СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2010 года по МПК C12P19/34 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано в медицине. Изобретение представляет собой способ выделения и очистки нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) из биологических и иных образцов.

Выделение и очистка нуклеиновых кислот являются критическими этапами в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе клинико-диагностических. Известны различные методы выделения и очистки нуклеиновых кислот, многие из которых характеризуются неудобством применения, потерями нуклеиновых кислот и длительностью процедур: центрифугирование в ступенчатом градиенте хлористого цезия, хроматография на колонках, экстракция фенолом и хлороформом, осаждение этанолом и изопропанолом [1].

Широкое распространение получили методы выделения и очистки нуклеиновых кислот с помощью силикатных сорбентов [2, 3], в том числе и с помощью монодисперсных и сферических частиц диоксида кремния с размерами от 0,05 до 10 мкм [4]. Они основаны на свойстве нуклеиновых кислот обратимо связываться с поверхностью силикатных сорбентов (стекловолокно, стеклянный порошок) в растворах солей и хаотропных агентов. Сорбент со связанными нуклеиновыми кислотами (ДНК, РНК) промывается, как правило, в спиртовых растворах, после чего нуклеиновые кислоты снимаются с сорбента в воде или низкосолевом буфере. При этом известны различные способы использования силикатных сорбентов для выделения и очистки нуклеиновых кислот, например с помощью жидкой хроматографии, а также с помощью магнитных частиц с силикатной поверхностью (5).

Одним из распространенных и удобных способов выделения и очистки нуклеиновых кислот является одновременное использование силикатных сорбентов и метода центрифугирования в стандартных лабораторных центрифугах. Ранее считалось, что для выделения и очистки нуклеиновых кислот с помощью центрифугирования наиболее оптимально использование силикатных сорбентов со средним размером частиц более 1 мкм [6]. Нами было найдено, что применение монодисперсных частиц диоксида кремния сферической формы позволяет снизить предпочтительный средний размер сорбента, используемого при выделении и очистке нуклеиновых частот с помощью метода центрифугирования, до 100-500 нм.

Наиболее близким к заявленному изобретению (прототипом) является способ выделения нуклеиновых кислот с помощью силикатного сорбента, описанный в [6]. В основе этого способа выделения и очистки нуклеиновых кислот лежит использование в качестве силикатного сорбента стеклянного порошка - полидисперсных частиц неправильной формы с наиболее предпочтительным размером 1-200 мкм.

Недостатком прототипа является низкая удельная сорбционная емкость используемого сорбента (стеклянного порошка), так как используется крупнодисперсный порошок микронных размеров. Более мелкие порошки, имеющие большую удельную поверхность, согласно прототипу использовать не рекомендуется, что связано с плохим редиспергированием получаемых центрифужных осадков, состоящих из полидисперсных частиц неправильной формы. Второй недостаток рекомендуемого материала состоит в том, что требуется предварительная его обработка, которая заключается в избавлении от частиц субмикронных размеров.

Задачей изобретения явилось уменьшение количества сорбента по массе, используемого для выделения и очистки нуклеиновых кислот при помощи центрифугирования.

Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе, включающем адсорбцию нуклеиновых кислот в буферах с высокими концентрациями солей на силикатном сорбенте, промывку его от примесей и элюцию нуклеиновых кислот в воде или низкосолевом буфере с помощью центрифугирования, в качестве сорбента используют монодисперсные и сферические частицы диоксида кремния с размерами в области 100-500 нм, что повышает удельную площадь поверхности сорбента и уменьшает количество используемого сорбента.

В предлагаемом процессе нуклеиновые кислоты сорбируются на монодисперсных сферических частицах диоксида кремния в буферном растворе, содержащем хаотропный агент. Монодисперсные частицы с нуклеиновыми кислотами осаждаются при высокоскоростном центрифугировании, промываются от примесей, далее нуклеиновые кислоты элюируются с сорбента в воде или низкосолевом буфере. В результате элюант представляет собой раствор очищенной ДНК или РНК, пригодных для использования в молекулярно-биологических исследованиях. Применение монодисперсных сферических частиц диоксида кремния диаметром от 100 до 500 нм обеспечивает одновременно высокую сорбцию и короткое время осаждения при центрифугировании. На фиг.1 показана зависимость удельной площади поверхности сферических частиц диоксида кремния от их диаметра. На фиг.2 показана зависимость времени полного осаждения монодисперсных сферических частиц диоксида кремния в стандартной пробирке при центрифугировании на 14000 об/сек частиц от их диаметра.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются следующие.

1. Использование в качестве сорбента монодисперсных частиц диоксида кремния.

2. Используемые монодисперсные частицы имеют сферическую форму, в то время как в прототипе используются полидисперсные частицы неправильной формы. Применение монодисперсных частиц сферической формы обеспечивает хорошее редиспергирование образуемого при центрифугировании плотного осадка частиц, связанных с высокомолекулярными нуклеиновыми кислотами. Кроме того, сферическая форма частиц обеспечивает хорошую десорбцию нуклеиновых кислот на заключительном этапе получения очистки.

3. Размер монодисперсных частиц диоксида кремния составляет от 100 до 500 нм. Частицы таких размеров обладают большой сорбционной поверхностью. С другой стороны, частицы таких размеров сохраняют высокую скорость осаждения в стандартных микроцентрифужных пробирках (до 4 минут) при центрифугировании 10000-16000 g.

4. Предпочтительный размер монодисперсных частиц диоксида кремния лежит в диапазоне 400-500 нм, так как частицы таких размеров обладают достаточно высокой удельной сорбцией нуклеиновых кислот и одновременно малым временем (до 10 секунд) полного осаждения при высокоскоростном центрифугировании в стандартных микроцентрифужных пробирках.

Использование предлагаемого способа позволяет, по сравнению с прототипом, уменьшить количество сорбента по массе.

Пример 1.

Очистка высокомолекулярной ДНК из клеток крови человека

Для выделения ДНК использовались архивные образцы клеток крови, фиксированные в растворе (метанол: уксусная кислота в соотношении 3:1). К 100 мкл клеточной суспензии было добавлено 10 мкл 0,5 М EDTA, полученную смесь лизировали с помощью 2 мкл протеиназы К при 55°С в течение 10 минут.

В качестве сорбента использовались монодисперсные сферические частицы SiO₂ в виде водного золя диаметром 300±10 нанометров (фиг.3), приготовленные в Лаборатории ядерных проблем ОИЯИ (г.Дубна Московской области) в соответствии с ранее описанной методикой [7]. Их размер составил 300±10 нм, концентрация 0,075 мг/мкл.

На одну пробу для очистки ДНК к 10 мкл полученного лизата клеток добавляли от 5 до 40 мкл сорбента - золя монодисперсных частиц SiO₂. Объем пробы доводили до 200 мкл добавлением 6 М раствора иодида натрия (pH 6,0), после чего выдерживали при комнатной температуре 10 минут для связывания геномной ДНК с носителем.

Частицы со связанной ДНК осаждали высокоскоростным центрифугированием при 14000 об/мин (12000-16000 g) в течение 25 секунд при комнатной температуре в настольной центрифуге фирмы "Eppendorf" (США), модель 5415С. Супернатант удалялся, а осадок ресуспендировался в 1 мл 80% раствора этанола в дистиллированной воде. Частицы со связанной ДНК вновь осаждали высокоскоростным центрифугированием при 14000 об/мин в течение 25 секунд. Супернатант удалялся, а осадок высушивали в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали в 40 мкл 1 мМ раствора Трис-HCl (pH 8,5) и выдерживали в течение 10 минут при 37°С для снятия ДНК с носителя. Смесь центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 секунд для осаждения частиц, супернатант с очищенной ДНК отбирали для анализа стандартным гель-электрофорезом.

На фиг.4 - 1% агарозный гель, окрашенный бромидом этидиума, с результатами очистки ДНК из 10 мкл лизата клеток крови человека: с использованием 5 мкл (дорожка 1), 10 мкл (дорожка 2), 20 мкл (дорожка 3) и 40 мкл (дорожка 4) сорбента - водного золя монодисперсных частиц SiO₂ диаметром 300±10 нм; дорожки 5 и 6 - контрольные образцы, состоящие из 10 и 5 мкл соответственно лизата клеток человека до очистки; дорожки 7-10 - осадок сорбента, оставшийся после снятия с него ДНК, нанесенной в дорожки 1-4 соответственно.

В данном примере показано выделение ДНК с использованием сорбента - монодисперсных сферических частиц диоксида кремния размером 300±10 нм, с концентрацией 0,075 мг/мкл. В прототипе описано использование того же объема сорбента - полидисперсных частиц диоксида кремния размерами 1-200 мкм, с концентрацией ~1 мг/мкл. Таким образом, по сравнению с прототипом, количество используемого сорбента было уменьшено более чем в 10 раз.

Пример 2.

Очистка высокомолекулярной ДНК из клеток крови человека

Очистка ДНК осуществлялась по методу, описанному в примере 1. В качестве сорбента ДНК использовались монодисперсные сферические частицы SiO₂ в виде водного золя с размером 450±10 нм (в отличие от примера 1, где были использованы частицы с размером 300±10 нм). Осаждение частиц высокоскоростным центрифугированием в данном примере производилось в течение 10 секунд (в отличие от 25 сек в примере 1).

Источники информации

1. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. - М.: Мир, 1984.

2. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E. and van der Noordaa J. // Journal of Clinical Microbiology. 1990. V.28. P.495-503.

3. Vogelstein В. and Gillespie D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V.76. P.615-619.

4. Патент US 2008/0241044 A1.

5. Патент US 5945525.

6. Патент US 5234809.

7. Bogush G., Tracy М. and Zukoski С. // J. of Non-Crystalline Solids. 1988. V.104. P.95-106.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу очистки нуклеиновых кислот. Предложенный способ выделения и очистки ДНК и РНК с помощью центрифугирования предусматривает сорбцию нуклеиновых кислот на силикатном сорбенте - монодисперсных сферических частицах диоксида кремния размером 100-500 нм - с последующими промыванием от примесей и элюцией. Способ позволяет увеличить эффективность выделения нуклеиновых кислот. 4 ил.

Способ выделения и очистки нуклеиновых кислот при помощи центрифугирования, включающий их адсорбцию в буферах с высокими концентрациями солей, промывку от примесей и элюцию в воде или низкосолевом буфере с использованием в качестве сорбента частиц диоксида кремния, отличающийся тем, что используют монодисперсные сферические частицы диоксида кремния с размерами 100-500 нм.