МОЛОЧНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ БАКТЕРИЙ-ПРОБИОТИКОВ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой промышленности и касается приготовления питательных сред для культивирования бифидо- и лактобактерий с целью получения биомассы микроорганизмов и дальнейшего ее использования в производстве заквасок для лечебно-профилактических продуктов, а также для производства биологически активных добавок (БАД).

В настоящее время продукты и биологически активные добавки с пробиотическими микроорганизмами занимают ведущее место в комплексе мер, направленных на профилактику и коррекцию нарушений микрофлоры. Значимость пробиотических препаратов и продуктов диктует необходимость разработки новых эффективных недорогих производственных питательных сред для наработки микробной массы. В производстве биологически активных добавок с пробиотиками, а также лечебно-профилактических продуктов и заквасок для них важной является разработка питательной основы для пробиотических микроорганизмов. Такая основа должна включать все основные компоненты, соответствующие потребностям бактерий. Культивирование в такой среде должно способствовать, как минимум, сохранению пробиотических свойств микроорганизмов. Производственная питательная среда должна обеспечивать высокую скорость размножения: для лактобактерий до 5-7 часов и для бифидобактерий до 18 часов, высокую концентрацию жизнеспособных микробных клеток в единице объема среды - не менее 1·10¹⁰ КОЕ/мл, высокую сохранность жизнеспособных микробных клеток - не менее 70-90 суток.

Питательные потребности молочнокислых бактерий весьма разнообразны и связаны с биохимической активностью микроорганизмов. По мере обогащения среды белком повышается способность бактерий сбраживать лактозу, добавление пептонов и пептидов (продукты гидролиза белка) усиливает рост молочнокислых бактерий в значительно большей степени, чем аминокислоты. Следует отметить, что количество аминокислот, требуемое различными молочнокислыми бактериями, непостоянно и зависит от потребностей штаммов. Бифидобактериям больше всего требуются аминокислоты: пролин, серин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Обладая некоторой протеолитической активностью, бифидобактерии могут в небольшой степени дополнительно обеспечить свои потребности в азотистых веществах.

Все питательные вещества в среде должны находиться в легкоусвояемой форме, белки, в частности, в форме гидролизатов, автолизатов. В ряде случаев несовершенная технология получения белковых гидролизатов и автолизатов может привести к появлению в их составе значительного количества пептидов высокой молекулярной массы, аммиака, а также окрашенных примесей, образовавшихся за счет деструкции лабильных аминокислот и взаимодействия с альдегидами. Наличие этих компонентов в среде существенно уменьшает питательную эффективность. Качество белковых гидролизатов в значительной степени обусловливается выбранным способом проведения гидролиза, обеспечивающим требуемую глубину гидролиза, и степенью последующей очистки получаемого гидролизата.

Для наращивания биомассы используются питательные среды различного состава. Известен состав питательной среды для роста бифидо- и лактобактерий, представляющий собой гидролизат молока, в который введены в качестве добавок пептон, хлорид натрия, агар-агар, лактоза, цистеин солянокислый, при следующем соотношении компонентов (Инструкция по приготовлению кисломолочного бифидумбактерина на молочных кухнях. - М.: МЗ РСФСР, 1987, - 11 с.), г/л:

Пептон2,0Хлорид натрия5,00Агар-агар0,75Лактоза10,00Цистеин солянокислый0,10Гидролизат молокаостальное.

Данный состав находит применение в практике для роста бифидо- и лактобактерий.

Однако наряду с дорогой основой - гидролизатом молока он содержит и дорогие добавки, такие как пептон, цистеин солянокислый. Кроме того, данный состав является недостаточно эффективной питательной средой для выращивания бифидо- и лактобактерий.

Известна питательная среда для наращивания биомассы бифидобактерий и лактобактерий на основе гидролизата гороха при следующем соотношении компонентов (Патент РФ №2061037, МПК С12N 1/20, опубл. 27.05.96 г), мас.%:

Пептон0,15-0,25Натрий хлористый0,2-0,4Агар-агар0,075-0,1Лактоза0,5-2,0Гидролизат гороха, разведенный водой до содержания аминного азота 130-150 мг %остальное до 100%.

Приведенный состав имеет низкое содержание низкомолекулярных пептидов и аминокислот (Аминный азот 130-150 мг%), поэтому не обеспечивает наработку биомассы высокой концентрации - не более 10⁸ КОЕ/мл. При этом время наращивания микробной массы (не менее 24 часов), титруемая кислотность и сроки сохранности не соответствуют предъявляемым требованиям.

Известна также питательная среда для накопления биомассы бактерий на основе молочной сыворотки при следующем соотношении компонентов (Патент РФ №2087532, МПК С12N 1/20, опубл. 20.08.97 г), мас.%:

Молочная сыворотка осветленная7,5-10,0Лактоза0,3-0,5Дрожжевой автолизат2,0-3,0D, L-цистеин0,05-0,1NaH₂PO₄·2Н₂O0,7-0,8NH₄Cl0,1-0,15MgSO₄·7H₂O0,015-0,020Агар-агар0,75-0,080ВодаостальноерН7,2-7,4

Среда подобного состава, хотя и дает высокую скорость роста, не имеет достаточного количества питательных веществ (белков, пептидов, аминокислот) для длительной сохранности микробных клеток, что очень важно для препаратов и БАД-пробиотиков. Дополнительным эффектом высоких ростовых показателей является значительное повышение титруемой кислотности, негативно отражающееся на органолептических свойствах конечного продукта. Наличие дорогостоящих компонентов (агар-агар, цистеин) в производстве препаратов и БАД-пробиотиков приводит к повышению себестоимости конечного продукта.

Широко известна кукурузно-лактозная среда (КЛС) для культивирования бифидобактерий и молочнокислых бактерий (ТУ 10-02-02-789-192-95):

Агар-агар2,5 гПептон10 гКукурузный экстракт40 млНатрий лимоннокислый6,6 гМагний сернокислый0,12 гКалий фосфорнокислый двузамещенный2,0Лактоза10 гЦистин солянокислый0,15 г

Однако КЛС не содержит гидролизованных белковых компонентов молока или дрожжевых клеток, что не обеспечивает при культивировании длительных сроков сохранности конечного продукта. Наличие в составе среды нестандартного компонента - кукурузного экстракта обусловливает нестандартность самой среды, а также неудовлетворительные органолептические свойства получаемых БАД и заквасок.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемой является молочная питательная среда для получения жидкого концентрата бифидобактерий, содержащая основу цистеин солянокислый (L-цистин), D(-)-лактозу, гидролизат молочных белков и аутолизат дрожжей и натрий хлористый. В качестве гидролизата молочных белков используют панкреатический гидролизат обрата молока, в качестве аутолизата дрожжей используют ферментативный аутолизат дрожжей, а в качестве основы используют нормализованный по сухому остатку обрат молока при суммарном содержании аминного азота в питательной среде 260-300 мг% при следующем соотношении ее компонентов, мас.% (патент РФ №2169763, МПК C12N 1/20, А61К 35/74, А23С 9/12, опубл. 27.06.2001 г.):

Панкреатический гидролизат обрата молока5,0-7,0Цистеин солянокислый (L-цистин)0,001-0,003D(-)-лактоза0,03-0,09Натрий хлористый0,01-0,05Ферментативный аутолизат дрожжей1,0-2,0Обрат молока (основа), нормализованный по сухому остаткуОстальное до 100%.

В качестве ферментативного аутолизата дрожжей используют аутолизат с показателем аминного азота 350-400 мг%. Обрат молока нормализован по сухому остатку до значения 13,0-14%. Кроме того, в питательную среду дополнительно вносят соевый изолят в количестве по массе 0,2-0,3%. Для активизации соевого изолята в питательную среду дополнительно вводят цитрат натрия в количестве по массе 0,1-0,2%.

Однако панкреатический гидролизат белков обрата молока содержит наряду с высокомолекулярными и низкомолекулярными пептидами частично гидролизованный казеин и другие компоненты, которые плохо усваиваются бактериями, а ферментативный аутолизат дрожжей наряду с витаминами и стимулирующими факторами роста бактерий содержит токсические вещества - продукты ферментативного автолиза, которые не благоприятствуют условиям роста бактерий (Т.М.Эрвольдер, А.В.Гудков и Л.П.Семенова. Воздействие ферментативных гидролизатов на накопление биомассы бифидобактерий. Журн. "Молочная промышленность", N 12, 1980, - с.15-17), вследствие чего снижаются сроки и титр биомассы бифидо- и лактобактерий в процессе хранения.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такой питательной среды, которая обеспечивала бы возможность культивирования как бифидобактерий, так и лактобактерий при более длительных сроках хранения и более высоких титрах биомассы бактерий в процессе хранения.

Указанный технический результат достигается тем, что в молочной питательной среде для получения биомассы бактерий-пробиотиков, содержащей основу в виде нормализованного по сухому остатку обрата молока, цистеин солянокислый (L-цистин) или аскорбиновую кислоту, гидролизат молочных белков и ростовые факторы из дрожжевых клеток, натрий хлористый, согласно изобретения среда дополнительно содержит марганец сернокислый MnSO₄·4H₂O и магний сернокислый MgSO₄·7Н₂О, в качестве гидролизата молочных белков используют ферментативный гидролизат сывороточных белков молока, в качестве ростовых факторов из дрожжевых клеток используют очищенный дрожжевой экстракт при следующем соотношении ее компонентов, мас.%:

ферментативный гидролизат сывороточных белков молока5,0-7,0цистеин солянокислый (Ĺ-цистин) или аскорбиновая кислота0,001-0,002натрий хлористый0,03-0,05марганец сернокислый MnSO₄·4Н₂О0,001-0,005магний сернокислый MgSO₄·7H₂O0,01-0,02очищенный дрожжевой экстракт1,5-2,0Обрат молока (основа), нормализованный по сухому остаткуОстальное до 100%

Молочная питательная среда содержит очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1-2,8%, общего белка не менее 3-4%, ферментативный гидролизат сывороточных белков молока (лактопептон) с показателем общего белка не менее 11%, аминного азота не менее 4%, а обрат молока содержит лактозу в количестве не более 15% и нормализован по сухому остатку до значения 13,0-14,0%.

Суммарный аминный азот в питательной среде содержится в количестве не менее 300 мг.%.

Введение в основу среды ферментативного гидролизата (лактопептон) сывороточных белков молока (лактальбумин и лактоглобулин) обеспечивает обогащение ее смесью высокомолекулярными и низкомолекулярными пептидами, которые являются более эффективными стимуляторами роста бифидо- и лактобактерий, чем, например, панкреатический гидролизат белков (основной компонент - казеин) обрата молока. Сывороточные белки молока по аминокислотному составу близки к белкам женского молока. В сравнении с казеином они более легко подвергаются полному гидролизу, содержат незаменимые серусодержащие кислоты в количестве, соответствующем потребностям человека, в 4 раза больше содержат цистеина и в 19 раз больше триптофана и их использование более предпочтительно в производстве пробиотиков для детей.

Очищенный экстракт дрожжей содержит витамины группы В и стимулирующие факторы роста бифидобактерий, а также оптимальное содержание аминного азота, обеспечивающего наиболее благоприятные условия роста для бифидо- и лактобактерий, и по сравнению с ферментативным аутолизатом дрожжей не содержит токсичные продукты метаболизма дрожжей, угнетающие рост бактерий.

Ощутимое повышение качества дрожжевого экстракта достигается за счет совершенствования технологии его получения - происходит перевод в растворимое состояние 30-50% дрожжевого белка, повышение перевариваемости клеточного белка на 8-10% за счет разрыхления всех слоев клеточной стенки.

Дрожжевой экстракт содержит:

- незаменимые аминокислоты - лизин, метионин, глицин, аланин, гистидин, аспарагиновую кислоту, треонин, глутаминовую кислоту, валин и др.;

- витамины - рибофлавин (В₂), тиамин (В₁), пиридоксин (B₆), цианкобаламин (В₁₂), ниацин (РР);

- протекторные пептиды.

Компонентами, обеспечивающими редуцирующие свойства заявляемой среды, являются, в основном, цистеин или аскорбиновая кислота, а также аминокислоты глутамин и аспарагин, которыми богат очищенный экстракт дрожжей, входящий в состав среды.

Для обеспечения роста и развития молочнокислые бактерии нуждаются в неорганических соединениях, особенно в ионах марганца и ионах магния. Марганец препятствует аутолизу клеток и необходим для нормальных процессов жирового обмена. Mn⁺⁺ и Mg⁺⁺ снимают токсическое действие Zn⁺⁺ при наличии его в среде.

Изобретение позволяет получить высокий начальный титр и увеличить срок хранения без угнетения роста и повышения активной кислотности пробиотических препаратов, полученных с использованием предложенной питательной среды.

Недостаток готовых азотистых веществ в заявляемой питательной среде возмещается добавлением в обезжиренное молоко лактопептона (ферментативный гидролизат сывороточных белков молока) и дрожжевого экстракта. Сывороточные белки молока играют важную роль в наращивании биомассы пробиотических бактерий и формировании качества конечного продукта, поскольку имеют высокое содержание незаменимых и серосодержащих аминокислот. Белки молочной основы (в основном, казеин) характеризуются высокой биологической ценностью и уникальным набором аминокислот, что позволяет улучшить общую сбалансированность аминокислотного состава конечного продукта. Молоко содержит уникальный дисахарид - лактозу, которая оказывает благотворное влияние на состав нормофлоры кишечника. При нагревании молока, например при его стерилизации, лактоза превращается в лактулозу, которая является мощным бифидогенным фактором. В молоке содержится значительное количество макро- и микроэлементов, витаминов. Особенно важен легкоусвояемый кальций молока, витамины A, B₁, В₂, Д, С, каротин.

Ниже приведены примеры составов заявляемой питательной среды.

Пример 1. Минимальное содержание компонентов среды (мас.%):

ферментативный гидролизат сывороточных белков молока5,0цистеин солянокислый (Ĺ-цистин)0,001натрий хлористый0,03марганец сернокислый MnSO₄·4Н₂О0,001магний сернокислый MgSO₄·7H₂O0,01очищенный дрожжевой экстракт1,5Обрат молока (основа), нормализованный по сухому остаткуОстальное до 100%

Пример 2. Среднее содержание компонентов среды (мас.%):

ферментативный гидролизат сывороточных белков молока6,0аскорбиновая кислота0,0015натрий хлористый0,04марганец сернокислый MnSO₄·4Н₂О0,003магний сернокислый MgSO₄·7H₂O0,015очищенный дрожжевой экстракт1,7Обрат молока (основа), нормализованный по сухому остаткуОстальное до 100%

Пример 3. Максимальное содержание компонентов среды (мас.%):

ферментативный гидролизат сывороточных белков молока7,0цистеин солянокислый (Ĺ-цистин)0,002натрий хлористый0,05марганец сернокислый MnSO₄·4Н₂О0,005магний сернокислый MgSO₄·7H₂O0,02очищенный дрожжевой экстракт2,0Обрат молока (основа), нормализованный по сухому остаткуОстальное до 100%

Ниже приведены данные (таблицы 1 и 2) по культивированию бифидобактерий (штамм Bifidobacterium bifidum 791 БАГ) и лактобактерий (штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S) с использованием заявляемой питательной среды и среды-прототипа. Из указанных таблиц видно, что титр как бифидобактерий, так и лактобактерий после культивирования с использованием заявляемой питательной среды в несколько раз выше, чем с использованием среды-прототипа, а время культивирования соответственно меньше.

Таблица 1Титр лактобактерий и активность кислотообразования при культивировании в заявляемой питательной среде№ п/пСостав средыНачальный титр, КОЕ/млКислотность, °TВремя сквашивания, час1Пример 11,2·10¹⁰1154,02Пример 22,5·10¹⁰1203,53Пример 31,5·10¹⁰1264,04Среда-прототип7,0·10⁹1075,0Таблица 2Титр бифидобактерий и активность кислотообразования при культивировании в заявляемой питательной среде№ п/пСостав средыНачальный титр, КОЕ/млКислотность, °TВремя сквашивания, час1Пример 14·10¹⁰130162Пример 21·10¹⁰145183Пример 31·10¹⁰155>184Среда-прототип2·10⁹12424-30

Пример 4. Исследование длительности хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком концентрате лактобактерий

Исследована длительность хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком концентрате (таблица 3). В качестве посевной дозы используется консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5863), Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3962); Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5724) в соотношении 2:0,5:0,5. Сквашивание производят при температуре (39-40)°С в течение 4-5 часов до достижения кислотности готового продукта не менее 100°Т.

Значительный срок (до 72 дней) хранения с титром не ниже 10 КОЕ/мл связан с обеспечением начальной кислотности препарата консорциума лактобактерий не более (120-140)°Т, получением исходного титра лактобактерий (не ниже 10¹⁰ КОЕ/мл) за счет использования заявляемой молочной питательной среды с добавлением лактопептона и дрожжевого экстракта.

Таблица 3Данные по культивированию консорциума бифидобактерий с использованием заявляемой питательной среды и хранению его биомассыПроизводственная закваскаБиомасса лактобактерий на основе консорциумаВиды штаммов лактобактерий в консорциуме 0,5:0,5:2Питательная средаВремя культивирования, часыКислотность, Т°Титр (КОЕ/мл) ЖКБ в процессе храненияСгусток1 сут72 сут1 сут60 сут72 сутВ-5724Заявляемая среда4,0.140160   НормальныйВ-39621·10¹⁰6·10⁹2·10⁹В-5863   То жеСреда - прототип5,01703202,5·10⁹9,0·10⁷2,5·10⁷Нормальный

Пример 5. Исследование длительности хранения биомассы консорциума штаммов бифидобактерий в жидком концентрате бифидобактерий, полученном с использованием заявляемой питательной среды

Исследована длительность хранения консорциума штаммов бифидобактерий в жидком концентрате бифидобактерий (таблица 4). В качестве посевной дозы бифидобактерий используют консорциум штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum Я-3, Bifidobacterium adolescentis B-1 в соотношении 3:1:1.

Посевную дозу бифидобактерий вносят в объеме 5,0-7,0% от объема питательной среды с титром бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/мл, культивирование осуществляют в течение времени, достаточного для получения концентрата бифидобактерий с биологическим титром не менее (0,8-1,0)10¹¹ КОЕ/мл.

Значительный срок (до 72-х дней) хранения жидкого концентрата бифидобактерий с титром не ниже 10¹⁰ КОЕ/мл связан с обеспечением начальной кислотности препарата консорциума бифидобактерий не более (140-145)°Т, получением исходного титра бифидобактерий (не ниже 10¹¹ КОЕ/мл).

Таблица 4
Данные по культивированию консорциума бифидобактерий с использованием заявляемой питательной среды и хранению его биомассыПроизводственная закваскаЖидкий концентрат бифидобактерий (ЖКБ) на основе консорциумаСостав заявляемого консорциумаСоотношение штаммовВремя культивирования, часКислотность, T°Титр (КОЕ/мл) ЖКБ в процессе храненияСгусток1 сут72 сут1 сут60 сут72 сутl)B.bifidum 8-360221461503·10¹¹1·10¹⁰1·10¹⁰Нормальный2)B.longum (Я-3)203)B.adolescentis.В-120То жеСреда - прототип291371525·10⁹1·10⁸9·10⁷Нормальный

Таким образом, технический результат заявляемого изобретения подтверждает создание такой питательной среды, которая обеспечивает возможность культивирования как бифидобактерий, так и лактобактерий при более длительных сроках хранения (до 72 суток и более) и более высоких титрах биомассы бактерий в процессе хранения.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой промышленности и касается приготовления питательных сред для культивирования бифидо- и лактобактерий с целью получения биомассы микроорганизмов и дальнейшего ее использования в производстве заквасок для лечебно-профилактических продуктов, а также для производства биологически активных добавок (БАД). Молочная питательная среда содержит основу в виде обезжиренного молока с содержанием сухого остатка 13-14%, цистеин солянокислый или аскорбиновую кислоту, лактопептон, очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1-2,8%, общего белка не менее 3-4%, натрий хлористый, марганец сернокислый семиводный и магний сернокислый четырехводный. Питательная среда обеспечивает возможность культивирования как бифидобактерий, так и лактобактерий при более длительных сроках хранения и более высоких титрах биомассы бактерий в процессе хранения. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Молочная питательная среда для получения биомассы бактерий-пробиотиков, содержащая основу в виде обезжиренного молока с содержанием сухого остатка 13-14%, цистеин соляно-кислый или аскорбиновую кислоту, гидролизат молочных белков, ростовые факторы из дрожжевых клеток и натрий хлористый, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит марганец серно-кислый четырехводный и магний серно-кислый семиводный, в качестве гидролизата белков молока содержит лактопептон, а в качестве ростовых факторов из дрожжевых клеток - очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1-2,8%, общего белка не менее 3-4% при следующем соотношении компонентов питательной среды, мас.%:

лактопептон5,0-7,0цистеин соляно-кислый или аскорбиновая кислота0,001-0,002натрий хлористый0,03-0,05марганец серно-кислый четырехводный0,001-0,005магний серно-кислый семиводный0,01-0,02

очищенный дрожжевой экстракт с

показателем аминного азота2,1-2,8%общего белка не менее 3-4%1,5-2,0обезжиренное молоко с содержанием сухого остатка 13-14%остальное до 100%