МАГНИТНЫЙ СОРБЕНТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2018 года по МПК B01J20/10 B01J20/06 B01J20/30 

Изобретение относится к методам выделения и очистки нуклеиновых кислот и их фрагментов из образцов, в частности, биологических образцов.

Выделение нуклеиновых кислот из образца - важнейший этап подготовки биологических образцов для проведения биохимических и/или диагностических процессов, таких как амплификация, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени, клонирование, секвенирование, гибридизация и др. Известны различные методы выделения нуклеиновых кислот (Basic DNA and RNA Protocols, Methods in Molecular Biology. V. 58 / Harwood A.J. (editor). New Jersey: Humana Press, Totowa, 1994, pp. 3-7), и выбор конкретного метода при проведении того или иного исследования осуществляют на основе таких факторов, как высокий выход целевой нуклеиновой кислоты, быстрота метода, высокая пропускная способность метода, высокая степень чистоты целевой нуклеиновой кислоты и др. (Klintschar М., Neuhuber F. Evaluation of an Alkaline Lysis Method for the Extraction of DNA from Whole Blood and Forensic Stains for STR Analysis // J. Forensic Sci. 2000, vol. 45, pp. 669-673).

Несмотря на известность множества методов выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов, основными недостатками большинства из них являются непригодность для автоматизации пробоподготовки и высокий риск контаминации белками, липидами, углеводами и другими примесями, которые могут препятствовать реализации необходимых реакций или методов исследования (Moss D., Harbison S.A., Saul D.J. An Easily Automated, Closed-Tube Forensic DNA Extraction Procedure Using a Thermostable Proteinase // Int. J. Legal Med. 2003, vol. 117, pp. 340-349; Buckingham L. and Flaws M.L. Molecular Diagnostics: Fundamentals, Methods, & Clinical Applications, F.A. Davis, Philadelphia, Pa, USA, 2007), а также обеспечиваемая сохранность выделенной нуклеиновой кислоты, необходимая для успешного проведения реакции или исследования (Cseke L.J., Kaufman Р.В., Podila G.K., and Tsai С.-J. Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine. // CRC Press, Boca Raton, Fla, USA, 2^nd edition, 2004).

Все методы выделения нуклеиновых кислот по основным физическим и биохимическим признакам можно разделить на жидкофазные и твердофазные.

Известны твердофазные методы выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов, задействующие ионообмен в водном растворе на анионообменных материалах (Teeters М.А., Conrardy S.E., Thomas B.L., et al. Adsorptive Membrane Chromatography for Purification of Plasmid DNA // Journal of Chromatography A. 2003, vol. 989, pp. 165-173), водородные связи с немодифицированной гидрофильной матрицей, такой как матрица на основе кварца (Breadmore М.С., Wolfe K.А., Arcibal I.G., et al. Microchip-Based Purification of DNA from Biological Samples // Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 1880-1886), механизм исключения нуклеиновых кислот по размеру и др. Данные методы имеют существенные ограничения, в частности, не позволяют удалить из образца все возможные примеси (Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. Chelex 100 as a Medium for Simple Extraction of DNA for PCR Based Typing from Forensic material // BioTechniques. 1991. V. 10, N 4. P. 506-513).

Одним из наиболее эффективных методов выделения и очистки нуклеиновых кислот является сорбция нуклеиновых кислот из образца на поверхности частиц из диоксида кремния, диспергированных в растворе, содержащем хаотропный агент, например, гуанидин хлорид, гуанидин изотиоцианат, мочевина, йодид натрия и др. (K.-Н. Esser, W.Н. Marx, and Т. Lisowsky. Nucleic acid free matrix: regeneration of DNA binding columns. // BioTechniques, vol. 39, no. 2, pp. 270-271, 2005). Данный метод впервые был предложен Willem R. Boom (см. патент США US 5234809, 10.08.1993) и впоследствии нашел свое развитие в решениях других исследователей (патент США US 5973138, 26.10.1999; патент США US 5705628, 06.01.1998).

Хаотропные агенты обеспечивают разрушение клеточных мембран и лизис клеток образца с высвобождением нуклеиновой кислоты. Использование самого по себе хаотропного агента для выделения и очистки нуклеиновых кислот также было описано в публикации Vogelstein В., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. // Proceedings of the National Academy of Sciences, 1979, vol. 76, No. 2, pp. 615-619.

Метод, предложенный в патенте США US 5234809, включает в себя лизис клеточных мембран и внутриклеточных белков образца под действием высоких концентраций хаотропного агента в присутствии протеаз и смешивание образца с частицами диоксида кремния в присутствии высоких концентраций хаотропного агента, сопровождающееся обратимым связыванием нуклеиновых кислот образца с частицами, с последующим сбором частиц, например, при помощи пипетора Таджима (патент США US 5702950, 30.12.1997; патент США US 6331277, 18.12.2001) и отмывкой примесей хаотропным агентом с последующей отмывкой хаотропного агента 80%-м этанолом.

Описанные выше методы малопригодны для обработки большого количества образцов. Кроме того, они не обеспечивают возможность селективного выделения нуклеиновых кислот или фрагментов нуклеиновых кислот определенного вида или определенного размера.

Еще одним подходом к выделению нуклеиновых кислот из образца является использование сорбентов на основе материалов, обладающих магнитными свойствами. Использование таких сорбентов является надежным и простым способом выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов, позволяющим автоматизировать процедуру выделения в случае, когда необходима обработка большого числа образцов. Для выделения нуклеиновых кислот используют магнитные носители с иммобилизированными аффинными лигандами, или магнитные носители, изготовленные из биополимера, увеличивающего аффинность к нужной нуклеиновой кислоте, или магнитные носители, изготовленные из синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или на основе неорганических магнитных материалов, таких как оксид железа с модифицированной поверхностью. Создано множество коммерчески доступных сорбентов для выделения ДНК, РНК и плазмидной ДНК, например, частицы AGOWA^® mag (Agowa, Германия), Dynabeads^® DNA (Invitrogen, Норвегия), магнитные гранулы GenoPrep^® DNA (Qiagen Company, Норвегия) и др. (Berensmeier S. Magnetic Particles for the Separation and Purification of Nucleic Acids // Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, Vol. 73, pp. 495-504).

Несмотря на известность большого числа методов выделения нуклеиновых кислот, значительную их часть составляют неселективные методы выделения, не позволяющие осуществлять сорбцию нуклеиновых кислот (или фрагментов нуклеиновых кислот) определенной длины. В частности, по-прежнему сохраняется потребность в расширении арсенала средств выделения нуклеиновых кислот на основе магнитных частиц, которые были бы пригодны для селективной экстракции фрагментов нуклеиновых кислот длиной более 500 пар нуклеотидов (далее - п.н.). Задача селективного выделения таких фрагментов является весьма актуальной, поскольку фрагменты молекул нуклеиновых кислот длиной более 500 п.н. широко используются для создания геномных библиотек для последующего секвенирования и т.д.

Среди прочих средств, обеспечивающих возможность автоматизации выделения нуклеиновых кислот из образца, используются магнитные частицы со стеклянным покрытием (Hoorfar J., Cook N., et al. Making Internal Amplification Control Mandatory for Diagnostic PCR. // J. Clin. Microbiol. 2003, V. 41, P. 5835). Образец, содержащий нуклеиновые кислоты, суспендируют совместно с частицами в водном растворе в присутствии магнитного поля. При этом нуклеиновая кислота связывается со стеклянным покрытием частиц. Затем, связанная с частицами, она проходит те же стадии экстракционного процесса, что и в методе по патенту США US 5234809: после серии отмывок в пробе остается нуклеиновая кислота, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Хотя такой метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к последующей амплификации нуклеиновых кислот и может быть легко модифицирован для использования на автоматизированных пипеттирующих рабочих станциях, при его реализации возможны потери целевых нуклеиновых кислот или фрагментов нуклеиновых кислот вследствие их необратимой сорбции на носителе, а также потери целевой нуклеиновой кислоты в процессе многочисленных отмывок, что особенно важно при работе с образцами, содержащими небольшие количества нуклеиновых кислот (Suffys Ph., Vanderborght P.R., Barros dos Santos P., et al. Inhibition of the Polymerase Chain Reaction by Sputum Samples from Tuberculosis Patients after Processing Using a Silica-guanidinium-thiocyanate DNA Isolation Procedure. // do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2001, vol. 96, №8, pp. 1137-1139).

В заявке на патент США US 20040126902, 01.07.2004 описан выбранный в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения магнитный сорбент на основе частиц ферромагнитного оксида железа, такого как маггемит (γ-Fe₂O₃), магнетит (Fe₃O₄) марганцево-цинкового феррита (Mn_1-xZn_xFe₂O₄), кобальто-железного сплава (FeCo) или бариевого феррита (BaFe₁₂O₁₉), диспергируемых в буфере, содержащем 1÷10 М хаотропного агента, и имеющих покрытие на основе диоксида кремния и соединения алюминия, а также способ выделения нуклеиновых кислот, использующий данный сорбент. Частицы сорбента характеризуются удельной намагниченностью насыщения 10÷80 А⋅м²/кг, коэрцитивной силой 0,80÷15,92 кА/м и средним размером частиц 0,1÷10 мкм. В наиболее предпочтительном варианте реализации известного решения соединение алюминия представляет собой оксид алюминия, такой как Al₂O₃, или соли алюминия, такие как алюминия хлорид, алюминия ацетат, алюминия сульфат и т.д.

Для указанного известного магнитного сорбента характерно неконтролируемое образование агломератов частиц еще до начала сорбции нуклеиновых кислот из образца, особенно в том случае, если параметры обработки магнитного сорбента при его изготовлении были нарушены (см. описание US 20040126902, абзацы [0130], [0135]). Такая неконтролируемая агломерация частиц магнитного сорбента приводит к уменьшению полезной сорбирующей поверхности частиц и снижению сорбции нуклеиновых кислот из образца. В свою очередь, высокая седиментационная устойчивость мелких частиц магнитного сорбента снижает эффективность полного отделения в магнитном поле частиц магнитного сорбента из среды, содержащей образец совместно с суспендированным в нем магнитным сорбентом. Еще одним недостатком магнитного сорбента согласно US 20040126902 является то, что он обеспечивает неспецифическую сорбцию всех разновидностей нуклеиновых кислот, содержащихся в образце, и не предоставляет возможности селективной сорбции и экстракции молекул нуклеиновых кислот и фрагментов молекул нуклеиновых кислот длиной около или более 500 п.н.

Кроме того, как показано в работе Zhongyuan Lv, Qi Wang, Yuezhen Bin, Ling Huang, Rong Zhang, Panpan Zhang, and Masaru Matsuo. Magnetic Behaviors of Mg- and Zn-Doped Fe₃O₄ Nanoparticles Estimated in Terms of Crystal Domain Size, Dielectric Response, and Application of Fe₃O₄/Carbon Nanotube Composites to Anodes for Lithium Ion Batteries // The Journal of Physical Chemistry C, 2015, 119 (46), p. 26128-26142, существует ограничение на количество вводимых допирующих ионов цинка Zn²⁺, обеспечивающих повышение удельной намагниченности магнитного сорбента, необходимой для более эффективной сорбции молекул нуклеиновой кислоты.

Задачей настоящего изобретения является создание магнитного сорбента, который устраняет перечисленные выше недостатки ближайшего аналога и других известных решений, а также обеспечивает селективную сорбцию молекул нуклеиновых кислот и/или фрагментов молекул нуклеиновых кислот длиной более 500 п.н.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности магнитного выделения нуклеиновых кислот и, дополнительно, повышении селективности сорбции нуклеиновых кислот и/или фрагментов нуклеиновых кислот длиной более 500 п.н.

Нуклеиновая кислота и/или фрагмент нуклеиновой кислоты может представлять собой плазмидную ДНК, геномную ДНК, кДНК, линейную ДНК, РНК, рибозим, аптамер либо рекомбинантную или полученную в результате химического синтеза нуклеиновую кислоту, либо их фрагмент.

Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается тем, что магнитный сорбент для выделения и очистки нуклеиновых кислот представляет собой водную дисперсию композиционного материала, состоящего из магнитных наночастиц, распределенных в матрице диоксида кремния, причем водная дисперсия содержит реагент для увеличения ионной силы раствора, хаотропный реагент и соосадитель нуклеиновых кислот (копреципитант).

Как показали многочисленные испытания, для магнитного сорбента согласно изобретению характерно управляемое и обратимое образование агломератов частиц сорбента (далее также «первичные частицы»). Кроме того, магнитный сорбент согласно изобретению отличается от аналогов, в частности ближайшего аналога, улучшенными магнитными характеристиками, такими как более высокая намагниченность конечных агломератов и коэрцитивная сила, большая удельная сорбирующая поверхность первичных частиц. В предпочтительном варианте исполнения изобретения первичные частицы имеют диаметр от 20 до 40 нм и, наиболее предпочтительно, удельную площадь поверхности от 215 до 310 м²/г, что обусловливает их особенно высокую сорбционную емкость по отношению к нуклеиновым кислотам.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация композиционного материала в водной дисперсии составляет 10÷100 г/л.

В качестве хаотропного агента могут быть использованы гуанидин изоцианат, гуанидин хлорид, мочевина, тиомочевина, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат (например, коммерчески доступный как TWEEN^® 20), октилфеноксиполиэтоксиэтанол (например, коммерчески доступный как Triton^® X-100) и др.

Далее, в отличие от магнитного сорбента согласно ближайшему аналогу, для магнитного сорбента согласно изобретению характерна контролируемая агломерация первичных частиц. Это достигается, в частности, введением в водную дисперсию реагента для увеличения ионной силы раствора. В качестве реагента для изменения ионной силы раствора предпочтительно использовать хлорид натрия, хлорид калия или хлорид магния. Дополнительно к этому агломерацию первичных частиц сорбента можно контролировать путем изменения путем изменения интенсивности механического воздействия на среду.

В качестве механического воздействия в предпочтительном, но не ограничивающем варианте исполнения изобретения могут использоваться обработка на магнитной или механической мешалке, обработка на шейкере, вортексирование. При этом в случае ослабления интенсивности механического воздействия на среду агрегация частиц усиливается вплоть до образования агломератов диаметром по меньшей мере 1 мкм, что упрощает и ускоряет последующее отделение частиц от жидкой фазы в присутствии магнитного поля. В случае же усиления интенсивности механического воздействия на среду агломераты частиц магнитного сорбента, напротив, распадаются до первичных частиц диаметром 20÷40 нм, для которых характерна высокая удельная площадь поверхности (от 215 до 310 м²/г) и высокая сорбционная емкость в отношении нуклеиновых кислот, в том числе в отношении молекул нуклеиновых кислот или фрагментов молекул нуклеиновых кислот длиной от 200 до 500 п.н.

Композиционный материал магнитного сорбента согласно изобретению представляет собой частицы, сформированные из магнитных наночастиц в матрице диоксида кремния. Слой диоксида кремния формируют любой подходящей методикой, описанной в уровне техники, в частности, путем гидролиза тетраэтилоксисилана (см. например, Boday, Dylan J.; Wertz, Jason Т.; Kuczynski, Joseph P. (2015). ''Functionalization of Silica Nanoparticles for Corrosion Prevention of Underlying Metal''. In: Kong, Eric S.W. Nanomaterials, Polymers and Devices: Materials Functionalization and Device Fabrication. John Wiley & Sons. pp. 121-140). В предпочтительном варианте исполнения изобретения частицы, образующие магнитный сорбент, содержат от 10 до 60 мас. % диоксида кремния.

В качестве соосадителя нуклеиновых кислот рамках настоящего изобретения могут быть использованы этанол, изопропанол, бутанол, полиэтиленгликоль, линейный полиакриламид, декстран, гликоген и др.

В предпочтительном варианте исполнения изобретения в качестве магнитных наночастиц используют магнетит (Fe₃O₄), допированный катионами цинка и меди, что обеспечивает дальнейшее увеличение намагниченности магнитных наночастиц и, как следствие, увеличение сорбции нуклеиновых кислот и/или их фрагментов из образца. Повышение величины намагниченности относительно ее значений для магнетита обеспечивается определенным соотношением ионов меди Cu²⁺ и цинка Zn²⁺, вводимых в магнетит. Хорошо известно, что магнетит имеет две подрешетки - А и В, образованные соответственно ионами железа Fe²⁺ и ионами железа Fe³⁺ (Григорьев В.М. Магнетит. Большая советская энциклопедия. // М.: Советская энциклопедия, 1969-1978). Также известно, что введение ионов металла, например ионов цинка Zn²⁺, в подрешетку А магнетита повышает его намагниченность (Lin С.Н., Kuo Р.С, Pan J.L., Huang D.R. Effects of Zn ion on magnetic properties of Fe₃O₄ magnetic colloids // Journal of Applied Physics. 1996. Vol. 79. P. 6035; Marand Z.R. el al. Study of magnetic and structural and optical properties of Zn doped Fe₃O₄ nanoparticles synthesized by co-precipitation method for biomedical application. // Nanomedicine Journal, vol. 1, No.4, Summer 2014, pp. 238-247).

Таким образом, упомянутый ранее эффект ограничения сорбции нуклеиновых кислот из раствора при помощи магнитных сорбентов (Zhongyuan Lv, et al., 2015), допированных только катионами цинка, может быть снижен и даже устранен дополнительным допированием катионами меди.

Как показали испытания, введение в кристаллическую решетку магнетита катионов металлов может приводить к увеличению намагниченности магнетита без ухудшения сорбционных свойств магнитного сорбента по отношению к нуклеиновым кислотам или фрагментам нуклеиновых кислот, в том числе длиной по меньшей мере 500 н.п. Так, согласно еще одному варианту исполнения изобретения, указанный дополнительный эффект достигается за счет того, что наряду с катионами цинка в кристаллическую решетку магнетита вводят катионы меди и катионы кобальта, причем является предпочтительным, если катионы меди и цинка вводятся в подрешетку А магнетита, а катионы кобальта - в подрешетку В магнетита.

Предположительно, этот эффект объясняется тем, что ионы меди Cu²⁺, будучи легче ионов цинка Zn²⁺ и имеющие меньший ионный радиус, замещают катионы железа в подрешетке А при соблюдении определенного соотношения катионов цинка и ионов меди, тогда как ионы кобальта Со²⁺, снижая суперобменное взаимодействие между ионами Fe³⁺ в подрешетке В магнетита, обеспечивают возможность дополнительного влияния ионов Cu²⁺ и Zn²⁺ на рост намагниченности частиц.

Предпочтительно, если магнитная составляющая композиционного материала, т.е. магнитные наночастицы, представляет собой частицы наноразмерного магнетита диаметром 5÷10 нм. Согласно приведенным выше вариантам исполнения изобретения, частицы наноразмерного магнетита могут быть допированы как ионами меди Cu²⁺ и цинка Zn²⁺, так и ионами кобальта Со²⁺, меди Cu²⁺ и цинка Zn²⁺. Во втором, наиболее предпочтительном варианте указанный наноразмерный магнетит характеризуется формулой Co_xZn_yCu_zFe_3-x-y-zO₄ и обладает ферримагнитными свойствами.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения для наноразмерного магнетита Co_xZn_yCu_zFe_3-x-y-zO₄ значение x лежит в диапазоне от 0,003 до 0,084, значение y - от 0,003 до 0,084, значение z - от 0,0465 до 0,093. Содержание катионов меди, предпочтительно, составляет от 0,1 до 2,8 атомных процента (далее - ат. %), катионов цинка - от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов кобальта - от 1,5 до 3 ат. %. Предлагаемое отношение допирующих ионов Cu²⁺, Zn²⁺ и Со²⁺ обеспечивает возможность осуществления процесса обратимого управляемого образования агломератов частиц из наноразмерного магнетита, допированного катионами кобальта, меди и цинка, причем указанные агломераты в наиболее предпочтительном воплощении имеют диаметр по меньшей мере 1 мкм.

В одном из предпочтительных воплощений изобретения удельная намагниченность частиц наноразмерного магнетита составляет не менее 75 А⋅м²/кг, но не более 95 А⋅м²/кг. В другом предпочтительном воплощении изобретения указанная удельная намагниченность составляет от 70 до 85 А⋅м²/кг либо от 70 до 95 А⋅м²/кг.

Предпочтительно, если частицы наноразмерного магнетита характеризуются коэрцитивной силой от 10 до 15 кА/м, а их остаточная намагниченность составляет до 25 А⋅м²/кг.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения описанного выше магнитного сорбента для выделения и очистки нуклеиновых кислот. Согласно изобретению, указанный способ включает получение композиционного материала, состоящего из магнитных наночастиц, распределенных в матрице диоксида кремния, и получение водной дисперсии указанного композиционного материала, также содержащей реагент для увеличения ионной силы раствора и соосадитель нуклеиновых кислот - копреципитанта.

Описанные выше варианты исполнения магнитного сорбента согласно изобретению и обеспечиваемые ими преимущества в сравнении с известными из уровня техники в полной мере применимы и к описанию способа получения магнитного сорбента. Так, предпочтительно, если в качестве магнитных частиц используют частицы наноразмерного магнетита.

Указанные частицы наноразмерного магнетита могут быть допированы катионами цинка и меди либо, что более предпочтительно, катионами кобальта, цинка и меди. Во втором случае является предпочтительным, если катионы цинка и меди вводят в подрешетку А частиц наноразмерного магнетита, а катионы кобальта вводят в подрешетку В частиц наноразмерного магнетита.

При допировании частиц наноразмерного магнетита катионами кобальта, цинка и меди магнетит характеризуется формулой CoxZnyCuzFe3-x-y-zO4, где предпочтительные значения индексов следующие: x - от 0,003 до 0,084, y - от 0,003 до 0,084, z - от 0,0465 до 0,093.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения катионов меди составляет от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов цинка - от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов кобальта - от 1,5 до 3 ат. %.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ выделения молекул нуклеиновых кислот, заключающийся в добавлении эффективного количества суспензии подробно описанного выше магнитного сорбента к образцу нуклеиновой кислоты, инкубирование полученной смеси, отделение твердой фазы с адсорбированными молекулами нуклеиновых кислот. Под выделением молекул нуклеиновых кислот может пониматься, в частности, сорбция молекул нуклеиновых кислот.

На стадии отделения твердой фазы с адсорбированными молекулами нуклеиновых кислот в рамках настоящего изобретения могут формировать агломераты частиц сорбента диаметром по меньшей мере 1 мкм.

Формирование агломератов контролируют методом изменения ионной силы раствора, или методом изменения интенсивности механического воздействия на среду, или комбинацией указанных методов. В случае использования метода изменения интенсивности механического воздействия целесообразно магнитную мешалку, или механическую мешалку, или производить обработку на шейкере, или применять вортексирование.

Приведенные далее примеры раскрывают один из предпочтительных вариантов осуществления изобретения с использованием в качестве магнитных частиц наноразмерного магнетита Co_xZn_yCu_zFe_3-x-y-zO₄. Данные примеры, однако, не должны рассматриваться как ограничивающие объем притязаний.

Пример 1. Синтез магнитного сорбента.

В качестве магнитной составляющей сорбента (магнитных наночастиц) использовали частицы наноразмерного магнетита с формулой Co_xZn_yCu_zFe_3-x-y-zO₄ при следующем содержании металлов (ат. %): Zn - 2,8; Со - 2,8; Cu - 3,1; Fe - 91,3. Для их получения растворяли 10 г Fe(NO₃)₃⋅9Н₂O, 3,76 г FeSO₄⋅7H₂O, 2,6 г безводного цитрата натрия и 0,1 г карбоксиметилцеллюлозы в 150 мл дистиллированной воды. Раствор дополнительно выдерживали на магнитной мешалке в течение 20 мин. К полученному раствору приливали раствор, содержащий Zn(NO₃)₂, Со(NO₃)₂ и Cu(NO₃)₃ в количествах, соответствующих составу материала. Общая концентрация солей составляла примерно 1 моль/л. В полученную смесь при интенсивном перемешивании капельно приливали раствор, содержащий NaOH и триэтаноламин с концентрациями соответственно 0,1 и 0,05 моль/л до достижения рН ~ 9,2. Наблюдали выпадение черного осадка, который последовательно отмывали пять раз 1% раствором NaCl и три раза дистиллированной водой методом магнитной декантации с использованием постоянного магнита с индукцией 2 Тл.

Для формирования частиц, образующих композиционный материал, готовили 300 мл суспензии синтезированных на предыдущей стадии частиц наноразмерного магнетита в 70% этаноле. При постоянном перемешивании в герметичной колбе на 500 мл в суспензию последовательно вводили 0,5 г поливинилового спирта, 0,58 мл тетраметилортосилоксана (ТМОС) и 1 мл концентрированной соляной кислоты (HCl) как катализатора гидролиза ТМОС. Полученную смесь подвергали ультразвуковой обработке с частотой 44 кГц в течение 30 мин. при охлаждении и выдерживали в течение 9 часов для завершения процесса гидролиза. Осадок последовательно отмывали три раза 70% раствором этанола, пять раз 1% раствором NaCl и три раза дистиллированной водой методом магнитной декантации с использованием постоянного магнита.

Химический состав полученных частиц композиционного материала характеризуется формулой [Co_xZn_yCu_zFe_3-x-y-zO₄]*SiO₂ при содержании SiO₂ 25 мол. % относительно оксидной фазы.

Пример 2. Структурные и функциональные свойства магнитного сорбента.

По данным рентгенофазового анализа и ИК-спектроскопии частицы твердой фазы магнитного сорбента, полученного в Примере 1, представлены аморфной матрицей SiO₂ с распределенными в ней частицами твердого раствора замещения Co_xZn_yCu_zFe_3-x-y-zO₄.

Согласно элементному анализу методами рентгеновского микроанализа и атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой, состав твердого раствора отвечает формуле Co_0,084Zn_0,084Cu_0,093Fe_2,739O₄, что соответствует введенному в кристаллическую решетку наноразмерного магнетита количеству легирующих металлов. По данным просвечивающей электронной микроскопии композиционный материал магнитного сорбента представлен наноразмерными частицами с формой, близкой к сферической, и диаметром 20÷30 нм. Удельная площадь поверхности полученного порошкообразного магнитного сорбента составляет 310 м²/г (оценка по методу БЭТ; см.: Brunauer, Stephen; Emmett, P.H.; Teller, Edward (1938). Adsorption of Gases in Multimolecular Layers. // Journal of the American Chemical Society, vol. 60, №2, pp. 309-319). Удельная намагниченность насыщения магнитного сорбента составляет 82 А⋅м²/кг, коэрцитивная сила - 15 кА/м, остаточная намагниченность - 23 А⋅м²/кг.

Пример 3. Характеристика процессов агрегации и дезагрегации в суспензии магнитного сорбента.

Как было указано в Примере 2, наноразмерные частицы магнитного сорбента, полученного в Примере 1, по данным электронной микроскопии имеют размер 20÷30 нм, что обеспечивает их высокую сорбционную емкость. Методом лазерной дифракции (статического рассеяния света) установлено, что после умеренного перемешивания суспензии магнитного сорбента в растворе NaCl (15 г/л) размер частиц твердой фазы составляет примерно 1,35 мкм, что свидетельствует об образовании агломератов. Такие агломераты быстро и полно сепарируются в поле стандартного магнитного штатива на стадии отделения магнитного сорбента от жидкой фазы. Наличие агломератов со средним диаметром примерно 1,3 мкм подтверждают данные сканирующей электронной микроскопии. Похожие результаты (около 1,4 мкм) для данной суспензии получены на основании седиментационного анализа, выполненного с помощью фотометрической фиксации скорости оседания частиц. Для доказательства обратимого характера агломерации изучаемую суспензию подвергали интенсивному встряхиванию или ультразвуковому диспергированию. Результаты дисперсионного анализа суспензии методом лазерной дифракции свидетельствуют о том, что в обоих случаях произошло разрушение агломератов до частиц с гидродинамическим диаметром соответственно примерно 65 и 60 нм. Эти значения хорошо согласуются с размерами первичных частиц. Завышенные результаты дифракционного анализа по сравнению с электронно-микроскопическим анализом являются закономерными и объясняются наличием объемной гидратной оболочки магнитных наночастиц, уменьшающей скорость их диффузии. Методом лазерной дифракции также установлено время, необходимое для образования агломератов после их разрушения. Оно составило примерно 3 мин., что достаточно для установления равновесия в системе магнитный сорбент - молекулы нуклеиновых кислот для большинства методик выделения с помощью магнитных сорбентов. Таким образом, были разработаны условия (определенные размер первичных частиц, намагниченность, коэрцитивная сила, ионная сила дисперсионной среды), которые позволяют осуществлять обратимую регулируемую агломерацию частиц на разных стадиях выделения нуклеиновых кислот за счет изменения интенсивности механического воздействия на суспензию.

Пример 4. Приготовление лизирующего буфера для выделения геномной ДНК.

К 2 г полиэтиленгликоля (PEG) добавили 500 мл 0,9% раствора хлорида натрия; смесь перемешивали до полного растворения PEG. Затем добавили 5 г гуанидина изоцианата, и перемешивание продолжали до полного растворения твердого осадка. Общий объем раствора довели до 100 мл 0,9% раствором хлорида натрия.

Пример 5. Приготовление лизирующего буфера для селективного выделения высокомолекулярной ДНК.

К 18 г полиэтиленгликоля (PEG) добавили 20 мл 5М раствора хлорида натрия, 100 мкл Твин-20, 1 мл Трис-HCl (1М, рН=8) и 200 мкл 0,5М ЭДТА. Смесь перемешивали до полного растворения PEG. Общий объем раствора довели до 100 мл деионизованной водой.

Пример 6. Приготовление суспензии магнитного сорбента.

К 4 г магнитного сорбента из Примера 1 добавили небольшое количество лизирующего буфера из Примера 5. Смесь перетирали шпателем до получения густой суспензии, к которой затем добавляли лизирующий буфер до достижения общего объема 100 мл. Полученную смесь встряхивали на вортексе до образования однородной суспензии.

Пример 7. Сорбция геномной ДНК человека.

Сорбцию проводили из стандартизированных образцов ДНК человека с концентрациями C₁=500 нг/мкл, С₂=250 нг/мкл, С₃=50 нг/мкл, С₄=5 нг/мкл. Для этого к 100 мкл образца ДНК добавляли 5 мкл суспензии магнитного сорбента из Примера 6 и 900 мкл лизирующего буфера из Примера 4. Смесь выдерживали пять минут при 60°С, после чего магнитные частицы с сорбированной ДНК отделяли в поле стандартного магнитного штатива, супернатант отбрасывали. К остатку добавляли 500 мкл 70% раствора этанола. Суспензию встряхивали, супернатант отбрасывали. Аналогичным образом частицы промывали в 200 мкл ацетона. Магнитный сорбент сушили в течение двух минут при 60°С. Сорбированную ДНК элюировали 100 мкл ТЕ-буфера (рН=8,0) в течение пяти минут при 60°С. Затем элюированную ДНК отбирали в чистую пробирку.

В качестве набора сравнения использовали набор реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «МАГНО-сорб» производства ФБУН «Центральный НИИ Эпидемиологии Росздравнадзора». Выделение ДНК проводили согласно инструкции по применению комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «МАГНО-сорб» производителя (см. www.interlabservice.ru/upload/iblock/5c7/МАГНО-copб (зарегистр)_ LA_160117.pdf).

Пример 8. Оценка количества выделенной ДНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).

Приготовили реакционную смесь согласно Таблице 1. В качестве специфичных олигонуклеотидов использовали праймеры и флуоресцентный зонд, специфичные к гену альбумина человека. Использовали реагенты для ПЦР (ПЦР буфер, смесь дНТФ и полимеразу с «горячим стартом») производства АО «Евроген». Реакцию ПЦР проводили на амплификаторе ДТ-Прайм производства ООО «ДНК-Технология». Протокол амплификации приведен в Таблице 2. Значения пороговых циклов для исходных образцов ДНК и образцов, полученных в результате выделения на исследуемом сорбенте или на наборе сравнения, представлены в Таблице 3.

Как следует из Таблицы 3, синтезированный магнитный сорбент проявляет эффективность сорбции геномной ДНК, схожую с таковой для сорбента сравнения.

Пример 9. Селективная сорбция высокомолекулярных фрагментов ДНК.

В качестве модельного раствора фрагментированной ДНК использовали маркер длины ДНК GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (ThermoFisher Scientific Inc, США), содержащий фрагменты синтетической ДНК от 100 до 3000 пар оснований. К 20 мкл раствора маркера длины ДНК добавляли различные объемы суспензии магнитного сорбента (от 50 мкл - 2.5 х, до 8 мкл - 0.4 х), приготовленной согласно Примеру 6 с использованием лизирующего буфера из Примера 5. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение пяти минут, после чего магнитные частицы с сорбированными фрагментами ДНК отделяли в поле стандартного магнитного штатива и супернатант отбрасывали. К остатку добавляли 500 мкл 70% раствора этанола. Суспензию встряхивали, спиртовой раствор отбрасывали. Аналогичным образом частицы промывали в 200 мкл ацетона. Магнитный сорбент сушили в течение двух минут при 60°С. Сорбированную ДНК элюировали 50 мкл ТЕ-буфера (рН=8,0) в течение пяти минут при 60°С. Затем элюированную ДНК отбирали в чистую пробирку.

Для проведения электрофореза отбирали от супернатанта и элюата по 20 мкл раствора и смешивали с 1 мкл буфера для загрузки в гель DNA Gel Loading Dye, 6Х (ThermoFisher Scientific Inc, США). Образцы наносили на 1,5% агарозный гель и проводили электрофорез при напряжении 100 В в течение 60 мин. Результаты суммированы в Таблице 4.

Как следует из Таблицы 4, синтезированный магнитный сорбент в присутствии определенных концентраций соосадителя ДНК (полиэтиленгликоля) способен селективно сорбировать фрагменты ДНК размером более 500 п.н. При этом исходный раствор обогащается низкомолекулярными фрагментами ДНК размером менее 500 п.н.

Изобретение относится к выделению и очистке нуклеиновых кислот и их фрагментов из биологических образцов. Предложен магнитный сорбент для выделения и очистки нуклеиновых кислот, представляющий собой водную дисперсию, содержащую композиционный материал, который представляет собой наночастицы магнетита, допированного катионами меди, цинка и кобальта. Наночастицы распределены в матрице диоксида кремния. Упомянутая дисперсия содержит также хаотропный агент и реагент для увеличения ионной силы раствора. Технический результат заключается в повышении эффективности магнитного выделения нуклеиновых кислот, повышении селективности сорбции нуклеиновых кислот и/или фрагментов нуклеиновых кислот длиной более 500 п.н. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 4 табл., 9 пр.

1. Магнитный сорбент для выделения и очистки нуклеиновых кислот, представляющий собой водную дисперсию, содержащую композиционный материал, представляющий собой наночастицы магнетита, допированного катионами меди, цинка и кобальта, общей формулы Co_xZn_yCu_zFe_3-x-y-zO₄, где х составляет от 0,003 до 0,084, у составляет от 0,003 до 0,084, z составляет от 0,0465 до 0,093, причем указанные наночастицы распределены в матрице диоксида кремния и причем указанная дисперсия содержит хаотропный агент и реагент для увеличения ионной силы раствора.

2. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что первичные частицы сорбента имеют размер 20÷40 нм.

3. Магнитный сорбент по п. 2, отличающийся тем, что первичные частицы сорбента имеют удельную площадь поверхности от 215 до 310 м²/г.

4. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что концентрация композиционного материала в водной дисперсии составляет 10÷100 г/л.

5. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что в качестве хаотропного реагента используется гуанидин изоцианат, гуанидин хлорид, мочевина, тиомочевина, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат, t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол.

6. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что реагент для увеличения ионной силы раствора представляет собой хлорид натрия, хлорид калия или хлорид магния.

7. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что содержание катионов меди составляет 0,1÷2,8 ат. %, катионов кобальта - 1,5÷3 ат. %, катионов цинка - 0,1÷2,8 ат. %.

8. Магнитный сорбент по п. 1, отличающийся тем, что магнитные частицы являются частицами наноразмерного магнетита размером менее 10 нм.

9. Магнитный сорбент по п. 8, отличающийся тем, что намагниченность частиц наноразмерного магнетита составляет не менее 75 А⋅м²/кг, но не более 95 А⋅м²/кг.

10. Магнитный сорбент по п. 8, отличающийся тем, что частицы наноразмерного магнетита характеризуются коэрцитивной силой 10÷15 кА/м и остаточной намагниченностью до 25 А⋅м²/кг.

11. Способ получения магнитного сорбента по любому из пп. 1-10, включающий: (а) стадию формирования композиционного материала, представляющего собой водную дисперсию наночастиц магнетита, допированного катионами меди, цинка и кобальта, общей формулы Co_xZn_yCu_zFe_3-x-y-zO₄, где х составляет от 0,003 до 0,084, у составляет от 0,003 до 0,084, z составляет от 0,0465 до 0,093, распределенных в матрице диоксида кремния, где стадия формирования указанного композиционного материала включает в себя распределение частиц наноразмерного магнетита в матрице диоксида кремния, (б) введение в указанную водную дисперсию хаотропного агента и реагента для увеличения ионной силы раствора, и (в) ультразвуковую обработку указанной водной дисперсии.

12. Способ по п. 11, в котором катионы цинка и меди входят в подрешетку А частиц наноразмерного магнетита, а катионы кобальта входят в подрешетку В частиц наноразмерного магнетита.

13. Способ по п. 11, в котором содержание катионов меди составляет от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов цинка - от 0,1 до 2,8 ат. %, катионов кобальта - от 1,5 до 3 ат. %.

14. Способ выделения нуклеиновых кислот, заключающийся в добавлении эффективного количества суспензии магнитного сорбента в лизирующем буфере к образцу, содержащему нуклеиновую кислоту, инкубирование полученной смеси, отделение твердой фазы с адсорбированными нуклеиновыми кислотами, добавление соосадителя (копреципитанта) и промывку указанной твердой фазы при механическом воздействии с последующим высушиванием промытой твердой фазы и элюированием из промытой твердой фазы адсорбированного продукта буферным раствором, отличающийся тем, что в качестве магнитного сорбента используют магнитный сорбент по любому из пп. 1-10.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что в качестве копреципитанта (соосадителя) используют этанол, изопропанол, бутанол, полиэтиленгликоль, линейный полиакриламид, декстран или гликоген.

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что в качестве соосадителя используют этанол.

17. Способ по п. 14, в котором на стадии отделения твердой фазы с адсорбированными молекулами нуклеиновых кислот формируют агломераты частиц сорбента диаметром по меньшей мере 1 мкм.

18. Способ по п. 17, в котором формирование агломератов контролируют изменением ионной силы раствора, или изменением интенсивности механического воздействия на среду, или обоими путями.

19. Способ по п. 18, в котором изменение интенсивности механического воздействия осуществляют с использованием магнитной мешалки, механической мешалки, обработкой на шейкере, вортексированием или ультразвуковым диспергированием.