СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОТРОПНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА СЕМЯН ЛОТОСА ОРЕХОНОСНОГО (NELUMBO NUCIFERA) Российский патент 2013 года по МПК A61K36/185 A61K131/00 A61P37/00 A61P39/06 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается разработки средств растительного происхождения на основе экстракта семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera), обладающих иммунотропной и антиоксидантной активностью.

В настоящее время имеется достаточно информации, позволяющей говорить о том, что иммунная система функционирует в тесном взаимодействии с другими системами организма - нервной, эндокринной и, в том числе, с биохимическими механизмами гомеостаза. При этом большое внимание исследователи обращают на тот факт, что именно активность антиоксидантной и иммунной систем определяет устойчивость клеток к повреждающим экзо- и эндогенным факторам и осуществляют общий иммунологический надзор за состоянием организма. Подтверждением тесного функционального взаимодействия иммунной и антиоксидантной систем является тот факт, что микробицидная активность фагоцитов реализуется через механизм так называемого "респираторного, окислительного или метаболического взрыва", в процессе которого в фагоцитирующих клетках резко возрастает продукция супероксидного анион-радикала, перекиси водорода, гидроксильного радикала и других прооксидантов. При этом кислородные метаболиты могут выходить за пределы фагоцита и в присутствии ионов железа инициировать процессы ПОЛ в мембранных системах.

В связи с вышесказанным, поиск средств, способных проявлять как иммунотропные свойства, так и модулирующее действие на биохимические процессы в организме, является, несомненно, актуальным.

В течение последних десятилетий в развитии клинической медицины прослеживается отчетливая тенденция к использованию широких возможностей модификаторов биологического ответа (biological response modifier), т.е. лекарственных препаратов системного действия. Представителями данной группы являются такие лекарственные растения как Lysium Barbarum, Rhodiola crenulata, Rhodiola kirilowii и др., оказывающие влияние на ключевые процессы жизнедеятельности и обладающие комплексным действием на организм человека и животных. Интерес также представляют биологически-активные вещества Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera) как потенциальная фармакологическая основа для последующего создания лекарственных препаратов указанной выше группы. Различные части (листья, стебли, семена, корни, зародыши) Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera), содержащие большое количество биологически активных веществ, широко используются в китайской, вьетнамской, индийской, арабской, тибетской медицине и обладают седативной, жаропонижающей, антисептической, мочегонной, гипогликемической, антиоксидантной, гепатопротективной и другими видами активности [1, 2, 3, 4, 5, 6, 8].

Известно использование экстракта цветков Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera) в составе чая, обладающего повышенными антиоксидантными свойствами [Патент РФ №2405355]. Однако авторы впервые экспериментально, на доклиническом этапе показали свойства экстракта семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera), именно как иммунотропного и антиоксидантного средства. Таким образом, заявленное решение соответствует критерию изобретения "Изобретательский уровень", так как оно явным образом не следует для специалиста уровня техники. Предлагаемое решение соответствует критерию изобретения "Промышленно применимо", так как оно с успехом может использоваться в практическом здравоохранении.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств с иммунотропной и антиоксидантной активностью растительного происхождения, получения препарата низкой себестоимости из доступного сырья за счет высокого содержания действующего вещества и воспроизводимости сырьевой базы.

Технический результат достигается тем, что в качестве средства с иммунотропной и антиоксидантной активностью применяют экстракт семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera).

Доказательная база, позволяющая сформировать концепцию данного изобретения, отражена в примерах.

Пример 1. Способ приготовления и химический анализ экстракта. Водно-спиртовой экстракт семян Лотоса орехоносного был приготовлен согласно протоколу WHO CG-04 [7]: 500 г семян высушивают, измельчают до порошкообразного состояния размером 0,2 мм и подвергают спиртовому экстрагированию 50%-ным этиловым спиртом в аппарате Сокслета при следующем соотношении компонентов, мас.%:

семена Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera) - 50 спирт этиловый - 50

После экстрагирования отгоняют спирт в ротационном испарителе. Выход активных веществ (флавоноидов) экстракта - около 5% вязкого смолообразного вещества. Раствор экстракта семян Лотоса орехоносного (0,5%-ный) готовят на физ. растворе.

Был проведен химический анализ экстракта семян Лотоса орехоносного. Проводили исследование состава жирных кислот методом газожидкостной хроматографии. Определяли общее содержание фенолов и флавоноидов колориметрическим методом. Высокоэффективной жидкостной хроматографией определяли состав флавоноидов полученного экстракта семян Лотоса орехоносного.

Таблица №1 Содержание жирных кислот (ЖК) в экстрактах семян Nelumbo nucifera Кислота Время удерживания, мин Содержание ЖК, % Лауриновая(C12:0) 6,933 35,26 Миристиновая (C14:0) 11,537 11,37 Пальмитиновая (C16:0) 12,333 10,10 Пальмитоолеиновая (C16:1) 13,283 0,84 Стеариновая (C18:0) 15,608 1,99 Олеиновая (C18:1) 16,092 4,25 Линолевая(C18:2) 17,073 12,76 Линолэлаидиновая (C18:2) 17,213 18,01 Линоленовая (C18:3) 18,290 1,28 δ-Линоленовая (C18:3) 18,717 0,59 Эйкозановая (C20:0) 21,592 1,82 цис-11-Эйкозеновая (C20:1) 23,827 1,67

Как видно из табл.1, основными жирными кислотами, входящими в состав экстракта семян Лотоса орехоносного, являются лауриновая (35,26%), линолэладиновая (18%), линолевая (12,76%) и миристиновая (11,37%) кислоты.

Общее содержание фенольных соединений и флавоноидов в экстракте семян лотоса представлено в табл.2.

Таблица №2 Содержание фенольных соединений и флавоноидов в экстракте семян лотоса Содержание фенольных соединений, г/100 г Содержание флавоноидов, г/100 г 1,70 0,82

Согласно проведенному нами химическому анализу основным активным компонентом экстракта семян Лотоса орехоносного при используемом способе экстрагирования были следующие флавоноиды: кверцетин, лейкоцианидин, изокверцетин, рутин.

Полученное средство рассматривается как основа для разработки нового препарата в будущем.

Пример 2. Влияние экстракта семян Лотоса орехоносного на активность иммунной системы.

Исследование выполнено на 132 самках белых беспородных крыс средней массой 220 г. Животные были разделены на следующие группы: контроль 1 (интактный), контроль 2 (животные, получавшие внутрижелудочно физиологический раствор) и опыт (№1-№5) - животные, получавшие внутрижелудочно раствор экстракта семян Лотоса орехоносного в дозе 50 мг/кг в течение 7, 14, 21, 28 и 42 дней соответственно.

Оценка иммунотропной активности проводилась на основе определения общего количества лейкоцитов, процентного соотношения между популяциями лейкоцитов, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа (латексный тест по изучению фагоцитарной активности нейтрофилов). О наличии антиоксидантных свойств судили по уровню ТБК-активных продуктов в тканях печени, сердца и плазме крови. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке с использованием критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони.

В ходе экспериментов было выявлено, что у животных, подверженных влиянию экстракта семян Лотоса орехоносного на протяжении 7 дней, происходило увеличение практически в 2 раза общего количества лейкоцитов. Введение же экстракта на протяжении 14 дней приводило к небольшому снижению общего количества лейкоцитов, тогда как дальнейшее применение изучаемого средства не сопровождалось достоверно значимыми изменениями числа белых клеток крови (табл.3).

Таблица 3 Влияние экстракта семян Лотоса орехоносного при разной продолжительности введения на общее количество лейкоцитов Экспериментальные группы Лейкоциты, M±m, ×10⁹/л Контроль 1 (интактный), n=12 3,9±0,47 Контроль 2 (физ. раствор) 7 дней (n=10) 1,2±0,18*** 14 дней (n=10) 3,9±0,20 21 день (n=10) 3,7±0,26 28 дней (n=10) 3,1±0,32 42 дня (n=15) 2,6±0,30* Экстракт Лотоса орехоносного 7 дней (n=10) 2,6±0,19* ### 14 дней (n=10) 3,2±0,18 # 21 день (n=10) 3,3±0,15 28 дней (n=10) 3,8±0,23 42 дня (n=15) 3,0±0,30 Условные обозначения: * - достоверность различий между группами животных по сравнению с интактным контролем; * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001; # - достоверность различий между животными, получавшими экстракт семян Лотоса орехоносного и контролем 2; # - p<0,05; ## - p<0,01; ### - p<0,001.

Анализ изменений лейкоцитарной формулы под влиянием экстракта семян Лотоса орехоносного при введении в течение 7 и 14 дней показал нарастание с разной степенью достоверности относительного количества моноцитов и нейтрофилов на фоне снижения числа лимфоцитов, что свидетельствует о вовлечении в реализацию иммунотропного действия экстракта семян Лотоса орехоносного при указанном курсе макрофагально-фагоцитарного звена иммунитета (табл.4). При введении экстракта семян Лотоса орехоносного в течение 21 дня показатели крови стабилизировались, приближаясь к значениям в контроле 2 (p>0,05) (табл.4). По мере увеличения сроков применения изучаемого экстракта (28-42 дня) происходило нарастание относительного числа лимфоцитов (p<0,001 и p<0,05) при одновременном снижении и нейтрофилов и моноцитов (p<0,001), что свидетельствует об активирующем действии экстракта семян Лотоса орехоносного при продолжительном применении на специфическое звено иммунореактивности (табл.4).

Таблица №4 Влияние экстракта семян Лотоса орехоносного при разной продолжительности введения на показатели лейкоцитарной формулы Экспериментальные группы Нейтрофилы, M±m, % Лимфоциты, M±m, % Эозинофилы,
M±m, % Моноциты,
M±m, % Контроль 1 (интактный), n=12 28,9±2,20 66,6±2,07 2,2±0,32 2,2±0,33 Контроль 2
(физ. раствор) 7 дней (n=10) 27,1±2,97 67,4±2,61 3,1±0,80 2,4±0,34 14 дней (n=10) 37,2±2,91* 57.2±2,94* 2,7±0,49 2,9±0,61 21 день (n=10) 41,0±2,99** 51,6±5,22** 0,9±0,31** 6,4±2,32 28 дней (n=10) 27,3±3,40 52,8±4,30 3,6±1,00 16,2±3,25*** 42 дня (n=15) 28,5±4,43 46,5±3,54*** 2,8±0,64** 22,2±5,84** Экстракт Лотоса орехоносного 7 дней (n=10) 51,2±4,97***### 43,8±5,12***### 2,0±0,51 3,9±0,65* 14 дней (n=10) 44,6±3,80** 50,3±4,09** 1,6±0,42 3,4±0,58 21 день (n=10) 40,1±3,52* 55,6±3,18** 2,1±0,71 6,2±2,00 28 дней (n=10) 19,5±2,24* 71,0±2,91 ## 4,6±0,64** 5,0±1,33*### 42 дня (n=15) 25,4±2,39 61,0±3,35# 5,0±0,78* # 8,6±2,87*### Условные обозначения: * - достоверность различий между группами животных по сравнению с интактным контролем; * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001; # - достоверность различий между животными, получавшими экстракт семян Лотоса орехоносного и контролем 2; # - p<0,05; ## - p<0,01; ### - p<0,001.

Что касается функционального состояния лейкоцитов, то отмечено, что введение экстракта семян Лотоса орехоносного в течение 7 дней приводило к некоторому подавлению фагоцитарной активности нейтрофилов по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы №2 (табл.5).

Таблица №5 Влияние экстракта семян Лотоса орехоносного при разной продолжительности введения на показатели лейкоцитарной формулы Экспериментальные группы Фагоцитарный индекс,
M±m, % Фагоцитарное число,
M±m Контроль 1 (интактный), n=12 65,1±3,87 8,67±0,34 Контроль 2
(физ. раствор) 7 дней (n=10) 56,8±3,18 9,1±0,39 14 дней (n=10) 46,4±4,76** 7,2±0,28 ** 21 день (n=10) 67,1±2,21 8,6±0,25 28 дней (n=10) 42,2±2,71*** 7,3±0,41* 42 дня (n=15) 47,7±3,20** 7,9±0,35 Экстракт Лотоса орехоносного 7 дней (n=10) 46,0±3,72** 6,1±0,23***### 14 дней (n=10) 77,3±3,10*### 8,3±0,32# 21 день (n=10) 76,5±2,88# 9,8±0,30*# 28 дней (n=10) 75,2±4,12### 10,2±0,09***### 42 дня (n=15) 94,2±1,23***### 10,8±0,21***### Условные обозначения (здесь и далее): * - достоверность различий между группами животных по сравнению с интактным контролем; * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001; # - достоверность различий между животными, получавшими экстракт семян Лотоса орехоносного и контролем 2; # - p<0,05; ## - p<0,01; ### - р<0,001.

Применение экстракта на протяжении 14 дней сопровождалось увеличением числа активных фагоцитов практически в 1,5 раза при усилении также напряженности фагоцитоза. Введение экстракта семян Лотоса орехоносного в течение 21 дня сопровождалось небольшим увеличением фагоцитарной активности нейтрофилов. Увеличение продолжительности введения изучаемого средства (28-42 дня) приводило к значительной активации фагоцитарной активности нейтрофилов, что проявлялось увеличением числа фагоцитируемого материала и количества активных клеток в 1,3-2 раза (табл.5). Полученные в данном разделе работы результаты свидетельствуют о наличии у экстракта семян Лотоса орехоносного иммунотропного действия в отношении неспецифических иммунных реакций.

Пример 3. Влияние экстракта семян Лотоса орехоносного на показатели перекисного окисления липидов в тканях печени, сердца, а также в плазме крови (табл.6).

Таблица №6 Влияние экстракта семян Лотоса орехоносного при разной продолжительности введения на содержание ТБК-активных продуктов в тканях печени, сердца и плазме крови Экспериментальные группы ТБК-активные продукты в ткани печени;
M±m, нмоль/мг ТБК-активные продукты в ткани сердца;
M±m, нмоль/мг ТБК-активные продукты в плазме крови;
M±m, нмоль/мл Контроль 1 (интактный), n=12 2,8±0,47 1,6±0,12 2,4±0,11 Контроль 2 (физ. раствор) 7 дней (n=10) 2,6±0,22 1,9±0,38 2,8±0,23 14 дней (n=10) 4,5±0,68* 1,9±0,30 2,9±0,09 * 21 день (n=10) 2,2±0,21 1,7±0,12 3,2±0,26 * 28 дней (n=10) 3,1±0,73 2,7±0,34** 2,5±0,21 42 дня (n=15) 2,4±0,13 5,2±0,73*** 1,9±0,10* Экстракт Лотоса орехоносного 7 дней (n=10) 2,3±0,16 2,0±0,30 1,6±0,11**## 14 дней (n=10) 1,7±0,22*## 1,8±0,28 2,0±0,09*### 21 день (n=10) 1,9±0,12 2,1±0,41 2,7±0,16 28 дней (n=10) 2,1±0,23 7,5±0,65***### 2,4±0,18 42 дня (n=15) 1,8±0,15*# 4,5±0,70*** 2,5±0,16# Условные обозначения (здесь и далее): * - достоверность различий между группами животных по сравнению с интактным контролем; * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001; # - достоверность различий между животными, получавшими экстракт семян Лотоса орехоносного и контролем 2; # - p<0,05; ## - p<0,01; ### - p<0,001.

Установлено, что независимо от продолжительности введения экстракта семян Лотоса орехоносного наблюдалось снижение с разной степенью достоверности уровня ТБК-активных продуктов в ткани печени, при этом наиболее выраженные антиоксидантные свойства изучаемое средство проявляло при применении курсом 14 и 42 дня (табл.6). В отношении процессов пероксидации в ткани сердца отмечено, что введение экстракта семян Лотоса орехоносного с 7 по 21 день и в течение 42 дней не приводило к достоверно значимым изменениям уровня ТБК-активных продуктов в ткани сердца, тогда как 28 дневное применение приводило даже к усилению процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) (табл.6). Установлено также, что на фоне применения экстракта семян Лотоса орехоносного в течение 7-21 дня происходило снижение исходного уровня ТБК-активных продуктов в плазме крови (табл.6). Следует отметить, что введение изучаемого средства в течение 42 дней сопровождалось усилением образования конечного метаболита ПОЛ. Полученные результаты свидетельствуют о наличии у экстракта семян Лотоса орехоносного выраженных антиоксидантных свойств, которые проявляются при внутрижелудочном применении в течение 7-14 дней.

Таким образом, экстракт семян Лотоса орехоносного проявляет иммунотропную и антиоксидантную активность, степень выраженности которой определяется продолжительностью введения изучаемого средства.

Список использованной литературы

1. Du H. Antiobesity and hypolipidemic effects of lotus leaf hot water extract with taurine supplementation in rats fed a high fat diet / H. Du, J.S. You, X. Zhao et al. // J Biomed Sci. - 2010. - №17. - Suppi 1. - P.42.

2. Hoon J. Nelumbo nucifera semen extract improves memory in rats with sco-pola mine-induced amnesia through the induction of choline acetyltransferase expression / J.O. Hoon, B.J. Choi, M.S. Chang, S.K. Park // Neuroscience Letters. - 2009. - V.461. - P.41-44.

3. Huang B. Hepatoprotective and antioxidant activity ofethanolic extracts of edible lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) leaves / B. Huang, B. Xiaoquan, H. Jingshenget et al. // Food Chemistry. - 2010. - V.120. - P.873-878.

4. Mukherjee P.K. Studies on psychopharmacological effects of Nelumbo nucifera Gaertn rhizome extract / P.K. Mukherjee, K. Saha, R. Balasubramanian, M. Pal, B.P. Saha // Journal of Ethnopharmacology 1996. - V.54. - P.63-67.

5. Mukherjee P.K. Diuretic activity of the rhizomes of Nelumbo nucifera Gaertn. (Fam. Nymphaeaceae) / P.K.Mukherjee, J.Das, K. Saha, M. Pal, B.P. Saha // Phytotherapy Research 1996. - V.10. - P.424-425.

6. Mukherjee P.K. Antipyretic activity of Nelumbo nucifera rhizome extract / P.K. Mukherjee, K. Saha, J. Das, S.N. Giri, M. Pal, B.P. Saha // Indian Journal of Experimental Biology 1996. - V.82. - P.274-276.

7. WHO: protocol CG-04. Preparation of alcoholic extract for bioassay and phytochemical studies (APJF/IP, 1001 A). Geneva, World Health Organization 1983.

8. Wu M.J. Antioxidant activity ofmethanol extract of the lotus leaf (Nelumbo nucifera Gaertn.) / M.J. Wu, L. Wang, C.Y. Weng, J.H. Yen // The American Journal of Chinese Medicine 2003. - V.31. - P.687-698.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства на основе экстракта семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera), обладающего иммунотропной и антиоксидантной активностью. Средство, обладающее иммунотропной и антиоксидантной активностью, которое получено путем экстрагирования семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera) 50%-ным этиловым спиртом в аппарате Сокслета, при определенном соотношении компонентов. Вышеописанное средство обладает выраженной иммунотропной и антиоксидантной активностью. 6 табл., 3 пр.

Средство, обладающее иммунотропной и антиоксидантной активностью на основе экстракта семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera), характеризующееся тем, что получено путем водно-спиртового экстрагирования 50%-ным этиловым спиртом в аппарате Сокслета при следующем соотношении компонентов, мас.%:
семена Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera) 50 спирт этиловый 50