ПЕПТИДЫ ЭПИТОПОВ MYBL2 И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ВАКЦИНЫ Российский патент 2013 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61P35/00 

Область техники

По настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительной Заявки США № 61/060293 от 10 июня 2008, полное содержание которой включено в настоящей документ ссылкой.

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, более конкретно, к области противораковой терапии. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые исключительно эффективны в качестве противораковых вакцин и лекарственных средств для лечения и предотвращения опухолей.

Уровень техники

Было продемонстрировано, что CD8-положительные CTL распознают пептиды эпитопов, выделенные из опухолевых специфических антигенов (TAA), обнаруженных на молекулах главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, и затем уничтожают опухолевые клетки. С момента открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) в качестве первого примера TAA было открыто много других TAA, главным образом посредством иммунологических способов (Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих TAA в настоящее время подвергаются клиническим исследованиям в качестве иммунотерапевтических мишеней.

Идентификация новых TAA, способных индуцировать специфический противоопухолевый иммунный ответ, обеспечивает дальнейшее развитие и клиническое применение стратегий пептидной вакцинации для различных типов рака (Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 JuI 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). К настоящему моменту, существует несколько сообщений о клинических испытаниях с использованием пептидов, выделенных из опухолевых специфичных антигенов. К сожалению, до сих пор в испытаниях этих противораковых вакцин наблюдали низкий целевой показатель ответной реакции (Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

TAA, который является необходимым для пролиферации и выживания раковых клеток, является вариантом в качестве мишени для иммунотерапии, так как использование таких TAA может минимизировать хорошо описанный риск ускользания раковых клеток от иммунного ответа, относимый на счет делеции, мутации или подавления (даун-регуляции) TAA как следствия проводимой терапевтической иммунной селекции.

С помощью скрининга кДНК-библиотек с зондами протоокогена c-myb (Nomura N et al., Nucleic Acids Res. 1988 Dec 9, 16(23): 11075-11089), MYBL2 (Регистрационный номер GenBank No: NM_002466, SEQ ID NO:21, кодирующая генный продукт SEQ ID NO:22), был идентифицирован гомолог миелобластозного вирусного онкогена v-myb, (птичий)-типа 2, в качестве члена семейства генов транскрипционного фактора MYB. Перед этой идентификацией, MYBL2 был известен в качестве молекулы, вовлеченной в регуляцию прогрессии клеточного цикла, а также в регуляцию запускаемого циклином фосфорилирования с помощью комплексов CDK2-циклин A и CDK2-циклин E (Robinson C et al., Oncogene 1996 May 2; 12(9): 1855-64, Lane et al., Oncogene 1997 May 22; 14(20):2445-53, SaIa et al., Proc Natl Acad Sci 1997 Jan 21; 94(2): 532-536, Johnson K et al., J Biol Chem 1999 Dec 17; 274(51): 36741-9). В недавнем сообщении было продемонстрировано, что Mip/LIN-9 регулируют экспрессию MYBL2, и оба белка играют ключевые роли в стимулировании развития клеточного цикла посредством контроля циклинами S и M фазы (Pilkinton M et al., J Biol Chem 2007 Jan 5; 282(1): 168-75). Кроме того, посредством анализа профиля экспрессии с использованием полногеномной микропанели кДНК, содержащей 23040 генов, MYBL2 также был идентифицирован в качестве новой молекулы, активированной (с ап-регуляцией) при некоторых раковых заболеваниях. Фактически было продемонстрировано, что MYBL2 активируется в некоторых раковых клетках, включающих, например, клетки тестикулярной опухоли (WO2004/031410), рака поджелудочной железы (WO2004/031412), рака мочевого пузыря (WO2006/085684), немелкоклеточного рака легкого (WO2004/031413), мелкоклеточного рака легкого (WO2007/013665) и рака пищевода (WO2004/031410), причем содержания этих описаний включено в настоящий документ ссылкой. Соответственно, в том MYBL2, который, как предполагается, является новым онкоантигеном, пептиды эпитопов, выделенные из MYB L2, могут быть применимы в качестве противораковых иммунотерапевтических средств для лечения широкого спектра раковых заболеваний.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение частично основано на открытии подходящих эпитопов пептидов, которые могут служить в качестве мишеней иммунотерапии. Так как TAA, как правило, воспринимаются иммунной системой как "свои" и, таким образом, часто не обладают присущей иммуногенностью, открытие подходящих мишеней представляет собой исключительную важность. Понимая, что MYBL2 был идентифицирован по активации в раковых клетках при раковых заболеваниях, таких как тестикулярная опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода, дальнейший анализ в настоящем изобретении нацелен на MYBL2 (SEQ ID NO: 22, кодируемая геном с Регистрационным номером базы GenBank No. NM_002466 (SEQ ID NO: 21)). Конкретно, выбирали продукты гена MYBL2, содержащие пептиды эпитопов, которые индуцируют CTL, специфичные для соответствующих молекул. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от здорового донора, стимулировали с использованием пептидов-кандидатов на связывание с HLA-A*2402, выделенных из MYB L2. Создавали CTL, которые специфично распознают HLA-A24-положительные клетки-мишени активированные с помощью соответствующих пептидов-кандидатов, и идентифицировали пептиды эпитопов, рестриктированных по HLA-A24, которые могут индуцировать убедительные и специфичные иммунные ответы против MYBL2. Эти результаты демонстрируют, что MYBL2 является в высокой степени иммуногенным, и его эпитопы являются эффективными мишенями для противоопухолевой иммунотерапии.

Соответственно, целью настоящего изобретения является предложение пептидов, обладающих способностью к индуцированию CTL, а также аминокислотных последовательностей, выбранных из числа, состоящего из SEQ ID NO: 1, 2 и 13. В настоящем изобретении предлагаются модифицированные пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2 или 13, где одна, две или более аминокислот заменены, вставлены, делетированы или добавлены при условии, что модифицированные пептиды сохраняют исходную способность к индуцированию CTL.

При введении субъекту настоящие пептиды презентируются на поверхности антиген-презентирующих клеток или экзосом и затем индуцируют CTL, нацеленные на соответствующие пептиды. Таким образом, целью настоящего изобретения является предложение антиген-презентирующих клеток и экзосом, презентирующих любые из настоящих пептидов, а также предложение способов индукции антиген-презентирующих клеток.

Противоопухолевый иммунный ответ индуцируется путем введения настоящих полипептидов MYBL2 или полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, а также экзосом и антиген-презентирующих клеток, которые презентируют полипептиды MYBL2. Таким образом, целью настоящего изобретения является предложение фармацевтических средств, содержащих полипептиды по настоящему изобретению или полинуклеотиды, кодирующие их, а также содержащих экзосомы и антиген-презентирующие клетки в качестве их активных ингредиентов. Фармацевтические средства по настоящему изобретению находят практическое применение в качестве вакцин.

Следующей целью настоящего изобретения является предложение способов лечения и/или профилактики (т.e. предотвращения) раковых заболеваний (опухолей), и/или предотвращения их послеоперационных рецидивов, а также способов индукции CTL, способов индукции иммунного ответа против опухолеспецифичного эндотелия, а также способов индукции противоопухолевого иммунитета, причем способы включают стадию введения полипептидов MYBL2, полинуклеотидов, кодирующих полипептиды MYBL2, экзосом или антиген-презентирующих клеток, презентирующих полипептиды MYBL2, или фармацевтических средств по изобретению. Кроме того, CTL по изобретению также находят применение в качестве противораковых вакцин. Примеры предполагаемых раковых заболеваний включают, в частности, тестикулярную опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода.

Дополнительно к вышеизложенному другие цели и признаки изобретения будут более очевидны при ознакомлении с следующим подробным описанием в сочетании с сопровождающими его чертежами и примерами. Однако следует понимать, что и вышеизложенная сущность изобретения и следующее подробное описание состоят из приведенных в качестве примера вариантов осуществлений, которые не ограничивают изобретение или другие альтернативные варианты осуществления изобретения. Конкретно, в то время как изобретение описано в настоящем документе со ссылкой на ряд конкретных вариантов осуществления, понятно, что описание является иллюстрацией изобретения и оно не построено в виде ограничения изобретения. Специалисты в данной области могут осуществлять различные модификации и применения, не выходя за рамки и сущность изобретения, описанные в приложенной формуле изобретения. Аналогично, другие цели, признаки, эффекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны исходя из сущности изобретения и конкретных воплощений, описанных ниже, и будут совершенно очевидны специалисту в данной области. Такие цели, признаки, эффекты и преимущества будут очевидны из вышеизложенного в сочетании с сопровождающимися примерами, данными, чертежами и всеми обоснованными выводами, сделанными на их основании, индивидуально или при рассмотрении ссылок, включенных в настоящий документ.

Краткое описание чертежей

Различные аспекты и применения настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области при рассмотрении краткого описания чертежей и подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, представленных ниже.

Фигура 1 состоит из серии фотографий, (a)-(d), изображающих результаты анализа ELISPOT для IFN-гамма на CTL, которые были индуцированы пептидами, выделенными из MYBL2. CTL в лунке номер #5, стимулированные с помощью MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO: 1) (a), #4 с помощью MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2) (b) и #1 с помощью MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13) (c), продемонстрировали убедительное продуцирование IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Напротив, не детектировали специфичного продуцирования IFN-гамма в CTL, стимулированных с помощью MYBL2-A24-10-48 (SEQ ID NO: 12) против клеток-мишеней, активированных пептидом (d). Клетки в лунках, обозначенных прямоугольным блоком, выращивали для создания линий CTL. На чертежах "+" обозначает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом, и "-" обозначает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не активированных никакими пептидами. Фигура 2 состоит из серий диаграмм в виде ломаной a-d, представляющих результат анализа ELISA для IFN-гамма на линиях CTL, созданных с помощью MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO: 1) (a), MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2) (b) и MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13) (c) в вышеописанном анализе ELISA для IFN-гамма. Результаты демонстрируют, что линии CTL, созданные путем стимулирования с помощью каждого пептида, продемонстрировали убедительное продуцирование IFN-гамма по сравнению с контролем. Напротив, не наблюдали никакого специфичного продуцирования IFN-гамма в линии CTL, созданной с помощью MYBL2-A24-10-48 (SEQ ID NO: 12), против клеток-мишеней, активированных пептидом (d). На фигурах "+" обозначает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных с помощью соответствующего пептида, и "-" обозначает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не активированных с помощью каких-либо пептидов.

Описание вариантов осуществления

Хотя при практическом осуществлении или при тестировании воплощений настоящего изобретения могут использоваться любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, сейчас будут описаны предпочтительные методы, устройства и материалы. Однако перед описанием настоящих материалов и методов, следует понять, что настоящее изобретение не ограничено конкретными размерами, формами, направлениями, методиками, протоколами и т.д., описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьировать согласно обычному проведению эксперимента и оптимизации. Также следует понимать, что терминология, используемая в описании, предназначена исключительно для целей описания конкретных вариантов или воплощений, и не подразумевает ограничения рамок настоящего изобретения, которое ограничивается только приложенной формулой изобретения.

Раскрытие каждой публикации, патента или патентной заявки, упомянутой в настоящем описании изобретения, специфически включено в настоящий документ в полном объеме с помощью ссылки. Однако ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не правомочно противопоставлять такое раскрытие более раннему приоритету посредством предшествующего изобретения.

I. Определения

До тех пор пока не определено по-другому, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, будут иметь такое же значение, какое обычно подразумевается специалистом в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Однако в случае противоречия настоящее описание изобретения, включающее определения, будет уточнено.

Формы единственного числа при использовании в настоящем документе, обозначают "по меньшей мере, один" до тех пор, пока не будет определенно указано другое.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются модифицированными остатками или синтетическими остатками, такими как искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также термины применяются к природным аминокислотным полимерам.

Термин "аминокислота", при использовании в настоящем документе, обозначает природные и синтетические аминокислоты, а также аминокислотные аналоги и аминокислотные миметики, которые обладают функцией, аналогичной функции природных аминокислот. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, которые кодируются с помощью генетического кода, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин). Фраза "аминокислотный аналог" обозначает соединения, которые имеют одинаковую общую химическую структуру (альфа-углеродный атом, связанный с водородом, карбокси-группой, аминогруппой и R-группой) с природной аминокислотой, но содержат модифицированную R-группу или модифицированный остов (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионин метилсульфоний). Фраза "аминокислотный миметик" обозначает химические соединения, которые имеют различные структуры, но одинаковые функции с основными аминокислотами.

Аминокислоты могут обозначаться в настоящем документе с помощью их общепринятых трехбуквенных символов или их однобуквенных символов, рекомендованных Комиссией по Биохимической Номенклатуре IUPAC-IUB.

Термины "ген", "полинуклеотиды", "нуклеотиды" и "нуклеиновые кислоты" используются в настоящем документе взаимозаменяемо и, до тех пор, пока определенно не указано другое, обозначаются их общепринятыми однобуквенными кодами.

До тех пор пока не определено по-другому, термин "рак" обозначает раковые заболевания, при которых сверхэкспрессируется ген MYBL2, включающие, например, тестикулярную опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода.

II. Пептиды

Для демонстрации того, что пептиды, выделенные из MYBL2, функционируют в качестве антигенов, распознаваемых цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), пептиды, выделенные из MYBL2 (SEQ ID NO: 22), анализировали для определения того, являются ли они эпитопами антигенов, рестриктированными по HLA-A24, которые представляют собой широко распространенные аллели HLA (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). Кандидаты пептидов, связывающихся с HLA-A24, выделенных из MYBL2, идентифицировали на основе их аффинностей связывания с HLA-A24. После in vitro-стимулирования T-клеток с помощью дендритных клеток (DC), несущих эти пептиды, CTL были успешно созданы с использованием каждого из следующих пептидов;

MYBL2- A24-9-100 (SEQ ID NO: 1),

MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2), и

MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13).

Эти созданные CTL демонстрируют убедительную специфичную активность CTL против клеток-мишеней, активированных с помощью соответствующих пептидов. Эти результаты, представленные в настоящем документе, демонстрируют, что MYBL2 представляет собой антиген, распознаваемый с помощью CTL, и что пептиды могут представлять собой пептиды эпитопов MYBL2, рестриктированных по HLA-A24.

Так как ген MYBL2 сверхэкспрессируется в большинстве опухолевых тканей, включающих, например, тестикулярную опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода, то он представляет собой удобную мишень для иммунотерапии. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются нонапептиды (пептиды, состоящие из девяти аминокислотных остатков) и декапептиды (пептиды, состоящие из десяти аминокислотных остатков), соответствующие эпитопам MYBL2, распознаваемым CTL. Особенно предпочтительные примеры нонапептидов и декапептидов по настоящему изобретению включают такие пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NOs: 1, 2 и 13.

Как правило, программы пакета программного обеспечения, доступного в настоящий момент из Интернета, такие как описанные у Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, могут использоваться для расчета аффинностей связывания между различными пептидами и антигенами HLA in silico. Аффинность связывания с антигенами HLA может быть измерена так, как описано, например, у Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; и Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81. Методы определения аффинности связывания описаны, например, в публикациях Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190 и Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Таким образом, настоящее изобретение охватывает пептиды MYBL2, которые связываются с антигенами HLA, идентифицированные с использованием таких известных программ.

Нонапептиды и декапептиды по настоящему изобретению могут фланкироваться дополнительными аминокислотными остатками при условии, что полученный в результате пептид сохраняет свою способность к индуцированию CTL. Такие пептиды, обладающие способностью к индуцированию CTL, как правило, содержат менее чем примерно 40 аминокислот, часто менее чем примерно 20 аминокислот, обычно менее чем примерно 15 аминокислот. Конкретные аминокислотные последовательности, фланкирующие нонапептиды и декапептиды по настоящему изобретению (например, пептиды, состоящие из аминокислотной пследовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 2 и 13), не ограничены и могут состоять из любого типа аминокислот при условии, что это не ослабляет способность исходного пептида к индуцированию CTL. Таким образом, в настоящем изобретении также предлагаются пептиды, обладающие способностью к индуцированию CTL и имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из числа SEQ ID NO: 1, 2 и 13.

Как правило, модификация одной, двух или более аминокислот в белке не повлияет на функцию белка и, в некоторых случаях, даже усилит целевую функцию исходного белка. Фактически, известно, что модифицированные пептиды (т.e. пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой были модифицированы одна, две или несколько аминокислотных остатков (т.e. заменены, добавлены, делетированы или вставлены) по сравнению с исходной эталонной последовательностью), сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в одном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению могут обладать и способностью к индуцированию CTL, и аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 2 и 13, где одна, две или несколько аминокислот вставлены, добавлены, делетированы и/или заменены.

Специалистам в данной области понятно, что индивидуальные добавления или замены в аминокислотной последовательности, которые изменяют единственную аминокислоту или небольшой процент аминокислот, имеют тенденцию приводить в результате к сохранению свойств исходной аминокислотной боковой цепи. Как таковые, они часто обозначаются как "консервативные замены" или "консервативные модификации", где изменение белка приводит в результате к получению модифицированного белка, обладающего функцией, аналогичной функции исходного белка. Таблицы консервативных замен, представляющих функционально подобные аминокислоты, хорошо известны из уровня техники. Примеры характеристик аминокислотных боковых цепей, которые подходят для консервативных замен, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), и боковые цепи, содержащие следующие функциональные группы или общие характеристики: алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (S, T, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (C, M); боковые цепи, содержащие карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковые цепи, содержащие основание (R, K, H); и боковые цепи, содержащие ароматический компонент (H, F, Y, W). Кроме того, каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые признаны в области техники как консервативные замены друг для друга:

1) Аланин (A), Глицин (G);

2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E);

3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);

4) Аргинин (R), Лизин (K);

5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (M), Валин (V);

6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W);

7) Серин (S), Треонин (T); и

8) Цистеин (C), Метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

Также предполагается, что такие консервативно модифицированные пептиды являются пептидами по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению не ограничены этим и могут включать неконсервативные модификации при условии, что модифицированный пептид сохраняет способность исходного пептида к индуцированию CTL. Кроме того, модифицированные пептиды не должны исключать пептидов, способных к индуцированию CTL, представляющих собой полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели MYBL2.

Для сохранения необходимой способности к индуцированию CTL можно модифицировать (вставить, добавить, делетировать и/или заменить) небольшое количество (например, одну две или несколько) или небольшой процент аминокислот. В настоящем документе термин "несколько" обозначает 5 или менее аминокислот, например 4 или 3 или менее. Процент аминокислот, которые следует модифицировать, предпочтительно составляет 20% или менее, более предпочтительно, 15% или менее, еще более предпочтительно, 10% или менее или 1-5%.

Анализ гомологии предпочтительных пептидов по настоящему изобретению, MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO:1), MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO:2),and MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13), подтвердил, что эти пептиды не обладают значительной гомологией с пептидами, выделенными из любых других известных генных продуктов. Таким образом, возможность того, что эти пептиды будут генерировать неизвестный или нежелательный иммунный ответ при использовании в иммунотерапии, значительно снижается. Соответственно, эти пептиды, как ожидается, будут весьма приемлемы для вызова иммунного ответа против MYBL2 в раковых клетках пациентов с опухолями при таких заболеваниях, как тестикулярная опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода.

При использовании в контексте иммунотерапии, пептиды по настоящему изобретению должны презентироваться на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно, в виде комплекса с антигеном HLA. Таким образом, предпочтительно выбирать пептиды, которые не только индуцируют CTL, но также обладают высокой аффинностью к антигену HLA. С этой целью пептиды могут быть модифицированы путем замены, вставки, делеции и/или добавления аминокислотных остатков с получением модифицированного пептида, обладающего повышенной аффинностью связывания. Так как закономерность последовательностей пептидов, выявленная путем связывания с антигенами HLA, уже известна (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), то на основе такой закономерности дополнительно к пептидам, которые выявлены в природе, в иммуногенные пептиды по изобретению могут быть введены модификации. Например, может быть желательной замена второй аминокислоты от N-конца на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан и/или аминокислоты с C-конца на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин с целью повышения аффинности связывания с HLA-A24. Таким образом, настоящим изобретением охвачены пептиды, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13, где вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13 заменена на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан, и/или где C-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13 заменен на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин. Замены могут вводиться не только в концевые аминокислоты, но также в положения пептидов, соответствующие потенциальным сайтам распознавания TCR. Несколько исследований продемонстрировали, что аминокислотные замены в пептиде могут быть равноценны или могут быть лучше, чем исходные, например CAP1, p53_(264-272),Her-2/neu_(369-377) или gp100_(209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1; 168(3): 1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 и S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

В настоящем изобретении также предполагается добавление одной-двух аминокислот к N- и/или C-концу описанных пептидов. Такие модифицированные пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с антигеном HLA и сохраняющие способность к индуцированию CTL, также включены в настоящее изобретение.

Однако когда последовательность пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, обладающего отличной функцией, то могут индуцироваться побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или аллергические симптомы против определенных веществ. Таким образом, предпочтительно сначала провести поиск гомологии с использованием доступных баз данных во избежание ситуаций, в которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого белка. Когда после поиска гомологии становится ясно, что не существует пептида даже с 1 или 2 аминокислотными отличиями по сравнению с целевым пептидом, то целевой пептид может быть модифицирован с целью повышения аффинности связывания с антигенами HLA и/или повышения его способности к индуцированию CTL без какой-либо опасности таких побочных эффектов.

Хотя пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с антигенами HLA, описанные выше, как ожидается, являются высоко эффективными, пептиды-кандидаты, которые выбраны согласно наличию высокой аффинности связывания в качестве индикатора, дополнительно исследуют на предмет присутствия способности к индуцированию CTL. В настоящем документе фраза "способность к индуцированию CTL" указывает на способность пептида индуцировать цитотоксические лимфоциты (CTL) при их презентации на антиген-презентирующих клетках. Далее, "способность к индуцированию CTL" включает способность пептида индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, стимулировать лизис клеток-мишеней с помощью CTL, и способность увеличивать продуцирование IFN-гамма клетками CTL.

Подтверждение способности к индуцированию CTL осуществляется путем индукции антиген-презентирующих клеток, несущих человеческие MHC-антигены (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC)), или, более конкретно, клеток DC, выделенных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, после стимулирования с помощью пептидов, смешивания с CD8-положительными клетками, и затем путем измерения IFN-гамма, продуцированного и высвобожденного клетками CTL против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы, могут использоваться трансгенные животные, которые были получены для экспрессии человеческого антигена HLA (например, такие, как описано у BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DRl transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Например, клетки-мишени могут быть радиоактивно помечены с помощью ⁵¹Cr и подобных меток, и цитотоксическая активность может быть рассчитана исходя из радиоактивности, высвобожденной из клеток-мишеней. Альтернативно, способность к индуцированию CTL может оцениваться путем измерения IFN-гамма, продуцированного и высвобожденного с помощью CTL в присутствии антиген-презентирующих клеток (APC), которые несут иммобилизованные пептиды, и путем визуализации области ингибирования на среде с использованием моноклональных антител к IFN-гамма.

В результате определения способности пептидов к индуцированию CTL, как описано выше, было открыто, что те пептиды, которые обладают высокой аффинностью связывания с антигеном HLA, необязательно обладают высокой способностью к индуцированию CTL. Однако те пептиды, что были идентифицированы и оценены, нонапептиды или декапептиды, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13, как было обнаружено, демонстрируют особенно высокую способность к индуцированию CTL, а также высокую аффинность связывания с антигеном HLA. Таким образом, эти пептиды приведены в качестве примера как предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

Дополнительно к вышеописанным модификациям пептиды по настоящему изобретению также могут быть связаны с другими веществами при условии, что полученный в результате пептид сохраняет требуемую способность к индуцированию CTL, характерную для исходного пептида. Примеры подходящих веществ включают, например: пептиды, липиды, сахар и сахарные цепи, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковых цепей или фосфорилирование и т.д., при условии, что модификации не нарушают биологической активности, характерной для исходного пептида. Эти типы модификаций могут осуществляться для придания дополнительных функций (например, функции нацеливания, и функции доставки) или для стабилизации полипептида.

Из уровня техники известно, что, например, для повышения in vivo-стабильности полипептида, вводят D-аминокислоты, аминокислотные миметики или синтетические аминокислоты; этот принцип также может быть адаптирован к настоящим полипептидам. Стабильность полипептида может оцениваться рядом способов. Например, для тестирования стабильности могут использоваться пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка (см., например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

Пептиды по настоящему изобретению презентируются на поверхности клетки (например, антиген-презентирующей клетки) или экзосомы в виде комплексов в комбинации с антигенами HLA, и затем индуцируют CTL. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению включают пептиды, презентированные на поверхности клетки или экзосомы. Такие экзосомы могут быть получены, например, с использованием методов, подробно описанных в Публикациях Японской Патентной Заявки Kohyo No. Hei 11-510507 и WO99/03499, и могут быть получены с использованием APC, полученных от пациентов, которые являются субъектом для лечения и/или предотвращения заболевания. Экзосомы или клетки, презентирующие пептиды по настоящему изобретению, могут быть инокулированы в качестве вакцин.

Тип антигенов HLA, содержащихся в вышеописанных комплексах, должен совпадать с типом антигенов субъекта, которому требуется лечение и/или предотвращение заболевания. Например, в японской популяции превалирует HLA-A24, конкретно HLA-A2402, и, таким образом, он будет подходящим для японского пациента. Использование типа A24, который высоко экспрессируется у японцев и европейцев, является благоприятным для получения эффективных результатов, и также находят свое применение субтипы, такие как A2402. Обычно в клинике тип антигена HLA пациента, которому требуется лечение, исследуется заранее, что дает возможность подходящего выбора пептидов, обладающих высоким уровнем аффинности связывания с конкретным антигеном или обладающих способностью к индуцированию CTL путем презентации антигенов.

При использовании A24-типа антигена HLA для экзосомы или клетки, предпочтительно используются пептиды, содержащие последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13.

В настоящем документе, пептиды по настоящему изобретению также могут быть описаны как "MYBL2-пептид(ы)" или "MYBL2-полипептид(ы)".

III. Получение MYBL2-пептидов

Пептиды по изобретению могут быть получены с использованием хорошо известных методов. Например, пептиды могут быть получены синтетически с использованием технологии рекомбинантной ДНК или химического синтеза. Пептиды по изобретению могут быть синтезированы индивидуально или в виде более длинных полипептидов, состоящих из двух или более пептидов. Затем пептиды могут быть изолированы, т.е. очищены так, чтобы быть по существу свободными от других природных белков клетки-хозяина и их фрагментов или от любых других химических веществ.

Пептид по настоящему изобретению может быть получен посредством химического синтеза на основе выбранной аминокислотной последовательности. Примеры подходящих методов пептидного синтеза, которые могут быть адаптированы для синтеза, включают:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; и

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

Альтернативно, настоящие пептиды могут быть получены путем адаптации любого известного метода генетической инженерии для получения пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Например, сначала получают подходящий вектор, несущий полинуклеотид, кодирующий целевой пептид в экспрессируемой форме (например, полинуклеотид, расположенный ниже регуляторной последовательности, соответствующей промоторной последовательности) и трансформируют в подходящую клетку-хозяин. Клетку-хозяин затем культивируют для продуцирования пептида, представляющего интерес. Пептид также может быть получен in vitro, заимствуя in vitro-систему трансляции.

IV. Полинуклеотиды

В настоящем изобретении также предлагается полинуклеотид, который кодирует любые из вышеупомянутых пептидов по настоящему изобретению. Они включают полинуклеотиды, выделенные из природного гена MYBL2 (Регистрационный номер GenBank No. NM_002466 (SEQ ID NO: 21)), а также полинуклеотиды, содержащие их консервативно модифицированную нуклеотидную последовательность. В настоящем документе, фраза "консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность" обозначает последовательности, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. В связи с вырожденностью генетического кода, большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой данный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин определяется с помощью кодона, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой "молчащие вариации", которые представляют собой тип консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует пептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно представляет собой единственный кодон для метионина, и TGG, который обычно представляет собой единственный кодон для триптофана) может быть модифицирован с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, полностью описана в каждой приложенной последовательности.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может состоять из ДНК, РНК и их производных. ДНК подходящим образом состоит из оснований, таких как A, T, C и G, и в РНК T заменяется на U.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может кодировать множество пептидов по настоящему изобретению, содержащих посередине внутренние аминокислотные последовательности или не содержащих их. Например, внутренняя аминокислотная последовательность может обеспечивать наличие сайта расщепления (например, последовательность распознавания ферментом) полинуклеотида или транслированных пептидов. Кроме того, полинуклеотид может включать любые дополнительные последовательности к кодирующей последовательности, которая кодирует пептид по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может представлять собой рекомбинантный полинуклеотид, который включает регуляторые последовательности, требующиеся для экспрессии пептида, или может представлять собой экспрессирующий вектор (плазмиду) с маркерными генами и так далее. Как правило, такие рекомбинантные полинуклеотиды могут быть получены с помощью манипуляции с полинуклеотидами посредством использования подходящих рекомбинантных методов, например, с использованием полимераз и эндонуклеаз.

Оба типа методов, рекомбинантный и метод химического синтеза, могут использоваться для получения полинуклеотидов по настоящему изобретению. Например, полинуклеотид может быть получен путем вставки в подходящий вектор, который может экспрессироваться при трансфекции в компетентную клетку. Альтернативно, полинуклеотид может амплифицироваться с использованием ПЦР-методов или с использованием экспрессии в подходящих хозяевах (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полинуклеотид может синтезироваться с использованием твердофазных методов, описанных у Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5.

V. Антиген-презентирующие клетки (APC)

В настоящем изобретении также предлагаются антиген-прзентирующие клетки (APC), которые презентируют на своей поверхности комплексы, образованные между анетигенами HLA и пептидами по настоящему изобретению. APC, которые получены путем контакта с пептидами по настоящему изобретению, или путем введения нуклеотидов, кодирующих пептиды по настоящему изобретению в экспрессирующей форме, могут быть получены от пациентов, которые являются субъектом лечения и/или предотвращения заболевания, и могут вводиться сами по себе в качестве вакцин или в комбинации с другим лекарственными средствами, включающими пептиды по настоящему изобретению, экзосомы или цитотоксические Т-клетки.

APC не ограничены конкретным типом клеток и включают дендритные клетки (DC), клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, которые, как известно, презентируют белковые антигены на своей поверхности так, чтобы они распознавались лимфоцитами. Так как DC представляют собой APC, обладающие сильнейшим действием в виде способности к индуцированию CTL среди APC, то DC находят применение в качестве APC по настоящему изобретению.

Например, APC могут быть получены путем индукции DC из моноцитов периферической крови и затем их контакта (стимулирования) с пептидами по настоящему изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. При введении субъектам пептидов по настоящему изобретению, APC, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению, индуцируются в теле субъекта. Фраза "индукция APC" включает контакт (стимулирование) клетки с пептидами по настоящему изобретению или с нуклеотидами, кодирующими пептиды по настоящему изобретению, для презентации комплексов, образованных между антигенами HLA и пептидами по настоящему изобретению на клеточной поверхности. Альтернативно, после введения пептидов по настоящему изобретению к APC, чтобы дать возможность APC презентировать пептиды, APC могут вводиться субъекту в качестве вакцины. Например, ex vivo-введение может включать стадии:

a: отбора APC у первого субъекта;

b: контакта APC стадии a с пептидом и

c: введения APC, несущих пептид, второму субъекту.

Первый субъект и второй субъект могут быть одним и тем же индивидуумом или могут быть различными индивидуумами. Альтернативно, согласно настоящему изобретению предлагается применение пептидов по настоящему изобретению для производства фармацевтической композиции, индуцирующей антиген-презентирующие клетки. Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ или метод производства фармацевтической композиции, индуцирующей антиген-презентирующие клетки. Кроме того, в настоящее изобретении также предлагаются пептиды по настоящему изобретению для индукции антиген-презенетрирующих клеток. APC, полученные с помощью стадии (b), могут вводиться субъекту в качестве вакцины.

Согласно аспекту настоящего изобретения, APC обладают высоким уровнем способности к индуцированию CTL. В термине "высокий уровень способности к индуцированию CTL", высокий уровень является относительным по отношению к уровню индукции с помощью APC, не контактирующих с пептидом или пептидами, и которые не могут индуцировать CTL. Такие APC, обладающие высоким уровнем способности к индуцированию CTL, могут быть получены с помощью метода, который включает in vitro-стадию трансфекции в APC генов, содержащих полинуклеотиды, которые кодируют пептиды по настоящему изобретению. Введение генов может быть в форме ДНК или РНК. Примеры методов введения включают без конкретных ограничений различные методы, обычно осуществляемые в этой области, такие как липофекция, электропорация, а также может использоваться кальций фосфатный метод. Более конкретно, это может осуществляться, как описано в публикациях Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281. После трансфекции гена в APC, ген подвергается в клетке транскрипции, трансляции и так далее, и затем полученный белок процессируется с помощью MHC Класса I или Класса II, и продолжает процессироваться через путь презентации для презентации частных пептидов.

VI. Цитотоксические T-клетки

Цитотоксическая T-клетка, индуцированная против любого из пептидов по настоящему изобретению, усиливает иммунный ответ, нацеленный на опухолеспецифичный эндотелий in vivo, и, таким образом, может использоваться в качестве вакцины подобно пептидам, как таковым. Таким образом, в настоящем изобретении также предлагаются изолированные цитотоксические T-клетки, которые специфически индуцируются или активируются любым из настоящих пептидов.

Такие цитотоксические T-клетки могут быть получены путем (1) введения субъекту или путем (2) контакта (стимулирования) полученных от субъекта APC, и CD8-положительных клеток, или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro с пептидами по настоящему изобретению.

Цитотоксические T-клетки, которые были индуцированы путем стимулирования из APC, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению, могут быть получены от пациентов, которые являются субъектом лечения и/или предотвращения заболевания, и могут вводиться сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включающими пептиды по настоящему изобретению или экзосомы, для целей эффективной регуляции. Полученные цитотоксические T-клетки действуют специфично против клеток-мишеней, презентирующих пептиды по настоящему изобретению, или, например, против тех же пептидов использующихся для индукции. Клетки-мишени могут представлять собой клетки, которые эндогенно экспрессируют MYBL2, или клетки, трансфецированные с помощью гена MYBL2; и клетки, которые презентируют пептид по настоящему изобретению на клеточной поверхности благодаря стимулированию с помощью пептида, также могут служить в качестве мишеней атак активированных CTL.

VII. T-клеточный рецептор (TCR)

В настоящем изобретении также предлагается композиция, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые способны к образованию субъединицы T-клеточного рецептора (TCR), а также способы ее применения. TCR-субъединицы обладают способностью к образованию TCR, которые придают специфичность к Т-клеткам против опухолевых клеток, презентирующих MYBL2. С помощью использования методов, известных из уровня техники, могут быть идентифицированы нуклеиновые кислоты альфа- и бета-цепей в качестве TCR-субъединиц CTL, индуцированных с помощью одного или более пептидов по настоящему изобретению (WO2007/032255 и Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Производные TCR могут связываться с высокой авидностью с клетками-мишенями, презентирующими пептид MYBL2, и необязательно опосредуют эффективное уничтожение клеток-мишеней, презентирующих пептид MYBL2, in vivo и in vitro.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие субъединицы TCR, могут быть включены в подходящие векторы, например, в ретровирусные векторы. Эти векторы хорошо известны из уровня техники. Нуклеиновые кислоты или векторы, содержащие их, могут быть трансфецированы в Т-клетку, например в Т-клетку пациента. Преимущественно в изобретении предлагается готовая к использованию композиция, дающая возможность быстрой модификации собственных Т-клеток пациента (или Т-клеток другого млекопитающего) для быстрого и легкого получения модифицированных T-клеток, обладающих исключительными свойствами уничтожения раковых клеток.

Также в настоящем изобретении предлагаются CTL, которые получают путем трансдукции с помощью нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды субъединиц TCR, которые связываются с пептидом MYBL2, например, SEQ ID NO: 1, 2 или 13 применительно к HLA-A24. Трансдуцированные CTL способны стремиться к микроокружению раковых клеток in vivo, и могут быть размножены с помощью хорошо известных методов культивирования in vitro (например, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). T-клетки по изобретению могут использоваться для образования иммуногенной композиции, применяемой для лечения или предотвращения рака у пациента, нуждающегося в терапии или в активации иммунитета (WO2006/031221).

Предотвращение или профилактика заболевания включают любую активность, которая снижает процент смертности или заболеваемости в результате данного заболевания. Предотвращение и профилактика могут происходить "на первичном, вторичном и третичном уровне предотвращения". В то время как первичное предотвращение и профилактика избегают развития заболевания, вторичный и третичный уровень предотвращения и профилактики охватывает активности, имеющие целью предотвращение и профилактику прогрессии заболевания и проявления симптомов, а также снижение вредного воздействия уже появившегося заболевания путем восстановления функции и снижения осложнений, сопровождающих заболевание. Альтернативно, предотвращение и профилактика включают широкий спектр профилактических терапий, имеющих целью облегчение тяжести конкретного расстройства, например снижения пролиферации и метастазирования опухолей.

Лечение и/или профилактика рака и/или предотвращение его послеоперационного рецидива включает любую из следующих стадий, таких как хирургическое удаление раковых клеток, ингибирование роста раковых клеток, инволюцию или регрессию опухоли, индукцию ремиссии и подавление появления рака, опухолевую регрессию и снижение или ингибирование метастазирования. Эффективное лечение и/или профилактика рака снижает смертность и улучшает прогноз индивидуумов, имеющих рак, снижает уровень опухолевых маркеров в крови и облегчает детектируемые симптомы, сопровождающие рак. Например, снижение или улучшение симптомов, составляющее эффективное лечение и/или профилактику, включает снижение на 10%, 20%, 30% или более процентов, или включает стабильное течение заболевания.

VIII. Фармацевтические средства или композиция

Так как экспрессия MYBL2 активируется в раковых клетках при нескольких раковых заболеваниях по сравнению со здоровой тканью, пептиды по настоящему изобретению или полинуклеотиды, кодирующие пептиды, могут использоваться для лечения и/или для профилактики рака, и/или для предотвращения его послеоперационного рецидива. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается фармацевтическое средство или композиция для лечения и/или профилактики рака и/или для предотвращения его послеоперационного рецидива, которые включают в качестве активного ингредиента один или несколько пептидов по настоящему изобретению или полинуклеотиды, кодирующие пептиды. Альтернативно, настоящие пептиды могут экспрессироваться на поверхности любой из вышеупомянутых экзосом или клеток, таких как APC, для применения в качестве фармацевтических средств или композиций. Кроме того, вышеупомянутые цитотоксические Т-клетки, которые нацелены на любой из пептидов по изобретению, также могут использоваться в качестве активного ингредиента настоящих фармацевтических средств или композиций.

В другом воплощении в настоящем изобретении также предлагается применение активного ингредиента, выбранного из числа:

(a) пептида по настоящему изобретению,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, раскрытый в настоящем документе, в экспрессирующейся форме,

(c) APC по настоящему изобретению, и

(d) цитотоксических T-клеток по настоящему изобретению в производстве фармацевтической композиции или средств для лечения рака.

Альтернативно, в настоящем изобретении дополнительно предлагается активный ингредиент, выбранный из числа:

(a) пептида по настоящему изобретению,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, раскрытый в настоящем документе, в экспрессирующейся форме,

(c) APC по настоящему изобретению, и

(d) цитотоксических T-клеток по настоящему изобретению для применения в лечении рака.

Альтернативно, в настоящем изобретении дополнительно предлагается способ или метод производства фармацевтической композиции или средств для лечения рака, где способ или метод включает стадию составления смеси фармацевтически или физиологически приемлемого носителя с активным ингредиентом, выбранным из числа:

(a) пептида по настоящему изобретению,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, раскрытый в настоящем документе, в экспрессирующейся форме,

(c) APC по настоящему изобретению, и

(d) цитотоксических T-клеток по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов.

В другом варианте осуществления в настоящем изобретении также предлагается способ или процесс производства фармацевтической композиции или средства для лечения рака, где способ или процесс включает стадию предварительного смешивания активного ингредиента с фармацевтически или физиологически совместимым носителем, где активный ингредиент выбран из числа:

(a) пептида по настоящему изобретению,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, раскрытый в настоящем документе, в экспрессирующейся форме,

(c) APC по настоящему изобретению, и

(d) цитотоксических T-клеток по настоящему изобретению.

Альтернативно, фармацевтическая композиция или средство по настоящему изобретению может использоваться для любого из двух или для обоих вместе, профилактики рака и предотвращения его послеоперационного рецидива.

Настоящие фармацевтические средства или композиции находят применение в качестве вакцины. В контексте настоящего изобретения, фраза "вакцина" (также обозначаемая как "иммуногенная композиция") обозначает вещество, которое имеет функцию индукции противоопухолевого иммунитета при инокуляции животным.

Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут использоваться для лечения и/или предотвращения раковых заболеваний, и/или для предотвращения их послеоперационных рецидивов у субъектов или пациентов, включающих человека и любое другое млекопитающее, включающее, в частности, мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, козу, свинью, крупный рогатый скот, лошадь, обезьяну, бабуина и шимпанзе, конкретно, важное с коммерческой точки зрения животное или домашнее животное.

Согласно настоящему изобретению полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из числа SEQ ID NO: 1, 2 и 13, как было обнаружено, представляют собой пептиды эпитопов, рестриктированных по HLA-A24, или пептиды-кандидаты, которые могут индуцировать убедительный и специфичный иммунный ответ. Таким образом, настоящие фармацевтические средства или композиции, которые включают любой из этих полипептидов с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1, 2 или 13, особенно подходят для введения субъектам, чей антиген HLA представляет собой HLA-A24. То же самое применяется к фармацевтическим средствам или композициям, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие любой из этих полипептидов.

Раковые заболевания, которые подвергаются лечению с помощью фармацевтических средств или композиций по настоящему изобретению, не ограничены и включают все типы раковых заболеваний, в какие вовлечен MYBL2, включающие, например, тестикулярную опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода.

Настоящие фармацевтические средства или композиции могут содержать дополнительно к вышеупомянутым активным ингредиентам другие пептиды, которые обладают способностью к индуцированию CTL против раковых клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие другие пептиды, другие клетки, которые презентируют другие пептиды и так далее. В настоящем документе другие пептиды, которые обладают способностью к индуцированию CTL против раковых клеток, приведены в качестве примера с помощью опухолеспецифичных антигенов (например, идентифицированных как TAA), но не ограничены ими.

Если необходимо, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению необязательно могут включать другие терапевтические вещества в качестве активных ингредиентов при условии, что вещество не ингибирует противоопухолевый эффект активного ингредиента, например, любого из настоящих пептидов. Например, составы могут включать противоопухолевые средства или композиции, болеутоляющие средства, химиотерапевтические средства и тому подобное. Дополнительно к включению других терапевтических веществ в само лекарственное средство, лекарственные средства по настоящему изобретению также могут вводиться последовательно или одновременно вместе с одним или несколькими другими фармакологическими средствами или композициями. Количества лекарственного средства и фармакологического средства или композиции зависят, например, от того, какой используется тип фармакологического средства(в) или композиции(й), какое заболевание подвергается лечению и от графика и путей введения.

Следует понимать, что дополнительно к ингредиентам, конкретно упомянутым в настоящем документе, фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут включать другие подходящие средства или композиции согласно уровню техники, с учетом типа рассматриваемого состава.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения настоящие фармацевтические средства или композиции могут быть включены в готовые изделия и в наборы реагентов, содержащие вещества, применяемые для лечения патологических состояний заболевания, которое подвергается лечению, например, рака. Готовое изделие может включать контейнер любого из настоящих фармацевтических средств или композиций, имеющий маркировку. Подходящие контейнеры включают флаконы, ампулы и пробирки. Контейнеры могут быть сделаны из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Маркировка на контейнере должна указывать средство или композицию, используемые для лечения или предотвращения одного или более состояний заболевания. Маркировка также может указывать руководство по введению и так далее.

Дополнительно к контейнеру, описанному выше, набор реагентов, включающий фармацевтическое средство или композицию по настоящему изобретению, необязательно может дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель. Он может дополнительно включать другие вещества, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включающие другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкциями по применению.

Фармацевтические композиции могут, если необходимо, присутствовать в упаковке или в дозирующем устройстве, которое может содержать одну или несколько дозированных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, включать металлическую фольгу или пластиковую пленку, такую как блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство может сопровождаться инструкциями по введению.

(1) Фармацевтические средства или композиции, содержащие пептиды в качестве активного ингредиента

Пептиды по настоящему изобретению могут вводиться непосредственно в виде фармацевтического средства или композиции или, если необходимо, в виде состава, приготовленного с помощью подходящих методов приготовления составов. В последнем случае дополнительно к пептидам по настоящему изобретению по необходимости могли быть включены без конкретных ограничений носители, вспомогательные вещества и так далее, которые обычно использовались для лекарственных средств. Примеры таких носителей представляют собой стерильную воду, физиологический раствор, фосфатный буфер, культуральную жидкость и так далее. Кроме того, фармацевтические средства или композиции могут содержать по необходимости стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества и так далее. Фармацевтические средства или композиции по настоящему изобретению могут использоваться в противораковых целях.

Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены в виде комбинации, состоящей из двух или более пептидов по изобретению, для индукции CTL in vivo. Пептидная комбинация может принимать форму коктейля, или пептиды могут быть соединены друг с другом с использованием стандартных методов. Например, пептиды могут быть химически связаны или могут экспрессироваться в виде единой сшитой полипептидной последовательности. Пептиды в комбинации могут быть одинаковыми или различными. Путем введения пептидов по настоящему изобретению пептиды презентируются с высокой плотностью с помощью антигенов HLA на APC, затем индуцируются CTL, которые специфично реагируют в отношении комплекса, образованного между презентированным пептидом и антигеном HLA. Альтернативно, APC, которые презентируют любой из пептидов по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности, получают путем отбора APC (например, DC) у субъектов, и стимулирования их с помощью пептидов по настоящему изобретению, CTL индуцируется у субъектов путем повторного введения этих APC (например, DC) субъектам, и в результате может быть увеличена агрессивность по отношению к раковым клеткам при таких заболеваниях, как тестикулярная опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода.

Фармацевтические средства или композиции для лечения и/или предотвращения рака, которые включают пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, также могут включать адъювант, который, как известно, эффективно создает клеточный иммунитет. Альтернативно, фармацевтические средства или композиции могут вводиться с другими активными ингредиентами или вводиться с помощью состава в виде гранул. Адъювант обозначает соединение, которое усиливает иммунный ответ против белка при введении вместе (или последовательно) с белком, обладающим иммунологической активностью. Адъюванты, предлагаемые в настоящем документе, включают адъюванты, описанные в публикациях (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Примеры подходящих адъювантов включают, в частности, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, холерный экзотоксин, токсин сальмонеллы и так далее.

Кроме того, подходящим образом могут использоваться липосомные составы, гранулярные составы, в которых пептид связан с гранулами диаметром несколько микрометров, и составы, в которых липид связан с пептидом.

В некоторых воплощениях, фармацевтические средства или композиции по изобретению могут дополнительно включать компонент, который стимулирует CTL. Липиды были идентифицированы в качестве средств или композиций, способных к стимулированию CTL in vivo против вирусных средств. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут прикрепляться к эпсилон- и альфа-аминогруппам остатка лизина и затем связываться с пептидом по изобретению. Липидированный пептид может затем включаться в липосому непосредственно в виде мицеллы или частицы, или может затем эмульгироваться в адъюванте. В качестве другого примера липидного стимулирования CTL ответов, могут использоваться липопротеины E. Coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинилсерил-серин (P3CSS), для стимулирования CTL при ковалентном присоединении к соответствующему пептиду (смотри, например, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

Метод введения может представлять собой пероральное введение, внутрикожное, подкожное, внутривенную инъекцию или им подобные, а также может представлять собой системное введение или местное введение в область, прилегающую к целевым сайтам. Введение может осуществляться с помощью однократного введения или может усиливаться с помощью множественных введений. Доза пептидов по настоящему изобретению может подходящим образом подбираться согласно заболеванию, которое подлежит лечению, возрасту пациента, массе, методу введения и так далее, и обычно составляет 0,001 мг - 1000 мг, например, 0,001 мг - 1000 мг, например, 0,1 мг - 10 мг, и может вводиться от одного раза в несколько дней до одного раза в несколько месяцев. Специалист в данной области может выбрать соответствующим образом подходящую дозу.

(2) Фармацевтические средства или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента

Фармацевтические средства или композиции по изобретению также могут содержать нуклеиновые кислоты в экспрессирующейся форме, кодирующие пептиды, раскрытые в настоящем документе. В настоящем документе фраза "в экспрессирующейся форме" обозначает, что полинуклеотид при введении в клетку будет экспрессироваться in vivo в виде полипептида, который индуцирует противоопухолевый иммунитет. В приведенном в качестве примера воплощении, последовательность нуклеиновой кислоты полинуклеотида, представляющего интерес, включает регуляторные элементы, необходимые для экспрессии полинуклеотида. Полинуклеотид(ы) может быть оснащен для достижения стабильной вставки в геном клетки-мишени (смотри, например, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 для описания кассеты векторов гомологичной рекомбинации). См., например, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; Патенты США № 5580859; 5589466; 5804566; 5739118; 5,736,524; 5679647; и WO 98/04720. Примеры методик доставки на основе ДНК включают "депротеинизированную ДНК", облегченную доставку (опосредованную с помощью бупивакаина, полимеров, пептидов), доставку с помощью катионных липидных комплексов и доставку, опосредованную частицами ("генная пушка"), или доставку, опосредованную давлением (см., например, Патент США № 5922687).

Пептиды по настоящему изобретению также могут экспрессироваться с помощью вирусных или бактериальных векторов. Примеры экспрессирующих векторов включают ослабленных вирусных хозяев, таких как вакциния или оспа птиц. Этот способ включает использование вируса вакцинии, например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, которые кодируют пептид. При введении в хозяин рекомбинантный вирус вакцинии экспрессирует иммуногенный пептид и, таким образом, индуцирует иммунный ответ. Векторы вакцинии и методы, применяемые в протоколах иммунизации, описаны, например, в Патенте США No. 4722848. Другой вектор представляет собой BCG (бациллу Кальмета-Герена). Векторы BCG описаны у Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60. Также очевидно широкое разнообразие других векторов, применяемых для терапевтического введения или иммунизации, например, адено- и аденоассоциированных вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы на основе Salmonella typhi, векторы на основе нейтрализованного токсина сибирской язвы и так далее. См., например, Shata et al., MoI Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85.

Доставка полинуклеотида пациенту может быть или непосредственной, в этом случае пациент непосредственно подвергается воздействию вектора, несущего полинуклеотид, или доставка может быть косвенной, в этом случае клетки сначала трансформируются in vitro полинуклеотидом, представляющим интерес, затем клетки трансплантируются пациенту. Эти два способа известны, соответственно, как in vivo и ex vivo генная терапия.

Для общего обзора методов генной терапии, смотри, например, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Методы технологии рекомбинантной ДНК, широко известные из уровня техники, которые также используются по настоящему изобретению, описаны в публикациях eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; и Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.

Метод введения может представлять собой пероральное введение, внутрикожное, подкожное, внутривенную инъекцию или им подобные, а также может представлять собой системное введение или местное введение в область, прилегающую к целевым сайтам. Введение может осуществляться с помощью однократного введения или может усиливаться с помощью множественных введений. Доза полинуклеотида в подходящем носителе или клеток, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептиды по настоящему изобретению, может подходящим образом подбираться согласно заболеванию, которое подлежит лечению, возрасту пациента, массе, методу введения и так далее, и обычно составляет 0,001 мг - 1000 мг, например 0,001 мг - 1000 мг, например 0,1 мг - 10 мг, и может вводиться от одного раза в несколько дней до одного раза в несколько месяцев. Специалист в данной области может выбрать соответствующим образом подходящую дозу.

IX. Способы с применением пептидов, экзосом, APC и CTL

Пептиды по настоящему изобретению и полинуклеотиды, кодирующие такие пептиды, могут использоваться для индукции APC и CTL. Экзосомы и APC по настоящему изобретению также могут использоваться для индукции CTL. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и APC могут использоваться в комбинации с любыми другими соединениями при условии, что соединения не ингибируют способность пептидов к индуцированию CTL. Таким образом, любые из вышеупомянутых фармацевтических средств по настоящему изобретению могут использоваться для индукции CTL, и, дополнительно к этому, также могут использоваться средства, включающие пептиды и полинуклеотиды, для индукции APC, как обсуждалось выше.

(1) Способ индукции антиген-презентирующих клеток (APC)

В настоящем изобретении предлагаются способы индукции APC с использованием пептидов по настоящему изобретению или полинуклеотидов, кодирующих пептиды. Индукция APC может осуществляться, как описано выше в "VI. Антиген-презентирующие клетки". В настоящем изобретении также предлагается способ индукции APC, обладающих высоким уровнем способности к индуцированию CTL, индукция которых также упоминается в пункте "VI. Антиген-презентирующие клетки", выше.

(2) Способ индукции CTL

Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются способы индукции CTL с использованием пептидов по настоящему изобретению, полинуклеотидов, кодирующих пептиды, или экзосом или APC, презентирующих пептиды. При введении субъекту пептидов по настоящему изобретению, в теле субъекта индуцируются CTL, и сила иммунного ответа, нацеленного на опухолеспецифичный эндотелий возрастает. Альтернативно, пептиды и полинуклеотиды, кодирующие пептиды, могут использоваться для ex vivo терапевтического метода, в котором полученные от субъекта APC и CD8-положительные клетки или мононуклеарные лейкоциты периферической крови контактируют (стимулируются) с пептидами по настоящему изобретению in vitro, и после индукции CTL, активированные клетки CTL возвращаются субъекту. Например, метод включает стадии:

a: отбора APC у субъекта;

b: контакта APC стадии a с пептидом;

c: смешивания APC стадии b с CD⁸⁺ Т-клетками и совместного культивирования для индукции CTL: и

d: сбора CD⁸⁺ Т-клеток после совместного культивирования стадии c.

Альтернативно, согласно настоящему изобретению предлагается применение пептидов по настоящему изобретению для производства фармацевтической композиции, индуцирующей CTL. Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ или метод производства фармацевтической композиции, индуцирующей CTL. Кроме того, в настоящем изобретении предлагается пептид по настоящему изобретению для индукции CTL.

CD⁸⁺ T-клетки, обладающие цитотоксической активностью, полученные с помощью стадии d, могут вводиться субъекту в качестве вакцины. APC, которые смешивают с CD⁸⁺ T-клетками в вышеописанной стадии c, также могут быть получены путем трансфекции генов, кодирующих настоящие пептиды, в APC, как подробно описано в разделе "VI. Антиген-презентирующие клетки"; но не ограничиваются этим. Соответственно, любые APC или экзосома, которые эффективно презентируют настоящие пептиды T-клеткам, могут использоваться в настоящем способе.

Следующие примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения и для того, чтобы способствовать специалисту в его осуществлении и применении. Примеры никоим образом не предназначены для какого-либо ограничения рамок изобретения.

ПРИМЕРЫ

Материалы и Методы

Клеточные линии

Клетки лимфобластной клеточной линии A24 (A24LCL) получали путем трансформации с помощью вируса Эпштейн-бара в человеческие В-лимфоциты, положительные по HLA-A24.

Выбор кандидатов из пептидов, выделенных из MYBL2

9-мерные и 10-мерные пептиды, выделенные из MYBL2, которые связываются с HLA-A*2402, были предсказаны с использованием программы прогноза связывания "BIMAS" (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind), чьи алгоритмы описаны у Parker KC et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75) и Kuzushima K et al. (Blood 2001, 98(6): 1872-81). Эти пептиды синтезировали с помощью Sigma (Sapporo, Japan) согласно стандартному методу твердофазного синтеза и очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обратной фазой (HPLC). Чистота (>90%) и идентичность пептидов определяли с помощью аналитической HPLC и масс-спектрометрического анализа, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) до концентрации 20 мг/мл и хранили при -80°C.

In vitro Индукция CTL

Полученные из моноцитов дендритные клетки (DC) использовали в качестве антиген-презентирующих клеток (APC) для индукции ответа цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) против пептидов, презентированных с лейкоцитарным антигеном человека (HLA). DC генерировали in vitro, как описано в других публикациях (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). Конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), изолированные от здорового волонтера (HLA-A*2402-положительных) с помощью раствора Фиколл-Пак (Pharmacia), разделяли путем адгезии на пластиковую чашку Петри (Becton Dickinson) для их обогащения в виде фракции моноцитов. Обогащенную моноцитами популяцию культивировали в присутствии 1000 Ед./мл гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (R&D System) и 1000 Ед./мл интерлейкина (IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированную нагреванием аутологическую сыворотку (AS). Через 7 дней культивирования цитокин-индуцированные DC активировали с помощью 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета2-микроглобулина в течение 3 часов при 37°C в среде AIM-V. Генерированные клетки, которые, как оказалось, экспрессируют DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класса II, на своих клеточных поверхностях (данные не показаны). Эти активированные пептидом DC затем инактивировали с помощью Митомицина C (MMC) (30 мкг/мл в течение 30 мин) и смешивали в соотношении 1:20 с аутологическими CD8+ T-клетками, полученными путем позитивной селекции с помощью набора реагентов CD8 Positive Isolation Kit (Dynal). Эти культуры поддерживали в 48-луночных планшетах (Corning); каждая лунка содержала 1,5×10⁴ активированных пептидом DC, 3×10⁵ CD8+ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл среды AIM-V/2% AS. Через три дня в эти культуры добавляли IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 МЕ/мл. На 7 и 14 день T-клетки дополнительно стимулировали с помощью аутологических активированных пептидом DC. DC получали каждый раз одинаковым способом, описанным выше. CTL тестировали против активированных пептидом клеток A24LCL после третьего раунда стимулирования пептидом на 21 день (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Процедура Размножения CTL

CTL размножали в культуре с использованием метода, подобного методу, описанному у Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). Всего 5×10⁴ CTL суспендировали в 25 мл среды AIM-V/5% AS вместе с 2 типами лимфобластных В-клеточных линий, инактивированных с помощью MMC, в присутствии 40 нг/мл моноклонального антитела к CD3 (Pharmingen). Через один день после инициации культур, к ним добавляли 120 МЕ/мл IL-2. Культуры снабжали свежей средой AIM-V/5% AS, содержащей 30 МЕ/мл IL-2 на 5, 8 и 11 день (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

Специфичная активность CTL

Для определения специфичной активности CTL осуществляли анализ иммуноферментный спот-анализ (ELISPOT) для (IFN)-гамма и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для (IFN)-гамма. Конкретно, активированные пептидом A24LCL (1×10⁴/на лунку) получали в качестве стимулирующих клеток. Культивированные клетки в 48 лунках использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ELISPOT для IFN-гамма и анализ ELISA для IFN-гамма осуществляли согласно инструкции производителя.

Результаты

Прогнозирование пептидов, связывающихся с HLA-A24, выделенных из MYBL2

В Таблице 1 продемонстрированы пептиды из MYBL2, связывающиеся с HLA-A*2402, по порядку наибольшей аффинности связывания. В Таблице 1 продемонстрированы 9-мерные и 10-мерные пептиды, выделенные из MYBL2. Всего было выбрано 20 пептидов, обладающих потенциальной способностью связывания с HLA-A24, и они были исследованы для определения пептидов эпитопов.

Таблица 1 Пептиды, связывающиеся с HLA-A24, выделенные из MYBL2 Исходное положение Аминокислотная последовательность Бальная оценка связывания SEQ ID NO. 100 KYGTKQWTL 400 1 370 EYRLDGHTI 50 2 431 SFLDSCNSL 43,2 3 458 NFWNKQDTL 20 4 533 KPLPQTPHL 14,4 5 156 RWAEIAKML 13,44 6 291 KWVVEAANL 12 7 48 QFGQQDWKF 11 8 253 EQEPIGTDL 10,08 9 100 KYGTKQWTLI 100 10 675 LFMQEKARQL 30 11 48 QFGQQDWKFL 20 12 197 KPPVYLLLEL 15,84 13 291 KWVVEAANLL 14,4 14 72 RWLRVLNPDL 14,4 15 335 SAEDSINNSL 12,096 16 144 RIICEAHKVL 12 17 104 KQWTLIAKHL 11,2 18 299 LLIPAVGSSL 10,08 19 509 KYSMDNTPHT 10 20

Исходное положение указывает количество аминокислотных остатков от N-конца MYBL2. Бальная оценка получена с использованием "BIMAS".

Индукция CTL с помощью предсказанных пептидов из MYBL2, рестриктированных по HLA-A*2402, и создание линий CTL, стимулированных с помощью пептидов, выделенных из MYBL2

CTL для пептидов, выделенных из MYBL2, генерировали согласно протоколам, описанным в разделе "Материалы и Методы". Пептидоспецифичную активность CTL определяли с помощью анализа ELISPOT с использованием IFN-гамма (Фигура la-c). Он продемонстрировал, что MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO: 1), MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2) и MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13) продемонстрировали убедительное продуцирование IFN-гамма по сравнению с контрольными лунками. Кроме того, клетки в положительной лунке номер #5, стимулированные с помощью SEQ ID NO: 1, #4 с помощью SEQ ID NO: 2 и #1 с помощью SEQ ID NO: 13, были размножены и были созданы линии CTL. Активность CTL этих линий CTL определяли с помощью анализа ELISA с использованием IFN-гамма (Фигура 2a-c). Анализ продемонстрировал, что все линии CTL продемонстрировали убедительное продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных с помощью соответствующего пептида, по сравнению с клетками-мишенями, не активированными пептидами. С другой стороны, не было создано никаких линий CTL путем стимулирования с помощью других пептидов, продемонстрированных в Таблице 1, не смотря на то, что эти пептиды обладали возможной активностью связывания с HLA-A*2402. Например, типичные негативные данные ответа CTL, стимулированных с помощью MYB L2-A24-10-48 (SEQ ID NO: 12), продемонстрированы на Фигуре 1d и на Фигуре 2d. Результаты, представленные в настоящем документе, показали, что три пептида, выделенных из MYBL2, обладают способностью к индуцированию мощных линий CTL.

Анализ гомологии пептидов антигенов

CTL, стимулированные с помощью MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO: 1), MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2) и MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13), продемонстрировали значительную и специфичную активность CTL. Этот результат может быть получен благодаря тому факту, что последовательности MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO: 1), MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2) и MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13) являются гомологичными пептидами, выделенными из других молекул, которые, как известно, сенсибилизируют иммунную систему человека. Чтобы исключить эту возможность, осуществляли анализ гомологии для этих пептидных последовательностей, используя в качестве запроса алгоритм BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), который не обнаружил последовательности со значительной гомологией. Результаты анализа гомологии выявили, что последовательности MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO: 1), MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2) и MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13) являются уникальными и, таким образом, в нашем понимании существует маленькая вероятность того, что эти молекулы вызовут непредвиденный иммунологический ответ на некоторые посторонние молекулы.

В заключение были идентифицированы новые пептиды эпитопов HLA-A24, выделенные из MYBL2 и было продемонстрировано, что они применимы для противораковой терапии.

Промышленная применимость

В настоящем изобретении описаны новые TAA, конкретно выделенные из MYBL2, которые индуцируют убедительный и специфичный противоопухолевый иммунный ответ и обладают применимостью среди широкого спектра типов рака. Такие TAA обеспечивают дальнейшее развитие в качестве пептидных вакцин против заболеваний, ассоциированных с MYBL2, например раковых заболеваний, более конкретно, тестикулярной опухоли, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого и рака пищевода.

В то время как изобретение подробно описано в настоящем документе со ссылкой на его конкретные воплощения, следует понимать, что вышеизложенное описание приведено в качестве примера и по своей природе является поясняющим, и предназначено для иллюстрации изобретения и его предпочтительных воплощений. Посредством обычного проведения эксперимента, специалист в данной области легко распознает, что там могут быть произведены различные изменения и модификации, не выходя за рамки и сущность изобретения, границы которого определены с помощью приложенной формулы изобретения.

Изобретение относится к пептидам, выделенным из MYBL2, которые индуцируют CTL, фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активных ингредиентов полипептиды MYBL2 или полинуклеотиды, кодирующие их, которые предназначены для лечения и/или профилактики опухолей и/или предотвращения их послеоперационных рецидивов. Также изобретение относится к способам индукции антиген-презентирующей клетки с высокой способностью к индуцированию CTL. 11 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 1 пр.

1. Нонапептид или декапептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2 и 13.

2. Пептид, обладающий способностью к индуцированию цитотоксического Т-лимфоцита (CTL), где пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
(a) SEQ ID NO:1,2 и 13; и
(b) SEQ ID NO:1, 2 и 13, в которых 1 или 2 аминокислоты заменены, вставлены, делегированы или добавлены.

3. Пептид по п.2, обладающий одной или обеими из следующих характеристик:
(a) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, 2 или 13 представляет собой или модифицирована так, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана, и
(b) С-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, 2 или 13 представляет собой или модифицирована так, чтобы представлять собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина.

4. Изолированный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.1-3.

5. Фармацевтическая композиция, включающая один или несколько пептидов по пп.1-3, или полинуклеотид, кодирующий такой пептид, в качестве активного ингредиента в комбинации с фармакологически приемлемым носителем, которая составлена с целью, выбранной из группы, состоящей из:
(i) лечения опухоли,
(ii) профилактики опухоли,
(iii) предотвращения послеоперационного рецидива опухоли, и
(iv) их комбинаций.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, составленная для введения субъекту, чей антиген HLA представляет собой HLA-A24.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, составленная для лечения рака.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, где указанная композиция включает вакцину.

9. Способ индукции антиген-презентирующей клетки с высокой способностью к индуцированию CTL с использованием пептида, представленного в любом из пп.1-3.

10. Способ индукции CTL путем использования пептида, представленного в любом из пп.1-3.

11. Способ индукции антиген-презентирующей клетки с высокой способностью к индуцированию CTL по п.9, где указанный способ включает по меньшей мере одну стадию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) контактирования антиген-презентирующей клетки с пептидом по любому из пп.1-3; и
(b) введения гена, который включает полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.1-3, в антиген-презентирующую клетку.

12. Способ индукции способности к индуцированию CTL по п.10, где указанный способ включает по меньшей мере одну стадию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) смешивания АРС, полученных способом по п.9 или 11 с СЭВ-положительными клетками, и совместного культивирования их; и
(b) трансдукции нуклеиновых кислот, кодирующих TCR-субъединицы, которые связываются с пептидом по любому из пп.1-3, в CD8-положительные клетки.

13. Изолированная цитотоксическая Т-клетка, где указанная клетка индуцируется способом по п.10 или 12.

14. Изолированная антиген-презентирующая клетка, которая презентирует на своей поверхности комплекс антигена HLA и пептида, представленного в любом из пп.1-3.

15. Антиген-презентирующая клетка по п.14, где указанная клетка индуцируется с помощью способа по п.9 или 11.

16. Способ индукции иммунного ответа против рака у субъекта, причем указанный способ включает стадию введения указанному субъекту вакцины, включающей пептид, представленный в любом из пп.1-3.