СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ, НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ, ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЙ, ГИПОХОЛЕСТЕРИНЕМИЧЕСКОЙ, ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ, ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЙ, ИММУНОСУПРЕССОРНОЙ АКТИВНОСТЯМИ Российский патент 2013 года по МПК C07J53/00 A61P1/16 A61P3/06 A61P25/00 A61P29/00 A61P37/02 

Описание патента на изобретение RU2487884C1

Изобретение относится к области медицины, конкретно к средству формулы 1:

которое может быть использовано в качестве основы для разработки лекарственного средства для профилактики и лечения атеросклероза, диабета (1 и 2 типов), аутоиммунных заболеваний (таких как ревматоидный артрит, рассеянный склероз), нейродегенеративных заболеваний (таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, токсический и лекарственный паркинсонизм, болезнь Гентингтона), и широкого спектра воспалительных заболеваний.

В аэробных организмах непрерывно образуется большое количество потенциально опасных молекул - свободных радикалов, основные из них - активные формы кислорода и азота, образующиеся в окислительно-восстановительных реакциях дыхательной цепи. Эти свободнорадикальные молекулы являются основным оружием клеток системы естественной резистентности организма, обеспечивая их бактерицидную активность; регулируют внутриклеточную сигнальную трансдукцию, экспрессию генов, пролиферацию клеток. При нарушении баланса между оксидантными и антиоксидантными процессами происходит повреждение клеточных мембран, ДНК, генной экспрессии, активности ферментов и т.д. [Poulsen H.E., Jensen B.R., Weimann A., Jensen S.A., Sørensen M., Loft S. Antioxidants, DNA damage and gene expression. // Free Radio Res. 2000. V.33 (Suppi). P.S33-S39]. Эти процессы лежат в патогенезе многих заболеваний (например, онкологических) и в основе старения. Многочисленными исследованиями установлено, что употребление в пищу продуктов, богатых антиоксидантами, приводит к уменьшению частоты развития онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний, а также возрастных изменений сетчатки глаз, обструктивных заболеваний дыхательных путей и др. [Stanner S.A., Hughes J., Kelly C.N.M., Buttriss J. A review of the epidemiological evidence for the 'antioxidant hypothesis'. // Public Health Nutrition. 2003. V.7 (3). P.407-422].

В качестве объекта для развития лекарственных средств с антиоксидантной активностью внимание фармакологов привлекла группа веществ из группы синтетических олеанановых тритерпеноидов (synthetic oleanane triterpenoids - SO). Обстоятельством, повышающим привлекательность тритерпенов, является их широкое распространение в природе и во многих случаях относительная простота технологии получения из многотоннажного растительного сырья. Как показали исследования на животных, эти вещества обеспечивают защиту от повреждающего действия реактивных форм кислорода и азота на уровне организма, защищают органы и системы от нарушений, связанных с оксидативным стрессом [Sporn M.B., Liby K.T., Yore M.M., Fu L., Lopchuk J.M., Gribble G.W. New synthetic triterpenoids: potent agents for prevention and treatment of tissue injury caused by inflammatory and oxidative stress. // J Nat Prod. 2011. V.74. P.537-545]. На основе одного из соединений данной группы разработано лекарственное средство - это полусинтетическое производное олеаноловой кислоты - метиловый эфир 2-пиано-3,12-диоксоолеан-1(2),9(11)-диен-28-овой кислоты, названное «бардоксолон метил» (2). Данное соединение обладает широким спектром биологической активности (противоопухолевой, противовоспалительной и др.) [Honda Т., Janosik Т., Honda Y., Han J., Liby К.Т., Williams Ch.R., Couch R.D., Anderson A.C., Sporn M.В., Gribble G.W. // Design, synthesis, and biological evaluation of biotin conjugates of 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic acid for the isolation of the protein targets. // J Med Chem. 2004. V.47. P.4923-4932].

В настоящее время бардоксолон метил (2) находится на 3-й фазе клинических испытаний, проводимых компанией Reata Pharmaceuticals, Inc. в качестве антиоксиданта, противовоспалительного модулятора, используемого при лечении хронической болезни почек, вызванной сахарным диабетом 2-го типа [Bardoxolone methyl - Oral, Once Daily AIM for Renal/Cardiovascular/Metabolic Diseases. Reata Pharnaceuticals. Retrieved June 2, 2011]. Основным недостатком бардоксолон метила (2) является сравнительная труднодоступность и, соответственно, высокая цена исходного соединения для синтеза бардоксолон метила - олеаноловой кислоты. В природных источниках олеаноловая кислота присутствует совместно с другими близкими по структуре тритерпеновыми кислотами, например, с урсоловой, что затрудняет ее выделение в индивидуальном виде.

Задачей изобретения является расширение арсенала антиоксидантных, противовоспалительных, нейропротекторных, гиполипидемических, гипохолестеринемических, гипогликемических, гепатопротекторных, иммуносупрессорных средств, обладающих низкой токсичностью и полученных на основе доступного растительного сырья.

Поставленная задача решается применением метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты формулы (1) в качестве антиоксидантного, противовоспалительного, нейропротекторного, гиполипидемического, гипохолестеринемического, гипогликемического, гепатопротекторного, иммуносупрессорного средства, обладающего низкой токсичностью и полученного на основе доступного растительного сырья.

Новые свойства метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты формулы (1) установлены экспериментально.

Метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты формулы (1) был получен в результате направленной комбинированной модификации колец А и С 18βН-глипирретовой кислоты формулы (3) [RU 2401273 C1, 10.10.2010].

В качестве исходного продукта для синтеза был взят метиловый эфир ацетата 18βН-глипирретовой кислоты, полученный в результате уксуснокислой дегликолизации глицирризиновой кислоты с последующим метилированием диазометаном [Толстиков Г.А. и др. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. Новосибирск: «Гео», 2007]. Первоначально была проведена модификация кольца С. Взаимодействие метилового эфира ацетата 18βН-глицирретовой кислоты с цинком и соляной кислотой приводит к восстановлению С-11 карбонильной группы до метиленовой. Окисление полученного соединения перекисью водорода в уксусной кислоте формирует карбонильную группу при С-12, последующее взаимодействие полученного кетона с бромом в уксусной кислоте (в результате реакции бромирования -дегидробромирования) приводит к 9,11-двойной связи. Дальнейшая 6-стадийная модификация кольца А (окисление гидроксильной группы в кетоннную при С-3, форматирование, конденсация с гидроксиламином, расщепление изоксазольного кольца и окисление дихлордицианхиноном) приводит к образованию 2-циано-3-оксо-1-еновый фрагмента и, соответственно, к соединению (1).

Элементный состав полученного соединения определяли из масс-спектров высокого разрешения, записанных на приборе DFS (Double Focusing Sector) фирмы Theimo Electron Corporation. Спектры ЯМР 1H и 13С регистрировали на спектрометрах АМ-400 (рабочие частоты 400.13 MHz для 1Н и 100.61 MHz для 13С) и DRX-500 (500.13 MHz и 125.76 MHz соответственно) фирмы Bruker для растворов вещества в CDCl3. В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы растворителя (δН 7.24 и δС 76.9 м.д). Строение полученного соединения устанавливали на основании анализа спектров ЯМР 1Н с привлечением спектров двойного резонанса 1Н-1Н, и двумерных спектров гомоядерной 1Н-1Н корреляции, а также анализа спектров ЯМР 13С, записанных в режиме J-модуляции (JMOD), с внерезонансным подавлением протонов и двумерных спектров гетероядерной 13С-1Н корреляции на прямых и на дальних константах спин-спинового взаимодействия (С-Н COSY, 1JC,H 135 Гц и COLOC, 2,3JC,H 10 Гц, соответственно). В квадратных скобках приведены химические сдвиги центров мультиплетов, взятые из двумерного спектра 13С-1Н COSY.

Т. пл. 247-249°С. Найдено, m/z: 505.3025 [M]+. C32H43NO4. Вычислено M 505.3181.

Спектр ИК (хлороформ) см-1: 2238 (C≡N); 1722,1662,1663 (C=O).

Спектр ЯМР 1Н соединения (1), δ, м.д. (J, Гц): 0.90 с (С28Н3), 0.96 с (С27Н3), 1.09 с (C29H3), 1.14 с (С24Н3), 1.22 с (С23Н3), 1.44 с (С26Н3), 1.47 с (С25Н3), 0.93 д.м (H16e, J16e,16a 13.3 Гц), 1.08 м (H15e), 1.20 д.д (H19a, J19a,19e 13.2, J19a,18 13.2 Гц), 1.18.1.32 м (H21a, H22e), 1.48 д.д.д (H22a, J22a,22e 14.0, J22a,21a 14.0, J22a,21e 4.2 Гц), 1.55 д.м (H7e, J7e,7a 13.5 Гц), 1.67-1.79 м (H5a, 2Н6, H7a), 1.82 м (H15a), 1.87 м (H16a), 1.94 д.д.д.д (H21e, J21e,21a 13.3, J21e,22a 4.2, J21e,22e 3.2, J21e,19e 2.8 Гц), 2.02 д.д.д (Н18, J18,19a 13.2, J18,13 4.7, J18,19e 3.2 Гц), 2.17 д.д.д (H19e, J19e,19a 13.2, J19e,18 3.2, J19e,21e 2.8 Гц), 3.02 д (Н13, J13,18 4.7 Гц), 3.72 с (ОС31Н3), 5.97 с (Н11), 8.01 с (Н1). Спектр ЯМР 13С соединения (1), δ, м.д.: 165.65 д (С1), 114.46 с (С2), 196.42 с (С3), 44.86 с (С4), 47.57 д (С5), 18.12 т (С6), 31.58 т (С7), 45.82 с (С8), 168.18 с (С9), 42.36 с (С10), 124.17 д (С11), 199.52 с (С12), 48.04 д (С13), 42.10 с (С14), 26.03 т (С15), 26.00 т (С16), 31.88 с (С17), 37.75 д (С18), 33.61 т (С19), 43.91 с (С20), 31.11 т (С21), 38.14 т (С22), 26.88 к (С23), 21.40 к (С24), 26.61 к (С25), 24.77 к (С26), 21.81 к (С27), 26.96 к (С28), 28.46 к (С29), 177.13 с (С30), 51.48 к (С31), 114.22 с (С32).

Показано, что соединение (1) обладает противоопухолевой активностью, превышающей активность ближайшего структурного аналога - бардоксолон метила (2) в отношении всех использованных опухолевых клеточных линий, в том числе в отношении линии клеток, обладающей фенотипом множественной лекарственной устойчивости [RU 2401273 C1, 10.10.2010].

Были исследованы следующие активности (свойства) заявляемого соединения - метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты формулы (I): антиоксидантная, антипаркинсоническая, нейропротекторная, нейропротекторная на модели болезни Альцгеймера, противовоспалительная, противовоспалительная на модели неспецифического язвенного колита и болезни Крона, противоартритная, иммуносупрессорная, иммуносупрессорная на модели рассеянного склероза (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит), гиполипидемическая, антиатеросклеротическая, гипогликемическая, антидиабетическая и гепатопротекторная.

Пример 1. Изучение токсичности метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1).

Клетки линии J-774 (перевиваемая макрофагальная мышиная линия) культивировали в среде IMDM (среда Дульбекко, модифицированная Исковым), содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного СО2 при 37°С. Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением (1) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты для получения монослоя. Через 24 ч, в лунках меняли среду и к клеткам добавляли раствор соединения (1) в ДМСО (диметилсульфоксид) (0.1 М) до конечной концентрации от 10-5 до 10-9 М. Клетки инкубировали в присутствии соединения еще в течение суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А570 - поглощение формазана, а А630 - фон клеток. По результатам теста определяли значение IC50, концентрацию соединения, при которой наблюдается гибель 50% клеток. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что соединение (1) является низкотоксичным для линии клеток J-774.

Пример 2. Противовоспалительная активность метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1).

Противовоспалительную активность соединения формулы (1) подтвердили результатами экспериментов in vitro и in vivo.

Известно, что оксид азота (NO) является одним из медиаторов воспаления, маркером воспаления. Под действием индукторов воспаления инфекционной и неинфекционной природы происходит увеличение экспрессии генов провоспалительных циюкинов, рецепторов к ним, хемокинов, привлекающих в очаг воспаления клетки, обеспечивающие его протекание, ферментов, вырабатывающих медиаторы воспаления (в том числе индуцибельную NO-синтазу (iNOS)), и молекул адгезии. Для изучения противовоспалительной активности каких-либо веществ широко используется тест, оценивающий действие вещества на продукцию NO индуцибельной NO-синтазой [Nathan С. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. // FASEB J. 1992. V.6 (12). P.3051-3064; Dugo L., Marzocco S., Mazzon E., Di Paola R., Genovese Т., Caputi A.P„ Cuzzocrea S. Ejects of GW274150, a novel and selective inhibitor of iNOS activity, in acute lung inflammation. // Br J Pharmacol. 2004. V.141 (6). P.979-987].

Для изучения влияния соединения формулы (1) на провоспалительные свойства макрофагов использовали клеточную линию J-774, которая представляет собой макрофагальную мышиную линию. Клетки макрофагальной мышиной линии J-774 рассаживали на 96-луночный планшет в среду RPMI с сывороткой и антибиотиками для достижения монослоя. Через 24 часа в лунках меняли среду и прибавляли соединение (1) или бардоксолон метил (2) в диапазоне от 0.01 до 5 мкМ, либо индометацин в диапазоне концентраций от 0.01 до 50 мкМ. ЛПС (липополисахарид) прибавляли до конечной концентрации 10 мкг/мл, либо совместно с исследуемыми соединениями, либо сам по себе. Клетки инкубировали в течение 24 часов. По окончании инкубации анализ количества синтезированного оксида нитрита (NO) проводили с помощью Griess Reagent System («Promega Corp.», США) согласно протоколу производителя. Оптическую плотность измеряли на многоканальном спектрофотометре на длине волны 570 нм. Количество NO, образовавшегося в течение инкубации клеток с соединением и ЛПС, определяли с помощью нитрит-стандарта, входящего в состав Griess Reagent System. Контролем являлись клетки, инкубированные в отсутствии соединений и ЛПС.

Соединение (1) эффективно ингибирует синтез NO в клетках в концентрациях, не достигающих значения IC50 (таблица 2). Степень подавления синтеза увеличивается с повышением концентрации соединения. Результаты исследования представлены в таблице 2. Доверительный интервал рассчитан с α=0.05 по стандартному отклонению от среднего значения, определенному по результату трех независимых экспериментов.

Из таблицы 2 видно, что инкубация клеток с соединением (1) в концентрации 1 мкМ в присутствии ЛПС снижает концентрацию NO практически до концентрации в контроле - клетках, инкубированных в отсутствии ЛПС. Эффективность ингибирования соединения (1) оказалась выше по сравнению с соединением прототипом (2) и индометацином.

Противовоспалительную активность соединения формулы (1) in vivo подтвердили исследованиями на модели гистамин-индуцированного отека. Для индукции отека аутбредным самцам CD-1 массой тела 25-28 г под плантарный апоневроз правой задней лапы вводили по 0.05 мл 0.1% раствора гистамина в аптечном изотоническом растворе хлорида натрия (опытная лапа), в другую заднюю лапу вводили столько же изотонического раствора хлорида натрия без гистамина (контрольная лапа). Соединение формулы (1) вводили внутрижелудочно через зонд в концентрации 50 мг/кг либо в растворе с Tween-80 либо с Cremophore-EL за 1 час до введения гистамина. О противовоспалительной активности судили по уменьшению отека в сравнении с интактной левой лапой по формуле:

% И н г и б и р о в а н и я о т е к а = ( М п р М л ) к о н т р о л ь ( М п р М л ) о п ы т ( М п р М л ) к о н т р о л ь × 100

где Мпр - средная масса опытной лапы, Мл - средняя масса контрольной лапы.

Данные, полученные при исследовании противовоспалительной активности на примере снижения гистаминового отека, представлены в таблице 3.

Как видно из представленных данных, соединение формулы (1) при введении внутрь в дозе 50 мг/кг значительно снижает величину отека, а эффективность противовоспалительного действия соединения (1) выше по сравнению с широко используемым НПВС индометацином.

Учитывая, что соединение формулы (1) ингибирует продукцию NO активированными макрофагальными клетками и подавляет локальную воспалительную реакцию, вызванную введением индуктора воспаления (гистамина), можно заключить, что соединение формулы (1) обладает противовоспалительной активностью.

Пример 3. Антиоксидантная активность метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1).

Антиоксидантную активность соединения формулы (1) оценивали по развитию спонтанного и аскорбатиндуцированного перекисного окисления липидов (ПОЛ) по уровню накопления соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой - ТБК-активных продуктов в гомогенате печени мышей, перенесших гипоксию. Были использованы аутбредные мыши самцы CD-1 массой 22-24 г. Животные получали внутрижелудочно соединение формулы (1) в дозе 50 мг/кг курсом в 1% растворе Tween-80 в объеме 0.5 мл 5 дней, последний раз за 1°ч до моделирования гипоксии. Контрольная группа животных получала курсом по 0.5 мл 1% раствора Tween-80. На 5-й день животных помещали в герметическую емкость объемом 0.2°л и выдерживали до появления предсмертного судорожного припадка или агонального дыхания. Затем мышей извлекали из емкости и декапитировали. Печень промывали охлажденным до 0°С изотоническим раствором натрия хлорида через портальную вену, отделяли и гомогенизировали при 1500 об/мин в этом же растворе. Образование ТБК-активных продуктов определяли при исследовании спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ in vitro в гомогенате печени по принятой методике [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., 1972]. Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре Shimadzu при 532 нм в точках, взятых с интервалом через 15 мин в течение часа.

Результаты исследования антиоксидантной активности соединения формулы (1) представлены в таблице 4.

Как видно из представленных результатов, гипоксическое воздействие приводило к увеличению уровня и скорости накопления ТБК-активных продуктов как спонтанного, так и аскорбатзависимого ПОЛ в печени мышей. Так, при спонтанном ПОЛ количество липидоперекисей превышало таковое в контроле во все сроки исследования, начиная с «нулевой» отметки времени инкубации гомогената. Профилактическое введение соединения формулы (1), как видно из таблицы 4, способствует нормализации процессов ПОЛ в печени мышей при спонтанном ПОЛ, препятствует нарастанию уровня ТБК-активных продуктов во все сроки инкубации гомогената.

Нарастание уровня ТБК-активных продуктов при гипоксии отмечалось также при аскорбатзависимом ПОЛ, начиная с 30 мин инкубации гомогената (таблица 5).

Усиление перекисного окисления липидов in vitro свидетельствует о предшествующей активации процессов ПОЛ в печени мышей в условиях гипоксии. И в этой модели курсовое введение соединения формулы (1) препятствовало нарастанию уровня индуцированных аскорбатом ТБК-активных продуктов на 30, 45 и 60 мин инкубации гомогената печени. Таким образом, соединение формулы (1) при курсовом введении животным вызывает снижение интенсивности ПОЛ в печени животных, подвергнутых гипоксии. Это позволяет заключить, что данное вещество проявляет антиоксидантную активность.

Пример 4. Нейропротекторная активность метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1).

Известно, что у антиоксидантов часто присутствует и нейропротекторная активность, т.е. способность защищать нейроны от повреждающего действия активных форм кислорода. Это свойство у соединения формулы (1) было подтверждено экспериментально на модели оксидативного стресса in vitro.

В исследованиях была использована клеточная линия IMR-32 (нейробластома человека). Клетки культивировали в пластиковых флаконах («Costar») при 37°С в атмосфере с 5% СО2 и абсолютной влажности, в среде состава (RPMI 1640,10% ЭТС, 20 мМ HEPES, 0.05 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 мкг/мл гентамицин и 2 мМ L-глютамин). Через 2-3 пассажа содержимое флаконов сливали, центрифугировали и ресуспендировали в свежей среде, после чего оценивали количество жизнеспособных клеток. Затем клетки помещали в 96-луночные планшеты и добавляли 0.5 мМ H2O2. Через 2 часа из лунок удаляли надосадок (надосадочную жидкость) и вносили культуральную среду, содержащую различные концентрации исследуемого соединения формулы (1), культивировали в указанных выше условиях 24 часа. За 4 ч до окончания культивирования в лунки вносили бромид 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразола (МТТ, «Merck Bioscience»), (до концентрации 200 мкг/мл) концентрация которого в лунках составляла 200 мкг/мл. Затем из лунок удаляли надосадок, а осадок растворяли диметилсульфоксидом («Димексид», «Татхимфармпрепараты»). Ход реакции оценивали с помощью многоканального спектрофотометра («Пикон») по интенсивности поглощения раствора при длине волны 530 нм. Результаты представлены в таблице 6.

Как видно из таблицы, соединение формулы (1) восстанавливало поврежденные перекисью водорода клетки нейробластомы, хотя и не отменяло последствия негативного воздействия полностью. Аналогичные по качеству результаты получены и на другой модели оксидативного стресса, индуцированного сульфатом железа. Таким образом, полученные данные указывают, что соединение формулы (1) обладает нейропротекторным действием на модели оксидативного стресса.

Пример 5. Антипаркинсоническая активность метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1).

В основе патогенеза болезни Паркинсона лежит, как известно, гибель дофаминергических нейронов. Для моделирования болезни Паркинсона in vivo и in vitro в качестве повреждающего агента используется гидроксилированная форма дофамина-6-гидроксидофамин (6-OHDA), нейротоксин с селективным цитотоксическим действием в отношении дофаминергических нейронов. По молекулярной структуре 6-гидроксидофамин (6-OHDA) аналогичен дофамину, входит в клетку с помощью специфического дофаминового транспортера и генерирует образование активных форм кислорода, что и приводит к гибели нейрона. В связи с этим 6-OHDA широко используется для экспериментального моделирования поражения нейронов in vitro, характерного для болезни Паркинсона [Takata M.K., Yamaguchi F., Nakanose К., Watanabe Y., Hatano N., Tsukamoto I., Nagata M., Izumori K., Tokuda M. Neuroprotective effect of D-psicose on 6-hydroxydopamine-induced apoptosis in rat pheochromocytoma (PC12) cells. // J Biosci Bioeng. 2005. V.100 (5). P.511-516; Tiong C.X., Lu M., Bian J.S. Protective effect of hydrogen sulphide against 6-OHDA-induced cell injury in SH-SY5Y cells involves PKC/PI3K/Akt pathway. // Br J Pharm. 2010. V.161 (2). P.467-480; Wang M., Zhang Z., Cheang L.C.V., Lin Z., Lee M.Y.S. Eriocaulon buergerianum extract protects PC12 cells and neurons in zebrafish against 6-hydroxydopamine-induced damage. // Chin Med. 2011. №6. Р.16-26].

В экспериментах была использована клеточная линия IMR-32, которая представляет собой нейробластому человека. Клетки культивировали в среде следующего состава: RPMI 1640 («Sigma»), 10% ЭТС («Hyclone»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0.05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицина («Sigma») и 2 мМ L-глютамина («Sigma»). Клетки пассировали в пластиковых флаконах («Costar») при 37°С в атмосфере с 5% СО2 и абсолютной влажности. Через 2-3 пассажа содержимое флаконов сливали, центрифугировали и ресуспендировали в свежей среде, после чего оценивали количество жизнеспособных клеток. Затем клетки помещали в 96-луночные планшеты и вносили в лунки исследуемое вещество - соединение формулы (1) в различных концентрациях и культивировали в указанных выше условиях 12 часов. После этого надосадок удаляли и вносили в лунки по 0.2 mM раствора 6-OHDA («Sigma»), культивировали в указанных выше условиях еще 12 часов. За 4 ч до окончания культивирования в лунки вносили бромид 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразола (МТТ, «Merck Bioscience»), концентрация которого в лунках составляла 200 мкг/мл. Затем из лунок удаляли надосадок, а осадок растворяли диметилсульфоксидом (димексид, «Татхимфармпрепараты»). Ход реакции оценивали с помощью многоканального спектрофотометра («Пикон») по интенсивности поглощения раствора при длине волны 530 нм. Результаты представлены в таблице 7.

Предобработка клеток соединением формулы (1) дозозависимо повышала число живых клеток в культуре с токсином 6-OHDA, максимальный эффект наблюдался при концентрации исследуемого вещества 40 нМ, в этой концентрации количество живых клеток было вдвое больше, чем в контрольной культуре. Таким образом, полученные данные указывают, что исследуемое соединение формулы (1) обладает антипаркинсонической активностью.

Антипаркинсоническое действие соединения формулы (1) выявлено также и на моделях болезни Паркинсона in vivo: химически индуцированный паркинсонизм с использованием галоперидола и МРТР.

Пример 6. Нейропротекторная активность метилового эфира 2-пиано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1) в модели болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера (БА) - тяжелое нейродегенеративное заболевание, приводящее к тяжелым нарушениям когнитивных функций. Ключевым маркером БА является накопление внеклеточных амилоидных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков [Tiraboschi P., Hansen L.A., Thal L.J, Corey-Bloom J. The importance of neuritic plaques and tangles to the development and evolution of AD. // Neurology. 2004. V.62 (11). P.1984-1989]. Амилоид-β (Аβ), основной компонент бляшек, играет ключевую роль в патогенезе БА, цитотоксическое действие олигомера Аβ 1-42 на клетки нейробластомы является широко используемой моделью БА in vitro [Kozikowski A.P., Chen Y., Subhasish Т., Lewin N.E., Blumberg P.M., Zhong Z., D'Annibale M.A., Wang W.-L., Shen Y., Langley B.C. Searching for disease modifiers - PKC activation and HDAC inhibition - a dual drug approach to Alzheimer's disease that reduces Aβ production while blocking oxidative stress. // Chem Mod Chem. 2009. V.4 (7). P.1095-1105; Liu P., Zhao L., Zhang S-L., Xiang J-Z. Modified wendan decoction can attenuate neurotoxic action associated with Alzheimer's disease. // eCAM. 2009. V.6 (3). P.325-330].

Клетки нейробластомы человека IMR-32 культивировали и готовили к эксперименту так, как описано выше. Подготовленные клетки помещали в 96-луночный планшет, добавляли исследуемое соединение формулы (1) в разных концентрациях и раствор олигомера амилоида-β 1-42 («Sigma»). Клетки культивировали 24 часа, за 4 ч до окончания культивирования в лунки вносили бромид 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразола (МТТ, «Merck Bioscience»), концентрация которого в лунках составляла 200 мкг/мл. Затем из лунок удаляли надосадок, а осадок растворяли диметилсульфоксидом (димексид, «Татхимфармпрепараты»). Ход реакции оценивали с помощью многоканального спектрофотометра («Пикон») по интенсивности поглощения раствора при длине волны 530 нм. Результаты представлены в таблице 8. Как видно из таблицы, соединение формулы (1) в концентрациях 10 нМ и 20 нМ оказывает протекторное действие на клетки нейробластомы в присутствии олигомера амилоида-β 1-42, что указывает на возможность предупреждать развитие болезни Альцгеймера.

Соединение формулы (1) проявляло также терапевтическую эффективность на модели болезни Альцгеймера, вызванной скополамином.

Пример 7. Протгивоартритная активность метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1).

Противоартритное действие соединения формулы (1) подтвердили экспериментами на модели адьювантного артрита у крыс, воспроизведенной согласно «Методическим указаниям по изучению новых нестероидных противовоспалительных препаратов» [Методические указания по изучению новых нестероидных противовоспалительных препаратов. / Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под общей редакцией Р.У.Хабриева). М.: ОАО «Издательство «Медицина»», 2005. С.701].

Аутбредным крысам Sprague Dawley массой тела 250-280 г в правую заднюю лапу (опытная лапа) вводили по 0.1 мл полного адьюванта Фрейнда («Difco»), а в левую - аналогичный объем аптечного раствора хлорида натрия (контрольная лапа). Начиная с первого дня после инъекции адъюванта, ежедневно в течение 14 дней вводили соединение формулы (1) внутрижелудочно через зонд в концентрации 50 мг/кг в растворе с Tween-80. Животным контрольной группы вводили водный раствор Tween-80 без соединения формулы (1) в том же объеме. Величину отека оценивали онкометрически в динамике воспаления и выражали в разнице между объемом опытной и контрольной лап в мл. Результаты представлены в таблице 9.

Как видно из таблицы 9, профилактическое введение соединения формулы (1) привело к значительному подавлению величины отека лап при развитии артрита у крыс, что свидетельствует о наличии у соединения формулы (1) противоартритной активности.

Пример 8. Влияние метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1) на воспалительные заболевания кишечника.

К воспалительным заболеваниям кишечника относятся неспецифический язвенный колит и болезнь Крона. В основе патогенеза этих заболеваний лежит аутоиммунное воспаление в стенке кишечника. Широко используемой моделью этой группы заболеваний является индуцированный 2,4,6-тринитробензоилсульфоновой кислотой (TNBS) колит у крыс по методу Morris G.P. [Morris G.P., Beck P.L., Herridge M.S., Depew W.T., Szewczuk M.R., Wallace J.L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. // Gastroenterology. 1989. V.96 (3). P.795-803]. Аутбредным крысам Sprague Dawley массой тела 250-280 г под наркозом при помощи катетера в прямую кишку через анус вводили по 0.25 мл раствора TNBS в 50%-ом этаноле (в концентрации 120 мг/мл). После этого животных держали вертикально головой вниз в течение 1 минуты. Соединение формулы (1) в дозе 50 мг/кг вводили внутрижелудочно в растворе 1% Tween-80 1 раз в день в течение 7 дней, начиная со дня введения TNBS. Клиническую оценку тяжести колита проводили по наличию у животных на 8-й день диареи, затем животных забивали, оценивали величину воспаления отрезка толстого кишечника (по массе отрезка длиной 10 см) и наличие спаек между воспаленным участком кишечника и прилежащими органами. Результаты представлены в таблице 10.

Исследуемое соединение формулы (1) снижало величину отека отрезка кишечника, значительно уменьшало клинические и морфологические проявления колита - количество животных с диареей и количество крыс, у которых наблюдались спайки. Полученные данные свидетельствуют о наличии у соединения формулы (1) свойства подавлять аутоиммунное воспаление в толстом кишечнике.

Пример 9. Влияние метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1) на экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит.

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит представляет собой модель рассеянного склероза - тяжелого аутоиммунного заболевания человека [Huitinga I., Bauer J., Stnjbos P.J.L.M., Rothwell N.J., Dijkstra C.D., Tilders F.J.H. Effect of annexm-1 on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in the rat. // Clin Exp Inununol. 1998. V.111 (1). P.198-204]. В экспериментах использовали аутбредных крыс Sprague Dawley массой тела 270-300 г. Миелиновый основный белок (Myelin Basic Protein bovine M1891 - MBP, «Sigma») в полном адъюванте Фрейнда («Difco») вводили в подушечку задней лапы крысы в объеме 0.06 мл (по 25 мг MBP). Соединение формулы (1) в дозе 50 мг/кг вводили 1 раз в день внутрижелудочно в растворе Tween-80 в течение 14 дней, начиная со дня иммунизации MBP. Контрольные животные получали аналогичным образом раствор Tween-80. Каждая группа состояла из 7 крыс. С появлением клинических признаков энцефаломиелита (с 7-го дня после иммунизации) проводили ежедневную оценку тяжести заболевания и оценивали ее в баллах по следующей шкале:

0 - нет симптомов;

1 - нарушение тонуса хвоста и неустойчивая походка;

2 - парез задних конечностей;

3 - полный паралич задних конечностей;

4 - паралич нижней части тела;

5 - смерть.

Результаты представлены в таблице 11.

Курсовое введение соединения формулы (1) приводило к подавлению развития энцефаломиелита, различия с контрольной (нелеченой) группой проявлялись, начиная с 13-го дня после иммунизации. Под действием соединения формулы (1) снижалась как тяжесть клинического течения, так и количество животных с тяжелыми проявлениями заболевания. Полученные данные свидетельствуют о наличии у соединения формулы (1) потенциальной способности подавлять аутоиммунное заболевание - рассеянный склероз.

Пример 10. Гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действие метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1).

Установлено, что в развитии атеросклероза наиболее существенным является изменение соотношения в крови различных по плотности фракций липополипротеидов: увеличение атерогенных липопротеидов (липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП), особого липопротеида (ЛПа)) и снижение антиатерогенных липопротеидов (липопротеидов высокой плотности (ЛПВП)).

Моделирование дисбаланса липополипротеидов осуществляли согласно методическим указаниям «Методические указания по изучению гиполипидемического и антиатеросклеротического действия фармакологических веществ» [Методические указания по изучению гиполипидемического и антиатеросклеротического действия фармакологических веществ. / Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под общей редакцией Р.У.Хабриева). М.: ОАО «Издательство «Медицина»», 2005. С.452], используя специальную диету. В экспериментах использовали аутбредных крыс Sprague Dawley массой тела 300-350 г, которым вводили в утренние часы внутрижелудочно ежедневно суспензию холестерина (в дозе 0.5 г/кг) в 30%-ом растворе насыщенных жиров в течение 21 дня. Для получения насыщенных жиров использовали подсолнечное масло, предварительно обработанное термически. Одновременно животные получали соединение формулы (1) в дозе 50 мг/кг внутрижелудочно в 1%-ном растворе Tween-80 в объеме 1 мл в течение 21 дня (во второй половине дня). Затем животных забивали, забирали кровь и получали сыворотку, в которой определяли содержание различных фракций липополипротеидов ферментативным способом с использованием коммерческих тест-систем согласно приложенным протоколам («Вектор-Бэст»). Результаты представлены в таблице 12.

Как видно из таблицы, холестериновая диета увеличивала содержание в крови общего холестерина и атерогенных липопротеидов (ЛПНП). У животных, получавших курс соединения формулы (1), наблюдалось снижение этих показателей. Кроме того, у животных опытной группы уменьшалось содержание триглицеридов и ЛПОНП, при этом повышалось содержание антиатерогенных липопротеидов (ЛПВП). Таким образом, соединение формулы (1) при модельной гиперлипидемии проявило антиатеросклеротическую и гиполипидемическую активность.

Пример 11. Гипогликемическое и антидиабетическое действие метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты.

Гипогликемическое и антидиабетическое действие соединения формулы (1) изучили на модели диабета, вызванного введением крысам аллоксана. Аллоксановый диабет является моделью инсулинзависимого сахарного диабета. Введение аллоксана приводит к гибели бета-клетки поджелудочной железы и появлению симптомов диабета (гипергликемия, глюкозурия, полифагия, полидипсия и полиурия), которые развиваются через 24-36 часов после введения аллоксана.

Моделирование диабета осуществляли, как описано [Yadav J.P., Saini S., Kalia A.N., Dangi A.S. Hypoglycemic and hypolipidemic activity of ethanolic extract of Salvadora oleoides in normal and alloxan induced diabetic rats. // Indian J Pharmacol. 2008. V.40. P.23-27]. Крысам самкам Sprague Dawley массой тела 300-350 г, лишенным пищи в течение ночи, в утренние часы внутрибрюшинно инъецировали раствор аллоксана тригидрата («La Chema») в дозе 120 мг/кг массы тела. Через 72 часа у животных забирали натощак кровь из хвостовой вены и определяли в ней содержание глюкозы при помощи глюкометра OneTouch Ultra. Животные, у которых уровень глюкозы превышал 200 мг/дл, были взяты для исследования противодиабстического действия соединения формулы (1). На другой день часть животных начинали получать ежедневно внутрь соединение формулы (1) в дозе 50 мг/кг в растворе Tween-80 в объеме 1 мл, другая часть - только по 1 мл раствора Tween-80. Длительность курса составила 21 день. Затем после забора крови и оценки уровня глюкозы животных забивали для получения сыворотки крови, в которой оценивали содержание общего холестерина, триглицеридов, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП, общего белка, альбумина, креатина, для чего использовали коммерческие тест-системы («Вектор-Бэст») согласно приложенным протоколам. Результаты представлены в таблицах 13 и 14.

Как видно из таблицы 13, курсовое введение исследуемого соединения приводило к значительному снижению содержания глюкозы в сыворотке крови крыс с диабетом, что свидетельствует о наличии у соединения гипогликемической активности.

Соединение формулы (1) улучшало и ферментативную функцию поджелудочной железы, что отразилось на некоторых биохимических показателях сыворотки крови (таблица 14). Содержание общего холестерина, триглицеридов, ЛПНП, ЛПОНП и креатинина снижалось практически до интактного уровня; сниженное содержание ЛПВП, общего белка и альбумина повышалось, достигая нормальных значений.

Полученные результаты показывают, что курсовое введение соединения формулы (1) оказывает антидиабетическое действие, снижая уровень глюкозы в крови и нормализуя секреторную активность поджелудочной железы.

Пример 12. Гепатопротекторная активность метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1).

Гепатопротекторную активность соединения формулы (1) изучали на модели токсического повреждения печени, вызванного введением крысам тетрахлорметана согласно «Методическим указаниям по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ» [Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ. / Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под общей редакцией Р.У.Хабриева). М.: ОАО «Издательство «Медицина»», 2005. С.683]. В экспериментах были использованы крысы самцы Sprague Dawley массой тела 200-230 г. Животные опытной группы получали ежедневно внутрижелудочно соединение формулы (1) в дозе 50 мг/кг в растворе Tween-80 в объеме 1 мл, крысы контрольной группы получали в том же объеме аналогичным образом по 1 мл раствора Tween-80. Курс введения составил 3 дня. Через 1 час после последнего введения внутрижелудочно крысам обеих групп ввели раствор тетрахлорметана (ССl4) в оливковом масле (соотношение компонентов 1:1) в дозе 5 мл/кг. Через 24 часа у животных брали кровь и определяли в сыворотке содержание ТБК-активных продуктов (малоновый диальдегид - МДА), глутатиона и активность супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы. Результаты представлены в таблице 15.

На фоне развития токсического гепатита у животных повышалось содержание в сыворотке крови продукта перекисного окисления липидов - МДА, при этом снижалась активность ферментов, обеспечивающих антиоксидантную активность (таблица 15). Введение соединения формулы (1) значительно повышало активность этих ферментов и приводило к снижению содержания продукта перекисного окисления. Таким образом, полученные результаты подтверждают наличие у соединения формулы (1) гепатопротекторной активности.

Пример 13. Иммуносупрессорная активность метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1).

Иммуносупрессорную активность соединения формулы (1) изучали согласно «Методическим указаниям по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ» [Методические указания по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ. / Руководство по экспериментальному (поклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под общей редакцией Р.У.Хабриева). М.: ОАО «Издательство «Медицина»», 2005. С.501]. Для оценки иммунотропного действия исследовали влияние соединения формулы (1) на гуморальный и клеточный иммунный ответ, вызванный эритроцитами барана (ЭБ). Гуморальный ответ оценивали по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, клеточный - по величине реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

Эксперименты проведены на мышах линии BALB/c (масса тела 19-20 г, возраст 8 недель). Животные получали ежедневно внутрижелудочно соединение формулы (1) в дозе 50 мг/кг в растворе Tween-80 в объеме 1 мл (опытная группа) или только раствор Tween-80 (контрольная группа) в течение 3-х дней. На 4-й день мышей обеих групп иммунизировали эритроцитами барана и продолжали вводить растворитель или соединение формулы (1) в течение еще 4-х дней (курс введения составил 7 дней). Для иммунизации суспензию эритроцитов барана («ЭКОлаб») предварительно трижды отмывали, подсчитывали их количество и в объеме 0.2 мл внутрибрюшинно вводили для определения числа АОК по 5×106, при проведении реакции ГЗТ по 1×108.

Для определения числа АОК животных забивали на 5-е сутки после иммунизации ЭБ, лимфоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0.9 мл среды культивирования (среда 199, 0.7% агар, «Difco»), 0.2 мл 20%-ой взвеси эритроцитов барана, 0.2 мл взвеси спленоцитов и 0.1 мл комплемента (ФГУП «НПО» «Микроген»»). После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 часа при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа.

Для оценки действия соединения формулы (1) на реакцию ГЗТ на 5-е сутки после иммунизации ЭБ животным проводили разрешающую инъекцию ЭБ в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (108 ЭБ в 0,02 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0.02 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа. Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Величину реакции оценивали по разнице массы опытной и контрольной лап и выражали в мг.

Как видно из представленных результатов (таблица 16), у животных, получавших соединение формулы (1), наблюдалось снижение вдвое величины реакции ГЗТ и уменьшение числа АОК. Эти данные свидетельствуют о наличии у соединения формулы (1) способности подавлять активность как клеточного, так и гуморального иммунного ответа, т.е. проявлять иммуносупрессорное действие.

Таким образом, экспериментально на моделях in vivo и in vitro показано, что метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты - соединение формулы (1) обладает антиоксидантной, противовоспалительной, нейропротекторной, цитопротекторной, антипаркинсонической, гепатопротекторной и иммуносупрессорной активностями, способностью предотвращать развитие или облегчать течение нейродегенеративных (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера), воспалительных аутоиммунных (неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, энцефаломиелит, ревматоидный артрит) заболеваний; оказывает гиполипидемический и гипогликемический эффект, антиатеросклеротическое и антидиабетическое действие. Благодаря таким свойствам метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты (1) может быть использован для разработки лекарственных средств для профилактики и лечения атеросклероза, диабета (1 и 2 типов), аутоиммунных заболеваний (таких как ревматоидный артрит, рассеянный склероз), нейродегенеративных заболеваний (таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, токсический и лекарственный паркинсонизм), воспалительных заболеваний кишечника (таких как неспецифический язвенный колит, болезнь Крона).

Таблица 1. Цитотоксическое действие соединения (1) Клеточная линия Значение IC50 соединения (1), мкМ JT-774 >40

Таблица 2. Влияние соединений формулы (1), (2) и индометацина различной концентрации на ЛПС-стимулированную продукцию оксида азота (NO) макрофагальными клетками J-774 (X±SE) Концентрация соединения (мкМ) Концентрация ЛПС (мкг/мл) Концентрация нитритов (мкМ) соединение формулы (1) соединение формулы (2) индометацин 0 (контроль-1) 0 3.9±0.2 3.9±0.2 3.9±0.2 0 (контроль-2) 10 17.1±0.4* 17.3±0.7* 17.3±0.7* 0.01 17.3±0,5* 17.3±0.5* - 0.05 14.8±0.7* 16.7±1.1* - 0.1 10.1±0.9*# 14.3±0.2*# - 0.5 7.5±0.3*# 12.9±0.3*# - 1.0 4.4±0.2# 10.5±0.6# 17.3±0.3* 5.0 3.6±0.4# 3.68±0.2# 16.5±0.9* 10 - - 12.32±0.4*# 50 - - 3.7±0.2*# Примечания: * - достоверные различия по сравнению с контролем-1 (р<0.05); # - достоверные различия по сравнению с контролем-2 (р<0.05).

Таблица 3. Влияние соединения формулы (1) на гистамин-индуцированный отек лапы у мышей CD-1 (X±SE) Вещества, вводимые внутрь Ингибирование отека (%) Индометацин 20 мг/кг (контроль) 44.7±0.56 Соединение формулы (1) + Tween 80 35.7±0.9* Соединение формулы (1) + Cremophore 37.5±1.3* Примечания: * - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0.05).

Таблица 4. Влияние соединения формулы (1) на скорость накопления ТБК-активных продуктов спонтанного ПОЛ в печени мышей при гипоксии (X±SX, n=10) Группы Уровень продуктов ПОЛ при инкубации гомогената в течение (мин): 0' 15' 30' 45' 60' Контроль-1 0.248±0.005 0.269±0.006 0.294±0.010 0.298±0.010 0.303±0.010 Контроль-2 (гипоксия + Tween-80) 0.308±0.013* 0.335±0.014* 0.372±0.015* 0.399±0.013* 0.395±0.007* Опыт (гипоксия + соединение формулы (1)) 0.255±0.010# 0.279±0.009# 0.267±0.016# 0.313±0.011# 0.321±0.005# Примечания: значения оптической плотности даны в у.е.;
* - достоверные различия по сравнению с контролем-1 (р<0.05);
# - достоверные различия по сравнению с контролем-2 (р<0.05).

Таблица 5. Влияние соединения формулы (1) на скорость накопление ТБК-активных продуктов аскорбатзависимого ПОЛ в печени мышей при гипоксии (X±SX, n=10) Группы Уровень продуктов ПОЛ при инкубации гомогената в течение (мин): 0' 15' 30' 45' 60' Контроль-1 0.381±0.009 0.417±0.010 0.470±0.013 0.497±0.011 0.527±0.007 Контроль-2 (гипоксия + Tween-80) 0.415±0.011 0.478±0.023 0.526±0.013* 0.579±0.007* 0.682±0.025* Опыт (гипоксия + соединение формулы (1)) 0.428±0.027 0.433±0.013 0.427±0.014# 0.493±0.011# 0.566±0.015# Примечания: значения оптической плотности даны в у.е.;
* - достоверные различия по сравнению с контролем-1 (р<0.05);
# - достоверные различия по сравнению с контролем-2 (р<0.05).

Таблица 6. Цитопротекторное действие соединения формулы (1) на клетки нейробластомы человека IMR-32 (доля жизнеспособных клеток, % от контроля-1) при оксидативном стрессе, индуцированном пероксидом водорода (X±SE) Концентрация соединения формулы (1) (нМ) Концентрация пероксида водорода (мМ) Доля жизнеспособных клеток, % 0 (контроль-1) 0 100.0±2.6 0 (контроль-2) 0.5 66.0±0.7* 5 67.9±1.3* 10 75.1±2.8*# 20 83.2±4.0*# 40 86.9±2.3*# Примечания: * - достоверные различия по сравнению с контролем-1 (р<0.05); # - достоверные различия по сравнению с контролем-2 (р<0.05).

Таблица 7. Цитопротекторное действие соединения формулы (1) (доля жизнеспособных клеток, % от контроля-1) на клетки нейробластомы человека IMR-32 при воздействии 6-OHDA (X±SE) Концентрация соединения формулы (1)(нМ) Концентрация 6-OHDA (мМ) Доля жизнеспособных клеток, % 0 (контроль-1) 0 100.0±2.7 0 (контроль-2) 0.2 48.0±2.9* 5 42.0±2.7* 10 64.8±3.9*# 20 72.6±3.4*# 40 84.1±2.4*# Примечания: * - достоверные различия по сравнению с контролем-1 (р<0.05); # - достоверные различия по сравнению с контролем-2 (р<0.05).

Таблица 8. Цитопротекторное действие соединения формулы (1) на клетки нейробластомы человека IMR-32 (доля жизнеспособных клеток, % от контроля-1) при воздействии олигомера амилоида-β 1-42 (X±SE) Концентрация соединения формулы (1) (нМ) Концентрация олигомера амилоида-β 1-42 (мкМ) Доля жизнеспособных клеток, % 0 (контроль-1) 0 100.0±3.6 0 (контроль-2) 10 49.5±3.7* 5 52.2±2.9* 10 65.9±2.3* 20 71.1±3.6*# 40 82.7±1.9*# Примечания: * - достоверные различия по сравнению с контролем-1 (р<0.05); # - достоверные различия по сравнению с контролем-2 (р<0.05).

Таблица 9. Влияние соединения формулы (1) на величину отека лап (мл) у крыс с адъювантным артритом (X±SE) Группы животных День после введения адъюванта Фрейнда: 15 18 21 24 27 Раствор Tween-80 (контроль) 0.53±0.09 0.82±0.03 0.93±0.06 1.38±0.05 1.63±0.07 Раствор соединения формулы (1) с Tween-80 0.30±0.04 0.42±0.05* 0.48±0.05* 0.52±0.05* 0.76±0.06* Примечания: * - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0.05).

Таблица 10. Влияние соединения формулы (1) на тяжесть у крыс колита, индуцированного введением TNBS, через 7 дней после его введения (X±SE) Группы животных Масса отрезка кишечника (г/10 см) Наличие диареи (число крыс с диареей/общее число крыс в группе) Наличие спаек кишечника с прилежащими органами (число крыс со спайками/общее число крыс в группе) Интактные 0.73±0.05 0/10 0/10 Колит (контроль) 1.75±0.10* 10/10 5/10 Колит + соединение формулы (1) 1.15±0.04*# 2/10 2/10 Примечания: * - достоверные различия по сравнению с интактными (р<0.05); # - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0.05).

Таблица 11. Влияние соединения формулы (1) на проявления экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (баллы, X±SE) День после индукции энцефаломиелита Группа животных контроль соединение формулы (1) 7 0.14±0.14 0.00±0.00 8 0.29±0.18 0.14±0.14 9 0.29±0.18 0.29±0.18 10 1.00±0.22 0.71±0.29 11 1.86±0.34 1.71±0.29 12 3.00±0.31 2.43±0.20 13 3.86±0.40 2.43±0.30* 14 4.00±0.31 2.57±0.30* 15 3.71±0.36 2.29±0.42 16 3.14±0.59 2.29±0.42 17 2.43±0.75 1.71±0.52 Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0.05).

Таблица 12. Влияние курсового введения соединения формулы (1) на уровень холестерина, триглицеридов и липопротеидов в сыворотке крови крыс с экспериментальной гиперлипидемией (X±SE) Исследуемые показатели Группы животных Интактные Контроль (диета) Опыт(диета + соединение формулы (1)) Общий холестерин (мг/дл) 69.6±2.5 198.1±6.6# 162.0±3.8* Триглипериды (мг/дл) 59.8±2.9 62.9±4.6 41.0±3.6* ЛПВП (мг/дл) 33.2±2.6 30.9±0.9 44.3±2.1* ЛПНП (мг/дл) 40.3±1.6 121.3±2.1# 71.4±3.2* ЛПОНП (мг/дл) 12.1±0.8 11.1±0.7 7.5±0.6* Примечания: # - достоверные различия по сравнению с интактными (р<0.05); * - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0.05).

Таблица 13. Влияние курсового введения соединения формулы (1) на уровень глюкозы в сыворотке крови крыс с аллоксановым диабетом (X±SE) Группа животных Содержание глюкозы (мг/дл) в разные дни после введения аллоксана: 3 10 17 24 Интактные 71.5±6.4 80.9±9.2 72.3±8.8 66.1±11.2 Контроль (аллоксан) 296.1±15.6* 314.4±7.7* 275.6±21.0* 272.0±19.6* Опыт (аллоксан + соединение формулы (1)) 279.7±20.8* 134.6±17.6*# 154.0±12.7*# 116.7±10.5*# Примечания: * - достоверные различия по сравнению с интактными (р<0.05); # - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0.05).

Таблица 14. Влияние курсового введения соединения формулы (1) на некоторые биохимические показатели сыворотки крови крыс с аллоксановым диабетом на 22-е сутки после введения аллоксана (X±SE) Показатель Группы животных интактные контроль (аллоксан) опыт (аллоксан + соединение формулы (1)) Общий холестерин (мг/дл) 67.4±2.6 154.6±6.1* 77.1±3.22# Триглицериды(мг/дл) 59.2±3.5 163.1±4.3* 88.6±4.1*# ЛПВП (мг/дл) 38.6±1.8 12.1±2.0* 35.6±2.2# ЛПНП (мг/дл) 32.7±2.9 176.4±6.4* 38.9±2.3# ЛПОНП(мг/дл) 11.3±0.9 32.6±1.5* 16.3±1.1*# Общий белок (г/дл) 6.43±0.36 2.97±0.97* 5.85±0.26# Альбумин (г/дл) 5.99±0.31 3.86±0.17* 5.21±0.14# Креатинин (г/дл) 0.39±0.03 1.65±0.07* 0.56±0.40# Примечания: * - достоверные различия по сравнению с интактными (р<0.05); # - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0.05).

Таблица 15. Влияние курсового введения соединения формулы (1) на функциональное состояние печени при токсическом гепатите у крыс, вызванном введением тетрахлорметана (X±SE) Исследуемый показатель Группа животных интактные контроль (CCl4) опыт (CCl4 + соединение формулы (1)) МДА (моль/г ткани) 0.31±0.09 1.82±0.18* 1.26±0.11*# Глутатион (мкМоль/г белка) 4.76±0.07 2.84±0.04* 4.53±0.05# Супероксиддисмутаза (Ед/мг) 38.56±0.69 15.53±0.47* 32.53±0.84*# Каталаза (Ед/мг) 94.63±6.74 46.37±2.93* 72.34±7.64# Глутатионпероксидаза (Ед/мг) 38.55±2.87 19.74±1.32* 31.94±2.11# Примечания: * - достоверные различия по сравнению с интактными (р<0.05); # - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0.05).

Таблица 16. Влияние курсового введения соединения формулы (1) на реакции клеточного (гиперчувствительность замедленного типа - ГЗТ) и гуморального (антителообразующие клетки - АОК) иммунитета у мышей, иммунизированных эритроцитами барана (X±SE) Группа животных Величина реакции ГЗТ (мг) Число АОК, 103/селезенку Контроль (иммунизация) 19.68±2.68 63.8±6.5 Опыт (иммунизация + соединение формулы (1)) 9.94±1.58* 39.4±4.2* Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0.05).

Похожие патенты RU2487884C1

название год авторы номер документа
ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО ТРИТЕРПЕНОВОЙ ПРИРОДЫ, ПОЛУЧЕННОЕ ПУТЕМ МОДИФИКАЦИИ ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТЫ 2009
  • Саломатина Оксана Владимировна
  • Салахутдинов Нариман Фаридович
  • Толстиков Генрих Александрович
  • Логашенко Евгения Борисовна
  • Зенкова Марина Аркадьевна
  • Власов Валентин Викторович
RU2401273C1
ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО ТРИТЕРПЕНОВОЙ ПРИРОДЫ 2008
  • Саломатина Оксана Владимировна
  • Салахутдинов Нариман Фаридович
  • Толстиков Генрих Александрович
  • Логашенко Евгения Борисовна
  • Зенкова Марина Аркадьевна
  • Власов Валентин Викторович
RU2393165C2
СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ С ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2010
  • Сорокина Ирина Васильевна
  • Толстикова Татьяна Генриховна
  • Жукова Наталья Анатольевна
  • Баев Дмитрий Сергеевич
  • Толстиков Генрих Александрович
  • Антимонова Анна Николаевна
  • Петренко Наталья Ивановна
  • Шульц Эльвира Эдуардовна
  • Николин Валерий Петрович
  • Попова Нелли Александровна
RU2425680C1
Водорастворимая композиция, обладающая противоопухолевой активностью и способ ее получения 2015
  • Саломатина Оксана Владимировна
  • Салахутдинов Нариман Фаридович
  • Зенкова Марина Аркадьевна
  • Логашенко Евгения Борисовна
  • Марков Андрей Владимирович
  • Болдырева Елена Владимировна
  • Огиенко Андрей Геннадьевич
  • Огиенко Анна Александровна
  • Богданова Екатерина Геннадьевна
RU2611362C1
ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ СРЕДСТВО С АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ, ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2009
  • Толстикова Татьяна Генриховна
  • Сорокина Ирина Васильевна
  • Жукова Наталья Анатольевна
  • Баев Дмитрий Сергеевич
  • Понеделькина Ирина Юрьевна
  • Лукина Елена Сергеевна
  • Хайбрахманова Эльвира Азаматовна
  • Одиноков Виктор Николаевич
  • Джемилев Усеин Меметович
RU2412712C1
Малотоксичные 1,3,4-оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты с простатопротекторным и противовоспалительным действием 2023
  • Сорокина Ирина Васильевна
  • Мешкова Юлия Владимировна
  • Жукова Наталья Анатольевна
  • Саломатина Оксана Владимировна
  • Попадюк Ирина Игоревна
  • Баев Дмитрий Сергеевич
  • Толстикова Татьяна Генриховна
  • Салахутдинов Нариман Фаридович
RU2819604C1
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ И ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ 3-АЦИЛОКСИМЕТИЛ-3-ОКСО-1-ЦИАНО-2,3-СЕКО-2-НОР-ТРИТЕРПЕНОИДОВ 2018
  • Крайнова Гульназ Фаизовна
  • Савинова Ольга Владимировна
  • Ерошенко Дарья Владимировна
  • Бореко Евгений Иванович
  • Еремин Владимир Федорович
  • Гришко Виктория Викторовна
RU2682669C1
ТРИТЕРПЕНОИДЫ С ФРАГМЕНТОМ ЕН-НИТРИЛА В А-ПЕНТАЦИКЛЕ 2012
  • Гришко Виктория Викторовна
  • Толмачева Ирина Анатольевна
  • Галайко Наталья Владимировна
  • Бореко Евгений Иванович
  • Еремин Владимир Федорович
  • Савинова Ольга Владимировна
  • Кучеров Игорь Иванович
RU2496785C1
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2014
  • Роговский Владимир Станиславович
  • Шимановский Николай Львович
  • Матюшин Александр Иванович
  • Коротеев Михаил Петрович
  • Коротеев Александр Михайлович
  • Нифантьев Эдуард Евгеньевич
RU2578473C2
1,2,4-Оксадиазольные производные дезоксихолевой кислоты, обладающие простатопротекторным действием, гипохолестеринемической и противовоспалительной активностями 2020
  • Сорокина Ирина Васильевна
  • Попадюк Ирина Игоревна
  • Жукова Наталья Анатольевна
  • Низомов Сирожиддин Ашуралиевич
  • Мешкова Юлия Владимировна
  • Баев Дмитрий Сергеевич
  • Борисов Сергей Алкисович
  • Саломатина Оксана Владимировна
  • Толстикова Татьяна Генриховна
  • Салахутдинов Нариман Фаридович
RU2750488C1

Реферат патента 2013 года СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ, НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ, ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЙ, ГИПОХОЛЕСТЕРИНЕМИЧЕСКОЙ, ГИПОГЛИКЕМИЧЕСКОЙ, ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЙ, ИММУНОСУПРЕССОРНОЙ АКТИВНОСТЯМИ

Изобретение относится к области медицины. Описано эффективное низкотоксичное средство, представляющее собой метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты формулы (I):

обладающее антиоксидантной, противовоспалительной, нейропротекторной, гиполипидемической, гипохолестеринемической, гипогликемической, гепатопротекторной, иммуносупрессорной активностями. Средство обладает низкой токсичностью и синтезируется на основе доступного растительного сырья. 13 пр., 16 табл.

Формула изобретения RU 2 487 884 C1

Средство, представляющее собой метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксо-18βН-олеан-1(2),11(9)-диен-30-овой кислоты формулы (I)

обладающее антиоксидантной, противовоспалительной, нейропротекторной, гиполипидемической, гипохолестеринемической, гипогликемической, гепатопротекторной, иммуносупрессорной активностями.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2013 года RU2487884C1

ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО ТРИТЕРПЕНОВОЙ ПРИРОДЫ, ПОЛУЧЕННОЕ ПУТЕМ МОДИФИКАЦИИ ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТЫ 2009
  • Саломатина Оксана Владимировна
  • Салахутдинов Нариман Фаридович
  • Толстиков Генрих Александрович
  • Логашенко Евгения Борисовна
  • Зенкова Марина Аркадьевна
  • Власов Валентин Викторович
RU2401273C1
ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО ТРИТЕРПЕНОВОЙ ПРИРОДЫ 2008
  • Саломатина Оксана Владимировна
  • Салахутдинов Нариман Фаридович
  • Толстиков Генрих Александрович
  • Логашенко Евгения Борисовна
  • Зенкова Марина Аркадьевна
  • Власов Валентин Викторович
RU2393165C2
Honda T
et al // J
Med
Chem
ЩИТОВОЙ ДЛЯ ВОДОЕМОВ ЗАТВОР 1922
  • Гебель В.Г.
SU2000A1

RU 2 487 884 C1

Авторы

Саломатина Оксана Владимировна

Салахутдинов Нариман Фаридович

Толстиков Генрих Александрович

Логашенко Евгения Борисовна

Марков Андрей Владимирович

Зенкова Марина Аркадьевна

Власов Валентин Викторович

Бельская Наталья Витальевна

Бельский Юрий Павлович

Даты

2013-07-20Публикация

2012-07-13Подача