СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ЖИДКОЙ СРЕДЫ (ВАРИАНТЫ) И СОСУД ИЗ ПЛАСТИКА ДЛЯ СОРБИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ЖИДКОЙ СРЕДЫ Российский патент 2013 года по МПК C12M3/00 C08J7/06 C07H21/04 B01L3/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу выделения и очистки нуклеиновых кислот.

Известно изобретение «СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ» (Патент RU №2382081, опубл. 20.02.2010), в котором предложен способ выделения и очистки ДНК и РНК с помощью центрифугирования, предусматривающий сорбцию нуклеиновых кислот на силикатном сорбенте - монодисперсных сферических частицах диоксида кремния размером 100-500 нм - с последующими промыванием от примесей и элюцией. Способ позволяет увеличить эффективность выделения нуклеиновых кислот.

Недостатком данного изобретения является низкая степень однородности и равномерности покрытия, также соответствующая ей производительность и технологичность. Высокая степень деформация материала основы. Частицы расположены не по всей поверхности сосуда.

Известно изобретение «Устройство для выделения ДНК и способ» (Патент WO 2004046231 (A1), опубл. 2004-06-03), в котором согласно первому воплощению изобретения сосуд из пластика для сорбирования нуклеиновых кислот из жидкой среды включает покрытие из оксида кремния на внутренней поверхности сосуда, выполненного из пластмассы, имеющего монослой частиц, по крайней мере, на части поверхности сосуда, частицы отобраны из кварца, геля кварца, или стекла. Метод выделения ДНК из сырой основы включает их сорбцию на внутренних стенках сосуда, промывку от примесей и элюцию в солевом растворе.

Недостатком данного изобретения является низкая производительность и технологичность, низкие сорбционные свойства, невозможность равномерного покрытия по всей поверхности сосуда, причем как на большой площади, так и на ограниченном участке возможна деформация материала основы, невысокая оптическая прозрачность.

Данное изобретение является наиболее близким техническим решением к заявляемому решению, т.е. прототипом.

Задачей заявляемого решения является повышение производительности и технологичности процесса выделения и очистки нуклеиновых кислот, увеличение скорости процесса, уменьшение количества выполняемых операций, повышение чистоты получаемых нуклеиновых кислот, повышение сорбционных свойств сосуда, в котором производится процесс, обеспечение равномерного покрытия по всей поверхности сосуда, причем как на большой площади, так и на ограниченном участке, повышение оптической прозрачности сосуда.

Задача решается созданием сосуда из пластика для сорбирования нуклеиновых кислот из жидкой среды, включающего покрытие из оксида кремния на внутренней поверхности сосуда, которое является нанопокрытием (определяемого как покрытие с толщиной от 1 до 100 нм), выполненным посредством тонкопленочного синтеза.

Кроме того, пластик может быть выбран из группы, включающий поливинилхлорид, полиэтилен, полипропилен, полистирол, поликарбонаты, акрилонитрил-бутадиен-стирол, полиуретаны, полиамиды, термоэластопласты, полисульфоны и полиэфирэфиркетоны, а также их смеси.

Кроме того, сосуд может быть выполнен оптически прозрачным.

Кроме того, сосуд может быть выполнен в виде пробирки.

Кроме того, указанный тонкопленочный синтез может быть реализован при сверхвысоком вакууме.

Кроме того, указанный тонкопленочный синтез может включать ионно-плазменное напыление.

Кроме того, ионно-плазменное напыление может включать распыление мишени оксида кремния потоком ионов Ar+ в вакууме.

Кроме того, внутренняя поверхность сосуда перед напылением может быть химически очищена спиртом в ультразвуковой ванне.

Кроме того, толщина нанопокрытия не превышает 25 нм.

Также задача решается созданием способа выделения и очистки нуклеиновых кислот из жидкой среды, включающий их сорбцию на внутренних стенках сосуда, промывку от примесей и элюцию в солевом растворе, при этом используют в качестве сорбента нанопокрытие оксида кремния, выполненного посредством тонкопленочного синтеза.

Кроме того, используют нанопокрытие оксида кремния с размерами от 1 до 25 нм.

Кроме того, в сосуд с тонкопленочным напылением SiO₂ дополнительно добавляют хаотропный реагент, pH-буфер, смесь встряхивают, затем сливают или отбирают автоматической пипеткой, в сосуд добавляют спирт по объему, равный номинальному объемы сосуда, встряхивают и сливают.

Кроме того, после добавления эллюирующего раствора сосуд нагревают до 95°C для выделения ДНК или до 65°C для выделения РНК, интенсивно встряхивают и отбирают раствор нуклеиновых кислот в другую емкость.

Также по варианту 2 задача решается созданием способа выделения и очистки нуклеиновых кислот из жидкой среды, включающего их сорбцию на внутренних стенках сосуда, промывку от примесей и элюцию в солевом растворе, при этом используют в качестве сорбента нанопокрытие оксида кремния SiO₂, выполненного посредством тонкопленочного синтеза в сосуде, при этом в сосуд дополнительно добавляют хаотропный реагент, pH-буфер, смесь встряхивают, затем сливают или отбирают автоматической пипеткой, далее в сосуд добавляют спирт, по объему, равный номинальному объемы сосуда, встряхивают и сливают.

Кроме того, используют нанопокрытие оксида кремния с размерами от 1 до 25 нм.

Кроме того, после добавления эллюирующего раствора сосуд нагревают до 95°C для выделения ДНК или до 65°C для выделения РНК, интенсивно встряхивают и отбирают раствор нуклеиновых кислот в другую емкость.

Также по варианту 3 задача решается созданием способа выделения и очистки нуклеиновых кислот из жидкой среды, включающий их сорбцию на внутренних стенках сосуда, промывку от примесей и элюцию в солевом растворе, нагрев сосуда, при этом используют в качестве сорбента нанопокрытие оксида кремния SiO₂, выполненного посредством тонкопленочного синтеза в сосуде, при этом в сосуд дополнительно добавляют хаотропный реагент, pH-буфер, после добавления эллюирующего раствора сосуд нагревают до 95°C для выделения ДНК или до 65°C для выделения РНК, интенсивно встряхивают и отбирают раствор нуклеиновых кислот в другую емкость.

Кроме того, используют нанопокрытие оксида кремния с размерами от 1 до 25 нм.

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг.1 изображена пробирка с напылением покрытия 1). Пробирка 2) покрыта равномерным слоем оксида кремния по всей внутренней поверхности.

Сосуд из пластика 1 (фиг.1), изготовленный из полипропилена, полиэтилена или поликарбоната с покрытием внутренних стенок SiO₂ 2. Нанесение SiO₂ проводится таким образом, чтобы сосуд 2 оставался оптически прозрачным, а толщина слоя уменьшалась с увеличением внутреннего объема сосуда. Это позволяет выровнять скорость нагрева жидкости, находящейся внутри сосуда. Сосуд может быть выполнен в виде пробирки. Пробирки без внутреннего покрытия имеют одинаковую толщину стенок по всему объему. В виду конусообразной формы нагрев жидкости в пробирках без нанесения внутреннего покрытие происходит неравномерно.

Для создания функционального тонкопленочного покрытия на внутренней стороне полипропиленовых, поликарбонатных и полиэтиленовых пробирок, объемом от 0,2 до 50 мл; используемых для биохимических, молекулярно-биологических, генетических, цитологических и прочих исследований, используется методы формирования (синтеза) тонких пленок (такие как термическое осаждение, электронное испарение, осаждение из газовой фазы, электролитическое осаждение, осаждение в катодном пятне, магнетронное испарение, ионно-плазменное осаждение, импульсное лазерное осаждение, и т.д.). Например, при использовании ионно-плазменного метода:

- пробирки располагаются открытой стороной по направлению потока распыляемого материала. Синтез тонкопленочного слоя оксида кремния проводился путем распыления мишени оксида кремния потоком высокоэнергетичных ионов Ar+ (1000÷1500 эВ). Предварительно пробирки подвергаются химической очистке спиртом в ультразвуковой ванне. Держатель подложек позволяет получать до тысячи образцов за один цикл (~1 час).

Толщина синтезированного на поверхности пробирки оксида кремния (~2÷400 нм), достаточная для сорбции нуклеиновых кислот на внутренних стенках и обеспечения высокой степени прозрачности полученных образцов пластиковых пробирок.

Благодаря оптимальной в данном способе энергии ионов полученные опытные образцы обладают высокой адгезией и равномерным слоем тонкопленочного покрытия.

При таких сочетаниях параметров достигается требуемая прозрачность для проведения полимеразной цепной реакции (ПНР) в реальном времени с использованием флуоуресцентных красителей, в том числе интеркалирующих.

Проведение описываемого процесса тонкопленочного синтеза SiO₂ в условиях сверхвысокого вакуума приводит к получению сверхтонких нанопокрытий оксида кремния на внутренней стороне пробирок, объемом от 0,2 до 50 мл, используемых для биохимических, молекулярно-биологических, генетических, цитологических и прочих исследований. Отладка процесса синтеза приводит к подбору наиболее оптимальных энергий конденсирующихся частиц, что позволяет получать покрытия SiO₂ с высокой степенью адгезии к внутренней поверхности пробирок, сохраняя при этом прозрачность необходимую, для проведения ПЦР в реальном времени с используемым флуоресцентных красителей, в том числе интеркалирующих. Покрытие может быть произведено на установке ионно-плазменного напыления.

Таким образом, сохраняются все физические параметры пробирки (прозрачность, теплоемкость, жесткость) и приобретаются новые - способность сорбировать нуклеиновые кислоты на внутренние стенки пробирки.

Способ осуществляется следующим образом.

В пробирку, изготовленную из полиэтилена, полипропилена или поликарбоната с внутренней поверхностью, покрытой SiO₂, помещают образец биологического материала или геля, содержащего фрагменты ДНК в количестве от 10-20000 мг, в зависимости от объема используемой пробирки. Добавляют от 2 до 10 объемов раствора 1, содержащего хаотропный реагент, лизирующий реагент, соли одновалентных катионов, реагент для стабилизации pH, реагент для хелатирования, реагент для ингибирования ферментативной активности. Возможно первичное добавление раствора с последующим внесением биологического материала. Тщательно перемешивают/пипетируют/встряхивают пробирку, содержащую компоненты. Отбирают раствор 2 из пробирки.

Реализация способа не ограничивается приведенными примерами. Возможны различные комбинации указанных реагентов и солей одновалентных элементов. Например возможно исключение некоторых реагентов в случае, если реагент обладает несколькими указанными свойствами. Возможно исключение реагента с указанными свойствами, если данное свойство не критично для биологического объекта, из которого выделяются или очищаются нуклеиновые кислоты. pH конечной смеси должен быть в пределах 7,8-8,4 (для выделения и очистки ДНК), 4,5-5,5 (для выделения и очистки РНК). Концентрация солей одновалентных катионов в конечной смеси должна быть в пределах 250-500 мМ. Возможно внесение протеолитических ферментов. При внесении протеолитических ферментов из раствора 1 исключаются реагенты, ингибирующие ферментативную активность. Возможно внесение иных ферментов, активность которых направлена на расщепление нуклеиновых кислот или белков в зависимости от поставленных задач.

Пример реализации способа выделения и очистки нуклеиновых кислот из жидкой среды состоит в том, что:

Способ 1. 10-50 мкл крови помещают в пробирку с содержащимся в ней лизирующим и/или хаотропным реагентом (например, использование тиоцианата гуанидина, додецилсульфата натрия, лауроилсаркозила) в количестве 100-180 мкл. Содержимое пробирки тщательно перемешивают. Добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 200-300 мМ. Перемешивают содержимое. Содержимое сливают. В пробирку добавляют 180 мкл этилового спирта. Перемешивают. Содержимое сливают. В пробирку добавляют 180 мкл этилового спирта. Перемешивают. Содержимое сливают. Пробирку высушивают. Добавляют смесь-мастермикс для проведения ПЦР.

Способ 2. Одиночную клетку вместе с небольшим количеством среды помещают в пробирку. Добавляют буфер, содержащий 10 мМ Трис-хлорида, 2 мМ ЭДТА, 250 мМ хлорида натрия. Содержимое пробирки нагревают до 70°C в течение 5 мин. Перемешивают. Содержимое пробирки сливают. Добавляют мастермикс для ПЦР.

Если выделенные нуклеиновые кислоты предназначаются для дальнейшей ферментативной амплификации методом ПЦР, обратной транскрипции, рестрикции, лигирования, модификации, то выделенные нуклеиновые кислоты могут быть растворены непосредственно в смесях для проведения указанных ферментативных реакций. В случае необходимости растворения нуклеиновых кислот в пробирку вносят бидистиллированную воду, воду, обработанную DEPC, или раствор, предотвращающий деградацию нуклеиновых кислот. Хранение нуклеиновых кислот осуществляется при минус 20 градусах Цельсия как в растворенном виде, так и в сорбированном на стенках пробирок состоянии.

Характеристики метода

1. Процент (от общего содержания ДНК или РНК в образце) извлечения из тканей млекопитающих, в т.ч. человека, - не менее 70%, бактериальных клеток - не менее 75%, из тканей растений - не менее 70%, из пищевых продуктов - не менее 60%, из деградированного биологического материала - не менее 80%;

2. Воспроизводимость количественных и качественных показателей - 90%;

3. Содержание остаточных белков - не более 5%.

Таким образом в сосуде, в котором используют нанонопокрытие, полученное методом тонкопленочного синтеза, сохраняются все физические параметры сосуда (прозрачность, теплоемкость, жесткость) и приобретаются новые - способность сорбировать нуклеиновые кислоты на внутренние стенки пробирки, при этом обеспечиваются большая скорость процесса, меньшее количеством операций, чистота получаемых нуклеиновых кислот.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен сосуд из пластика для сорбирования нуклеиновых кислот из жидкой среды. На внутренней поверхности сосуда нанесено покрытие из оксида кремния, выполненное посредством тонкопленочного синтеза, включающего ионно-плазменное напыление, реализованное при сверхвысоком вакууме распылением мишени оксида кремния потоком ионов Ar+. При этом толщина данного покрытия выполнена в пределах 2÷400 нм. Также предложены способы выделения и очистки нуклеиновых кислот из жидкой среды (варианты) с использованием данного сосуда. Сначала осуществляют сорбцию нуклеиновых кислот на внутренних стенках сосуда и промывку от примесей. После добавления элюирующего раствора сосуд нагревают до 95°С для выделения ДНК или до 65°С для выделения РНК, интенсивно встряхивают и отбирают раствор нуклеиновых кислот в другую емкость. Изобретения позволяют повысить сорбционные свойства сосуда, обеспечивают равномерность покрытия по всей поверхности сосуда, причем как на большой площади, так и на ограниченном участке повышают оптическую прозрачность сосуда, уменьшают количество выполняемых операций при выделении и очистке нуклеиновых кислот. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Сосуд из пластика для сорбирования нуклеиновых кислот из жидкой среды, включающий покрытие из оксида кремния на внутренней поверхности сосуда, отличающийся тем, что покрытие является нанопокрытием, выполненным посредством тонкопленочного синтеза, включающего ионно-плазменное напыление, реализованное при сверхвысоком вакууме распылением мишени оксида кремния потоком ионов Ar+, при этом толщина данного покрытия выполнена в пределах 2÷400 нм.

2. Сосуд по п.1, отличающийся тем, что пластик выбран из группы, включающей поливинилхлорид, полиэтилен, полипропилен, полистирол, поликарбонаты, акрилонитрил-бутадиен-стирол, полиуретаны, полиамиды, термоэластопласты, полисульфоны и полиэфирэфиркетоны, а также их смеси.

3. Сосуд по п.1, отличающийся тем, что энергия потока ионов Ar+ выбрана 1000÷1500 эВ.

4. Сосуд по п.1 или 2, отличающийся тем, что сосуд выполнен оптически прозрачным.

5. Сосуд по п.4, отличающийся тем, что внутренняя поверхность сосуда перед напылением химически очищена спиртом в ультразвуковой ванне.

6. Сосуд по п.1 или 2, отличающийся тем, что толщина нанопокрытия не превышает 25 нм.

7. Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот из жидкой среды, включающий их сорбцию на внутренних стенках сосуда из пластика, промывку от примесей и элюцию в солевом растворе, отличающийся тем, что на внутренних стенках сосуда из пластика используют в качестве сорбента нанопокрытие оксида кремния, выполненное посредством тонкопленочного синтеза, включающего ионно-плазменное напыление, реализованное при сверхвысоком вакууме распылением мишени оксида кремния потоком Ar+, при этом толщина данного покрытия выполнена в пределах 2÷400 нм.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что используют сосуд с толщиной покрытия оксида кремния с размерами от 1 до 25 нм.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что в сосуд из пластика с тонкопленочным напылением оксида кремния дополнительно добавляют хаотропный реагент, рН-буфер, смесь встряхивают, затем сливают или отбирают автоматической пипеткой, в сосуд добавляют спирт по объему, равному номинальному объему сосуда, встряхивают и сливают.

10. Способ по п.7, отличающийся тем, что после добавления элюирующего раствора сосуд нагревают до 95°С для выделения ДНК или до 65°С для выделения РНК, интенсивно встряхивают и отбирают раствор нуклеиновых кислот в другую емкость.

11. Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот из жидкой среды, включающий их сорбцию на внутренних стенках сосуда из пластика, промывку от примесей и элюцию в солевом растворе, отличающийся тем, что на внутренних стенках сосуда из пластика используют в качестве сорбента нанопокрытие оксида кремния, выполненное посредством тонкопленочного синтеза, включающего ионно-плазменное напыление, реализованное при сверхвысоком вакууме распылением мишени оксида кремния потоком Ar+, при этом толщина данного покрытия выполнена в пределах 2÷400 нм, при этом в сосуд дополнительно добавляют хаотропный реагент, рН-буфер, смесь встряхивают, затем сливают или отбирают автоматической пипеткой, далее в сосуд из пластика добавляют спирт в объеме, равном номинальному объему сосуда, встряхивают и сливают.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что используют сосуд с толщиной покрытия оксида кремния с размерами от 1 до 25 нм.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что после добавления элюирующего раствора сосуд из пластика нагревают до 95°С для выделения ДНК или до 65°С для выделения РНК, интенсивно встряхивают и отбирают раствор нуклеиновых кислот в другую емкость.

14. Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот из жидкой среды, включающий их сорбцию на внутренних стенках сосуда из пластика, промывку от примесей и элюцию в солевом растворе, нагрев сосуда, отличающийся тем, что на внутренних стенках сосуда из пластика используют в качестве сорбента нанопокрытие оксида кремния, выполненное посредством тонкопленочного синтеза, включающего ионно-плазменное напыление, реализованное при сверхвысоком вакууме распылением мишени оксида кремния потоком Ar+, при этом толщина данного покрытия выполнена в пределах 2÷400 нм, при этом в сосуд из пластика дополнительно добавляют хаотропный реагент, рН-буфер, после добавления элюирующего раствора сосуд нагревают до 95°С для выделения ДНК или до 65°С для выделения РНК, интенсивно встряхивают и отбирают раствор нуклеиновых кислот в другую емкость.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что используют сосуд с толщиной покрытие оксида кремния с размерами от 1 до 25 нм.