 Фолиевая кислота 0,001 Никотинамид 0,001 Тиамин гидрохлорид (Витамин В₁) 0,001 Рибофлавин (Витамин В₂) 0,0001 Мио-инозитол 0,002 Пиридоксин гидрохлорид (Витамин В₆) 0,001 Цианокобаламин (Витамин В₁₂) 0,0001-0,1 DL-альфа-Токоферол (Витамин Е) 0,0001 -0,1 Олеиновая кислота 0,000005-0,5 Кадмий хлористый 2,5-водный 0,00001-4,0 Кобальт хлористый 6-водный 0,00001-4,0 Цинк сернокислый 7-водный 0,00001-4,0 Никель (II) сернокислый 7-водный 0,00001-4,0 Натрий селенистокислый (двунатриевая соль селеновой кислоты Na₂SeO₃) 0,00001-4,0 Натрий молибденовокислый 2-водный (NaMoO₄) 0,00001-4,0 Вода для инъекций или вода очищенная до 1 л

2. Бессывороточная питательная среда по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит инсулин человека рекомбинантный в количестве (г/л) 0,000025-0,025.