ПЕПТИДНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РАКА С ЭКСПРЕССИЕЙ ПОЛИПЕПТИДОВ MPHOSPH1 ИЛИ DEPDC1 Российский патент 2012 года по МПК C07K14/435 C07K7/00 C12N15/63 A61K38/00 A61K39/00 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США No. 60/852575, поданной 17 октября 2006, полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к области биологии, более конкретно, к области терапии рака. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые являются чрезвычайно эффективными вакцинами против рака, и к лекарственным средствам для лечения и профилактики опухолей, содержащих такие пептиды.

Уровень техники

Показано, что CD8+ цитотоксические T-лимфоциты (CTL) распознают пептиды-эпитопы, происходящие из ассоциированных с опухолью антигенов (TAA), представленных на молекулах MHC класса I, и лизируют опухолевые клетки. С момента обнаружения семейства MAGE в качестве первого примера TAA с использованием иммунологических способов было обнаружено много других TAA (Boon T. (1993) Int J Cancer 54: 177-80.; Boon T. et al., (1996) J Exp Med 183: 725-9.; van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7.; Brichard V et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95.; Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52.). Некоторые из них в настоящее время проходят разработку в клинике в качестве мишеней для иммунотерапии. Обнаруженные к настоящему времени TAA включают в себя MAGE (van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7.), gp100 (Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52.), SART (Shichijo S et al., (1998) J Exp Med 187:277-88.) и NY-ESO-1 (Chen Y.T. et al., (1997) Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 94: 1914-8.). С другой стороны, было показано, что продукты определенных генов с повышенной до некоторой степени специфической экспрессией в опухолевых клетках, распознаются в качестве мишени для индукции клеточных иммунных ответов. Продукты таких генов включают в себя p53 (Umano Y et al., (2001) Br J Cancer, 84:1052-7.), HER2/neu (Tanaka H et al., (2001) Br J Cancer, 84: 94-9.), CEA (Nukaya I et al., (1999) Int. J. Cancer 80, 92-7.) и т.п.

Несмотря на значительный прогресс в фундаментальных и клинических исследованиях в отношении TAA (Rosenberg SA et al., (1998) Nature Med, 4: 321-7.; Mukherji B. et al., (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92: 8078-82.: Hu X et al., (1996) Cancer Res, 56: 2479-83.), в настоящее время доступно только очень ограниченное число TAA-кандидатов, подходящих для лечения рака. TAA с избыточной экспрессией в раковых клетках, и экспрессия которых ограничена раковыми клетками, были бы многообещающими кандидатами в качестве мишеней для иммунотерапии.

Как HLA-A24, так и HLA-A0201 представляют собой общераспространенные аллели HLA в японской популяции и в популяциях европеоидов (Date Y et al., (1996) Tissue Antigens 47: 93-101.; Kondo A et al., (1995) J Immunol 155: 4307-12.; Kubo RT et al., (1994) J Immunol 152: 3913-24.; Imanishi et al., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992); Williams F et al., (1997) Tissue Antigen 49: 129-33.). Таким образом, антигенные пептиды рака, представляемые этими аллелями HLA, могут обладать определенной эффективностью для лечения рака у японских и европеоидных пациентов. Кроме того, известно, что индукция низкоаффинных CTL in vitro обычно происходит в результате воздействия высоких концентраций пептида, образующих высокий уровень комплексов специфический пептид/MHC на антиген-презентирующих клетках (APC), которые могут эффективно активировать эти CTL (Alexander-Miller et al., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7).

Недавние разработки в способах микрочипов кДНК позволили сконструировать подробные характеристики экспрессии генов в злокачественных клетках по сравнению с нормальными клетками (Okabe, H. et al., (2001) Cancer Res., 61, 2129-37.; Lin YM. et al., (2002) Oncogene, 21;4120-8.; Hasegawa S. et al., (2002) Cancer Res 62:7012-7.). Этот способ позволяет лучше понять сложную природу раковых клеток и механизмы канцерогенеза, и облегчает идентификацию генов, регуляция экспрессии которых прекращена в опухолях (Bienz M. et al., (2000) Cell 103, 311-20.). Среди транскриптов, идентифицированных как обладающие повышенной регуляцией при раке, недавно был обнаружен MPHOSPH1 (фосфoбелок 1 M-фазы; инвентарный No. в GenBank NM_016195; SEQ ID NО:1, 2), и DEPDC1 (содержащий домен DEP 1; инвентарный No. в GenBank BM683578). См. WO 2004/031413, WO 2006/085684 и WO 2007/013,665, полное содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. DEPDC1 описан в контексте двух различных транскрипционных вариантов - DEPDC1 V1 (SEQ ID NО: 3, 4) и DEPDC1 V2 (SEQ ID NО:5, 6). Показано, что эти гены обладают специфической повышенной регуляцией в опухолевых клетках различных раковых тканей в анализированных случаях (см. ниже); однако, анализы Нозерн-блоттингом показали, что продукты этих генов не обнаружены в нормальных жизненно важных органах (см. PCT/JP2006/302684). Поскольку иммуногенные пептиды, полученные из MPHOSPH1 и DEPDC1, могут находить применение для уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих эти антигены, эти гены представляют особенный интерес для авторов настоящего изобретения.

Поскольку цитотоксические лекарственные средства, такие как M-VAC, часто вызывают тяжелые побочные реакции, понятно, что тщательный отбор новых молекул-мишеней на основании хорошо охарактеризованных механизмов действия является важным для создания эффективных противораковых лекарственных средств с минимальным риском нежелательных побочных эффектов. Для этой цели авторы изобретения предварительно провели анализ профиля экспрессии различных видов рака и нормальной ткани человека, и обнаружили множество генов с повышенной экспрессией при раке (Lin YM, et al., Oncogene. 2002 Jun 13;21:4120-8.; Kitahara O, et al., Cancer Res. 2001 May 1;61:3544-9.; Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov 1;63:7038-41.; Ashida S, Cancer Res. 2004 Sep 1;64:5963-72.; Ochi K, et al., Int J Oncol. 2004 Mar;24(3):647-55.; Kaneta Y, et al., Int J Oncol. 2003 Sep;23:681-91.; Obama K, Hepatology. 2005 Jun;41:1339-48.; Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65:5638-46.; Kitahara O, et al., Neoplasia. 2002 Jul-Aug;4:295-303.; Saito-Hisaminato A et al., DNA Res 2002, 9: 35-45.). Из них, MPHOSPH1 (No. для внутреннего пользования C2093) и DEPDC1 (No. для внутреннего пользования B5860N) представляли собой идентифицированные гены с повышенной экспрессией при различных видах рака. В частности, MPHOSPH1 идентифицировали как ген, обладающий повышенной экспрессией при раке мочевого пузыря, раке молочной железы, раке шейки матки, холангиоцеллюлярной карциноме, CML, раке ободочной и прямой кишки, раке желудка, NSCLC, лимфоме, остеосаркоме, раке предстательной железы, карциноме почки, опухоли мягких тканей. Аналогично, DEPDC1 идентифицировали как ген, обладающий повышенной экспрессией при раке мочевого пузыря, раке молочной железы, раке шейки матки, холангиоцеллюлярной карциноме, CML, NSCLC, лимфоме, остеосаркоме, раке предстательной железы, SCLC, опухоли мягких тканей.

MPHOSPH1 ранее был идентифицирован как один из белков, специфически фосфорилированных при переходе G2/M, и охарактеризован как белок, родственный направленному к плюс-концу кинезину (Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52.). Более конкретно, ранее сообщалось, что MPHOSPH1 представляет собой направленный к плюс-концу молекулярный мотор, который играет критическую роль в цитокинезе и накапливается в средней зоне веретена во время анафазы - телофазы в клетках HeLa (Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52; Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276: 37520-8). кДНК MPHOSPH1 кодирует белок из 1780 аминокислот, который состоит из трех доменов: NH2-моторный домен кинезина, центральный домен спираль-стебель, и глобулярный хвостовой C-домен. Вместе эти данные позволяют сделать предположение о том, что MPHOSPH1 представляет собой белок, сходный с кинезином NH2-типа.

Что касается DEPDC1, то его функция остается неясной. Домен DEP, содержащийся в этом белке, обнаружен также в Dishevelleed, Egl-10, и плекстрине. Домен DEP в disheveled Drosophila играет определяющую роль в устранении дефектов планарной полярности и индуцирует передачу сигналов JNK; тем не менее, его функция у человека до конца не выяснена. Однако, как описано в PCT/JP2006/302684, миРНК для DEPDC1 могут супрессировать рост раковых клеток. Эти результаты показывают, что DEPDC1 играет важную роль в росте большинства раковых клеток.

Краткое изложение сущности изобретения

Как указано выше, MPHOSPH1 (фосфобелок 1 M-фазы), и DEPDC1 (содержащий домен DEP 1) идентифицировали как гены, обладающие повышенной регуляцией при различных видах рака. Более конкретно, гены идентифицировали путем определения профиля экспрессии генов с помощью микрочипа кДНК для всего генома. Как указано выше, было показано, что экспрессия MPHOSPH1 и DEPDC1 обладает специфической повышенной регуляцией в различных опухолевых клетках, включая рак легкого и рак мочевого пузыря. Как описано в таблице 1, показано, что экспрессия MPHOSPH1 воспроизводимо повышена в 30 из 31 случая рака мочевого пузыря, 8 из 36 случаев рака молочной железы, 18 из 18 случаев рака шейки матки, 5 из 17 холангиоцеллюлярных карцином, 25 из 31 случая CML, 6 из 11 случаев рака ободочной и прямой кишки, 6 из 14 случаев рака желудка, 5 из 5 случаев NSCLC, 7 из 7 лимфом, 6 из 10 остеосарком, 7 из 22 случаев рака предстательной железы, 10 из 18 карцином почки и 15 из 21 опухоли мягких тканей. В то же самое время, показано, что экспрессия DEPDC1 воспроизводимо увеличена в 23 из 25 случаев рака мочевого пузыря, 6 из 13 случаев рака молочной железы, 12 из 12 случаев рака шейки матки, 6 из 6 холангиоцеллюлярных карцином, 3 из 4 CML, 2 из 4 случаев рака ободочной и прямой кишки, 6 из 6 случаев NSCLC, 7 из 7 лимфом, 10 из 14 остеосарком, 11 из 24 рака предстательной железы, 14 из 14 случаев SCLC и 22 из 31 опухоли мягких тканей, как описано в таблице 1.

Настоящее изобретение основано, по крайней мере отчасти, на идентификации специфических эпитопов пептидов, продуктов указанных генов (MPHOSPH1 и DEPDC1), которые способны индуцировать цитотоксические T-лимфоциты (CTL), специфические в отношении соответствующих молекул. Как подробно описано ниже, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) здорового донора стимулировали с помощью пептидов-кандидатов, связывающих HLA-A*2402 и HLA-A*0201, полученных из MPHOSPH1 или DEPDC1. Затем получали клоны и/или линии CTL со специфической цитотоксичностью против положительных по HLA-A24 или HLA-A2 клеток-мишеней, обработанных каждым из пептидов-кандидатов. Эти результаты показывают, что пептиды являются пептидами, ограниченными HLA-A24 или HLA-A2 эпитопами, которые могут индуцировать сильные и специфические иммунные ответы против клеток, экспрессирующих MPHOSPH1 или DEPDC1.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака. Такие способы включают в себя стадию введения индивиду полипептида MPHOSPH1 и/или DEPDC1 по изобретению. Введение такого пептида(пептидов) приводит к возникновению иммунитета против опухолей. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам, вызывающим иммунитет против опухолей у индивида, где такие способы включают в себя стадию введения индивиду полипептида MPHOSPH1 и/или DEPDC1, а также к фармацевтическим композициям для лечения или профилактики заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, которые содержат полипептиды MPHOSPH1 и/или DEPDC1. Раком в качестве неограничивающих примеров может быть рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак предстательной железы, карцинома почек, SCLC и опухоль мягких тканей.

Таким обазом, настоящая заявка включает в себя следующие варианты осуществления и любые их сочетания.

[1] Выделенный пептид, способный индуцировать цитотоксические T-клетки, где указанный пептид получен из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, 4 или 6.

[2] Выделенный пептид, состоящий по меньшей мере приблизительно из 15 аминокислот, выбранный из группы, состоящей из пептидов, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8 и 12, или пептид, способный индуцировать цитотоксические T-клетки, где указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей SEQ ID NO:7, 8 и 12, где 1, 2 или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены.

[3] Пептид, способный индуцировать цитотоксические T-клетки, как указано в п.[2], где вторая аминокислота от N-конца представляет собой фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан.

[4] Пептид, способный индуцировать цитотоксические T-клетки, как указано в п.[2], где C-концевая аминокислота представляет собой фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан, или метионин.

[5] Выделенный пептид, состоящий по меньшей мере приблизительно из 15 аминокислот, выбранный из группы, состоящей из пептидов, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 253, 254 и 255, или пептид, способный индуцировать цитотоксические T-клетки, где указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей SEQ ID NO: 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 253, 254 и 255, где 1, 2 или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены.

[6] Пептид, способный индуцировать цитотоксические T-клетки, как указано в п.[5], где вторая аминокислота от N-конца представляет собой лейцин или метионин.

[7] Пептид, способный индуцировать цитотоксические T-клетки, как указано в п.[5], где C-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин.

[8] Вектор, в котором ДНК кодирует пептиды по любому из п.п.[1]-[7].

[9] Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболевания, связанного с повышенной экспрессией генов SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5, где указанная композиция содержит один или несколько пептидов по любому из п.п.[1]-[7].

[10] Фармацевтическая композиция как указано в п.[9], где заболеванием является рак.

[11] Фармацевтическая композиция как указано в п.[10], где рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, карциномы почек, SCLC и опухоли мягких тканей.

[12] Экзосома, презентирующая на своей поверхности комплекс, содержащий пептид по любому из п.п.[1]-[7] и антиген HLA.

[13] Экзосома как указано в п.[12], где антиген HLA представляет собой HLA-A24.

[14] Экзосома как указано в п.[13], где антиген HLA представляет собой HLA-A2402.

[15] Экзосома как указано в п.[12], где антиген HLA представляет собой HLA-A2.

[16] Экзосома как указано в п.[13], где антиген HLA представляет собой HLA-A0201.

[17] Способ индукции антиген-презентирующих клеток, способный к высокоэффективной индукции цитотоксических T-клеток, включающий стадию приведения в контакт антиген-презентирующих клеток с пептидом по любому из п.п.[1]-[7].

[18] Способ индукции цитотоксических T-клеток путем приведения в контакт T-клетки с пептидом по любому из п.п.[1]-[7].

[19] Способ индукции антиген-презентирующих клеток, способный к высокоэффективной индукции цитотоксических T-клеток, где указанный способ включает в себя стадию переноса гена, содержащего полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из п.п.[1]-[7], в антиген-презентирующую клетку.

[20] Выделенная цитотоксическая T-клетка, которую индуцируют путем приведения в контакт T-клетки с пептидом по любому из п.п.[1]-[7], или которую трансдуцируют нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептиды субъединиц TCR, связывающие пептид по любому из п.п.[1]-[7] в контексте HLA-A24 или HLA-A2.

[21] Антиген-презентирующая клетка, содержащая комплекс, сформированный между антигеном HLA и пептидом по любому из [1] - [7].

[22] Антиген-презентирующая клетка как указано в п.[21], индуцированная способом как указано в п.[17].

[23] Вакцина, ингибирующая пролиферацию клеток, экспрессирующих гены из SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5, где вакцина в качестве активного ингредиента содержит пептид по любому из п.п.[1]-[7].

[24] Вакцина как указано в п.[23], где клетка представляет собой раковую клетку.

[25] Вакцина как указано в п.[24], где рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, карциномы почек, SCLC и опухоли мягких тканей.

[26] Вакцина как указано в п.[23], предназначенная для введения индивиду, антиген HLA которого представляет собой HLA-A24 или HLA-A2.

[27] Способ лечения или профилактики заболевания, связанного с повышенной экспрессией генов SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5, у индивида, включающий введение указанному индивиду вакцины, содержащей один или несколько пептидов по любому из п.п.[1]-[7], его иммунологически активный фрагмент или полинуклеотид, кодирующий указанный пептид или иммунологически активный фрагмент.

[28] Способ как указано в п.[27], где заболеванием является рак.

[29] Способ как указано в п.[28], где рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, карциномы почек, SCLC и опухоли мягких тканей.

Альтернативно, настоящее изобретение также относится к способу индукции цитотоксических T-клеток, включающему стадию приведения в контакт T-клетки с антиген-презентирующей клеткой, полученной способом как указано в п.[19].

Эти и другие объекты и признаки изобретения будут более очевиды при ознакомлении с нижеприведенным подробным описанием, а также сопутствующими фигурами и примерами. Однако, следует учесть, что как предшествующее краткое описание сущности изобретения, так и последующее подробное описание, представляют собой предпочтительные варианты осуществления, и не являются ограничивающими изобретение или другие альтернативные варианты осуществления изобретения.

Краткое описание рисунков

[Фиг.1] На фиг.1A показаны результаты анализа ELISPOT IFN-гамма для скрининга пептидов-эпитопов, которые, в свою очередь, показывают, что MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7) вызывает сильную продукцию IFN-гамма. CTL для этих пептидов, полученных из MPHOSHP1, получены согласно способам, описанным в разделе «Материалы и методы» из примеров ниже. Показаны полученные CTL, обладающие поддающейся детекции специфической активностью CTL. В частности, для клеток в лунке номер #4, стимулированных MPHOSPH1-A24-9-278, показали сильную продукцию IFN-гамма для узнавания обученных пептидом клеток-мишеней по сравнению с контролем. На фиг.1B показаны результаты анализа ELISPOT IFN-гамма для скрининга клонов CTL после лимитирующего разведения (клон CTL MPHOSPH1-A24-9-278). Клетки в положительной лунке размножали и проводили лимитирующее разведение. Как показывают описанные результаты, получены клоны CTL, обладающие специфическими активностями CTL против обученной пептидом мишени по сравнению с активностями против мишени без обучения пептидом.

[Фиг.2] На фиг.2A показаны результаты анализа ELISPOT IFN-гамма для скрининга цитотоксичности пептидов-эпитопов, которые, в свою очередь, показывают, что MPHOSPH1-A24-10-278 (SEQ ID NO:8) вызывает сильную продукцию IFN-гамма. CTL для этих пептидов, полученных из MPHOSHP1, получены согласно способам, описанным в разделе «Материалы и методы» из примеров ниже. Показаны полученные CTL, обладающие поддающейся детекции специфической активностью CTL. В частности, для клеток в лунке номер #8, стимулированных MPHOSPH1-A24-10-278, показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фиг.2B показаны результаты анализа ELISPOT IFN-гамма для скрининга клонов CTL после лимитирующего разведения (клон CTL MPHOSPH1-A24-10-278). Клетки в положительной лунке размножали и проводили лимитирующее разведение. Как показывают описанные результаты, получены клоны CTL, обладающие специфическими активностями CTL против обученной MPHOSPH1-A24-10-278 мишени по сравнению с активностями против мишени без обучения пептидом.

[Фиг.3] На фиг.3A показано получение клонов CTL, стимулированных MPHOSPH1-A24-9-278. (SEQ ID NO:7). Для этого клона CTL показали высокую специфическую активность CTL против клеток-мишеней (A24LCL), обученных MPHOSPH1-A24-9-278, но не показали значительной активности CTL против таких же клеток-мишеней (A24LCL) без обучения пептидами. На фиг.3B показано получение клонов CTL, стимулированных MPHOSPH1-A24-10-278 (SEQ ID NO:8). Для этого клона CTL показали высокую специфическую активность CTL против клеток-мишеней (A24LCL), обученных MPHOSPH1-A24-10-278, в то время как не показали значительной активности CTL против таких же клеток-мишеней (A24LCL) без обучения пептидами. R обозначает Отвечающий: клон CTL. S обозначает Стимулятор: обученные пептидом A24-LCL (1×10⁴/лунку).

[Фиг.4] На фиг.4 показана экспрессия MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7) на поверхности клетки-мишени с HLA-A24. Специфическую активность CTL против COS7, трансфицированных геном и полноразмерного MPHOSPH1, и молекулы HLA-A*2402, анализировали с использованием в качестве эффекторных клеток клона CTL, стимулированного посредством MPHOSPH1-A24-9-278. COS7, трансфицированные полноразмерным MPHOSPH1, но не HLA-A*2402, и COS7, трансфицированные HLA-A*2402, но не полноразмерным MPHOSPH1, получали в качестве контролей. Для клона CTL показали высокую специфическую активность CTL против COS7, трансфицированных и MPHOSPH1, и HLA-A24. Однако, не показали значительной специфической активности CTL против COS7, не трансфицированных ни MPHOSPH1, ни HLA-A24. R обозначает Отвечающий: клон CTL. S обозначает Стимулятор: трансфектант COS7 (1×10⁴/ лунку).

[Фиг.5] На фиг.5 показана активность CTL против линий клеток рака мочевого пузыря с эндогенной экспрессией MPHOSPH1. Полученный клон CTL, индуцированный пептидом MPHOSPH1-A24-9-278, узнает опухолевые клетки с эндогенной экспрессией MPHOSPH1. Клетки HT1376, RT-4 и J82 экспрессируют эндогенный MPHOSPH1, соответственно. Для клона CTL показали продукцию IFN-гамма против HT1376, обладающих генотипом HLA-A*2402, но не показали ответа против RT-4 и J82, не обладающих генотипом HLA-A*2402.

[Фиг.6] На фиг.6 показан анализ иммуногенности in vivo с использованием пептида MPHOSPH1-A24-9-278. IFA-конъюгированный пептид инъецировали подкожно мышам BALB/c на сутки 0 и 7. На сутки 14 спленоциты вакцинированных мышей собирали и использовали в качестве отвечающих клеток, и 1×10⁴ клеток RLmale1, обученных пептидом MPHOSPH1-A24-9-278, использовали в качестве стимулирующих клеток для анализа ELISPOT IFN-гамма. Счет образующихся пятен (SFC) указан в случае каждой мыши; пять мышей (Ani1~Ani5) вакцинировали пептидом-эпитопом и трех мышей (nega1~nega3) инъецировали эмульсией Mock IFA в качестве отрицательного контроля.

[Фиг.7] На фиг.7 показаны результаты анализа ELISPOT IFN-гамма для скрининга пептидов-эпитопов, которые, в свою очередь, показывают, что MPHOSPH1-A2-9-282 (SEQ ID NO:9), MPHOSPH1-A2-9-638 (SEQ ID NO:10) и MPHOSPH1-A2-10-1714 (SEQ ID NO:11) обладают сильной активностью для продукции IFN-гамма. CTL для этих пептидов, полученных из MPHOSHP1, получены согласно способам, описанным в разделе «Материалы и методы» из примеров, описанных ниже. Показаны полученные CTL, обладающие поддающейся детекции специфической активностью CTL. В частности, на Фиг.7A показано, что для клеток в лунках #1 и #5, стимулированных MPHOSPH1-A2-9-282, показали сильную продукцию IFN-гамма, достаточную для узнавания обученных пептидами клеток-мишеней, по сравнению с контролем. На фиг.7B показано, что для клеток в лунке номер #8, стимулированных MPHOSPH1-A2-9-638, показали сильную продукцию IFN-гамма, достаточную для узнавания обученных пептидом клеток-мишеней, по сравнению с контролем. На фиг.7C показано, что для клеток в лунке номер #4, стимулированных MPHOSPH1-A2-10-1714, показали сильную продукцию IFN-гамма для узнавания обученных пептидом клеток-мишеней, по сравнению с контролем.

[Фиг.8] На фиг.8 показано получение линий CTL, стимулированных MPHOSPH1-A02-9-282, (SEQ ID NO:9) MPHOSPH1-A02-9-638 (SEQ ID NO:10) и MPHOSPH1-A02-10-1714 (SEQ ID NO:11). Клетки в положительных лунках размножали и, как показывают описанные результаты, получили линии CTL, обладающие более высокими специфическими активностями CTL против обученной MPHOSPH1-A02-9-282 мишени (A), обученной MPHOSPH1-A02-9-638 мишени (B) или обученной MPHOSPH1-A02-10-1714 мишени (C) по сравнению с активностями против мишени без обучения пептидом. R обозначает Отвечающий: линии CTL. S обозначает Стимулятор: обученные пептидом T2 (1×10⁴/лунку).

[Фиг.9] На фиг.9A показаны результаты анализа ELISPOT IFN-гамма для скрининга клонов CTL после лимитирующего разведения (клон MPHOSPH1-A2-9-282 CTL). Клетки в положительной лунке размножали и проводили лимитирующее разведение. Как показывают описанные результаты, получены клоны CTL, обладающие более высокими специфическими активностями CTL против обученной MPHOSPH1-A2-9-282 (SEQ ID NO:9) мишени по сравнению с активностями против мишени без обучения пептидом. На фиг.9B показано получение клонов CTL, стимулированных MPHOSPH1-A02-9-282. Клон CTL обладает высокой специфической активностью CTL против клеток-мишеней (T2), обученных MPHOSPH1-A2-9-282, но не обладает значительной активностью CTL против таких же клеток-мишеней (T2) без обучение пептидами. R обозначает Отвечающий: клон CTL. S обозначает Стимулятор: обученные пептидом T2 (1×10⁴/лунку).

[Фиг.10] На фиг.10A показаны результаты анализа ELISPOT IFN-гамма для скрининга пептидов-эпитопов, которые, в свою очередь, показывают, что DEPDC1-A24-9-294 (SEQ ID NO:12) вызывает сильную продукцию IFN-гамма. CTL для этих пептидов, полученных из DEPDC1, получены согласно способам, описанным в разделе «Материалы и методы» из примеров ниже. Показаны полученные CTL, обладающие поддающейся детекции специфической активностью CTL. Для клеток в лунке номер #10, стимулированных DEPDC1-A24-9-294, показали сильную продукцию IFN-гамма для узнавания обученных пептидом клеток-мишеней по сравнению с контролем. На фиг.10B показаны результаты анализа ELISPOT IFN-гамма для скрининга клонов CTL после лимитирующего разведения (клон DEPDC1-A24-9-294 CTL). Клетки в положительной лунке размножали и проводили лимитирующее разведение. Как показывают описанные результаты, получены клоны CTL, обладающие более высокими специфическими активностями CTL против обученной DEPDC1-A24-9-294 мишени по сравнению с активностями против мишени без обучения пептидом.

[Фиг.11] На фиг.11 показано получение клонов CTL, стимулированных DEPDC1-A24-9-294 (SEQ ID NO:12). Для клона CTL показали высокую специфическую активность CTL против клеток-мишеней (A24LCL), обученных DEPDC1-A24-9-294, в то время как не показали значительной активности CTL против таких же клеток-мишеней (A24LCL) без обучения пептидами. R обозначает Отвечающий: клон CTL DEPDC-A24-9-294. S обозначает Стимулятор: обученные пептидом A24-LCL (1×10⁴/лунку).

[Фиг.12] На фиг.12 показана экспрессия DEPDC1-A24-9-294 (SEQ ID NO:12) на поверхности клетки-мишени с HLA-A24. Специфическую активность CTL против COS7, трансфицированных геном и полноразмерного DEPDC1, и молекулы HLA-A*2402, анализировали с использованием в качестве эффекторных клеток клона CTL, стимулированного DEPDC1-A24-9-294. COS7, трансфицированные полноразмерным DEPDC1, но не HLA-A*2402, и COS7, трансфицированные HLA-A*2402, но не полноразмерным DEPDC1, получали в качестве контролей. Для полученного клона CTL показали высокую специфическую активность CTL против COS7, трансфицированных и DEPDC1, и HLA-A24. Однако не показали значительной специфической активности CTL против COS7, не трансфицированных ни DEPDC1, ни HLA-A24. R обозначает Отвечающий: клон CTL DEP-A24-9-294. S обозначает Стимулятор: трансфектант COS7 (1×10⁴/лунку).

[Фиг.13] На фиг.13 показана активность CTL против линий клеток рака мочевого пузыря с эндогенной экспрессией DEPDC1. Полученный клон CTL, индуцированный пептидом DEPDC1-A24-9-294, узнает опухолевые клетки с эндогенной экспрессией DEPDC1. Клетки HT1376, RT-4 и J82 экспрессируют эндогенный DEPDC1, соответственно. Для клона CTL показали продукцию IFN-гамма против HT1376, обладающих генотипом HLA-A*2402, но не показали ответа против RT-4 и J82, не обладающих генотипом HLA-A*2402.

[Фиг.14] На фиг.14 показан анализ иммуногенности in vivo с использованием пептида DEPDC1-A24-9-294. IFA-конъюгированный пептид инъецировали подкожно мышам BALB/c на сутки 0 и 7. На сутки 14 спленоциты вакцинированных мышей собирали и использовали в качестве отвечающих клеток, и 1×10⁴ клеток RLmale1, обученных пептидом DEPDC1-A24-9-294, использовали в качестве стимулирующих клеток для анализа ELISPOT IFN-гамма. Счет образующихся пятен (SFC) указан в случае каждой мыши; пять мышей (Ani1~Ani5) вакцинировали пептидом-эпитопом, и двух мышей (nega1 и nega2) инъецировали эмульсией Mock IFA в качестве отрицательного контроля.

[Фиг.15] На фиг.15 показана сильная продукция IFN-гамма DEPDC1-A02-10-644, -10-575, -10-506, -10-765, -10-395, -10-224, -9-297, -10-296 и -10-302 по анализу ELISPOT IFN-гамма для скрининга пептидов-эпитопов. CTL для этих пептидов, полученных из DEPDC1, получены способом, описанным в «Материалах и методах». Для клеток в лунках номер #4 и #7, стимулированных с помощью DEPDC1-A02-10-644, #2 - с помощью DEPDC1-A02-10-575, #7 - с помощью DEPDC1-A02-10-506, #1 - с помощью DEPDC1-A02-10-765 и #1 - с помощью DEPDC1-A02-10-395, #1 и #2 с помощью DEPDC1-A02-10-224, #4 - с помощью DEPDC1-A02-9-297, #3 и #4 - с помощью DEPDC1-A02-10-296 и #2, #3, #5 и #7 - с помощью DEPDC1-A02-10-302, показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем.

[Фиг.16] На фиг.16 показана продукция IFN-гамма линией CTL, полученной с помощью пептида DEPDC1-A02-10-296. Полученные линии CTL, стимулированные пептидом DEPDC1-A02-10-296, обладают сильной активностью продукции IFN-гамма. Показана продукция IFN-гамма против обученных пептидом клеток-мишеней, но не показана продукция против клеток-мишеней без обучения пептидом. Используемые клетки-мишени представляли собой клетки T2, экспрессирующие молекулу HLA-A2 на поверхности клеток.

[Фиг.17] На фиг.17 показана активность CTL против мишеней с эндогенной экспрессией молекул DEPDC1 и HLA-A2. На верхней панели показано, что полученная линия CTL, полученная с помощью пептида DEPDC1-A02-10-296, обладает активностью продукции IFN-гамма против клеток-мишеней с эндогенной экспрессией DEPDC1V2 и HLA-A2. Случай с использованием пептида DEPDC1-A02-10-296 показан на нижней панели. Клетки-мишени, экспрессирующие только DEPDC1V2, и экспрессирующие только HLA-A2, с обработкой обучением пептидом DEPDC1V1-9-674 или DEP-9-462, получали в качестве отрицательного контроля. Клетки-мишени получали из трансфектанта HEK293, со стабильной экспрессией HLA-A2 или пустого.

[Фиг.18] На фиг.18 показана экспрессия антигена в случае 2. В случае 2 и MPHOSPH1, и DEPDC1, экспрессировались сильно. Таким образом, проводили вакцинацию двумя видами пептидов-эпитопов, полученных из MPHOSPH1 и DEPDC1.

[Фиг.19] На фиг.19 показана клиническая оценка местного рецидива рака мочевого пузыря в случае 2. Случай 2 оценивали как SD согласно критериям RECIST.

[Фиг.20] На фиг.20 показана экспрессия антигена в случае 3. В случае 3 DEPDC1 экспрессировался сильно. Таким образом, авторы настоящего изобретения проводили вакцинацию только пептидом-эпитопом, полученным из DEPDC1.

[Фиг.21] На фиг.21 показана клиническая оценка правой доли легкого с метастазированием в случае 3. Скорость прогрессирования снижалась после вакцинации. В частности, размер опухоли уменьшался после 3-го курса.

[Фиг.22] На фиг.22 показана клиническая оценка левой доли легкого с метастазированием в случае 3. Скорость прогрессирования снижалась после вакцинации. В частности, размер опухоли уменьшался после 3-го курса.

[Фиг.23] На фиг.23 показан противоопухолевый эффект в случае 3. Скорость прогрессирования метастазирующей опухоли снижалась после вакцинации.

[Фиг.24] На фиг.24 показан специфический ответ CTL в случае 3. Показан сильный специфический ответ CTL после вакцинации.

[Фиг.25] На фиг.25 показана экспрессия антигена в случае 4. В случае 4 экспрессировались MPHOSPH1 и DEPDC1. Таким образом, проводили вакцинацию двумя видами пептидов-эпитопов, полученных из MPHOSPH1 и DEPDC1.

[Фиг.26] На фиг.26 показана клиническая оценка местного рецидива рака мочевого пузыря в случае 4. Размер опухоли уменьшился на 20% согласно критериям RECIST после 1-го курса вакцинации.

Подробное описание изобретения

Форму единственного числа используют в данном случае для обозначения «по меньшей мере один», если конкретно не указано иного.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в описании, имеют то же значение, что и общепринятое и понятное специалисту в данной области, к которой относится настоящее изобретение.

Идентификация новых TAA, в частности, TAA, которые индуцируют сильные и специфические противоопухолевые иммунные ответы, гарантирует дальнейшую разработку клинического применения способа вакцинации пептидами при различных видах рака (Boon T et al., (1996) J Exp Med 183: 725-9.; van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7.; Brichard V et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95.; Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52.; Shichijo S et al., (1998) J Exp Med 187:277-88.; Chen YT et al., (1997) Proc.Natl.Acd. Sci.USA, 94: 1914-8.; Harris CC, (1996) J Natl Cancer Inst 88:1442-55.; Butterfield LH et al., (1999) Cancer Res 59:3134-42.; Vissers JL et al., (1999) Cancer Res 59: 5554-9.; van der Burg SH et al., (1996) J. Immunol 156:3308-14.; Tanaka F et al., (1997) Cancer Res 57:4465-8.; Fujie T et al., (1999) Int J Cancer 80:169-72.; Kikuchi M et al., (1999) Int J Cancer 81: 459-66.; Oiso M et al., (1999) Int J Cancer 81:387-94.). Как указано выше, MPHOSPH1 (фосфобелок 1 M-фазы; инвентарный No. в GenBank NM_016195; SEQ ID NО:1, 2) и DEPDC1 (содержащий домен DEP 1; инвентарный No. в GenBank BM683578), более конкретно, его два варианта, DEPDC1V1 (SEQ ID NО:3, 4) и DEPDC1V2 (SEQ ID NО:5, 6), ранее были идентифицированы с использованием способов биочипов кДНК как обладающие повышенной экспрессией при различных видах рака. MPHOSPH1 был ранее идентифицирован как один из белков, специфически фосфорилированных при переходе G2/M, и охарактеризован как белок, сходный с направленным к плюс-концу кинезином (Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52.). Более конкретно, ранее было описано, что MPHOSPH1 представляет собой направленный к плюс-концу молекулярный мотор, который играет критическую роль в цитокинезе, и накапливается в средней зоне веретена во время анафазы - телофазы в клетках HeLa (Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52; Kamimoto T et al., J Biol Chem 2001, 276: 37520-8.). кДНК MPHOSPH1 кодирует белок из 1780 аминокислот, который состоит из трех доменов: NH2-моторный домен кинезина, центральный домен спираль-стебель, и глобулярный хвостовой C-домен. Эти данные позволяют сделать предположение, что MPHOSPH1 представляет собой белок, сходный с кинезином NH2-типа.

Функция белка DEPDC1 остается неизвестной. Домен DEP, содержащийся в этом белке, обнаружен также в Dishevelled, Egl-10 и плекстрине. В частности, домен DEP в dishevelled Drosophila необходим для устранения дефектов планарной полярности и индуцирует передачу сигналов JNK; тем не менее, его функция у человека до конца не ясна. Однако, как описано в PCT/JP2006/302684, DEPDC1 (No. для внутреннего пользования B5860N), обладает двумя различными транскрипционными вариантами, состоящими из 12 и 11 экзонов, соответствующими DEPDC1 V1 и V2, соответственно. Отмечены альтернативные варианты в экзоне 8 V1, и обнаружено, что остальные экзоны являются одинаковыми у обоих вариантов. Вариант V2 не имеет экзона 8 из V1, но образует такой же стоп-кодон внутри последнего экзона. Варианты последовательности полноразмерной кДНК B5860NV1 и B5860NV2 состоят из 5318 и 4466 нуклеотидов, соответственно. ORF этих вариантов начинается внутри каждого экзона 1. В конечном счете, транскрипты V1 и V2 кодируют 811 и 527 аминокислот, соответственно. миРНК супрессировали рост раковых клеток. Эти результаты показывают, что DEPDC1 играет важную роль в росте большинства раковых клеток.

Как описано в PCT/JP2006/302684, MPHOSPH1 и DEPDC1 обладают повышенной экспрессией при раке мочевого пузыря, но минимально экспрессируются в нормальных тканях. Кроме того, было обнаружено, что эти гены выполняют важную функцию, связанную с пролиферацией клеток.

В настоящем изобретении показано, что пептиды, полученные из MPHOSPH1 или DEPDC1, являются эпитопами TAA, рестриктированными по HLA-A24 и HLA-A2, аллелям HLA, общераспространенным в японской популяции и в популяциях европеоидов. В частности, с использованием их аффинности связывания с HLA-A24 и HLA-A2, были идентифицированы пептиды-кандидаты, связывающие HLA-A24 и HLA-A2, полученные из MPHOSPH1 или DEPDC1. После стимуляции T-клеток in vitro посредством дендритных клеток (DC), нагруженных этими пептидами, были успешно получены CTL с использованием MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEQ ID NO:7)), MPHOSPH1-A24-10-278 (IYNEyIYDLF (SEQ ID NO:8)), MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEQ ID NO:9)), MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEQ ID NO:10)), MPHOSPH1-A2-10-1714 (TMSSsKLSNV (SEQ ID NO:11)), DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO:12)), DEPDC1-A02-10-644 (SLMIhTFSRC (SEQ ID NO:240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPaSSMLT (SEQ ID NO:241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL (SEQ ID NO:243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQkEYPLI (SEQ ID NO:244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEQ ID NO:249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANtSKRGV (SEQ ID NO:253)), DEPDC1- A02-9-297 (ELFVNILGL (SEQ ID NO:226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFvNILGL (SEQ ID NO:254)), DEPDC1-A02-10-301 (NILGlLQPHL (SEQ ID NO:255)), DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV (SEQ ID NO:192)), DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM (SEQ ID NO:195)), DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL (SEQ ID NO:197)), DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL (SEQ ID NO:209)), DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV (SEQ ID NO:225)), DEPDC1-A2-10-674 (FLMDhHQEIL (SEQ ID NO:228)) и DEPDC1-A2-10-302 (ILVVcGYITV (SEQ ID NO:230)). Для этих CTL была показана сильная цитотоксическая активность против обученных пептидом клеток A24LCL и T2. Более того, для клонов CTL, полученных из этих клеток, также показали специфическую цитотоксичность против положительных по HLA-A24 или HLA-A2 клеток, экспрессирующих MPHOSPH1 или DEPDC1, соответственно. Однако эти клоны CTL не обладали цитотоксической активностью против клеток с экспрессией только одного из пептидов, включая HLA-A24, HLA-A2, MPHOSPH1 и DEPDC1. Вместе эти результаты позволяют предполагать эффективность MPHOSPH1 и DEPDC1 в качестве TAA для раковых клеток и то, что MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEQ ID NO:7)), MPHOSPH1-A24-10-278 (IYNEyIYDLF (SEQ ID NO:8)), MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEQ ID NO:9)), MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEQ ID NO:10)), MPHOSPH1-A2-10-1714 (TMSSsKLSNV (SEQ ID NO:11)), DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO:12)), DEPDC1-A02-10-644 (SLMIhTFSRC (SEQ ID NO:240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPaSSMLT (SEQ ID NO:241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL (SEQ ID NO:243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQkEYPLI (SEQ ID NO:244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEQ ID NO:249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANtSKRGV (SEQ ID NO:253)), DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEQ ID NO:226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFvNILGL (SEQ ID NO:254)), DEPDC1-A02-10-301 (NILGlLQPHL (SEQ ID NO:255)), DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV (SEQ ID NO:192)), DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM (SEQ ID NO:195)), DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL (SEQ ID NO:197)), DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL (SEQ ID NO:209)), DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV (SEQ ID NO:225)), DEPDC1-A2-10-674 (FLMDhHQEIL (SEQ ID NO:228)) и DEPDC1-A2-10-302 (ILVVcGYITV (SEQ ID NO:230)) представляют собой пептиды-эпитопы каждого TAA, рестриктированного по HLA-A24 или HLA-A2. Поскольку эти антигены обладают повышенной экспрессией при большинстве видов рака и связаны с пролиферацией опухолевой клетки, их можно использовать в качестве иммунотерапевтических мишеней против рака. Раком, в качестве неограничивающих примеров, может быть рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак предстательной железы, карцинома почек, SCLC, опухоль мягких тканей.

Соответственно, настоящее изобретение, кроме того, относится к способам лечения или профилактики заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, у индивида, где такие способы включают стадии введения индивиду, нуждающемуся в этом, иммуногенного пептида, состоящего по меньшей мере приблизительно из 40 аминокислот, как правило, по меньшей мере приблизительно из 20 аминокислот, обычно, по меньшей мере приблизительно из 15 аминокислот, и имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 или 255. Альтернативно, иммуногенный пептид может состоять из последовательности SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 или 255, в которых 1, 2, или несколько (например, вплоть до 5) аминокислот заменены, делетированы или добавлены, при условии, что полученный вариант сохраняет иммуногенную активность (т.е. способен индуцировать CTL, специфический для клеток, экспрессирующих MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например, при раке). Число остатков, подлежащих замене, делеции или добавлению, как правило, составляет 5 аминокислот или менее, предпочтительно, 4 аминокислоты или менее, более предпочтительно, 3 аминокислоты или менее, даже более предпочтительно, одну или две аминокислоты. Предполагаемые виды рака включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, карциному почек, SCLC, опухоль мягких тканей.

Известно, что варианты пептидов (т.е. пептиды, обладающие аминокислотной последовательностью, модифицированной посредством замещения, делеции или добавления одного, двух или нескольких аминокислотных остатков к оригинальной аминокислотной последовательности) сохраняют оригинальную биологическую активность (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6.; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500.; Dalbadie-McFarland G et al., (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13.). В контексте настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы модификация аминокислоты сохраняла свойства боковой цепи исходной аминокислоты (способ, известный как консервативная аминокислотная замена). Примеры свойств боковых цепей аминокислот включают в себя гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), и боковые цепи, обладающие следующими общими функциональными группами или характеристиками: алифатическая боковая цепь (G, A, V, L, I, P); боковая цепь, содержащая гидроксильную группу (S, T, Y); боковая цепь, содержащая атом серы (C, M); боковая цепь, содержащая карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковая цепь, содержащая основание (R, K, H); и боковая цепь, содержащая ароматическую группу (H, F, Y, W). Следует отметить, что заключенные в скобки буквы обозначают однобуквенные коды аминокислот.

В предпочтительных вариантах осуществления иммуногенный пептид представляет собой нонапептид (9-членный) или декапептид (10-членный).

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу индукции иммунитета против опухолей при заболевании, связанном с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например при раке, у индивида, где такой способ включает стадии введения нуждающемуся в этом индивиду иммуногенного пептида по настоящему изобретению, а именно, одного из пептидов с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 или 255 или его варианта (т.е. включая 1, 2 или несколько замен, делеций или добавлений аминокислот). Предполагаемыми видами рака, в качестве неограничивающих примеров, могут быть рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак предстательной железы, карцинома почек, SCLC, опухоль мягких тканей.

В контексте настоящего изобретения индивидом предпочтительно является млекопитающее. Млекопитающие включают в себя в качестве неограничивающих примеров, например, человека, не относящегося к человеку примата, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь или корову.

В соответствие с настоящим изобретением пептид можно вводить индивиду способом in vivo или ex vivo. Более того, настоящее изобретение также относится к применению нонапептида или декапептида, выбранного из пептидов, обладающих аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 и 255 (и их вариантов) для получения иммуногенной композиции для лечения или профилактики заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака. Предполагаемые виды рака включают, в качестве неограничивающих примеров, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, карциному почек, SCLC, опухоль мягких тканей.

Анализ гомологии MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEQ ID NO:7)), MPHOSPH1-A24-10-278 (IYNEyIYDLF (SEQ ID NO:8)), MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEQ ID NO:9)), MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEQ ID NO:10)), MPHOSPH1-A2-10-1714 (TMSSsKLSNV (SEQ ID NO:11)), DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO:12)), DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV (SEQ ID NO:192)), DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM (SEQ ID NO:195)), DEPDC1-A2-9-290 (LLTFEYYEL (SEQ ID NO:197)), DEPDC1-A2-9-563 (RLCKSTIEL (SEQ ID NO:209)), DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV (SEQ ID NO:225)), DEPDC1-A2-10-674 (FLMDhHQEIL (SEQ ID NO:228)), DEPDC1-A2-10-302 (ILVVcGYITV (SEQ ID NO:230)) DEPDC1-A02-10-644 (SLMIhTFSRC (SEQ ID NO:240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPaSSMLT (SEQ ID NO:241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL (SEQ ID NO:243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQkEYPLI (SEQ ID NO:244)), DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEQ ID NO:249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANtSKRGV (SEQ ID NO:253)), DEPDC1-A02-9-297 (ELFVNILGL (SEQ ID NO:226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFvNILGL (SEQ ID NO:254)) и DEPDC1-A02-10-301 (NILGlLQPHL (SEQ ID NO:255)) указывает на отсутствие значительной гомологии с пептидами, полученными из любых известных продуктов генов человека. Соответственно, вероятность неизвестных или нежелательных иммунных ответов при иммунотерапии против этих молекул значительно снижена.

Что касается антигенов HLA, то представленные в настоящем описании данные показывают, что применение антигенов типа A-24 или типа A-2 (которые, как указано, обладают высокой экспрессией у японцев) является благоприятным для получения эффективных результатов. Использование таких подтипов, как A-2402 и A-0201, является еще более предпочтительным. Как правило, в клинике предварительно исследуют тип антигена HLA пациента, что, в свою очередь, позволяет сделать выбор подходящих пептидов, обладающих высокими уровнями аффинности связывания с антигеном пациента, или обладающих способностью индуцировать цитотоксические T-клетки (CTL) посредством представления антигена. Более того, для получения пептидов, обладающих высокой аффинностью связывания и способностью индуцировать CTL, можно осуществить замену, делецию или добавление 1, 2 или нескольких аминокислот на основании аминокислотной последовательности природного частичного пептида MPHOSPH1 и DEPDC1. В данном случае, термин «несколько» обозначает 5 или менее, более предпочтительно, 3 или менее. Кроме того, в дополнение к природным пептидам, поскольку уже известны закономерности последовательностей пептидов, экспонируемых посредством связывания с антигенами HLA (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24.; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228.; Kondo A, et al., (1995) J. Immunol. 155:4307-12.), на основании такой закономерности можно выполнять модификации иммуногенных пептидов по изобретению. Например, можно эффективно использовать пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания HLA-24, в которых вторая аминокислота от N-конца заменена на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан. Аналогично, можно эффективно использовать пептиды, C-концевая аминокислота которых заменена на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин. Альтернативно, можно эффективно использовать пептиды с высокой аффинностью связывания HLA-A2, обладающие второй аминокислотой от N-конца, замененной на лейцин или метионин, и пептиды, C-концевая аминокислота которых заменена на валин или лейцин. Более того, 1-2 аминокислоты можно добавлять к N-концу и/или C-концу пептида.

Однако если последовательность пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, обладающего другой функцией, то можно индуцировать побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения или аллергические реакции против конкретных веществ. Таким образом, предпочтительно избегать ситуации, в которых иммуногенная последовательность совпадает с аминокислотной последовательностью известного белка. Этой ситуации можно избежать путем проведения поиска гомологии с использованием доступных баз данных. Если поиски гомологии подтверждают, что пептиды с 1, 2 или несколькими различными неприродными аминокислотами, тогда можно избежать опасности тех модификаций вышеупомянутой аминокислотной последовательности, которые, например, увеличивают аффинность связывания с антигенами HLA, и/или увеличивают способность индуцировать CTL.

Хотя предполагают, что пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с антигенами HLA, как описано выше, будут высоко эффективными в качестве вакцин против рака, пептиды-кандидаты, которые выбраны по наличию высокой аффинности связывания в качестве показателя, необходимо проверять по действительному наличию способности индуцировать CTL. Способность индуцировать CTL можно подтвердить общепринятым способом путем индукции антиген-презентирующих клеток, несущих антигены MHC человека (например, B-лимфоцитов, макрофагов, и дендритных клеток), или, более конкретно, дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, и, после стимуляции интересующим пептидом, смешивания с CD8-положительными клетками и измерения цитотоксической активности против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы можно использовать трансгенных животных, созданных для экспрессии антигена HLA (например, описанных в BenМohamed L, et al., (2000) Hum. Immunol.; 61(8):764-79, родственные статьи, книги, ссылки.). Например, клетки-мишени можно метить радиоактивной меткой ⁵¹Cr и т.п., а цитотоксическую активность можно рассчитывать по радиоактивности, высвобождающейся из клеток-мишеней. Альтернативно, активность можно оценивать посредством измерения IFN-гамма, продуцируемого и высвобождаемого CTL в присутствии антиген-презентирующих клеток, несущих иммобилизованные пептиды, и визуализации зоны ингибирования на среде с использованием моноклональных антител против IFN-гамма.

В результате оценки способности пептидов индуцировать CTL, как описано выше, было обнаружено, что пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с антигеном HLA, не обязательно обладают высокой способностью к индукции. Однако, для нонапептидов или декапептидов, выбранных из группы пептидов, обладающих аминокислотными последовательностями, показанными как IYNEYIYDL (SEQ ID NO:7), IYNEyIYDLF (SEQ ID NO:8), YIYDLFVPV (SEQ ID NO:9), RLAIFKDLV (SEQ ID NO:10), TMSSsKLSNV (SEQ ID NO:11), EYYELFVNI (SEQ ID NO:12), LLQPHLERV (SEQ ID NO:192), LLMRMISRM (SEQ ID NO:195), LLTFEYYEL (SEQ ID NO:197), RLCKSTIEL (SEQ ID NO:209), CVLCCAEEV (SEQ ID NO:225), FLMDhHQEIL (SEQ ID NO:228), ILVVcGYITV (SEQ ID NO:230) DEPDC1-A02-10-644 (SLMIhTFSRC (SEQ ID NO:240)), DEPDC1-A02-10-575 (SLLPaSSMLT (SEQ ID NO:241)), DEPDC1-A02-10-506 (QLCRsQSLLL (SEQ ID NO:243)), DEPDC1-A02-10-765 (KQFQkEYPLI (SEQ ID NO:244)), DEPDC1- A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEQ ID NO:249), DEPDC1-A02-10-224 (NMANtSKRGV (SEQ ID NO:253)), DEPDC1- A02-9-297 (ELFVNILGL (SEQ ID NO:226)), DEPDC1-A02-10-296 (YELFvNILGL (SEQ ID NO:254)) и DEPDC1-A02-10-301 (NILGlLQPHL (SEQ ID NO:255)), продемонстрирована особенно высокая способность индуцировать CTL.

Как указано выше, настоящее изобретение относится к пептидам, обладающим способностью индуцировать цитотоксические T-клетки, а именно к пептидам, обладающим аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 или 255 или к их вариантам (т.е., вариантам, в которых 1, 2 или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены). Является предпочтительным, чтобы аминокислотные последовательности, состоящие из 9 или 10 аминокислот, показанных на SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 или 255, или их варианты не совпадали с аминокислотной последовательностью, связанной с другим эндогенным белком. В частности, замена аминокислоты на лейцин или метионин для второй аминокислоты от N-конца, замена аминокислоты на валин или лейцин для C-концевой аминокислоты, и добавление аминокислот для 1-2 аминокислот на N-конце и/или C-конце являются примерами предпочтительных вариантов. Специалисту в данной области известно, что кроме замен и добавлений аминокислот, иммунологически активные фрагменты пептидов также можно использовать в способах по настоящему изобретению. Способы определения активных фрагментов хорошо известны в данной области. Клоны CTL, полученные посредством стимуляции этими модифицированными пептидами, могут распознавать исходные пептиды и вызывать разрушение клеток, экспрессирующих исходные пептиды.

Пептиды по настоящему изобретению можно получить с использованием хорошо известных способов. Например, пептиды можно получить синтетическими методами, используя либо способы рекомбинантной ДНК, либо химический синтез. Пептиды по настоящему изобретению можно синтезировать по отдельности или в виде длинных полипептидов, содержащих два или более пептида. Пептиды по настоящему изобретению предпочтительно являются выделенными, т.е., по существу свободными от других природных белков клетки-хозяина и их фрагментов.

Пептиды по настоящему изобретению могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование; пока модификации не нарушают биологической активности пептидов, как описано в настоящем описании, а именно способности связываться с антигеном HLA и индуцировать CTL. Другие модификации включают в себя введение D-аминокислот или других миметиков аминокислот, которое можно использовать, например, для увеличения времени полужизни пептидов в сыворотке.

Пептиды по настоящему изобретению можно получить в виде комбинации, которая содержит два или более пептида по изобретению, для использования в качестве вакцины против заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, где такая вакцина индуцирует CTL in vivo. Предполагаемым раком в качестве неограничивающих примеров может быть рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак предстательной железы, карцинома почек, SCLC, опухоль мягких тканей. Пептиды могут присутствовать в смеси или могут быть конъюгированы друг с другом с использованием общепринятых способов. Например, пептиды можно экспрессировать в виде отдельной полипептидной последовательности. Пептиды в сочетании могут являться одинаковыми или различными. Посредством введения пептидов по изобретению, пептиды презентированы на антигенах HLA антиген-презентирующих клеток с высокой плотностью, что, в свою очередь, индуцирует CTL, которые специфически реагируют на комплекс, сформированный между экспонированным пептидом и антигеном HLA. Альтернативно, антиген-презентирующие клетки, обладающие иммобилизованными пептидами по изобретению на поверхности клеток, полученные посредством получения дендритных клеток у индивидов, можно стимулировать пептидами по изобретению. Повторное введение клеток соответствующим индивидам индуцирует CTL, и, в результате, можно повысить агрессивность в отношении к клеткам-мишеням.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к лекарственным средствам для лечения и/или профилактики пролиферации, метастазирования, и т.п., заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, содержащим один или несколько пептидов по изобретению. Пептиды по изобретению могут быть особенно эффективны для лечения заболевания, связанного с MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака. Предполагаемые виды рака включают в себя в качестве неограничивающих примеров рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, карциному почек, SCLC, опухоль мягких тканей.

Пептиды по изобретению можно вводить индивиду непосредственно, в виде фармацевтической композиции, составленной посредством общепринятых способов составления. В таких случаях, кроме пептидов по настоящему изобретению, носители, наполнители и т.п., которые обычно используют для лекарственных средств, можно вводить при необходимости, без конкретных ограничений. Иммуногенные композиции по изобретению можно использовать для лечения и профилактики заболевания, связанного с MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака. Предполагаемые виды рака включают в себя в качестве неограничивающих примеров, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, карциному почек, SCLC, опухоль мягких тканей.

Иммуногенные композиции для лечения и/или профилактики заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, содержащие в качестве активного ингредиента один или несколько пептидов по настоящему изобретению, могут дополнительно содержать адъювант, эффективно вызывая клеточный иммунитет. Альтернативно, их можно вводить с другими активными ингредиентами, такими как противораковые средства. Предполагаемые виды рака включают в себя в качестве неограничивающих примеров, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, карциному почек, SCLC, опухоль мягких тканей. Подходящие составы включают в себя гранулы. Подходящие адъюванты описаны в литературе (Johnson AG. (1994) C1in. Microbio1. Rev., 7:277-89.). Адъюванты включают в себя в качестве неограничивающих примеров, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, и квасцы. Более того, можно соответствующим образом использовать липосомные составы, гранулированные составы, в которых лекарственное средство связано с бусами диаметром несколько микрометров, и составы, в которых липид связан с пептидом. Способом введения может быть пероральный, интрадермальный, подкожный, внутривенная инъекция или т.п. и может включать в себя системное введение или местное введение в непосредственной близости от опухоли-мишени. Дозу пептида(пептидов) по изобретению можно соответствующим образом изменять в соответствии с заболеванием, на которое направлено лечение, возрастом пациента, массой, способом введения и т.п. Хотя доза обычно составляет 0,001 мг - 1000 мг, предпочтительно, 0,01 мг - 100 мг, более предпочтительно, 0,1 мг - 10 мг, предпочтительно вводимых один раз в несколько суток или один раз в несколько месяцев, специалист в данной области может легко выбрать подходящую дозу и способ введения, так как выбор и оптимизация этих параметров полностью находится в компетенции специалиста в данной области.

Кроме того, настоящее изобретение относится к внутриклеточным везикулам, называемым экзосомами, которые представляют на своей поверхности комплексы, сформированные между пептидами по этому изобретению и антигенами HLA. Экзосомы могут быть получены, например, с использованием способов, подробно описанных в опубликованном японском переводе международных публикаций No. Hei 11-510507 и 2000-512161, и предпочтительно, полученными с использованием антиген-презентирующих клеток, полученных от индивидов, являющихся мишенями для лечения и/или профилактики. Экзосомы по изобретению можно инокулировать в форме вакцин против рака, подобно пептидам по этому изобретению.

Тип используемых антигенов HLA должен совпадать с типом антигенов индивида, получающего лечение и/или которому проводят профилактику. Например, в японской популяции, HLA-A24 или HLA-A2, в частности HLA-A2402 или HLA-A0201, часто являются подходящими.

В некоторых вариантах осуществления композиции вакцины по настоящему изобретению содержат компонент, примирующий цитотоксические T лимфоциты. Липиды идентифицированы как средства, способные примировать CTL in vivo против вирусных антигенов. Например, остатки пальмитиновой кислоты можно присоединять к эпсилон- и альфа-аминогруппам остатка лизина и затем присоединять к иммуногенному пептиду по изобретению. Пептид с присоединенными липидами можно затем вводить непосредственно, в мицелле или частице, заключенным в липосому или эмульгированным в адъюванте. В качестве другого примера примирования липидами ответов CTL, липопротеины E. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинлизерил-серин (P3CSS), можно использовать для примирования CTL при ковалентном присоединении к соответствующему пептиду (см., например, Deres K, et al., (1989) Nature 342:561-4.).

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут также содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие один или несколько из иммуногенных пептидов, описанных в настоящем описании. См., например, Wolff JA et al., (1990) Science 247:1465-8; Патенты США No. 5580859; 5589466; 5804566; 5739118; 5736524; 5679647; и WO 98/04720. Примеры основанных на ДНК способов доставки включают в себя «голую ДНК», доставку с вспомогательными средствами (опосредованную бупивикаином, полимерами, пептидами), катионные липидные комплексы, и опосредованную частицами («генная пушка») или опосредованную давлением доставку (см., например, патент США No. 5922687).

Иммуногенные пептиды по изобретению можно также экспрессировать с помощью вирусных или бактериальных векторов. Примеры подходящих экспрессирующих векторов включают в себя аттенуированных вирусных хозяев, таких как вирусы осповакцины или оспы-дифтерита птиц. Этот способ включает в себя использование вируса осповакцины, например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих пептид. После введения хозяину рекомбинантный вирус осповакцины экспрессирует иммуногенный пептид, и, таким образом, вызывает иммунный ответ. Векторы осповакцины и способы, используемые в способах иммунизации, описаны, например, в патенте США No. 4722848. Другим подходящим вектором является BCG (Bacille Calmette Guerin). Векторы BCG описаны в Stover CK, et al., (1991) Nature 351:456-60. Большое множество других векторов, используемых для терапевтического введения или иммунизации, например, адено- и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы Salmonella typhi, векторы с детоксифицированным токсином антракса, и т.п., известны в данной области. См., например, Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6:66-71; Shedlock DJ and Weiner DB., et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; and Hipp JD, et al., (2000) In Vivo 14:571-85.

Настоящее изобретение также относится к способам индукции антиген-презентирующих клеток с использованием одного или нескольких пептидов по изобретению. Антиген-презентирующие клетки можно индуцировать путем индукции дендритных клеток из моноцитов периферической крови и их последующего приведения в контакт (стимуляции) с одним или несколькими пептидами по этому изобретению in vitro, ex vivo или in vivo. Когда пептиды по настоящему изобретению вводят индивидам, антиген-презентирующие клетки, обладающие иммобилизованными на них пептидами по этому изобретению, индуцируют в организме индивида. Альтернативно, после иммобилизации пептидов по этому изобретению на антиген-презентирующих клетках, клетки можно вводить индивиду в качестве вакцины. Например, введение ex vivo может включать в себя стадии:

a: сбора антиген-презентирующих клеток от индивида, и

b: приведения в контакт антиген-презентирующих клеток со стадии a с пептидом по настоящему изобретению.

Антиген-презентирующие клетки, полученные посредством стадии b, можно вводить индивиду в качестве вакцины.

Настоящее изобретение также относится к способу индукции антиген-презентирующих клеток, обладающих высоким уровнем способности индуцировать цитотоксические T-клетки, где способ включает в себя стадию переноса генов, состоящих из полинуклеотида(полинуклеотидов), кодирующих один или несколько пептидов по этому изобретению, в антиген-презентирующие клетки in vitro. Вводимые гены могут присутствовать в форме ДНК или РНК. Для способа введения можно подходящим образом использовать, без конкретных ограничений, различные способы, общепринятые в данной области, такие как липофекция, электропорация и способ с использованием фосфата кальция. Более конкретно, трансфекцию можно проводить, как описано в Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56:5672-7.; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161:5607-13.; Boczkowski D, et al., (1996) J. Exp. Med., 184:465-72.; опубликованный японский перевод международной публикации No. 2000-509281. Путем переноса гена в антиген-презентирующие клетки, ген подвергают транскрипции, трансляции и т.п. в клетке, и затем полученный белок процессируется посредством MHC класса I или класса II, и продвигается по пути представления для представления частичных пептидов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам индукции CTL с использованием одного или нескольких пептидов по изобретению. Когда пептиды по изобретению вводят индивиду, CTL индуцируют в организме индивида, и таким образом увеличивают силу иммунной системы, нацеленной на клетки, экспрессирующие MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например раковые клетки в тканях опухоли. Предполагаемые виды рака включают в себя в качестве неограничивающих примеров, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, карциному почек, SCLC, опухоль мягких тканей. Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно использовать в контексте терапевтического способа ex vivo, в котором полученные от индивида антиген-презентирующие клетки и CD8-положительные клетки или мононуклеарные лейкоциты периферической крови приводят в контакт (стимулируют) с одним или несколькими пептидами по этому изобретению in vitro, и, после индукции CTL, клетки возвращают индивиду. Например, способ может включать в себя стадии:

a: сбора антиген-презентирующих клеток от индивида,

b: приведения в контакт антиген-презентирующих клеток со стадии a с пептидом по настоящему изобретению,

c: смешивания антиген-презентирующих клеток со стадии b с CD⁸⁺ T-клетками и совместного культивирования, так чтобы индуцировать цитотоксические T-клетки:, и

d: сбора CD⁸⁺ T-клеток после совместного культивирования на стадии c.

CD⁸⁺ T-клетки, обладающие цитотоксической активностью, полученные на стадии d, можно вводить индивиду в качестве вакцины.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения активированных цитотоксических T-клеток с использованием пептидов по этому изобретению. Например, способ может включать в себя следующие стадии:

a: сбора T-клеток от индивида, и

b: приведения в контакт T-клеток со следующими пептидами.

(1) Выделенный пептид из менее чем приблизительно 15 аминокислот, выбранный из группы, состоящий из пептидов, обладающих аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 и 255.

(2) Пептид, способный индуцировать цитотоксические T-клетки, где указанный пептид обладает аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 и 255, где 1, 2, или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены.

Настоящее изобретение также относится к способу получения APC, обладающих способностью индуцировать активированные T-клетки с использованием пептидов по настоящему изобретению. Например, способ может включать в себя стадию приведения в контакт антиген-презентирующих клеток с пептидами для получения антиген-презентирующих клеток, представляющих пептид и HLA антиген на поверхности.

В контексте настоящего изобретения, «активированная цитотоксическая T-клетка» индуцирует продукцию IFN-гамма, высвобождение IFN-гамма и гибель опухолевых клеток.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным цитотоксическим T-клеткам, индуцированным с использованием пептидов по изобретению. Цитотоксические T-клетки, индуцированные посредством стимуляции антиген-презентирующими клетками, представляющими один или несколько пептидов по этому изобретению, предпочтительно, получают от индивидов, являющихся мишенями для лечения и/или профилактики, и их можно вводить отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами, включая один или несколько пептидов по этому изобретению или экзосомы, обладающие противоопухолевой активностью. Полученные цитотоксические T-клетки действуют специфически против клеток-мишеней, представляющих пептиды по этому изобретению, или предпочтительно, тот же самый пептид(ы), используемый для индукции. Клетки-мишени могут представлять собой клетки с эндогенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1 или клетки, трансфицированные генами MPHOSPH1 и/или DEPDC1. Клетки, представляющие пептиды по изобретению на поверхности клеток, из-за стимуляции этими пептидами, также могут становиться мишенями атаки.

Настоящее изобретение также относится к антиген-презентирующим клеткам, представляющим комплексы, сформированные между антигенами HLA и одним или несколькими пептидами по изобретению. Антиген-презентирующие клетки, полученные посредством приведения в контакт с пептидами по этому изобретению или с нуклеотидами, кодирующими такие пептиды, предпочтительно получают от индивидов, являющихся мишенями для лечения и/или профилактики, и их можно вводить в качестве вакцин, отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами, включая пептиды, экзосомы, или цитотоксические T-клетки по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, способные формировать субъединицу T-клеточного рецептора (TCR), и к способам с ее использованием. Субъединицы TCR обладают способностью формировать TCR, которые сообщают T-клеткам специфичность для опухолевых клеток, представляющих MPHOSPH1 или DEPDC1. С использованием известного в данной области способа можно идентифицировать нуклеиновые кислоты альфа- и бета-цепи, как относящиеся к субъединицам TCR CTL, индуцированных одним или несколькими пептидами по этому изобретению (WO2007/032255 и Morgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Производные TCR предпочтительно связывают клетки-мишени, экспонирующие пептид MPHOSPH1 или DEPDC1, с высокой авидностью, и необязательно, опосредуют эффективное уничтожение клеток-мишеней, представляющих пептид MPHOSPH1 или DEPDC1, in vivo и in vitro.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие субъединицы TCR, можно включать в подходящие векторы, например, ретровирусные векторы. Эти векторы хорошо известны в данной области. Нуклеиновые кислоты или содержащие их векторы можно эффективно переносить в T-клетку, где T-клетка предпочтительно происходит от пациента. Преимущественно, изобретение относится к имеющейся в готовом виде композиции, позволяющей быструю модификацию собственных T-клеток пациента (или T-клеток другого млекопитающего) для быстрого и простого получения модифицированных T-клеток, обладающих отличными свойствами уничтожения раковых клеток.

Настоящее изобретение относится также к CTL, полученным посредством трансдукции нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептиды субъединиц TCR, связывающихся с пептидом MPHOSPH1 или DEPDC1, например, SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 или 255 в контексте HLA-A24 или HLA-A2. Трансдуцированные CTL способны к хомингу к раковым клеткам in vivo и к размножению посредством хорошо известного способа культивирования in vitro (например, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). T-клетки по изобретению можно использовать для получения иммуногенной композиции, применимой для лечения или профилактики рака у пациента, нуждающегося в терапии или защите (WO2006/031221).

В контексте настоящего изобретения, термин «вакцина» (обозначаемая также иммуногенной композицией) относится к веществу, которое индуцирует иммунитет против опухоли или супрессирует рак при введении животным. В соответствии с настоящим изобретением, предположили, что полипептиды, обладающие аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, 8 или 12, представляют собой рестриктированные по HLA-A24 пептиды-эпитопы, и предположили, что полипептиды из SEQ ID NO: 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 или 255, представляют собой рестриктированные по HLA-A2 пептиды-эпитопы, которые могут индуцировать сильный и специфичный иммунный ответ против клеток, экспрессирующих MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например раковых клеток, экспрессирующих MPHOSPH1 и/или DEPDC1. Предполагаемые виды рака включают в себя в качестве неограничивающих примеров, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, карциному почек, SCLC, опухоль мягких тканей. Таким образом, настоящее изобретение относится также к способу индукции иммунитета против опухолей с использованием полипептидов, обладающих аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 249, 253, 254 или 255, или их вариантов (т.е., включающих 1, 2, или несколько замен, делеций или добавлений аминокислот). Как правило, иммунитет против опухолей включает в себя иммунные ответы, такие как следующие:

- индукция цитотоксических лимфоцитов против опухолей, содержащих клетки, экспрессирующие MPHOSPH1 и/или DEPDC1,

- индукция антител, распознающих опухоли, содержащие клетки, экспрессирующие MPHOSPH1 и/или DEPDC1, и

- индукция продукции противоопухолевых цитокинов.

Таким образом, когда конкретный пептид индуцирует любой из этих иммунных ответов при инокуляции животному, решают, что пептид обладает индуцирующим эффектом для иммунитета против опухолей. Индукцию иммунитета против опухолей пептидом можно детектировать посредством наблюдения in vivo или in vitro ответа иммунной системы хозяина против пептида.

Например, хорошо известен способ детекции индукции цитотоксических T лимфоцитов. Чужеродное вещество, которое входит в живой организм, представляется T-клеткам и B-клеткам посредством действия антиген-презентирующих клеток (APC). T-клетки, которые отвечают на антиген, представляемый APC, специфическим для антигена образом, дифференцируют до цитотоксических T-клеток (обозначаемых также как цитотоксические T-лимфоциты или CTL) из-за стимуляции посредством антигена, и затем пролиферируют; этот процесс обозначают в настоящем описании как «активацию» T-клеток. Таким образом, индукцию CTL конкретным пептидом можно оценивать посредством представления пептида T-клеткам посредством APC и детекции индукции CTL. Более того, APC обладают эффектом активации CD4+ T-клеток, CD8+ T-клеток, макрофагов, эозинофилов и NK-клеток. Поскольку CD4+ T-клетки также являются важными для иммунитета против опухолей, действие пептида, индуцирующее иммунитет против опухоли, можно оценивать с использованием эффекта активации этих клеток в качестве индикаторов.

Способ для оценки индуцирующего действия на CTL с использованием дендритных клеток (DC) в качестве APC хорошо известен в данной области. DC является репрезентативной APC, обладающей наиболее сильным индуцирующим CTL действием среди APC. По этому способу тестируемый полипептид сначала приводят в контакт с DC, и затем эти DC приводят в контакт с T-клетками. Детекция T-клеток, обладающих цитотоксическими эффектами против интересующих клеток после контакта с DC показывает, что тестируемый полипептид обладает активностью индукции цитотоксических T-клеток. Активность CTL против опухолей можно детектировать, например, с использованием лизиса меченных ⁵¹Cr опухолевых клеток в качестве показателя. Альтернативно, хорошо известна оценка степени разрушения опухолевой клетки с использованием активности поглощения ³H-тимидина или высвобождения LDH (дегидрогеназы лактозы) в качестве показателя. Более того, ее можно также оценивать посредством измерения количества IFN-гамма, продуцированного и высвобожденного CTL в присутствии антиген-презентирующих клеток, несущих иммобилизованные пептиды, посредством визуализации с использованием антител против IFN-гамма, например анализа ELISPOT.

Помимо DC мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) также можно использовать в качестве APC. Опубликовано, что индукцию CTL усиливают посредством культивирования PBMC в присутствии GM-CSF и IL-4. Подобным образом, показано, что CTL индуцируют посредством культивирования PBMC в присутствии гемоцианина морского блюдечка (KLH) и IL-7.

Тестируемые полипептиды, как подтверждено, обладающие активностью CTL, индуцируемой этими способами, представляют собой полипептиды, обладающие эффектом активации DC и активностью последующей индукции CTL. Таким образом, полипептиды, которые индуцируют CTL против опухолевых клеток, являются применимыми в качестве вакцин против заболеваний, связанных с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака. Более того, APC, которые приобретают способность индуцировать CTL против заболевания, связанного с MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, посредством приведения в контакт с полипептидами, являются применимыми в качестве вакцин против заболевания. Более того, CTL, обладающие приобретенной цитотоксичностью из-за представления полипептидных антигенов посредством APC, также можно использовать в качестве вакцин против заболевания, связанного с MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака. Такие терапевтические способы для заболеваний, связанных с MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, с использованием иммунитета против опухолей благодаря APC и CTL, обозначают клеточной иммунотерапией. Предполагаемые виды рака включают в себя в качестве неограничивающих примеров рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак предстательной железы, карциному почек, SCLC, опухоль мягких тканей.

Как правило, при использовании полипептида для клеточной иммунотерапии, эффективность индукции CTL можно увеличивать посредством объединения множества полипептидов, обладающих различными структурами, и приведения их в контакт с DC. Таким образом, при стимуляции DC фрагментами белка, является преимущественным использовать смесь из множества типов фрагментов.

Индукцию иммунитета против опухолей посредством полипептида можно дополнительно подтвердить наблюдением индукции продукции антитела против опухолей. Например, когда антитела против полипептида индуцированы в лабораторном животном, иммунизированным полипептидом, и когда рост, пролиферация и/или метастазирование опухолевых клеток супрессированы этими антителами, определяют, что полипептид индуцирует иммунитет против опухолей.

Иммунитет против опухолей можно индуцировать посредством введения вакцины по этому изобретению, и индукция иммунитета против опухолей позволяет лечение и профилактику заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака. Терапия против заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, или профилактика его дебюта, может включать в себя ингибирование роста клеток, экспрессирующих MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например раковых клеток, инволюцию этих клеток и супрессию возникновения этих клеток, например раковых клеток. Снижение смертности индивидуумов, страдающих заболеванием, связанным с MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например раком, уменьшение уровня маркеров заболевания в крови, облегчение поддающихся детекции симптомов, сопровождающих заболевание, и т.п. также включены в терапию или профилактику заболевания, например рака. Такие терапевтические и профилактические эффекты предпочтительно являются статистически значимыми, например, наблюдаемыми с уровнем значимости 5% или менее, где терапевтический или профилактический эффект вакцины против заболевания, связанного с MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, сравнивают с контролем без введения вакцины. Например, t-тест Стьюдента, U-тест Манна-Уитни или ANOVA можно использовать для определения статистической значимости.

Поскольку настоящее изобретение относится к способу для лечения или профилактики заболевания, связанного с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака, терапевтические соединения или композиции можно вводить профилактически или терапевтически индивидам, страдающим от заболевания или подверженным риску развития заболевания (или чувствительным к развитию заболевания). Таких индивидов можно идентифицировать с использованием стандартных клинических способов. В контексте настоящего изобретения профилактическое введение происходит до проявления явных клинических симптомов заболевания, так что заболевание или нарушение предотвращают или, альтернативно, задерживают его прогрессирование. В контексте области медицины термин «предотвращать» включает в себя любую активность, которая снижает нагрузку смертности или заболеваемости для заболевания. Предотвращение может происходить на первичном, вторичном и третичном уровнях предотвращения. В то время как первичное предотвращение предотвращает развитие заболевания, вторичный и третичный уровни предотвращения включают в себя активности, направленные на предотвращение прогрессирования заболевания и появления симптомов, так же, как на снижение отрицательного вклада уже развившегося заболевания посредством восстановления функции и уменьшения связанного с заболеванием осложнений.

В контексте лечения рака, термин «эффективный» относится к лечению, которое приводит к уменьшению размера, распространения или метастатического потенциала рака у индивида. Когда лечение применяют профилактически, «эффективный» означает, что лечение задерживает или предотвращает возникновение рака или облегчает клинический симптом рака. Оценку рака можно производить с использованием стандартных клинических протоколов. Более того, эффективность лечения можно определять в сочетании с любым известным способом для диагностики или лечения рака. Например, рак можно диагностировать гистопатологически или посредством идентификации симптоматических аномалий.

Вышеупомянутый пептид, обладающий иммунологической активностью, или полинуклеотид или вектор, кодирующий такой пептид, можно объединять с адъювантом. Адъювант относится к соединению, которое усиливает иммунный ответ против пептида при введении совместно (или последовательно) с пептидом, обладающим иммунологической активностью. Подходящие адъюванты включают в себя в качестве неограничивающих примеров холерный токсин, токсин Salmonella, квасцы и т.п. Более того, вакцину по этому изобретению можно соответствующим образом сочетать с фармацевтически приемлемым носителем. Примерами таких носителей являются стерилизованная вода, физиологический солевой раствор, фосфатный буфер, культуральная жидкость и т.п. Более того, вакцина может содержать, при необходимости, стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества и т.п. Вакцину вводят системно или местно. Введение вакцины можно осуществлять посредством однократного введения или множества бустер-введений.

При использовании APC или CTL в качестве вакцины по этому изобретению, заболевание, связанное с повышенной экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рак, можно лечить или предотвращать, например, посредством способа ex vivo. Более конкретно, PBMC индивида, подвергаемого лечению или профилактике, собирают, приводят в контакт ex vivo с пептидом по настоящему изобретению. После индукции APC или CTL клетки можно вводить индивиду. APC можно также индуцировать введением вектора, кодирующего пептид, в PBMC ex vivo. APC или CTL, индуцированные in vitro, можно клонировать перед введением. Посредством клонирования и выращивания клеток, обладающих высокой активностью разрушения клеток-мишеней, клеточную иммунотерапию можно проводить более эффективно. Более того, APC и CTL, выделенные этим способом, можно использовать для клеточной иммунотерапии не только для индивидуумов, от которых происходят клетки, но также против заболеваний подобного типа у других индивидуумов.

Аспекты настоящего изобретения описаны в следующих примерах, которые представлены только, чтобы проиллюстрировать настоящее изобретение и помочь обычному специалисту в данной области в его осуществлении и использовании. Примеры никаким образом не предназначены, чтобы в других случаях ограничивать объем изобретения.

Хотя методы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать для практического осуществления или тестирования настоящего изобретения, подходящие методы и материалы описаны ниже.

ПРИМЕРЫ

Здесь далее настоящее изобретение иллюстрируют, но не ограничивают, посредством следующих примеров. Однако, материалы, способы и т.п., описанные в настоящем описании, только иллюстрируют аспекты изобретения и никаким образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В силу этого, материалы, методы и т.п., подобные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать для практического осуществления или тестирования настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии клеток

Клетки A24LCL (HLA-A24/24), человеческие лимфобластные В-клеточные линии, клетки T2 и COS7 закупали в ATCC.

Отбор пептидов-кандидатов, полученных из MPHOSOH1 и DEPDC1

9-членные и 10-членные пептиды, полученные из MPHOSOH1 или DEPDC1, связывающиеся с молекулой HLA-A*2402 и HLA-A*0201, предсказывали с использованием программного обеспечения для предсказания связывания «BIMAS» (bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform) (Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(1):163-75.; Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81.). Эти пептиды синтезировали в Sigma (Sapporo, Japan) согласно общепринятому твердофазному способу синтеза и очищали обращеннофазовой HPLC. Чистоту (>90%) и идентичность пептидов определяли аналитической HPLC и анализом масс-спектрометрии, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) при 20 мг/мл и хранили при -80 градусах C.

Индукция CTL in vitro

Происходящие из моноцитов дендритные клетки (DC) использовали в качестве антиген-презентирующих клеток (APC) для индукции ответов CTL против пептидов, представленных на HLA. DC получали in vitro, как описано в других местах (Nukaya I et al., (1999) Int. J. Cancer 80, 92-7., Tsai V et al., (1997) J. Immunol 158:1796-802.). Кратко, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные от нормального добровольца (HLA-A*2402 и/или HLA-A*0201) посредством раствора Ficoll-Paque (Pharmacia), разделяли по адгезии на пластиковом культуральном флаконе (Becton Dickinson) для их обогащения по фракции моноцитов. Обогащенную моноцитами популяцию культивировали в присутствии 1000 Ед./мл GM-CSF (Genzyme) и 1000 Ед./мл IL-4 (Genzyme) в AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированной нагреванием аутологичной сыворотки (AS). После 7 суток в культуре образующие цитокины DC обучали с помощью 20 мкг/мл синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета-2-микроглобулина в течение 4 час при 20 градусах C в AIM-V. Эти обученные пептидом DC затем инактивировали посредством MMC (30 мкг/мл в течение 30 мин) и смешивали в соотношении 1:20 с аутологичными CD8+ T-клетками, полученными положительным отбором с помощью Dynabeads M-450 CD8 (Dynal) и DETACHa BEAD™ (Dynal). Эти культуры получали в 48-луночных планшетах (Corning); каждая лунка содержала 1,5×10⁴ обученных пептидом DC, 3×10⁵ CD8+ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (Genzyme) в 0,5 мл AIM-V/2% AS. Трое суток спустя, эти культуры дополняли IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 Ед./мл. На сутки 7 и 14, T-клетки далее повторно стимулировали обученными аутологичным пептидом DC. DC получали каждый раз одним и тем же способом, описанным выше. CTL тестировали против обученных пептидом клеток A24LCL или T2-клеток после 3-го цикла стимуляции пептидом на сутки 21.

Способ размножения CTL

CTL размножали в культуре с использованием способа, сходного со способом, описанным Riddell SR, et al., (Walter EA et al., (1995) N Engl J Med 333:1038-44.; Riddel SR, et al., (1996) Nature Med. 2:216-23.). Всего 5×10⁴ CTL ресуспендировали в 25 мл AIM-V/5% AS с 2 видами человеческих лимфобластных В-клеточных линий, инактивированных посредством MMC, в присутствии 40 нг/мл моноклонального антитела против CD3 (Pharmingen). Через одни сутки после начала культивирования к культурам добавляли 120 МЕ/мл IL-2. Культуры подпитывали свежей AIM-V/5% AS, содержащей 30 МЕ/мл IL-2, на сутки 5, 8 и 11.

Получение клонов CTL

Выполняли разведения для получения 0,3, 1, и 3 CTL/лунку в 96-луночном круглодонном планшете для микротитрования (Nalge Nunc International). CTL культивировали с 7×10⁴ клеток/лунку 2 видов человеческих лимфобластных В-клеточных линий, 30 нг/мл антитела против CD3, и 125 ЕД./мл IL-2 всего в 150 мкл/лунку AIM-V, содержащей 5% AS. 50 мкл/лунку IL-2 добавляли к среде 10 суток спустя, так что конечная концентрация IL-2 стала 125 ЕД/мл. CTL активность CTL тестировали на 14-е сутки, и клоны CTL размножали с использованием того же самого способа, как выше.

Специфическая активность CTL

Для проверки специфической активности CTL, проводили анализ ELISPOT IFN-гамма и ELISA IFN-гамма.

Кратко, обученные пептидом A24-LCL или T2-клетки (1×10⁴/лунку) получали в качестве стимулирующих клеток. Культивируемые клетки в 48 лунках или клоны CTL после лимитирующего разведения использовали в качестве отвечающих клеток. Анализ ELISPOT IFN-гамма и ELISA проводили по способу производителя.

Культивирование и трансфекция клеток

HLA-A24 B-LCL (A24LCL), трансформированные вирусом Эпштейна-Барр, получали. Jiyoye, EB-3, COS7, HT1376, RT-4 и J82 закупали в Американской коллекции типовых культур (Rockville, MD). A24LCL, Jiyoye и EB-3 поддерживали в RPMI1640, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку (GEMINI Bio-Products) и 1% раствор антибиотика (Sigma). COS7, HT1376, RT-4 и J82 поддерживали в соответствующей среде и антибиотиках. Трансфекцию COS7 и HEK проводили с использованием FUGENE6 (Roche). Клетки HEK-A2, стабильный клон, экспрессирующий молекулу HLA-A*0201, получали трансфекцией плазмидой pcDNA6.2-HLA-A2 и выделяли способом лимитирующего разведения в присутствии 5 мкг/мл бластицидина S.

Иммуногенность пептидов-эпитопов для мышей BALB/c

Для индукции специфических для пептидов CTL проводили иммунизацию с использованием 100 мл смеси вакцины, содержащей 50 мкл (100 мкг) рестриктированного по HLA-A24 пептида и 50 мкл IFA на мышь. Вакцину инъецировали подкожно в правый бок для первой иммунизации на сутки 0 и в левый бок для второй на сутки 7. На сутки 14 спленоциты из вакцинированных мышей, без какой-либо стимуляции in vitro, представляли собой используемые отвечающие клетки, а клетки RLmale1, с или без обучения пептидами, использовали в качестве стимулирующих клеток для анализа ELISPOT IFN-гамма.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Увеличенная экспрессия MPHOSPH1 и DEPDC1 при раке

Данные общего профиля экспрессии генов, полученные для различных видов рака с использованием кДНК-микрочипа, выявили, что является повышенной экспрессия MPHOSPH1 (Инвентарный No. в GenBank NM_016195; SEQ ID NО:1) и DEPDC1 (Инвентарный No. в GenBank No. BM683578), имеющего два варианта; DEPDC1 V1 (SEQ ID NО:3) и DEPDC1 V2 (SEQ ID NО:5). Экспрессия MPHOSPH1 являлась воспроизводимо повышенной в 30 из 31 случаев рака мочевого пузыря, 8 из 36 случаев рака молочной железы, 18 из 18 случаев рака шейки матки, 5 из 17 холангиоцеллюлярных карцином, 25 из 31 случая CML, 6 из 11 случаев рака ободочной и прямой кишки, 6 из 14 случаев рака желудка, 5 из 5 случаев NSCLC, 7 из 7 лимфом, 6 из 10 остеосарком, 7 из 22 случаев рака предстательной железы, 10 из 18 карцином почек и 15 из 21 опухоли мягких тканей по сравнению с соответствующей нормальной тканью. Экспрессия DEPDC1 являлась воспроизводимо повышенной в 23 из 25 случаев рака мочевого пузыря, 6 из 13 случаев рака молочной железы, 12 из 12 случаев рака шейки матки, 6 из 6 холангиоцеллюлярных карцином, 3 из 4 CML, 2 из 4 случаев рака ободочной и прямой кишки, 6 из 6 NSCLC, 7 из 7 лимфом, 10 из 14 остеосарком, 11 из 24 случаев рака предстательной железы, 14 из 14 SCLC и 22 из 31 опухолей мягких тканей по сравнению с соответствующей нормальной тканью (Таблица 1).

Предсказание связывающих HLA-A24 и HLA-A2 пептидов, полученных из MPHOSPH1 или DEPDC1

В таблице 2 указаны связывающие HLA-A*2402 пептиды для MPHOSPH1 в порядке аффинности связывания. В таблице 2A указаны 9-членные пептиды, полученные из MPHOSPH1, и в таблице 2B указаны 10-членные пептиды, полученные из MPHOSPH1.

В таблице 3 указаны связывающие HLA-A*0201 пептиды для MPHOSPH1 в порядке аффинности связывания. В таблице 3A указаны 9-членные пептиды, полученные из MPHOSPH1, и в таблице 3B указаны 10-членные пептиды, полученные из MPHOSPH1.

В таблице 4 указаны связывающие HLA-A*2402 пептиды для DEPDC1 V1 и V2 в порядке аффинности связывания. В таблице 4A указаны 9-членные пептиды, полученные из DEPDC1 V1 и V2, и в таблице 4B указаны 10-членные пептиды, полученные из DEPDC1 V1.

В таблице 5 указаны связывающие HLA-A*0201 пептиды для DEPDC1 V1 и V, в таблице 5A указаны 9-членные пептиды, полученные из DEPDC1 V1 и V2, и в таблице 5B указаны 10-членные пептиды, полученные из DEPDC1 V1 и V2.

Начальное положение обозначает номер аминокислоты от N-конца MPHOSPH1. Показатель связывания выведен из «BIMAS», описанного в материалах и методах.

Начальное положение обозначает номер аминокислоты от N-конца MPHOSPH1. Показатель связывания выведен из «BIMAS», описанного в материалах и методах.

Начальное положение обозначает номер аминокислоты от N-конца MPHOSPH1. Показатель связывания выведен из «BIMAS», описанного в материалах и методах.

Начальное положение обозначает номер аминокислоты от N-конца MPHOSPH1. Показатель связывания выведен из «BIMAS», описанного в материалах и методах.

Начальное положение обозначает номер аминокислоты от N-конца DEPDC1. Показатель связывания выведен из «BIMAS», описанного в материалах и методах.

Начальное положение обозначает номер аминокислоты от N-конца DEPDC1. Показатель связывания выведен из «BIMAS», описанного в материалах и методах.

Начальное положение обозначает номер аминокислоты от N-конца DEPDC1. Показатель связывания выведен из «BIMAS», описанного в материалах и методах.

Начальное положение обозначает номер аминокислоты от N-конца DEPDC1. Показатель связывания выведен из «BIMAS», описанного в материалах и методах.

Стимуляция T-клеток с использованием предсказанных пептидов из MPHOSPH1, рестриктированных по HLA-A*2402

CTL для этих пептидов, полученных из MPHOSHP1 (SEQ ID No:2), получены согласно способам, указанным в разделе «Материалы и методы» выше. Полученные CTL, обладающие поддающейся детекции специфической активностью CTL, как оценивали посредством анализа ELISPOT IFN-гамма, показаны на Фиг.1A и на Фиг.2A. На фиг.1A, для клеток в лунке номер #4, стимулированных MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. На фиг.2A, для клеток в лунке номер #8, стимулированных MPHOSPH1-A24-10-278 (SEQ ID NO:8), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Затем эти клетки в положительной лунке размножали и проводили лимитирующее разведение. Как показано на Фиг.1B (MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7)) и на Фиг.2B (MPHOSPH1-A24-10-278 (SEQ ID NO:8)), получили клоны CTL, обладающие более высокими активностями CTL против обученной пептидом мишени по сравнению с активностями против мишени без обучения пептидом.

Для клонов CTL, стимулированных MPHOSPH1-A24-9-278 (IYNEYIYDL (SEQ ID NO:7)) (Фиг.3A) и MPHOSPH1-A24-10-278 (IYNEYIYDLF (SEQ ID NO:8)) (Фиг.3B), показали сильную специфическую активность CTL против обученной пептидом мишени, не показав какой-либо значительной специфической активности CTL против мишеней, не обученных каким-либо пептидом. Это позволяет предполагать, что клон CTL обладает специфической для пептида цитотоксичностью.

Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих MPHOSPH1

Полученные клоны CTL, стимулированные против этих пептидов, исследовали по их способности распознавать клетки-мишени с эндогенной экспрессией MPHOSPH1 и HLA-A*2402. Специфическую активность CTL против COS7, трансфицированных геном и полноразмерного MPHOSPH1, и молекулы HLA-A*2402, которые представляют собой специфическую модель для клеток-мишеней с эндогенной экспрессией MPHOSPH1 и HLA-A*2402, тестировали с использованием в качестве эффекторных клеток клона CTL, стимулированного посредством MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7). COS7, трансфицированные полноразмерным MPHOSPH1, но не HLA-A*2402, и COS7, трансфицированные HLA-A*2402, но не полноразмерным MPHOSPH1, получали в качестве контролей. Клоном CTL, обладающим наиболее высокой специфической активностью CTL против COS7, являлся клон, трансфицированный и MPHOSPH1, и HLA-A24. Однако, для него не показали значительной специфической активностью CTL против COS7, не трансфицированных ни MPHOSPH1, ни HLA-A24 (Фиг.4).

Эти результаты ясно показывают, что MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7) является естественным образом экспрессированным на поверхности клеток-мишеней с молекулой HLA-A24 и узнаваемым CTL.

Активность CTL против линий клеток рака мочевого пузыря с эндогенной экспрессией MPHOSPH1

Полученный клон CTL, стимулированный против пептида MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7), проверяли по его способности распознавать опухолевые клетки с эндогенной экспрессией MPHOSPH1. Активность CTL против клеток HT1376 с эндогенной экспрессией MPHOSPH1 и HLA-A24 тестировали с использованием клона CTL, стимулированного посредством MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7), в качестве эффекторных клеток. Клетки J82 и клетки RT-4 использовали в качестве клеток-мишеней с эндогенной экспрессией MPHOSPH1, но без экспрессии HLA-A24. Для полученного клона CTL показали высокую продукцию IFN-гамма против клеток HT1376, экспрессирующих и MPHOSPH1, и HLA-A24. С другой стороны, для CTL не показали значительной активности CTL против клеток J82 и RT-4, экспрессирующих MPHOSPH1, но не HLA-A24 (Фиг.5). Это ясно показывает, что пептид MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7) являлся естественным образом процессированным к поверхности опухолевой клетки с помощью молекулы HLA-A24 и узнаваемым CTL.

Индукция CTL in vivo с помощью пептида MPHOSPH1-A24-9-278 у мышей BALB/c

Известно, что молекула H-2Kd, одна из молекул MHC класса I мыши, напоминает якорный мотив молекулы HLA-A24 и частично перекрестно реагирует с рестриктированным по HLA-A24 пептидом. Затем авторы настоящего изобретения проверяли, индуцирует ли пептид MPHOSPH1-A24-9-278 CTL in vivo, посредством вакцинации этим пептидом с использованием мышей BALB/c (H-2Kd). IFA-конъюгированный пептид подкожно инъецировали мышам BALB/c на сутки 0 и 7. На сутки 14 спленоциты собирали и использовали в качестве отвечающих клеток для анализа ELISPOT. Для спленоцитов всех мышей, инъецированных пептидом (Ani1~5), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контрольными мышами, которым инъецировали только IFA (nega1~3) (Фиг.6). Эти данные показывают, что пептид MPHOSPH1-A24-9-278 может вызывать ответ CTL даже in vivo.

Стимуляция T-клеток с использованием предсказанных пептидов из MPHOSPH1, рестриктированных по HLA-A*0201

Полученные CTL, обладающие поддающейся детекции специфической активностью CTL, как оценивали анализом ELISPOT IFN-гамма, показаны на Фиг.7. Как показано на Фиг.7A, для клеток в лунке номер #1 и #5, стимулированных с помощью MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEQ ID NO:9)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Как показано на Фиг.7B, для клеток в лунке номер #8, стимулированных MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV (SEQ ID NO:10)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Как показано на Фиг.7C, для клеток в лунке номер #4, стимулированных MPHOSPH1-A2-10-1714 (TMSSsKLSNV (SEQ ID NO:11)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем.

Как показано на Фиг.8A (MPHOSPH1-A2-9-282 (SEQ ID NO:9)), на Фиг.8B (MPHOSPH1-A2-9-638 (SEQ ID NO:10)), и на Фиг.8C (MPHOSPH1-A2-10-1714(SEQ ID NO:9)), эти клетки в положительной лунке размножали, и получили линии CTL, обладающие более высокими специфическими активностями CTL против обученной пептидом мишени по сравнению с активностями против мишени без обучения пептидом.

Для клонов CTL, стимулированных MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV (SEQ ID NO:9)) (Фиг.9A, и 9B), показали сильную специфическую активность CTL против обученной пептидом мишени без какой-либо значительной специфической активности CTL против мишеней, не обученных каким-либо пептидом.

Стимуляция T-клеток с использованием предсказанных пептидов из DEPDC1, рестриктированных по HLA-A*2402

CTL для этих пептидов, полученных из DEPDC1, получены согласно способу, описанному в разделе «Материалы и методы» выше. Полученные CTL, обладающие поддающейся детекции специфической активностью CTL, как оценено ELISPOT IFN-гамма, показаны на Фиг.10. Как показано на Фиг.10A, для клеток в лунке номер #10, стимулированных DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO:12)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Соответственно, эти клетки в положительной лунке размножали и проводили лимитирующее разведение. Как показано на Фиг.10B (DEPDC1-A24-9-294 (SEQ ID NO:12)), получены клоны CTL, обладающие более высокими специфическими активностями CTL против обученной пептидом мишени по сравнению с активностями против мишени без обучения пептидом. Для клонов CTL, стимулированных DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO:12)) (Фиг.11), показали сильную специфическую активность CTL против обученной пептидом мишени без какой-либо значительной специфической активности CTL против мишеней без обучения каким-либо пептидом. Результаты позволяют предполагать, что клон CTL обладает специфической для пептида цитотоксичностью.

Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих DEPDC1 и HLA-A*2402

Полученные клоны CTL, стимулированные против этих пептидов, оценивали по их способности распознавать клетки-мишени с эндогенной экспрессией DEPDC1 и HLA-A*2402. Специфическую активность CTL против COS7, трансфицированных геном и полноразмерного DEPDC1, и молекулы HLA-A*2402, которые служат специфической моделью для клеток-мишеней с эндогенной экспрессией DEPDC1 и HLA-A*2402, тестировали с использованием в качестве эффекторных клеток клона CTL, стимулированного DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO:12)). COS7, трансфицированные полноразмерным DEPDC1, но не HLA-A*2402 и COS7, трансфицированные HLA-A*2402 но не полноразмерным DEPDC1, получали в качестве контролей. Для клона CTL показали высокую специфическую активность CTL против COS7, трансфицированных и DEPDC1, и HLA-A24. Однако, не показали значительной специфической активности CTL против COS7, не трансфицированных ни DEPDC1, ни HLA-A24 (Фиг.12).

Эти результаты ясно показывают, что DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO:12)) является естественным образом экспрессированным на поверхности клеток-мишеней с помощью молекулы HLA-A24 и узнаваемым CTL.

Активность CTL против линий клеток рака мочевого пузыря с эндогенной экспрессией DEPDC1

Полученный клон CTL, стимулированный против пептида DEPDC1-A24-9-294, оценивали по его способности распознавать опухолевые клетки с эндогенной экспрессией DEPDC1. Активность CTL против клеток HT1376, которые экспрессируют эндогенные DEPDC1 и HLA-A24, тестировали с использованием клона CTL, стимулированного DEPDC1-A24-9-294, в качестве эффекторных клеток. Клетки J82 и клетки RT-4 использовали в качестве клеток-мишеней, которые экспрессируют эндогенный DEPDC1, но не экспрессируют HLA-A24. Для полученного клона CTL показали высокую продукцию IFN-гамма против клеток HT1376, экспрессирующих и DEPDC1, и HLA-A24. С другой стороны, не показали значительную активность CTL против клеток J82 и RT-4, экспрессирующих DEPDC1, но не HLA-A24 (Фиг.13). Это ясно показывает, что DEPDC1-A24-9-294 является естественным образом процессированным к поверхности опухолевой клетки с помощью молекулы HLA-A24 и узнаваемым CTL.

Индукция CTL in vivo с помощью пептида DEPDC1-A24-9-294 у мышей BALB/c

Известно, что молекула H-2Kd, одна из молекул MHC класса I мыши, напоминает якорный мотив молекулы HLA-A24 и частично перекрестно реагирует с рестриктированным по HLA-A24 пептидом. Затем авторы настоящего изобретения проверяли, индуцирует ли пептид DEPDC1-A24-9-294 CTL in vivo посредством вакцинации этим пептидом с использованием мышей BALB/c mice (H-2Kd). IFA- конъюгированный пептид подкожно инъецировали мышам BALB/c на сутки 0 и 7. На сутки 14, спленоциты собирали и использовали в качестве отвечающих клеток для анализа ELISPOT. Для спленоцитов всех мышей, инъецированных пептидом (Ani1~5), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контрольными мышами, которым инъецировали только IFA (nega1, 2) (Фиг.14). Эти данные показывают, что пептид DEPDC1-A24-9-294 может вызывать ответ CTL даже in vivo.

Стимуляция T-клеток с использованием предсказанных пептидов из DEPDC1, рестриктированных по HLA-A*0201

Полученные CTL, обладающие поддающейся детекции специфической активностью CTL при скрининге посредством анализа ELISPOT IFN-гамма, показаны на Фиг.15 и в таблице 6. Для клеток в лунке номер #4 и #7, стимулированных с помощью DEPDC1- A02-10-644 ((SLMIHTFSRC SEQ ID NO:240)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #2, стимулированных DEPDC1- A02-10-575 (SLLPASSMLT (SEQ ID NO:241)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #7, стимулированных DEPDC1- A02-10-506 (QLCRSQSLLL (SEQ ID NO:243)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #1, стимулированных DEPDC1-A02-10-765 (KQFQKEYPLI (SEQ ID NO:244)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #1, стимулированных DEPDC1-A02-10-395 (IMGGSCHNLI (SEQ ID NO:249)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #1 и #2, стимулированных DEPDC1-A02-10-224 (NMANTSKRGV (SEQ ID NO:253)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #4, стимулированных DEPDC1- A02-9-297 (ELFVNILGL (SEQ ID NO:226)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #3 и #4, стимулированных DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEQ ID NO:254)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #2, #3, #5 и #7, стимулированных DEPDC1-A02-10-301 (NILGLLQPHL (SEQ ID NO:255)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #6, стимулированных DEPDC1-A02-9-598 (LLQPHLERV (SEQ ID NO:192)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #6, стимулированных DEPDC1-A02-9-619 (LLMRMISRM (SEQ ID NO:195)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #2, стимулированных DEPDC1-A02-9-290 (LLTFEYYEL (SEQ ID NO:197)) показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #5, стимулированных DEPDC1-A02-9-563 (RLCKSTIEL (SEQ ID NO:209)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #1 и #3, стимулированных DEPDC1-A02-9-653 (CVLCCAEEV (SEQ ID NO:225)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Для клеток в лунке номер #1, стимулированных DEPDC1-A02-10-674 (FLMDhHQEIL (SEQ ID NO:228)) показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем. Наконец, для клеток в лунке номер #2 и #6, стимулированных DEPDC1-A02-10-302 (ILVVcGYITV (SEQ ID NO:230)), показали сильную продукцию IFN-гамма по сравнению с контролем.

Для линий CTL, стимулированных DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEQ ID NO:254)) и DEPDC1-A02-9-653 (CVLCCAEEV (SEQ ID NO:225)) (Фиг.16), показали сильную специфическую активность CTL против обученной пептидом мишени без какой-либо значительной специфической активности CTL против мишеней, не обученных каким-либо пептидом. Это показывает, что клон CTL обладает специфической для пептида цитотоксичностью.

Таблица 6 Пептиды-кандидаты из DEPDC1, рестриктированные по HLA-A*0201 Наименование пептида SEQ ID NО: № лунки DEPDC1-A02-9-589 192 6 DEPDC1-A02-9-619 195 6 DEPDC1-A02-9-290 197 2 DEPDC1-A02-9-563 209 5 DEPDC1-A02-9-653 225 1 DEPDC1-A02-9-653 225 3 DEPDC1-A02-10-674 228 1 DEPDC1-A02-10-302 230 2 DEPDC1-A02-10-302 230 6

Специфическая активность CTL против клеток-мишеней, экспрессирующих DEPDC1 и HLA-A*0201

Полученные линии CTL, стимулированные против пептида DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEQ ID NO:254)) и DEPDC1-A02-9-653 (CVLCCAEEV (SEQ ID NO:225)), оценивали по их способности узнавать клетки-мишени с эндогенной экспрессией DEPDC1 и HLA-A2. Сначала авторы настоящего изобретения получили линию клеток HEK293 с конститутивной экспрессией HLA-A*0201 (HEK-A2) для эффективного определения специфического ответа CTL. Специфическую активность CTL против клеток HEK-A2, трансфицированных геном полноразмерного DEPDC1, которые представляют собой специфическую модель для клеток-мишеней с экспрессией DEPDC1 и HLA-A2, тестировали с использованием полученных линий CTL, стимулированных DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL (SEQ ID NO:254)) или DEPDC1-A02-9-653 (CVLCCAEEV (SEQ ID NO:225)) в качестве эффекторных клеток. HEK-A2, трансфицированные экспрессирующим вектором Mock и HEK-A2, обученные несоответствующим пептидом, полученным из DEPDC1, получали для отрицательного контроля. Для полученных линий CTL показали специфическую активность CTL против HEK-A2, трансфицированных DEPDC1. С другой стороны, для линий CTL не показали значительной специфической активности CTL против HEK-A2, трансфицированных экспрессирующим вектором Mock и обученных пептидом DEPDC1-A02-9-674 или пептидом DEPDC1-A02-9-462 (Фиг.17). Это ясно показывает, что пептид DEPDC1-A02-10-296 и DEPDC1-A02-9-653 являлся естественным образом процессированным на поверхности клеток-мишеней с помощью молекулы HLA-A2 и узнаваемым CTL.

Анализ гомологии антигенных пептидов

Для CTL, полученных против пептидов по этому изобретению, показали сильную специфическую активность CTL. Это позволяет предполагать, что последовательности MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7), MPHOSPH1-A24-10-278 (SEQ ID NO:8), MPHOSPH1-A2-9-282 (SEQ ID NO:9), MPHOSPH1-A2-9-638 (SEQ ID NO:10), MPHOSPH1-A2-10-1714 (SEQ ID NO:11), DEPDC1-A24-9-294 (SEQ ID NO:12), DEPDC1-A2-9-589 (SEQ ID NO:192), DEPDC1-A2-9-619 (SEQ ID NO:195), DEPDC1-A2-9-290 (SEQ ID NO:197), DEPDC1-A2-9-563 (SEQ ID NO:209), DEPDC1-A2-9-653 (SEQ ID NO:225), DEPDC1-A2-10-674 (SEQ ID NO:228), DEPDC1-A2-10-302 (SEQ ID NO:230) DEPDC1-A02-10-644 (SEQ ID NO:240), DEPDC1-A02-10-575 (SEQ ID NO:241), DEPDC1-A02-10-506 (SEQ ID NO:243), DEPDC1-A02-10-765 (SEQ ID NO:244), DEPDC1-A02-10-395 (SEQ ID NO:249), DEPDC1-A02-10-224 (SEQ ID NO:253), DEPDC1-A02-9-297 (SEQ ID NO:226), DEPDC1-A02-10-296 (SEQ ID NO:254) и DEPDC1-A02-10-301 (SEQ ID NO:255) являются гомологичными пептидам, полученным из других молекул, которые, как известно, сенсибилизируют иммунную систему человека. Чтобы исключить эту возможность, проводили анализ гомологии с последовательностями пептидов в качестве запросов с использованием алгоритма BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi). Не выявили значительной гомологии последовательности.

Эти результаты позволяют предполагать, что последовательности MPHOSPH1-A24-9-278 (SEQ ID NO:7), MPHOSPH1-A24-10-278 (SEQ ID NO:8), MPHOSPH1-A2-9-282 (SEQ ID NO:9), MPHOSPH1-A2-9-638 (SEQ ID NO:10), MPHOSPH1-A2-10-1714 (SEQ ID NO:11), DEPDC1-A24-9-294 (SEQ ID NO:12), DEPDC1-A2-9-598 (SEQ ID NO:192), DEPDC1-A2-9-619 (SEQ ID NO:195), DEPDC1-A2-9-290 (SEQ ID NO:197), DEPDC1-A2-9-563 (SEQ ID NO:209), DEPDC1-A2-9-653 (SEQ ID NO:225), DEPDC1-A2-10-674 (SEQ ID NO:228), DEPDC1-A2-10-302 (SEQ ID NO:230) DEPDC1-A02-10-644 (SEQ ID NO:240), DEPDC1-A02-10-575 (SEQ ID NO:241), DEPDC1-A02-10-506 (SEQ ID NO:243), DEPDC1-A02-10-765 (SEQ ID NO:244), DEPDC1-A02-10-395 (SEQ ID NO:249), DEPDC1-A02-10-224 (SEQ ID NO:253), DEPDC1-A02-9-297 (SEQ ID NO:226), DEPDC1-A02-10-296 (SEQ ID NO:254) и DEPDC1-A02-10-301 (SEQ ID NO:255) являются уникальными и таким образом, обладают низким риском вызывать непредусмотренный иммунологический ответ на какую-либо неродственную молекулу.

ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация новых TAA, в частности, тех, которые индуцируют сильные и специфические иммунные ответы против опухолей, обеспечивает дальнейшее развитие клинического применения способов пептидной вакцинации при различных типах рака (Boon T. et al., (1996) J Exp Med 183: 725-9.; van der Bruggen P et al., (1991) Science 254: 1643-7.; Brichard V et al., (1993) J Exp Med 178: 489-95.; Kawakami Y et al., (1994) J Exp Med 180: 347-52.; Shichijo S et al., (1998) J Exp Med 187:277-88.; Chen YT et al., (1997) Proc.Natl.Acd. Sci. USA, 94: 1914-8.; Harris CC., (1996) J Natl Cancer Inst 88:1442-5.; Butterfield LH et al., (1999) Cancer Res 59:3134-42.; Vissers JL et al., (1999) Cancer Res 59: 5554-9.; van der Burg SH et al., (1996) J. Immunol 156:3308-14.; Tanaka F et al., (1997) Cancer Res 57:4465-8.; Fujie T et al., (1999) Int J Cancer 80:169-72.; Kikuchi M et al., (1999) Int J Cancer 81: 459-66.; Oiso M et al., (1999) Int J Cancer 81:387-94.).

Способы микрочипов кДНК позволяют описывать подробные характеристики экспрессии генов в злокачественных клетках (Lin YM, et al., Oncogene. 2002 Jun 13;21:4120-8.; Kitahara O, et al., Cancer Res. 2001 May 1;61:3544-9.; Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003 Nov 1;63:7038-41.; Ashida S, Cancer Res. 2004 Sep 1;64:5963-72.; Ochi K, et al., Int J Oncol. 2004 Mar;24(3):647-55.; Kaneta Y, et al., Int J Oncol. 2003 Sep;23:681-91.; Obama K, Hepatology. 2005 Jun;41:1339-48.; Kato T, et al., Cancer Res. 2005 Jul 1;65:5638-46.; Kitahara O, et al., Neoplasia. 2002 Jul-Aug;4:295-303.; Saito-Hisaminato A et al., ДНК Res 2002, 9: 35-45.) и находят применение для идентификации потенциальных TAA. Среди транскриптов, которые обладают повышенной регуляцией при различных видах рака, два новых гена человека, названные MPHOSPH1 и DEPDC1, соответственно, идентифицировали с использованием этих способов.

Как показано выше, MPHOSPH1 и DEPDC1, обладают повышенной экспрессией при различных видах рака, но обладают минимальной экспрессией в нормальных тканях. Кроме того, показано, что эти гены выполняют значительную функцию, связанную с пролиферацией клеток (см. PCT/JP2006/302684). Таким образом, пептиды, полученные из MPHOSPH1 и DEPDC1, могут служить эпитопами TAA, которые, в свою очередь, можно использовать для индукции значительных и специфических иммунных ответов против раковых клеток.

Таким образом, поскольку MPHOSPH1 и DEPDC1 представляют собой новые TAA, вакцины с использованием этих пептидов-эпитопов находят применение в качестве иммунотерапевтических средств против различных карцином или другого заболевания с экспрессией этих молекул.

ПРИМЕР 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пептиды и адъювант

Синтезированные пептиды квалификации GMP закупали из Neo Multi Peptide System (MPS) (San Diego, CA). В качестве адъюванта использовали неполный адъювант Фрейнда (IFA) (MONTANIDE *ISA51). 1 мг соответствующего пептида эмульгировали с 1 мг IFA.

Экспрессия антигена

Авторы настоящего изобретения проводили иммуногистохимический анализ. Опухолевые клетки или опухолевые ткани для нескольких видов рака мочевого пузыря, полученные в результате хирургической операции или биопсии, окрашивали каждым из специфических для MPHOSPH1 и DEPDC1 поликлональных антител. Способ окрашивания разработан в Human Genome Center, Institute for Medical Science, the University of Tokyo, как описано ранее (Kanehira M et al. Cancer Res.;67(7):3276-3285, 2007., Kanehira M et al. Oncogene. 2007 Apr 23; [электронная публикация до печати]). Тестирование экспрессии HLA-A*2402 проводили в SRL (Tachikawa, Japan).

Внесенные в список пациенты

Критерии внесения в список являлись следующими;

1. Пациенты с неоперабельным рецидивирующим раком мочевого пузыря, которых ранее лечили общепринятой химиотерапией, и это оказалось неудачным.

2. Пациенты с состоянием работоспособности 0 или 1 по японским критериям.

3. Пациенты в возрасте от 20 лет до 80 лет.

4. Пациенты с первичной опухолью или метастазированием, которые можно распознать проверкой изображения (CT/MRI) перед лечением, независимо от рекомендаций RECIST.

5. Пациенты через более чем 4 недели после предыдущего лечения (хирургии, химиотерапии, радиотерапии, термотерапии, другой иммунотерапии и т.д.).

6. Пациенты с предполагаемым более чем 3-месячным прогнозом.

7. Пациенты с функцией костного мозга (WBC более 2000, менее 15000, тромбоциты более 50000), функцией печени (GOT менее 150, GPT менее 150, T-bil менее 3,0), функцией почек (Cr менее 3,0).

8. Пациенты с HLA-A*2402.

9. Пациенты с опухолью с экспрессией MPHOSPH1 и/или DEPDC1.

Критерии исключения являлись следующими:

1. Пациенты с беременностью.

2. Пациенты с грудным вскармливанием.

3. Пациенты, желающие забеременеть.

4. Пациенты с неконтролируемой инфекцией.

5. Пациенты с необходимостью в следующих лекарственных средствах в период клинического испытания:

- системное введение стероида.

- системное введение иммунодепрессанта.

6. Пациенты, которых не предполагают вносить в список для этого испытания врач или ответственный исполнитель.

Протокол

Внесенных в список пациентов с раком мочевого пузыря с HLA-A*2402, опухоли которых экспрессируют фосфобелок 1 M-фазы (MPHOSPH1) и/или содержащий домен DEP 1 (DEPDC1), иммунизировали пептидами-эпитопами, рестриктированными по HLA-A*2402, MPHOSPH1-9-278 (IYNEYIYDL (SEQ ID NO:7)) и/или DEPDC1-9-294 (EYYELFVNI (SEQ ID NO:12)). Каждый пептид объединяли с 1 мл неполного адъюванта Фрейнда (IFA, MONTANIDE *ISA51) и подкожно инъецировали в аксиллярный или ингвинальный очаг раз в неделю. Инъекцию четыре раза определяли как один курс, затем после 1 курса, для иммунологической и клинической оценки, отбирали кровь и проводили CT/MRI.

Оценка безопасности

Оценку неблагоприятного эффекта проводили согласно общим критериям токсичности National Cancer Institute версии 3, (NCI-CTC ver.3).

Иммунологическая оценка

Оценка представляет собой одну из вторичных конечных точек в этом исследовании, и авторы настоящего изобретения подтверждают, возникает ли специфический для пептида ответ CTL или нет. Специфический ответ CTL измеряли следующим образом; Мононуклеарные клетки периферической крови собирали и повторно стимулировали соответствующими пептидами. Ответ CTL тестировали на 14-е сутки анализом ELISPOT IFN-g.

Оценка противоопухолевых эффектов

Оценку клинического ответа проводили согласно критериям RECIST.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В таблице 7 показано обобщение этого клинического испытания. Не присутствовало тяжелых неблагоприятных эффектов, за исключением экзантемы степени 2 в случае 3. Получен один незначительный ответ (случай 3) и один смешанный ответ (случай 4). Экспрессия MPHOSPH1 составляла 4 из 5 случаев, тогда как экспрессия DEPDC1 составляла 5 из 5 случаев, соответственно.

NT: не тестировали

Случай 2

В случае 2 женщину в возрасте 72 лет с сильно развитым раком мочевого пузыря при неудаче общепринятой химиотерапии внесли в список для этого клинического испытания. На фиг.18, экспрессия антигенов ее опухоли выявила сильную экспрессию и MPHOSPH1, и DEPDC1. Таким образом, авторы настоящего изобретения проводили вакцинацию двумя видами пептидов-эпитопов, полученных из MPHOSPH1 и DEPDC1. Случай 2 обладал местным рецидивом рака мочевого пузыря. Это оценивали как стабильное заболевание (SD) согласно критериям RECIST (Фиг.19).

Случай 3

В случае 3 мужчину в возрасте 49 с сильно развитым раком мочевого пузыря при неудаче общепринятой химиотерапии внесли в список для этого клинического испытания. Только DEPDC1 являлся сильно экспрессированным (Фиг.20). Таким образом, авторы настоящего изобретения проводили вакцинацию только пептидом-эпитопом, полученным из DEPDC1. Случай 3 обладал множественными метастазами рака мочевого пузыря в легких. Для метастазов в правой (Фиг.21) и левой (Фиг.22) долях легкого скорость прогрессирования снижалась после вакцинации. В частности, размер опухоли уменьшался после 3-го курса. На фиг.23 показан противоопухолевый эффект согласно критериям RECIST. Это ясно показывает, что скорость прогрессирования метастазирующей опухоли снижалась после вакцинации. Это показывает, что получен незначительный ответ при вакцинации с использованием пептида-эпитопа, полученного из DEPDC1. В отношении иммунологической оценки в случае 3, специфический ответ CTL измеряли до и после вакцинации. Показан сильный специфический ответ CTL после вакцинации (Фиг.24). Это ясно показывает, что CTL, индуцированные пептидом-эпитопом, полученным из DEPDC1, могут обладать противоопухолевым эффектом.

Случай 4

В случае 4, мужчину в возрасте 74 с сильно развитым раком мочевого пузыря при неудаче общепринятой химиотерапии внесли в список для этого клинического испытания. MPHOSPH1 и DEPDC1 экспрессировались из его опухоли (Фиг.25). Таким образом, авторы настоящего изобретения проводили вакцинацию двумя видами пептидов-эпитопов, полученных из MPHOSPH1 и DEPDC1. Случай 4 обладал местным рецидивом рака мочевого пузыря. После 1 курса вакцинации размер опухоли уменьшился на 20% согласно критериям RECIST (Фиг.26). Однако появились новые очаги метастазирования в легком. Это показывает, что получили смешанный ответ при вакцинации с использованием двух видов пептидов-эпитопов, полученных из MPHOSPH1 и DEPDC1.

ОБСУЖДЕНИЕ

Обоснование этого клинического испытания описано ниже:

1. Поскольку MPHOSPH1 и DEPDC1 не экспрессируются в нормальных тканях, за исключением семенников, оба антигена являются высокоопухолеспецифическими.

2. Считают, что эти пептиды обладают сильной иммуногенностью, поскольку активные и специфические CTL получены посредством этих пептидов-эпитопов.

3. Существует 60% японской популяции с HLA-A*2402.

4. Эти пептиды являются достаточно химически стабильными для применения в клиническом испытании.

Целью этого исследования является получение клинической информации о его токсичности, иммунологическом ответе и противоопухолевой активности.

Опубликованные ранее неблагоприятные эффекты клинического испытания вакцины с использованием пептидов представляют собой подобные лихорадке симптомы, такие как повышение температуры, головная боль и дискомфорт. В редких случаях опубликована радикальная кожная реакция с буллезным поражением, рассматриваемая как временная перекрестная реактивность в участке инъекции. В этом исследовании не присутствовало тяжелых неблагоприятных эффектов, за исключением экзантемы степени 2 в случае 3. Этот пациент обладал клинической историей проявления экзантемы во время химиотерапии. Это показывает, что этот неблагоприятный эффект не происходит от этой вакцинации, и таким образом, этот протокол может являться безопасным.

Иммунологический анализ проводили посредством специфической индукции CTL после вакцинации. В случае 1 специфического ответа CTL не получили после вакцинации (данные не представлены). В случае 3 специфический ответ CTL против полученного из DEPDC1 пептида ясно показали после 1-го и 2-го курса вакцинации. В случае 3 противоопухолевый эффект получили посредством вакцинации. Это ясно показывает, что этот полученный из DEPDC1 пептид обладает противоопухолевым эффектом против рака мочевого пузыря посредством индукции специфических CTL.

В случае 4 после только 1-го курса вакцинации ясно наблюдали противоопухолевый эффект против местного рецидива рака мочевого пузыря. Это доказательство сильно поддерживает то, что эти пептиды-эпитопы обладают противоопухолевым эффектом против рака мочевого пузыря.

В заключение, было ясно показано, что эта терапия эпитопами являлась безопасной, и более того, обладала сильным противоопухолевым эффектом без тяжелых неблагоприятных эффектов.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

По настоящему изобретению идентифицировали новые TAA, в частности, те, что индуцируют сильные и специфические иммунные ответы против опухолей. Такие TAA обеспечивают дальнейшее развитие в качестве пептидных вакцин против заболеваний, связанных с MPHOSPH1 и/или DEPDC1, например рака.

Содержание всех патентов, патентных заявок и публикаций, процитированных в настоящем описании, приведено в качестве ссылки.

В то время как изобретение описано подробно и в отношении его конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что предшествующее описание является примерным и объясняющим по природе, и предназначено для иллюстрации изобретения и предпочтительных вариантов его осуществления. Посредством общепринятых экспериментов специалисту в данной области совершенно понятно, что в настоящем описании можно выполнять различные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема изобретения. Таким образом, предполагают, что изобретение определено не посредством приведенного выше описания, а посредством следующих пунктов формулы изобретения и их эквивалентов.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к выделенному декапептиду или нонапептиду, способному индуцировать цитотоксические Т-клетки, а также к данным пептидам, в которых 1 аминокислота заменена, к полинуклеотиду, который кодирует данные пептиды, к фармацевтической композиции и вакцине, которые включают данные пептиды, способу индукции антиген-презентирующих клеток, способу индукции цитотоксических Т-клеток, выделенной цитотоксической CD8+Т-клетке, дендритной клетке, индуцирующей CTL и способу лечения заболевания, связанного с повышенной экспрессией генов SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5. Выделенный декапептид или нонапептид, способный индуцировать цитотоксические Т-клетки, содержит аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 12, 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 253, 254 и 255. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с повышенной экспрессией генов SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5 содержит один или несколько вышеуказанных пептидов и фармацевтически приемлемый носитель. Способ лечения заболевания, связанного с повышенной экспрессией генов SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5, у индивида, включает введение указанному индивиду вакцины, содержащей один или несколько вышеуказанных пептидов. Предложенное изобретение позволяет получать пептиды, которые используются при лечении заболевания, связанного с повышенной экспрессией генов SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5, например рака. 11 н. и 11 з.п. ф-лы, 26 ил., 7 табл., 2 пр.

1. Выделенный декапептид или нонапептид, способный индуцировать цитотоксические Т-клетки, содержащий аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 12, 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 253, 254 и 255.

2. Выделенный пептид, способный индуцировать цитотоксические Т-клетки, где указанный пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8 и 12, в которой 1 аминокислота заменена.

3. Пептид, способный индуцировать цитотоксические Т-клетки, по п.2, где вторая аминокислота от N-конца представляет собой фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан.

4. Пептид, способный индуцировать цитотоксические Т-клетки, по п.2, где С-концевая аминокислота представляет собой фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин.

5. Выделенный пептид, способный индуцировать цитотоксические Т-клетки, где указанный пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 10, 11, 192, 195, 197, 209, 225, 226, 228, 230, 240, 241, 243, 244, 253, 254 и 255, в которой 1 аминокислота заменена.

6. Пептид, способный индуцировать цитотоксические Т-клетки, по п.5, где вторая аминокислота от N-конца представляет собой лейцин или метионин.

7. Пептид, способный индуцировать цитотоксические Т-клетки, по п.5, где С-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин.

8. Полинуклеотид, кодирующий пептиды по любому из пп.1-7.

9. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с повышенной экспрессией генов SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5, где указанная композиция содержит один или несколько пептидов по пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Фармацевтическая композиция по п.9, где заболеванием является рак.

11. Фармацевтическая композиция по п.10, где рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, карциномы почек, SCLC и опухоли мягких тканей.

12. Способ индукции антиген-презентирующих клеток, обладающий высокой способностью индуцировать цитотоксические Т-клетки, включающий стадию приведения в контакт антиген-презентирующей клетки с пептидом по пп.1-7.

13. Способ индукции цитотоксических Т-клеток посредством приведения в контакт антиген-презентирующей клетки с пептидом по любому из пп.1-7 и смешивания антиген-презентирующей клетки с CD8+ Т-клетками, одновременно культивируя их.

14. Выделенная цитотоксическая CD8+ Т-клетка, вызывающая гибель опухолевых клеток, экспрессирующих гены SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5, которую индуцируют in vitro способом по п.13.

15. Дендритная клетка, индуцирующая CTL, индуцированная in vitro способом по п.12.

16. Вакцина для ингибирования пролиферации клеток, экспрессирующих гены SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5, где вакцина содержит пептид по любому из пп.1 -7 в качестве активного ингредиента.

17. Вакцина по п.16, где клетка представляет собой раковую клетку.

18. Вакцина по п.17, где рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, карциномы почек, SCLC и опухоли мягких тканей.

19. Вакцина по любому из пп.16-18, предназначенная для введения индивиду, антиген HLA которого представляет собой HLA-A24 или HLA-A2.

20. Способ лечения заболевания, связанного с повышенной экспрессией генов SEQ ID NO: 1, 3 и/или 5, у индивида, включающий введение указанному индивиду вакцины, содержащей один или несколько пептидов по пп.1-7.

21. Способ по п.20, где заболевание представляет собой рак.

22. Способ по п.21, где рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака предстательной железы, карциномы почек, SCLC и опухоли мягких тканей.