СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ МИКОТОКСИКОЗОВ И ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2013 года по МПК A61K35/00 

Изобретение относится к микробиологии и микотоксикологии, и может быть использовано в ветеринарии для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, вызванных микотоксинами (в частности Т-2 и афлатоксином Bi, Mi).

В настоящее время препараты - пробиотики, подавляющие развитие патогенных микроорганизмов, находят широкое применение в ветеринарии для лечения желудочно-кишечных и гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, обладающие сравнимой с антибиотиками эффективностью и не дающие осложнений в виде дисбактериозов и аллергических реакций. Эффективность этих препаратов связывают с витаминообразующей, кислотообразующей, антагонистической и иммуностимулирующей активностью микроорганизмов, входящих в их состав (Малик Н.И. Ветеринарные пробиотические препараты / Н.И. Малик, А.Н. Панин // Ветеринария. - 2001. - №1. - С.46-51).

Известны способы профилактики расстройств пищеварения желудочно-кишечного тракта у животных, вызванных различной патогенной и условно-патогенной микрофлорой (патент РФ 2381806, РФ №2035185, №2184774).

Кроме желудочно-кишечных заболеваний бактериальной природы, расстройства желудочно-кишечного тракта могут быть вызваны отравлениями микотоксинами.

Микотоксины, метаболиты микроскопических грибов, распространены повсеместно, вызывают порчу продуктов питания и кормов. Многие из них являются опасными сильнодействующими токсичными соединениями для человека и животных. Ущерб, наносимый микотоксинами агропромышленному комплексу, чрезвычайно велик. К наиболее опасным и токсичным микотоксинам относят Т-2 токсин и афлатоксины. Отравление микотоксинами в первую очередь проявляется нарушением работы органов желудочно-кишечного тракта, диспепсией, гастритом, нарушением работы печени, кровоизлияниями во внутренних органах и др. Болезнь сопровождается общим угнетенным состоянием животных, снижением аппетита вплоть до полного отказа от корма, жаждой, рвотой, нарушением перистальтики кишечника, расстройством в работе сердечно-сосудистой системы, затруднением дыхания и др.

Контаминируя продукты животноводства и растениеводства (зерновые культуры) микотоксины могут представлять опасность и для здоровья людей. Попадая с продуктами питания, в том числе и с хлебом, в организм человека, микотоксины проявляют мутагенный, канцерогенный, иммунодепрессантный эффекты, вызывают аллергозы, поражения печени и почек, органов воспроизводительной системы.

Профилактика отравлений микотоксинами в основном связана с предупреждением попадания микотоксинов в организм животных, т.е. выявлением их содержания в кормах и последующим обезвреживанием (Иванов, А.В. Микотоксикозы животных (этиология, диагностика, лечение, профилактика) / А.В. Иванов М.Я. Тремасов, К.Х. Папуниди и др. - М.: Колос, 2008. - 140 с.; Иванов, А.В. Микотоксикозы (биологические и ветеринарные аспекты) / А.В. Иванов, В.И. Фисинин, М.Я. Тремасов и др. - М.: Колос, 2010. - 392 с.).

Для профилактики и лечения микотоксикозов животных в основном используют сорбенты, действие которых сводится к сорбции ядов в желудочно-кишечном тракте, при этом специфических средств при отравлении микотоксинами не разработано.

Лечение антибиотиками диареи и других осложнений, вызванных отравлением микотоксинами, может еще более усугубить процесс интоксикации. К тому же антибиотики и химиотерапевтические препараты оказывают подавляющее действие на нормальную кишечную микрофлору, восстановление которой после применения этих средств происходит очень медленно. В связи с этим особую актуальность приобретает использование пробиотических штаммов в качестве профилактических средств при микотоксикозах.

Наиболее близким к предлагаемому является способ профилактики микотоксикозов животных, предусматривающий применение пробиотического препарата внутрь, в качестве которого используют препарат Сахабактисубтил, состоящий из двух штаммов бактерий Bacillus subtilis-ТНП-3 и Bacillus subtilis-THn-5, обладающих антагонистической активностью к токсинообразующим плесневым грибам (патент РФ 2297842 С2, опубл. 27.04.2007).

Однако обнаружение в кормах микроскопических грибов не всегда свидетельствует о наличии в них микотоксинов. В связи с этим актуальным является поиск профилактических средств, обладающих также выраженным обезвреживающим действием в отношении микотоксинов.

Задачей изобретения является повышение качества профилактических мероприятий при микотоксикозах сельскохозяйственных животных и сокращение сроков их проведения.

Эффективность достигается тем, что бактерии Bacillus subtilis-93 обладают выраженными антагонистическими свойствами по отношению к большому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих дисбактериозы кишечника (сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, клебсиеллы, стафилококки, микроскопические грибы). Применение средства приводит к нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта, гемато-биохимических показателей крови, стимуляции обменных процессов, улучшению усвоения кормов, укреплению иммунитета животных.

В отличие от прототипа штамм В. subtilis-93 обладает антагонистическим действием не только к микроскопическим плесневым грибам, но и проявляет выраженное обезвреживающие действие в отношении Т-2 токсина, афлатоксинов, что подтверждено экспериментально в лабораторных и производственных условиях. Механизм обезвреживающего действия пробиотического штамма В. subtilis-93 заключается в продуцировании ряда ферментов, разрушающих микотоксины и их сорбцией компонентами клеточной стенки.

Введение пробиотического штамма В. subtilis-93 сокращает также частоту случаев диареи - неспецифического симптома микотоксикоза, возникающего в результате подавления микотоксинами роста микроорганизмов нормальной микрофлоры.

Кроме того, используемые для этого дозы и кратность введения препарата существенно ниже: 10 раз по 6-10 мл с концентрацией 1 млрд микробных клеток, против 30 дней по 50 млрд микробных клеток на голову, что существенно удешевляет профилактирование животных.

Штамм В.subtilis-93 активно размножается в питательных средах, принятых в производстве пробиотических препаратов. Устойчив к высушиванию и хранению.

Штамм Bacillus subtilis-93 выделен в 1993 году из сенного настоя в Тюлячинском районе РТ.

Характеристика штамма ранее не опубликована. Штамм в других целях не использовался.

Bacillus subtilis-93 имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.

Морфология. Спорообразующие палочки расположены одиночно или собраны в короткие цепочки. Окрашивается по Грамму положительно.

Культуральные признаки. На жидкой питательной среде (МПБ) через, 18-24 часа культивирования при 37 С образуют пленку на поверхности среды и придонный осадок. На твердой питательной среде (МПА) образуют плоские непрозрачные блестящие колонии бежевого цвета с неровными краями, 2-3 мм в диаметре. На агаре Сабуро образуют крупные плоские непрозрачные колонии R-формы с выраженным центром. Поверхность колоний матовая шероховатая, цвет бежевый.

Физиологические признаки. Аэроб, оптимальные условия роста при температуре 37°C и pH 6,0-7,5.

Биохимические свойства. Растет в присутствии 6% NaCl. Обезжиренное молоко не свертывает, метиленовое молоко восстанавливает. Каталазоположительный. Сбраживает до кислоты без образования газа глюкозу, сахарозу, слабо ферментирует манит, лактозу и мальтозу, не ферментирует галактозу, арабинозу, рамнозу, дульцит, ксилозу, сорбит.

Bacillus subtilis-93 не патогенен, характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов рода Escherichia, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Proteus. Активен в отношении микроскопических грибов рода Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Mucor.

Штамм депонирован 11.04.2001 г. во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. (ВГНКИ) - штамм Bacillus subtilis-93-ДЕП. Местом хранения штамма определена коллекция микроорганизмов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань).

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при экспериментальном Т-2 токсикозе телят

Опыты проведены на 12 телятах, пятидневного возраста, разделенных по принципу аналогов на 2 группы: опытная и контрольная. Животным опытной группы задавали внутрь по 10 мл взвеси штамма Bacillus subtilis-93 в физ. растворе, с содержанием в 1 мл 1 млрд микр. кл., один раз в день в течение 10 суток. Сразу после введения пробиотического штамма внутрь задавали Т-2 токсин в дозе 0,4 мг/кг в виде водно-спиртового раствора. Контрольная группа получала только Т-2 токсин.

У животных контрольной группы Т-2 токсикоз проявлялся резкими изменениями клинико-гематологических и биохимических показателей; на 3-5 сут после введения Т-2 токсина у телят отмечалась диарея.

К концу опыта количество эритроцитов у телят контрольной группы, в сравнении с аналогичными показателями у опытной группы было ниже на 23,6% (Р<0,01), лейкоцитов на 17,4% (Р<0,05), гемоглобина на 32,8% (Р<0,001), общего белка на 16,3% (Р<0,05).

Введение пробиотического штамма животным опытной группы снижало отрицательное влияние экотоксиканта, диарея выявлялась только у одного животного в более поздние сутки. Изменения гемато-биохимических показателей были менее значительны (таблица 1).

Таблица 1 Гемато-биохимические показатели телят при подостром Т-2 токсикозе на фоне применение пробиотического штамма Bacillus subtilis-93 Группа животных Показатель Сроки наблюдения, сут Исх. данные 5 10 Опыт Эритроциты, ×10¹²/л 8,1±0,17 8,3±0,21 8,9±0,7** Лейкоциты, ×10⁹/л 11,1±0,2 11,0±0,3 10,1±0,3* Гемоглобин, г/л 96,5±1,9 96,1±0,2 108,5±0,4***   Общий белок, г/л 62,8±0,3 61,9±1,6 62,6±0,27* Контроль Эритроциты, ×10¹²/л 8,2±0,3 7,9±0,5 7,2±0,1 Лейкоциты, ×10⁹/л 11,3±0,4 10,9±0,6 8,6±0,3 Гемоглобин, г/л 96,1±1,3 91,6±0,2 81,7±0,6 Общий белок, г/л 62,0±2,4 56,7±0,23 53,8±0,1 * - Р<0,05 ** - Р<0,01 *** Р<0,001

Пример 2. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при микотоксической диарее поросят, вызванной содержанием в корме микотоксинов: Т-2 и афлатоксина B₁

Опыты проведены на 40 поросятах, разделенных по принципу аналогов на 2 группы, по 20 голов в каждой, с признаками диареи на фоне кормления свиноматок кормом, содержащим микроскопические грибы Fusarium sporotrichiella, Aspergillus flavus и микотоксины - Т-2 токсин в дозе 0,2±0,03 мг/кг и афлатоксин B₁ - 0,3±0,05 мг/кг. В молозиве свиноматок обнаружен афлатоксин M₁ (метаболит афлатоксина B₁) в количестве 0,005-0,01 мг/кг.

Животным опытной группы сразу после рождения (до приема молозива) внутрь задавали по 5 мл взвеси штамма Bacillus subtilis-93 в физиологическом растворе, с содержанием в 1 мл 1 млрд микр. кл., один раз в день в течение 10 суток; второй группе (контроль) по аналогичной схеме задавали физиологический раствор.

На 1-2 сутки после рождения у поросят контрольной группы отмечали признаки диареи: частая дефекация, жидкий кал без примеси крови и пузырьков воздуха. На 6-8 сут признаки диареи усиливались, наблюдался профузный понос, животные отставали в росте, отмечалась дегидратация, повышение температуры, учащение пульса и частоты дыхания. В дальнейшем развивался цианоз кожи и слизистых оболочек, наблюдалось снижение температуры тела, ослабление пульса и частоты дыхания. Сохранность составила лишь 30% (таблица 2). У выживших животных в дальнейшем отмечалось снижение роста, привесов.

Таблица 2 Сроки наблюдения признаков диареи и интенсивность роста поросят-сосунов при употреблении ими молока содержащего афлатоксин M₁ на фоне применения пробиотического штамма Bacillus subtilis-93 Группа животных Сроки наблюдения (сут), количество поросят с признаками диареи Кол-во павших поросят, гол Средний вес одного поросенка Среднесуточный прирост, г 1 5 10 15 20 25 30 Контроль - 2 3 3 6 7 9 6 5,17 139,2 Опыт - - - - - 2 2 - 5,97 165,4

Введение поросятам пробиотического штамма способствовало нормализации гематологических (увеличение количества эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина) и биохимических (общего белка, альбуминов, глюкозы) показателей крови, максимальному уменьшению развития дегенеративно-дистрофических изменений в органах и тканях, снижению заболеваемости и падежа животных. Признаки диареи, не сопровождающиеся повышением температуры, на 25 сутки отмечались только у двух поросят. Животные все выжили и были переведены в группу отъема.

Микробиологическими исследованиями содержимого толстого отдела кишечника контрольных поросят обнаружили гемолитические, энтерококки, стафилококки, сальмонеллы, дрожжи и микроскопические грибы, количество бифидо- и лактобактерий (в сравнении с группой, получавшей пробиотический штамм) было ниже на 31,4 и 28,9% (Р<0,001) соответственно.

Пример 3. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при микотоксической диарее телят, вызванной содержанием в корме стельных коров микотоксина Т-2 и афлатоксина B₁

Опыты проведены на 40 новорожденных телятах черно-пестрой породы, разделенных на две группы по 20 голов, с признаками диареи на фоне кормления стельных коров комбикормом, содержащим микроскопические грибы Fusarium sporotrichiella, Aspergillus flavus и микотоксины - Т-2 токсин в дозе 0,15 мг/кг и афлатоксин B₁ - 0,2 мг/кг.

Новорожденным телятам опытной группы сразу после рождения задавали по 10 мл взвеси штамма Bacillus subtilis-93 в физ. растворе, с содержанием в 1 мл 1 млрд микр. кл., один раз в день в течение 10 суток. Контрольная группа получала физиологический раствор.

Наличие микотоксинов в кормах беременных коров оказывает отрицательное влияние на организм новорожденных животных. На 5 сутки после рождения у 35% телят контрольной группы отмечалась диарея. В группе контроля пало 2 теленка (таблица 3).

Таблица 3 Сроки наблюдения признаков диареи и интенсивность роста телят при употреблении ими молока содержащего афлатоксин M₁ на фоне применения пробиотического штамма Bacillus subtilis-93 Группа животных Сроки наблюдения (сут), количество телят с признаками диареи Кол-во павших телят, гол Средний вес одного теленка Среднесуточный прирост, г 1 5 10 15 20 25 30 Контроль - 7 8 12 17 17 17 2 58,1 570 Опыт - - - - - 2 2 - 42,2 410

Пробиотический штамм Bacillus subtilis-93 обладает выраженной профилактической эффективностью при микотоксикозе, в опытной группе диарея отмечалась только у двух телят в более поздние сроки (25-30 сут) и была менее выражена.

Пример 4. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при афлатоксикозе поросят-отъемышей

Опыты проведены на 30 подсвинках средней живой массой 20-25 кг, разделенных на две группы по 15 голов в каждой, в рационе которых был обнаружен афлатоксин Bi в концентрации от 18,5 до 80,0 мкг/кг. Первая группа животных служила контролем и получала токсичный корм; вторая - совместно с токсичным кормом ежедневно в течение 10 сут получала взвесь культуры Bacillus subtilis-93 в физиологическом растворе, в дозе 5 мл (с содержанием в 1 мл 1 млрд микр. кл).

Пробиотический штамм Bacillus subtilis-93 при спонтанном афлатоксикозе поросят оказывал положительное влияние на клинические, гемато-биохимические показатели, нормофлору желудочно-кишечного тракта (количество бифидобактерий было выше на 61,2%, лактобактерий на 54,0% (Р<0,001), чем в контрольной группе).

У контрольных животных отмечалось расстройство желудочно-кишечного тракта, отставание в росте, увеличение популяционного уровня гемолитических эшерихий, золотистого стафилококка, сальмонелл, дрожжей и плесени (таблица 4).

Таблица 4 Состояние кишечного микробиоценоза поросят при афлатоксикозе на фоне применения пробиотического штамма Bacillus subtilis-93 Микроорганизмы, IgKOE/r Группа животных Контроль Опыт Бифидобактерий 4,28±0,18 6,9±0,15^*** Лактобактерий 3,48±0,53 5,36±0,2^*** Энтерококки 4,06±0,26 5,6±0,18^*** Эшерихии с норм. ферм. активностью 3,13±0,44 4,85±0,5^*** Эшерихии гемолитич. 0,3±0,03 - Стафилококки зол. 0,50±0,11 0,14±0,01^*** Сальмонеллы 2,27±0,24 1,0±0,02^*** Дрожжи и плесени 1,73±0,06 1,34±0,06^**

Пример 5. Профилактическая эффективность Bacillus subtilis-93 при экспериментальном афлатоксикозе поросят

Опыты проведены на 30 поросятах, 30 суточного возраста, разделенных по принципу аналогов на 3 группы: 2 опытные и контрольная. В течение опытов животные получали автоклавированный (стерильный) комбикорм, контаминированный афлатоксином Bi (40 мкг/кг).

Животным первой опытной группы задавали внутрь по 5 мл взвеси штамма Bacillus subtilis-93 в физ. растворе, с содержанием в 1 мл 1 млрд. микр. кл., один раз в день в течение 10 суток; животным второй группы по 6 мл.

Контрольная группа получала в аналогичной дозе физиологический раствор.

У животных контрольной группы афлатоксикоз проявлялся изменениями клинико-гематологических и биохимических показателей. Отмечалось угнетение, снижение пищевой возбудимости, реакции на внешние раздражители, расстройства желудочно-кишечного тракта. На 8 сут опыта в группе контроля пало одно животное.

При патологоанатомическом вскрытии павшего поросенка, выявлены желтушность видимых слизистых оболочек, подкожной клетчатки, увеличение и уплотнение печени, наличие точечных кровоизлияний. Кровоизлияния обнаружены и в слизистой кишечника.

Введение пробиотического штамма животным опытных групп снижало отрицательное влияние микотоксина, обеспечивало сохранность, причем, более эффективной оказалась доза 6 мл, отличающаяся менее выраженными изменениями клинико-гематологических показателей.

Таким образом, предлагаемый способ профилактики микотоксикозов с использованием штамма Bacillus subtilis-93 позволяет:

- снизить заболеваемость молодняка сельскохозяйственных животных;

- повысить сохранность;

- снизить количество вводимого препарата в 15 раз;

- сократить количество дней введения препарата до 10 дней;

- снизить стоимость профилактических мероприятий.

Изобретение относится к микробиологии и микотоксикологии и предназначено для профилактики микотоксикозов. Способ включает введение микробного препарата внутрь, в качестве которого используют штамм Bacillus subtilis-93 в дозе 6-10 мл с содержанием 1 млрд. микр кл./мл в течение 10 дней. Способ позволяет повысить эффективность профилактики микотоксикозов, снизить заболеваемость молодняка, повысить сохранность, сократить сроки введения. 4 табл., 4 пр.

Способ профилактики микотоксикозов животных путем введения микробного препарата внутрь, отличающийся тем, что в качестве микробного препарата используют штамм Bacillus subilis-93 в дозе 6-10 мл с содержанием 1 млрд. микр. кл/мл в течение 10 дней.