ПЕПТИДЫ HJURP И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ВАКЦИНЫ Российский патент 2015 года по МПК C07K7/00 C07K16/00 C12N15/11 C12N15/63 C12N5/783 C12N5/784 A61K38/00 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Данное изобретение относится к области биологической науки, более конкретно, к области терапии рака. В частности, данное изобретение относится к новым пептидам, которые являются чрезвычайно эффективными в качестве противораковых вакцин, а также лекарственным средствам для лечения и предотвращения опухолей.

[0002] Приоритет

Данная заявка испрашивает приоритет предварительных заявок на патент США № 61/312931, поданная 11 марта 2010 года, и № 61/315320, поданная 18 марта 2010 года, содержание которых включено здесь посредством ссылки в полном виде для всех целей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Было продемонстрировано, что CD8-положительные CTL распознают эпитопные пептиды, произведенные из опухолеспецифических антигенов (TAA), обнаруживаемых на молекулах главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, и затем убивают эти опухолевые клетки. Со времени открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) в качестве первого примера TAA, были обнаружены многие другие TAA посредством иммунологических подходов (NPL 1, Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; NPL 2, Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих TAA в настоящее время подвергаются клинической разработке в качестве иммунотерапевтических мишеней.

[0004] Подходящие TAA являются незаменимыми для пролиферации и выживания раковых клеток. Применение таких TAA в качестве мишеней для иммунотерапии может минимизировать хорошо описанный риск ускользания от (механизмов) иммунологического надзора раковых клеток, приписываемый делеции, мутации или понижающей регуляции ТАА, в качестве последствия терапевтически запускаемой иммунной селекции. Таким образом, продолжающаяся идентификация новых TAA, способных индуцировать сильные и специфические противоопухолевые иммунные реакции, гарантирует дальнейшее развитие клинического исследования стратегий пептидной вакцинации для различных типов рака (NPL 3, Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4, Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5, Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; NPL 6, van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; NPL 7, Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; NPL 8, Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9, Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10, Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). К настоящему времени имелось несколько сообщений о клинических исследованиях с использованием этих полученных из опухолеспецифического антигена пептидов. К сожалению, многие из существующих противораковых вакцин показали только низкий реальный уровень реакции (NPL 11, Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; NPL 12, Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; NPL 13, Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15). Таким образом, остается потребность в идентификации новых TAA в качестве иммунотерапевтических мишеней.

[0005] HJURP (ссылочная последовательность показана в GenBank Accession No: NM_018410), распознающий структуру Холлидея белок, идентифицировали из анализа профиля экспрессии генов в размере генома немелкоклеточного рака легкого с использованием кДНК-микроэррея (кДНК-микрочипа), содержащего 27648 генов, (NPL 14, Kato T et al., Cancer Res. 2007 Sep 15; 67(18):8544-53). HJURP участвует в процессе репарации пути гомологичной рекомбинации в DSB (разрыве двухцепочечной ДНК) через взаимодействие с hMSH5 (гомологом 5 MutS человека) и NBS1 (белком 1 синдрома Nijmegen 1), который является частью комплекса MRN-белок. Обработка раковых клеток малой интерферирующей РНК (siRNA) против HJURP вызывала аномальные хромосомные слияния и приводила к нестабильности и старению генома. Кроме того, сверхэкспрессию HJURP наблюдали в большинстве клеток рака легкого человека (PTL 1, WO2004/031413). Взятые вместе, эти данные предполагают, что HJURP может быть применим для мишени противораковой иммунотерапии в отношении пациента.

СПИСОК ЦИТИРОВАНИЯ

Патентная литература

[0006] [PTL 1] WO2004/031413

Непатентная литература

[0007] [NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

[NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3):725-9

[NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55

[NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13):3134-42

[NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9

[NPL 6] van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9):3308-14

[NPL 7] Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

[NPL 8] Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

[NPL 9] Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66

[NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94

[NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

[NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

[NPL 13] Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

[NPL 14] Kato T. et al., Cancer Res, 2007 Sep 15; 67(18):8544-53

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Данное изобретение основано отчасти на обнаружении подходящих мишеней иммунотерапии. Поскольку ТАА обычно воспринимаются иммунной системой как "свое" и, следовательно, часто не имеют природной иммуногенности, обнаружение подходящих мишеней является крайне важным. Принимая во внимание то, что HJURP (SEQ ID NO:50), обычно кодируемый геном GenBank Accession No. NM_018410 (SEQ ID NO:49), был идентифицирован в качестве активируемого в типах рака, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, острый миелоидный лейкоз (AML), рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, хронический миелоидный лейкоз (CML), колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, мелкоклеточный рак легкого (SCLC), опухоль мягкой ткани и опухоль яичка, данное изобретение нацелено на HJURP в качестве кандидата для мишени противораковой/противоопухолевой иммунотерапии, более конкретно на новые эпитопные пептиды HJURP, которые могут служить в качестве подходящих иммунотерапевтических мишеней.

[0009] Для этой цели данное изобретение направлено, по меньшей мере отчасти, на идентификацию специфических эпитопных пептидов среди продуктов гена HJURP, которые имеют способность индуцировать CTL, специфические в отношении HJURP. Как описано подробно ниже, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные из здорового донора, стимулировали с использованием HLA-A*2402- или HLA-A*0201-связывающих кандидатных пептидов, произведенных из HJURP. Затем были установлены CTL-линии, со специфической цитотоксичностью против HLA-A24- или HLA-A2-положительных клеток-мишеней, импульсно обработанных каждым из кандидатных пептидов. Приведенные здесь результаты демонстрируют, что эти пептиды являются HLA-A24- или HLA-A2-рестриктированными эпитопными пептидами, которые могут индуцировать сильные и специфические иммунные реакции против экспрессирующих HJURP клеток. Эти результаты дополнительно демонстрируют, что HJURP является сильно иммуногенным и что его эпитопы являются эффективными мишенями для противораковой/противоопухолевой иммунотерапии.

[0010] Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение выделенных пептидов, связывающихся с HLA-антигеном, полученных из HJURP (SEQ ID NO:50), и его иммунологически активных фрагментов. Ожидается, что такие пептиды имеют CTL-индуцибельность и, следовательно, могут быть использованы для индукции CTL ex vivo или для введения субъекту индуцирования иммунных реакций против типов рака, примеры которых включают в себя, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка. Предпочтительные пептиды являются нонапептидами или декапептидами и, более предпочтительно, нонапептидом или декапептидом, имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-24 и 26-48. Пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:3, 4, 7, 18, 23, 26, 27, 30, 31, 32, 35, 37, 38 и 43, обнаруживали сильную CTL-индуцибельность и, следовательно, являются особенно предпочтительными.

Данное изобретение рассматривает также модифицированные пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-24 и 26-48, где одна, две или более аминокислот являются замещенными, делетированными или добавленными, пока эти модифицированные пептиды сохраняют требуемую исходную CTL-индуцибельность.

Данное изобретение включает в себя дополнительно полинуклеотиды, кодирующие любые пептиды данного изобретения. Эти полинуклеотиды могут быть использованы для индукции или получения APC с CTL-индуцибельностью или, подобно вышеописанным пептидам данного изобретения, могут вводиться субъекту индуцирования иммунных реакций против рака.

[0011] При введении субъекту данные пептиды презентируются на поверхности APC для индукции нацеливания CTL на соответствующие пептиды. Таким образом, одним предметом данного изобретения является обеспечение агентов, композиций или веществ, которые содержат или включают в себя любые пептиды или полинуклеотиды данного изобретения, для индукции CTL. Такие агенты, композиции и/или вещества могут быть использованы для лечения и/или профилактики, и/или послеоперационного рецидива рака, примеры которого включают в себя, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка. Таким образом, еще одним предметом данного изобретения является обеспечение фармацевтических агентов, композиций или веществ для лечения и/или профилактики, и/или предотвращения послеоперационного рецидива рака, которые содержат или включают в себя любые пептиды или полинуклеотиды данного изобретения. Вместо презентирования пептидов или полинуклеотидов, или наряду с презентированием пептидов или полинуклеотидов, эти фармацевтические агенты, композиции или вещества данного изобретения могут включать в себя в качестве активных ингредиентов APC или экзосомы, которые презентируют любой из этих пептидов.

[0012] Пептиды или полинуклеотиды данного изобретения могут быть использованы для индукции APC, которые присутствуют на поверхности комплекса HLA-антигена и этого пептида, например, контактированием APC, полученных из субъекта, с пептидом или введением полинуклеотида, кодирующего пептид этого изобретения, в APC. Такие APC имеют высокую CTL-индуцибельность против пептидов-мишеней и находят применение в противораковой иммунотерапии. Таким образом, данное изобретение включает в себя способы индукции APC с CTL-индуцибельностью, а также APC, полученные такими способами.

[0013] Следующим предметом данного изобретения является обеспечение способа индукции CTL, причем такие способы предусматривают стадию сокультивирования CD8-положительных клеток с APC или экзосомами, презентирующими пептид данного изобретения на их поверхности, или стадию введения гена, который включает в себя полинуклеотид, кодирующий полипептид субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR), связывающегося с данным пептидом. CTL, полученные такими способами, находят применение в лечении и/или предотвращении рака, примеры которого включают в себя, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка. Таким образом, еще одним предметом данного изобретения является обеспечение CTL, полученных этими способами.

[0014] Еще одним предметом данного изобретения является обеспечение способов индуцирования иммунной реакции против рака в субъекте, нуждающемся в этом, причем такие способы предусматривают стадию введения композиций или веществ, включающих в себя полипептиды HJURP или их иммунологически активные фрагменты, полинуклеотиды, кодирующие полипептиды HJURP, экзосомы или APC, презентирующие полипептиды HJURP.

[0015] Применимость данного изобретения простирается до любого из ряда заболеваний, связанных со сверхэкспрессией HJURP или возникающих из сверхэкспрессии HJURP, таких как рак, примеры которого включают в себя, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка.

[0016] Более конкретно, данное изобретение обеспечивает следующее:

[1] выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50 или ее иммунологически активного фрагмента, где указанный пептид связывает HLA-антиген и имеет индуцибельность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL);

[2] выделенный пептид по [1], где HLA-антиген представляет собой HLA-A24;

[3] выделенный пептид по [1], где HLA-антиген представляет собой HLA-A2;

[4] выделенный пептид по [1] или [2], где указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-24;

[5] выделенный пептид по [1] или [3], где указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:26-48;

[6] выделенный пептид, выбранный из группы, состоящей из:

(a) выделенного пептида, который связывается с HLA-антигеном, имеет индуцибельность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50 или ее иммунологически активного фрагмента,

(b) выделенного пептида по (a), где HLA-антиген представляет собой HLA-A24,

(c) выделенного пептида по (a) или (b), который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-24, и

(d) выделенного пептида по (a) или (b), где указанный пептид содержит модифицированный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-24, где 1, 2 или несколько аминокислот замещены, делетированы или добавлены, при условии, что указанный модифицированный пептид сохраняет CTL-индуцибельность исходного пептида;

[7] выделенный пептид, выбранный из группы, состоящей из:

(a) выделенного пептида, связывающегося с HLA-антигеном и имеющего индуцибельность цитотоксического Т-лимфоцита (CTL), где этот пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50 или ее иммунологически активного фрагмента,

(b) выделенного пептида по (a), где HLA-антиген представляет собой HLA-A2,

(c) выделенного пептида по (a) или (b), который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:26-48, и

(d) выделенного пептида по (a) или (b), где указанный пептид содержит модифицированный пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:26-48, где 1, 2 или несколько аминокислот замещены, делетированы или добавлены, при условии, что указанный модифицированный пептид сохраняет CTL-индуцибельность исходного пептида;

[8] Выделенный пептид по [6], который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-24, где этот пептид имеет одну или обе из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота от N-конца выбрана из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана; и

(b) C-концевая аминокислота выбрана из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина;

[9] выделенный пептид по [7], который состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:26-48, где этот пептид имеет одну или обе их следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота от N-конца выбрана из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана, и

(b) C-концевая аминокислота выбрана из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина;

[10] выделенный пептид по любому из [1]-[9], где указанный пептид представляет собой нонапептид или декапептид;

[11] выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из [1]-[10];

[12] композиция индуцирования CTL, где эта композиция содержит один или более пептидов по любому из [1]-[10] или один или более полинуклеотидов по [11];

[13] фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака и/или предотвращения его послеоперационного рецидива, где эта композиция содержит один или более пептидов по любому из [1]-[10] или один или более полинуклеотидов по [11];

[14] фармацевтическая композиция по [13], где указанная композиция приготовлена для введения субъекту, HLA-антиген которого представляет собой HLA-A24;

[15] фармацевтическая композиция по [13], где указанная композиция приготовлена для введения субъекту, HLA-антиген которого представляет собой HLA-A2;

[16] фармацевтическая композиция по [13]-[15], где указанная композиция приготовлена для лечения рака;

[17] способ индуцирования антигенпрезентирующей клетки (APC) с CTL-индуцибельностью, предусматривающий стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(a) приведения APC в контакт с пептидом по любому из [1]-[10] in vitro, ex vivo или in vivo, и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид по любому из [1]-[10], в APC;

[18] способ индуцирования CTL способом, который предусматривает стадию, выбранную из группы, состоящей из:

(a) сокультивирования CD8-положительных T-клеток с APC, которые присутствуют на поверхности комплекса HLA-антигена и пептида по любому из [1]-[10],

(b) сокультивирования CD8-положительных T-клеток с экзосомами, которые презентируют на поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из [1]-[10], и

(c) введения гена, который содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR), связанный с пептидом по любому из [1]-[10], в Т-клетку;

[19] выделенная APC, которая презентирует на ее поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из [1]-[10];

[20] APC по [19], которая индуцирована способом по [17];

[21] выделенный CTL, мишенью которого является любой из пептидов [1]-[10];

[22] CTL по [21], индуцированный способом по [18];

[23] способ индуцирования иммунного ответа против рака у субъекта, нуждающемся в этом, предусматривающий стадию введения этому субъекту композиции, содержащей пептид по [1]-[10], его иммунологически активный фрагмент, или полинуклеотид, кодирующий этот пептид или этот фрагмент;

[24] антитело или его иммунологически активный фрагмент против любого из пептидов по [1]-[10];

[25] вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из пептидов по [1]-[10];

[26] диагностический набор, содержащий любой из пептидов по [1]-[10], нуклеотид по [1] или антитело по [24];

[27] выделенный пептид по любому из [1], [2], [4], [6], [8] и [10], где этот пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:3, 4, 7, 18 и 23;

[28] выделенный пептид по любому из [1], [3], [5], [7], [9] и [10], где этот пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:26, 27, 30, 31, 32, 35, 37, 38 и 43;

[29] экзосома, которая презентирует комплекс, содержащий любой из пептидов по [1]-[10] и HLA-антиген; и

[30] клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная экспрессирующим вектором по [25].

[0017] Должно быть понятно, что как предыдущий раздел «Сущность изобретения», так и последующий раздел «Подробное описание» является иллюстративными вариантами и не ограничивают это изобретение или другие, альтернативные варианты осуществления этого изобретения. Наряду с описанным выше, другие предметы и признаки этого изобретения будут более понятными при чтении следующего подробного описания вместе с сопутствующими фигурами и примерами. Однако, должно быть понятно, что как предыдущий раздел «Сущность изобретения», так и последующий раздел «Подробное описание» является иллюстративными вариантами и не ограничивают это изобретение или другие, альтернативные варианты осуществления этого изобретения. В частности, хотя это изобретение описано здесь со ссылкой на ряд конкретных вариантов, должно быть понятно, что это описание является иллюстративным для этого описания и не рассматривается как ограничивающее это изобретение. Различные модификации и применения могут приходить на ум квалифицированным в данной области специалистам, без отклонения от сущности и объема этого изобретения, описанного прилагаемой формулой изобретения. Подобным образом, другие цели, признаки, эффекты и преимущества данного изобретения будут очевидными из раздела «Сущность изобретения» и некоторых описанных ниже вариантов осуществления и будут вполне очевидными для квалифицированных в данной области специалистов. Такие цели, признаки, эффекты и преимущества будут очевидными из вышеописанного вместе с сопутствующими примерами, данными, фигурами и всеми обоснованными выводами, сделанными из них, отдельно или с учетом включенных здесь ссылок.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0018] Различные аспекты и применения данного изобретения станут очевидными квалифицированному в данной области специалисту после рассмотрения краткого описания фигур и подробного описания данного изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, которые следуют далее.

[0019] Фиг.1 состоит из ряда фотографий, (a)-(f), изображающих результаты анализа IFN-гамма ELISPOT на CTL, которые были индуцированы пептидами, произведенными из HJURP. CTL в лунке № 4, стимулированные HJURP-A24-9-28 (SEQ ID NO:3) (a), в № 4 HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4) (b), в № 4 HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7) (c), в № 6 HJURP-A24-10-383 (SEQ ID NO:18) (d) и в № 4 HJURP-A24-10-162 (SEQ ID NO:23) (e), показали сильное продуцирование IFN-гамма в сравнении с контролем, соответственно. Квадрат на лунке этих изображений указывает на то, что клетки из соответствующей лунки размножались с установлением линий CTL. В отличие от этого, как это является типичным для отрицательных данных, не детектировали специфического продуцирования IFN-гамма из CTL, стимулированных HJURP-A24-9-149 (SEQ ID NO:1), против импульсно обработанных пептидом клеток-мишеней (f). Квадрат на лунке этих изображений указывает на то, что клетки из соответствующей лунки размножались с установлением линий CTL. На этих фигурах "+" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующим пептидом, и "-" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанных импульсно никакими пептидами.

[0020] Фиг.2 состоит из ряда линейных графиков, (a) и (b), изображающих результаты анализа IFN-гамма ELISA на CTL, которая, в свою очередь, демонстрирует продуцирование IFN-гамма CTL-линий, стимулированное HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4) (a) и HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7) (b). Эти результаты демонстрируют, что CTL-линии, установленные стимуляцией каждым пептидом, обнаруживают сильное продуцирование IFN-гамма в сравнении с контролем. На этих фигурах, "+" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующим пептидом, и "-" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанных импульсно никакими пептидами.

[0021] Фиг.3 является линейным графиком, изображающим продуцирование IFN-гамма CTL-клона, установленного лимитирующим разведением из CTL-линии, стимулированной HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7). Эти результаты демонстрируют, что CTL-клон, установленный стимуляцией HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7), обнаруживает сильное продуцирование IFN-гамма в сравнении с контролем. На этой фигуре "+" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующим пептидом, и "-" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанными импульсно никакими пептидами.

[0022] Фиг.4 состоит из ряда линейных графиков, (a) и (b), изображающих специфическую CTL-активность против клеток-мишеней, которые экзогенно экспрессируют HJURP и HLA-A*2402. В качестве контролей готовили COS7-клетки, трансфицированные HLA-A*2402, или полноразмерный ген HJURP. Эта CTL-линия, установленная с HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7) (a) и HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4) (b), обнаруживала специфическую CTL-активность против COS7-клеток, трансфицированных как HJURP, так и HLA-A*2402 (черный ромб). С другой стороны, не детектировали значимо специфической CTL-активности против клеток-мишеней, экспрессирующих либо HLA-A*2402 (треугольник), либо HJURP (кружок).

[0023] Фиг.5-1 состоит из ряда фотографий, (a)-(i), изображающих результаты анализов IFN-гамма ELISPOT на CTL, которые индуцировали пептидами, произведенными из HJURP. CTL в лунке № 4, стимулированные HJURP-A02-9-496 (SEQ ID NO:26) (a), в № 2 HJURP-A02-9-354 (SEQ ID NO:27) (b), в № 4 HJURP-A02-9-406 (SEQ ID NO:30) (c), в № 5 HJURP-A02-9-129 (SEQ ID NO:31) (d), в № 3 HJURP-A02-9-599 (SEQ ID NO:32) (e) и в № 1 HJURP-A02-9-386 (SEQ ID NO:35) (f), показывали сильное продуцирование IFN-гамма в сравнении с контролем, соответственно. Квадрат на лунке этих изображений указывает на то, что клетки из соответствующей лунки размножались с установлением линий CTL. В отличие от этого, как это является типичным для отрицательных данных, не детектировали специфического продуцирования IFN-гамма из CTL, стимулированных HJURP-A02-9-150 (SEQ ID NO:25) (j). На этих фигурах "+" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующим пептидом, и "-" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанных импульсно никакими пептидами.

[0024] Фиг.5-2 состоит из ряда фотографий, (a)-(i), изображающих результаты анализов IFN-гамма ELISPOT на CTL, которые индуцировали пептидами, произведенными из HJURP. CTL в № 5 с HJURP-A02-10-405 (SEQ ID NO:37) (g), в № 3 с HJURP-A02-10-128 (SEQ ID NO:38) (h) и в № 6 с HJURP-A02-10-54 (SEQ ID NO:43) (i) показывали сильное продуцирование IFN-гамма в сравнении с контролем, соответственно. Квадрат на лунке этих изображений указывает на то, что клетки из соответствующей лунки размножались с установлением линий CTL. В отличие от этого, как это является типичным для отрицательных данных, не детектировали специфического продуцирования IFN-гамма из CTL, стимулированных HJURP-A02-9-150 (SEQ ID NO:25) (j). На этих фигурах "+" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующим пептидом, и "-" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанных импульсно никакими пептидами.

[0025] Фиг.6 составлена из ряда линейных графиков, (a)-(e), изображающих результаты анализа IFN-гамма ELISA, демонстрирующие продуцирование IFN-гамма CTL-линиями, стимулированными HJURP-A02-9-496 (SEQ ID NO:26) (a), HJURP-A02-9-406 (SEQ ID NO:30) (b), HJURP-A02-9-129 (SEQ ID NO:31) (c), HJURP-A02-10-405 (SEQ ID NO:37) (d) и HJURP-A02-10-128 (SEQ ID NO:38) (e). Эти результаты демонстрируют, что CTL-линии, установленные стимуляцией каждым пептидом, обнаруживают сильное продуцирование IFN-гамма в сравнении с контролем. На этих фигурах "+" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующим пептидом, и "-" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанных импульсно никакими пептидами.

[0026] Фиг.7 составлена из ряда линейных графиков, (a)-(d), изображающих продуцирование IFN-гамма CTL-клонами, установленными лимитирующим разведением из CTL-линий, стимулированных HJURP-A02-9-406 (SEQ ID NO:30) (a), HJURP-A02-9-129 (SEQ ID NO:31) (b), HJURP-A02-10-405 (SEQ ID NO:37) (c) и HJURP-A02-10-128 (SEQ ID NO:38) (d). Эти результаты демонстрируют, что CTL-клоны, установленные стимуляцией каждым пептидом, обнаруживали сильное продуцирование IFN-гамма в сравнении с контролем. На этой фигуре, "+" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующим пептидом, и "-" показывает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не обработанными импульсно никакими пептидами.

[0027] Фиг.8 составлена из ряда линейных графиков, изображающих специфическую CTL-активность в сравнении с клетками-мишенями, которые экзогенно экспрессируют HJURP и HLA-A*0201. В качестве контролей готовили COS7-клетки, трансфицированные HLA-A*0201, или полноразмерный ген HJURP. CTL-клон, установленный с HJURP-A02-10-128 (SEQ ID NO:38), обнаруживал специфическую CTL-активность против с COS7-клеток, трансфицированных как HJURP, так и HLA-A*0201 (черный ромб). С другой стороны, не детектировали значимо специфической CTL-активности против клеток-мишеней, экспрессирующих либо HLA-A*0201 (треугольник), либо HJURP (кружок).

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0028] Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным здесь, могут быть использованы в практике или тестировании вариантов осуществления данного изобретения, теперь описываются предпочтительные материалы, способы и устройства. Однако, перед описанием этих материалов и способов должно быть понятно, что эти описания являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения. Должно быть также понятно, что данное изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными размерами, формами, размерностями, методологиями, протоколами и т.д., так как они могут варьироваться в соответствии с рутинным экспериментированием и оптимизацией. Должно быть также понятно, что терминология, используемая в этом описании, предназначена только для цели описания конкретных версий или вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.

[0029] Раскрытие каждой публикации, патента или заявки на патент, упоминаемых в этом описании изобретения, специально включено здесь посредством ссылки в полном виде. Однако, ничто здесь не должно пониматься как признание того, что это изобретение не дает права на датирование задним числом такого раскрытия на основании предыдущего изобретения.

Если нет другого определения, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, что и значение, обычно понимаемое специалистом, квалифицированным в области, к которой принадлежит данное изобретение. В случае противоречия, данное описание изобретения, в том числе определения, будут служить контролем. Кроме того, эти материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

[0030] I. Определения

Слова, упоминаемые в настоящем описании в единственном числе, обозначают в данном контексте "по меньшей мере один", если нет других указаний.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на полимер аминокислотных остатков. Эти термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков являются модифицированным остатком или не встречающимся в природе остатком, таким как искусственный химический миметик соответствующей природно-встречающейся аминокислоты, а также к природно-встречающимся аминокислотным полимерам.

[0031] Термин "олигопептид", используемый иногда в этом описании изобретения, используется для ссылки на пептид, который имеет длину 20 остатков или менее, обычно 15 остатков или менее и обычно состоит из приблизительно 8 - приблизительно 11 остатков, часто из 9 или 10 остатков.

Термин "аминокислота" в данном контексте относится к природно-встречающимся и синтетическим аминокислотам, а также аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые имеют функцию, сходную с функцией природно-встречающихся аминокислот. Природно-встречающимися аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и О-фосфосерин). Фраза "аналог аминокислот" относится к соединениям, которые имеют одну и ту же базовую химическую структуру (альфа-углерод, связанный с водородом, карбоксигруппа, аминогруппа и R-группа), что и природно-встречающаяся аминокислота, но имеют модифицированную R-группу или модифицированные скелеты макромолекулы (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионинметилсульфоний). Фраза "аминокислотный миметик" относится к химическим соединениям, которые имеют различные структуры, но сходные функции с обычными аминокислотами.

Аминокислоты могут называться здесь их обычно известными трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендуемыми IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

[0032] Термины "ген", "полинуклеотиды", "нуклеотиды" и "нуклеиновые кислоты" используются здесь взаимозаменяемо, если нет других указаний, и подобно аминокислотам, называются их общепринятыми однобуквенными кодами.

Термины "агент", "вещество" и "композиция" используются здесь взаимозаменяемо в отношении продукта, включающего в себя указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любого продукта, который происходит, прямо или косвенно, из комбинации указанных ингредиентов в указанных количествах. Такие термины в отношении определения "фармацевтические" предназначены для включения в себя продукта, в том числе активного ингредиента (активных ингредиентов), и любого инертного ингредиента (инертных ингредиентов), которые составляют этот носитель, а также любого продукта, который происходит, прямо или косвенно, из объединения, комплексообразования или агрегации любых двух или нескольких из этих ингредиентов, или диссоциации одного или нескольких из этих ингредиентов, или из других типов реакций или взаимодействий одного или нескольких из этих ингредиентов. Таким образом, в контексте данного изобретения, термины "фармацевтический агент" и "фармацевтическая композиция" используются взаимозаменяемо в отношении любого агента, вещества или композиции, приготовленных смешиванием продукта данного изобретения и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя.

[0033] Фраза "фармацевтически приемлемый носитель" или "физиологически приемлемый носитель", обозначает в данном контексте фармацевтически или фармакологически приемлемый материал, композицию, вещество или носитель, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующий в несении или транспорте удерживаемых субъектом полифармакофоров из одного органа, или части тела, в другой орган, или в другую часть тела.

Фармацевтические агенты или композиции этого изобретения находят особое применение в качестве вакцин. В контексте данного изобретения, фраза "вакцина" (также называемая "иммуногенной композицией") относится к веществу, которое имеет функцию индуцирования противоопухолевого иммунитета после инокуляции в животных.

[0034] Если нет других указаний, термин "рак" относится к типам рака, сверхэкспрессирующим ген HJURP, примеры которых включают в себя, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка.

Если нет других указаний, термины "цитотоксический Т-лимфоцит", "цитотоксическая Т-клетка" и "CTL" используются здесь взаимозаменяемо и, если не оговорено иное, относятся к подгруппе Т-лимфоцитов, которые способны распознавать не-свои клетки (например, опухолевые клетки, инфицированные вирусом клетки) и индуцировать смерть таких клеток.

[0035] Если нет других указаний, термин "HLA-A24" относится к типу HLA-A24, содержащему подтипы, примеры которых включают в себя, но не ограничиваются ими, HLA-A*2401, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2404, HLA-A*2407, HLA-A*2408, HLA-A*2420, HLA-A*2425 и HLA-A*2488.

Если нет других указаний, термин "HLA-A2", в данном контексте, относится репрезентативно к подтипам, примеры которых включают в себя, но не ограничиваются ими, HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219, HLA-A*0228 и HLA-A*0250.

Если нет других указаний, термин "набор" используется в данном контексте в отношении комбинации реагентов и других материалов. Здесь обсуждается, что этот набор может включать в себя микроэррей (микрочип) чип, маркер и т.д. У авторов нет намерения ограничения термина "набор" конкретной комбинацией реагентов и/или материалов.

[0036] При применении здесь, в контексте субъекта или пациента, фраза "HLA-A2-положительный" означает, что этот субъект или пациент гомозиготно или гетерозиготно имеет ген HLA-A2-антигена, и HLA-A2-антиген экспрессируется в клетках этого субъекта или пациента в виде HLA-антигена.

Подобным образом, при применении здесь, в контексте субъекта или пациента, фраза "HLA-A24-положительный" означает также, что этот субъект или пациент гомозиготно или гетерозиготно имеет ген HLA-A24-антигена, и HLA-A24-антиген экспрессируется в клетках этого субъекта или пациента в виде HLA-антигена.

[0037] В той степени, в которой способы и композиции этого изобретения находят применение в контексте "лечения" рака, лечение считается "эффективным", если оно приводит к клинической эффективности, такой как уменьшение экспрессии гена HJURP или уменьшение в размере, распространенности или метастатическом потенциале рака в этом субъекте. При профилактическом применении лечения, "эффективное" означает, что это лечение задерживает или предотвращает образование рака или предотвращает или облегчает клинический симптом рака. Эффективность определяют вместе с использованием любого известного способа для диагностики или лечения конкретного типа опухоли.

[0038] В той степени, в которой способы и композиции этого изобретения находят применение в контексте "предотвращения" и "профилактики" рака, такие термины используются здесь взаимозаменяемо в отношении любой активности, которая уменьшает летальность и болезненность, связанные с этим заболеванием. Предотвращение и профилактика могут осуществляться "при первичном, вторичном и третичном уровнях предотвращения". В то время как первичные предотвращение и профилактика избегают развития заболевания, вторичный и третичный уровни предотвращения и профилактики включают в себя активности, нацеленные на предотвращение и профилактику развития заболевания и появление симптомов, а также уменьшение отрицательного действия уже установившегося заболевания посредством восстановления функции и уменьшения связанных с заболеванием осложнений. Альтернативно, предотвращение и профилактика могут включать в себя широкий диапазон профилактических способов лечения, нацеленных на облегчение тяжести конкретного нарушения, например, уменьшением пролиферации и метастазирования опухолей.

[0039] В контексте данного изобретения, лечение и/или профилактика рака и/или предотвращение его послеоперационного рецидива включают в себя любую из следующих стадий, таких как хирургическое удаление раковых клеток, ингибирование роста раковых клеток, обратное развитие или регресс опухоли, индукцию ремиссии и уменьшение или ингибирование метастазирования. Эффективное лечение и/или профилактика рака уменьшает смертность и улучшает прогноз индивидуумов, имеющих рак, уменьшает уровни опухолевых маркеров в крови и ослабляет детектируемые симптомы, сопутствующие раку. Например, эффективное лечение включает в себя уменьшение или улучшение симптомов, и/или профилактика включает в себя 10%, 20%, 30% или большее уменьшение, или достижение стабильного состояния заболевания.

[0040] В контексте данного изобретения термин "антитело" относится к иммуноглобулинам и их фрагментам, которые являются специфически реактивными в отношении указанного белка или его пептида. Антитело может включать в себя антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, антитела, слитые с другими белками или радиоактивными метками, и фрагменты антител. Кроме того, антитело используется здесь в самом широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность. "Антитело" обозначает все классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).

Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, что и значение, обычно понимаемое специалистом, квалифицированным в области, к которой принадлежит данное изобретение.

[0041] II. Пептиды

Для демонстрации, что пептиды, происходящие из HJURP, функционируют как антиген, распознаваемый CTL, пептиды, произведенные из HJURP (SEQ ID NO:50), анализировали для определения, были ли они антигенными эпитопами, HLA-A24- или А2-рестриктированными, с которыми обычно встречаются аллели HLA (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994).

[0042] Кандидаты HLA-A24-связывающих пептидов, произведенные из HJURP, идентифицировали с использованием информации об их аффинностях связывания с HLA-A24. Идентифицировали следующие кандидатные пептиды.

HJURP-A24-9-576 (SEQ ID NO:2),

HJURP-A24-9-28 (SEQ ID NO:3),

HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4),

HJURP-A24-9-403 (SEQ ID NO:5),

HJURP-A24-9-388 (SEQ ID NO:6),

HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7),

HJURP-A24-9-544 (SEQ ID NO:8),

HJURP-A24-9-280 (SEQ ID NO:9),

HJURP-A24-10-149 (SEQ ID NO:10),

HJURP-A24-10-395 (SEQ ID NO:11),

HJURP-A24-10-729 (SEQ ID NO:12),

HJURP-A24-10-56 (SEQ ID NO:13),

HJURP-A24-10-590 (SEQ ID NO:14),

HJURP-A24-10-635 (SEQ ID NO:15),

HJURP-A24-10-389 (SEQ ID NO:16),

HJURP-A24-10-28 (SEQ ID NO:17),

HJURP-A24-10-383 (SEQ ID NO:18),

HJURP-A24-10-379 (SEQ ID NO:19),

HJURP-A24-10-235 (SEQ ID NO:20),

HJURP-A24-10-218 (SEQ ID NO:21),

HJURP-A24-10-388 (SEQ ID NO:22),

HJURP-A24-10-162 (SEQ ID NO:23) и

HJURP-A24-10-627 (SEQ ID NO:24).

[0043] Кроме того, после in vitro стимуляции Т-клеток дендритными клетками (DC), импульсно обработанными (загруженными) этими пептидами, CTL успешно устанавливали стимуляцией этих DC следующими пептидами:

HJURP-А24-9-28 (SEQ ID NO:3),

HJURP-А24-9-263 (SEQ ID NO:4),

HJURP-А24-9-408 (SEQ ID NO:7),

HJURP-А24-10-383 (SEQ ID NO:18) и

HJURP-А24-10-162 (SEQ ID NO:23).

Эти установленные CTL обнаруживают сильную специфическую CTL-активность против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующими пептидами. Эти результаты демонстрируют здесь, что HJURP является антигеном, распознаваемым CTL, и что эти тестированные пептиды могут быть эпитопными пептидами HJURP, рестриктированными по HLA-A24.

[0044] Кандидаты HLA-A2-связывающих пептидов, произведенные из HJURP, идентифицировали на основе их связывающих аффинностях в отношении HLA-A2. Были идентифицированы следующие кандидатные пептиды:

HJURP-A2-9-496 (SEQ ID NO:26),

HJURP-A2-9-354 (SEQ ID NO:27),

HJURP-A2-9-266 (SEQ ID NO:28),

HJURP-A2-9-51 (SEQ ID NO:29),

HJURP-A2-9-406 (SEQ ID NO:30),

HJURP-A2-9-129 (SEQ ID NO:31),

HJURP-A2-9-599 (SEQ ID NO:32),

HJURP-A2-9-226 (SEQ ID NO:33),

HJURP-A2-9-274 (SEQ ID NO:34),

HJURP-A2-9-386 (SEQ ID NO:35),

HJURP-A2-9-244 (SEQ ID NO:36),

HJURP-A2-10-405 (SEQ ID NO:37),

HJURP-A2-10-128 (SEQ ID NO:38),

HJURP-A2-10-649 (SEQ ID NO:39),

HJURP-A2-10-273 (SEQ ID NO:40),

HJURP-A2-10-266 (SEQ ID NO:41),

HJURP-A2-10-598 (SEQ ID NO:42),

HJURP-A2-10-54 (SEQ ID NO:43),

HJURP-A2-10-731 (SEQ ID NO:44),

HJURP-A2-10-397 (SEQ ID NO:45),

HJURP-A2-10-157 (SEQ ID NO:46),

HJURP-A2-10-455 (SEQ ID NO:47) и

HJURP-A2-10-156 (SEQ ID NO:48).

[0045] Кроме того, после in vitro стимуляции Т-клеток дендритными клетками (DC), импульсно обработанными (загруженными) этими пептидами, CTL успешно устанавливали стимуляцией этих DC следующими пептидами:

HJURP-А2-9-496 (SEQ ID NO:26),

HJURP-А2-9-354 (SEQ ID NO:27),

HJURP-А2-9-406 (SEQ ID NO:30),

HJURP-А2-9-129 (SEQ ID NO:31),

HJURP-А2-9-599 (SEQ ID NO:32),

HJURP-А2-9-386 (SEQ ID NO:35),

HJURP-А2-10-405 (SEQ ID NO:37),

HJURP-А2-10-128 (SEQ ID NO:38) и

HJURP-А2-10-54 (SEQ ID NO:43).

Эти установленные CTL обнаруживают сильную специфическую CTL-активность против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующими пептидами. Эти результаты демонстрируют, что HJURP является антигеном, распознаваемым CTL, и что эти тестированные пептиды могут быть эпитопными пептидами HJURP, рестриктированными по HLA-A2.

[0046] Поскольку ген HJURP сверхэкспрессируется в случае рака, такого как AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфома, остеосаркома, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоли мягкой ткани и опухоли яичка, и не экспрессируется в большинстве здоровых опухолей, он может быть хорошей мишенью для противораковой иммунотерапии. Таким образом, данное изобретение обеспечивает нонапептиды (пептиды, состоящие из девяти аминокислотных остатков) и декапептиды (пептиды, состоящие из десяти аминокислотных остатков) CTL-распознаваемых эпитопов из HJURP. Альтернативно, данное изобретение обеспечивает выделенные пептиды, которые связываются с HLA-антигенами и индуцируют цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), где этот пептид имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:50, или является его иммунологически активным фрагментом. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления, данное изобретение обеспечивает пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-24 и 26-48.

[0047] В основном, программы пакета программного обеспечения, доступные в настоящее время, например, в Интернете, такие как описанные в Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75 и Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12; 1007-17, могут быть использованы для расчета аффинностей связывания между различными пептидами и HLA-антигенами in silico. Аффинность связывания с HLA-антигенами может быть измерена, как описано, например, в ссылке Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; и Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424, Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17 и Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796, которые суммированы, например, в Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220. Способы для определения аффинности связывания описаны, например, в Journal of Immunological Methods (1995, 185: 181-190) и Protein Science (2000, 9: 1838-1846). Таким образом, можно использовать такие программы для отбора фрагментов, произведенных из HJURP, которые имеют высокую связывающую аффинность с антигенами HLA. Таким образом, данное изобретение включает в себя пептиды, состоящие из любых фрагментов, произведенных из HJURP, которые могли бы определяться по связыванию антигенов HLA такими известными программами. Кроме того, такие пептиды могут включать в себя пептид, состоящий из полноразмерного HJURP.

[0048] Пептиды данного изобретения, в частности, нонапептиды и декапептиды данного изобретения, могут быть фланкированы дополнительными аминокислотными остатками, пока эти пептиды сохраняют их CTL-индуцибельность. Конкретные дополнительные аминокислотные остатки могут состоять из любого типа аминокислот, пока они не ухудшают CTL-индуцибельность исходного пептида. Таким образом, данное изобретение включает в себя также пептиды, имеющие связывающую аффинность в отношении антигенов HLA, включающие в себя пептиды, произведенные из HJURP. Такие пептиды содержат, например, менее приблизительно 40 аминокислот, часто даже менее приблизительно 20 аминокислот, обычно менее приблизительно 15 аминокислот.

[0049] Обычно известно, что модификации одной или нескольких аминокислот в пептиде не влияют на функцию этого пептида или, в некоторых случаях, даже увеличивают желаемую функцию исходного белка. Действительно, было известно, что модифицированные пептиды (то есть пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, модифицированной заменой, делецией, инсертированием или добавлением одного или нескольких аминокислотных остатков, сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79:6409-13). Таким образом, в одном варианте осуществления данного изобретения, пептид, имеющий CTL-индуцибельность данного изобретения, может состоять из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-24 и 26-48, где одна, две или даже более аминокислот добавлены, делетированы и/или заменены.

[0050] Специалисты с квалификацией в данной области признают, что индивидуальные добавления, делеции, инсерции или замены в отношении аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот, приводят к сохранению свойств боковой цепи исходной аминокислоты; таким образом, они обычно называются "консервативными заменами" или "консервативными модификациями", в которых изменение белка приводит к белку, со сходными функциями. Таблицы консервативных замен, обеспечивающих функционально сходные аминокислоты, известны в данной области. Примерами характеристик боковых цепей аминокислот являются гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) и боковые цепи, имеющие следующие функциональные группы или характеристики в общем: алифатическую боковую цепь (G, A, V, L, I, P); гидроксильную группу, содержащую боковую цепь (S, T, Y); атом серы, содержащий боковую цепь (C, M); карбоксильную кислоту и амидсодержащую боковую цепь (D, N, E, Q); основание, содержащее боковую цепь (R, K, H) и содержащую ароматическую группу боковую цепь (H, F, Y, W). Кроме того, следующие восемь групп, каждые, содержат аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг друга:

1) аланин (A), глицин (G);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

3) аспарагин (N), глутамин (Q);

4) аргинин (R), лизин (K);

5) изолейцин (1), лейцин (L), метионин (M), валин (V);

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);

7) серин (S), треонин (T); и

8) цистеин (C), метионин (M) (смотрите, например, Creighton, Proteins 1984).

[0051] Считается также, что такие консервативно модифицированные пептиды являются пептидами данного изобретения. Однако пептиды данного изобретения не ограничиваются этим и могут включать в себя неконсервативные модификации, пока этот модифицированный пептид сохраняет CTL-индуцибельность исходного пептида. Кроме того, модифицированные пептиды не должны исключать CTL-индуцибельные пептиды полиморфных вариантов, межвидовых гомологов и аллелей HJURP.

[0052] Аминокислотные остатки могут быть инсертированы, заменены или добавлены к пептидам данного изобретения или, альтернативно, аминокислотные остатки могут быть делетированы из них для получения более высокой аффинности связывания. Для сохранения необходимой CTL-индуцибельности, можно модифицировать (инсертировать, делетировать, добавить и/или заменить) только небольшое число (например, 1, 2 или несколько) или небольшой процент аминокислот. Здесь, термин "несколько" означает 5 или менее аминокислот, например, 4 или 3 или менее. Процент аминокислот, которые должны быть модифицированы, составляет предпочтительно 20% или менее, более предпочтительно 15% или менее, даже более предпочтительно 10% или менее, например, 1-5%.

[0053] При использовании в иммунотерапии рака, пептиды данного изобретения презентируются на поверхности клетки или экзосомы в виде комплекса с HLA-антигеном. Таким образом, предпочтительно выбирать пептиды, которые не только индуцируют CTL, но также и имеют высокую аффинность связывания с HLA-антигеном. С этой целью пептиды могут быть модифицированы заменой, инсерцией и/или добавлением аминокислотных остатков для получения модифицированного пептида, имеющего улучшенную аффинность связывания. Кроме пептидов, которые природно представлены, поскольку регулярность последовательностей пептидов, представляемых посредством связывания с HLA-антигенами, уже известна (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), в иммуногенные пептиды этого изобретения изобретения могут быть введены модификации, основанные на такой регулярности.

[0054] Например, пептиды, имеющие высокую HLA-А24-связывающую аффинность, имеют тенденцию наличия второй аминокислоты от N-конца, замененной фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном. Подобным образом, пептиды, в которых С-концевая аминокислота заменена фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином, может быть также выгодно использована. Таким образом, пептиды, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:2-24, где вторая аминокислота от N-конца этой аминокислотной последовательности SEQ ID NO заменена фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, и/или пептиды, в которых С-конец этой последовательности SEQ ID NO заменен фенилаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином, включены в данное изобретение.

[0055] Альтернативно, в пептидах, обнаруживающих высокую HLA-А2-связывающую аффинность, может быть желательной замена второй аминокислоты от N-конца лейцином или метионином или аминокислоты на С-конце валином или лейцином. Таким образом, пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO:26-48, где вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности этой SEQ ID NO заменена лейцином или метионином, и/или пептиды, в которых С-конец аминокислотной последовательности этой SEQ ID NO заменен валином или лейцином, включены в данное изобретение.

[0056] Замены могут быть введены не только в концевых аминокислотах, но также в положении потенциального распознавания пептидов Т-клеточных рецепторов (TCR). Несколько исследований продемонстрировали, что пептид с аминокислотными заменами может иметь равную или лучшую функцию, чем функция исходного белка, например, CAP1, p53_(264-272), Her-2/neu_(369-377) или gp100_(209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T.K. Hoffmann et al.,. J Immunol. (2002) Feb 1; 168 (3):1338-47., S.O. Dionne et al., Cancer Immunol Immunother. (2003) 52: 199-206 и S.O. Dionne et al., Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

[0057] Данное изобретение рассматривает также добавление одной, двух или нескольких аминокислот к N- и/или C-концу описанных пептидов. Такие модифицированные пептиды, имеющие высокую аффинность связывания с HLA-антигеном и сохраняющие CTL-индуцибельность, также включены в данное изобретение. Например, данное изобретение обеспечивает выделенный пептид с длиной менее чем 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислот, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

(i) аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-9 и 26-36, где 1, 2 или несколько аминокислот являются замещенными, где этот пептид связывает HLA-антиген и индуцирует цитотоксические Т-лимфоциты, и

(ii) аминокислотной последовательности (i), где эта аминокислотная последовательность имеет одну или обе из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота от N-конца указанной SEQ ID NO выбрана из группы, состоящей из лейцина или метионина; и

(b) C-концевая аминокислота указанной SEQ ID NO выбрана из группы, состоящей из валина или лейцина.

[0058] Кроме того, данное изобретение обеспечивает также выделенный пептид с длиной менее чем 15, 14, 13, 12 или 11 аминокислот, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i') аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:10-24 и 37-48, где 1, 2 или несколько аминокислот являются замененными, где этот пептид связывает HLA-антиген и индуцирует цитотоксические Т-лимфоциты, и

(ii') аминокислотной последовательности (i'), где эта аминокислотная последовательность имеет одну или обе из следующих характеристик:

(a) вторая аминокислота от N-конца указанной SEQ ID NO выбрана из группы, состоящей из лейцина или метионина; и

(b) C-концевая аминокислота указанной SEQ ID NO выбрана из группы, состоящей из валина или лейцина.

Эти пептиды процессируются в APC для презентации (i), (ii), (i') и (ii') на них при контактировании этих пептидов с APC или введении их в APC.

[0059] Однако, когда пептидная последовательность идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, имеющего отличающуюся функцию, могут быть индуцированы побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или аллергические симптомы против конкретных веществ. Таким образом, можно сначала провести поиски гомологии с использованием доступных баз данных во избежание ситуаций, в которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого белка. Когда из поисков гомологии становится ясно, что не существует даже пептида с такими малыми отличиями, как 1 или 2 аминокислоты, в сравнении с пептидом-мишенью, этот пептид-мишень может быть модифицирован для увеличения его аффинности связывания с HLA-антигенами и/или для увеличения его CTL-индуцибельности без какой-либо угрозы в отношении таких побочных эффектов.

[0060] Хотя ожидается, что пептиды, имеющие высокую аффинность связывания с HLA-антигенами, как описано выше, являются высоко эффективными, кандидатные пептиды, которые выбраны в соответствии с присутствием высокой аффинности связывания в качестве индикатора, исследуются дополнительно на присутствие CTL-индуцибельности. Здесь, фраза "CTL-индуцибельность" указывает на способность этого пептида индуцировать цитотоксические лимфоциты (CTL) при презентации его на антигенпрезентирующих клетках (APC). Далее, "CTL-индуцибельность" включает в себя способность этого пептида индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, стимулировать лизис CTL клеток-мишеней и увеличивать продуцирование IFN-гамма CTL.

[0061] Подтверждение CTL-индуцибельности достигается индуцированием APC (антигенпрезентирующих клеток), несущих MHC-антигены человека (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC)), или более конкретно DC, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, и после стимуляции этими пептидами, смешиванием с CD8-положительными клетками, и затем измерением IFN-гамма, продуцируемого и высвобождаемого CTL против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы могут быть использованы трансгенные животные, которые были получены для экспрессии HLA-антигена человека (например, такие, как описанные в BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000, 61 (8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Например, эти клетки-мишени могут быть помечены радиоактивной меткой ⁵¹Cr и т.п., и цитотоксическая активность может быть рассчитана из радиоактивности, высвобождаемой из этих клеток-мишеней. Альтернативно, CTL-индуцибельность может быть испытана измерением продуцирования и высвобождения IFN-гамма CTL в присутствии антигенпрезентирующих клеток (APC), которые несут иммобилизированные пептиды, и визуализацией зоны ингибирования на этой среде с использованием моноклональных анти-IFN-гамма-антител.

[0062] В результате исследования CTL-индуцибельности пептидов, как описано выше, было обнаружено, что нонапептиды или декапептиды, выбранные из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:2-24 и 26-48, проявляли особенно высокую CTL-индуцибельность, а также высокую аффинность связывания с HLA-антигеном. Таким образом, эти пептиды иллюстрируются как предпочтительные варианты осуществления данного изобретения.

[0063] Кроме того, результаты анализа гомологии, показали, что такие пептиды не имеют значимой гомологии с пептидами, полученными из любых других продуктов гена человека. Это снижает возможность неизвестных или нежелательных реакций, возникающих при использовании для иммунотерапии. Таким образом, также из этого аспекта, эти пептиды применимы индуцирования иммунитета против HJURP в раковых пациентах. Таким образом, пептидами этого изобретения являются предпочтительно пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-24 и 26-48.

[0064] Кроме обсуждаемой выше модификации этих пептидов, пептиды данного изобретения могут также быть связаны с другими веществами, пока полученный связанный пептид сохраняет необходимую CTL-индуцибельность исходного пептида и, более предпочтительно, сохраняет также необходимое HLA-связывание. Примерные "другие" пептиды включают в себя: пептиды данного изобретения или CTL-индуцибельные пептиды, произведенные из других TAA. Линкеры между этими пептидами хорошо известны в данной области, например, AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) или K (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715).

[0065] Например, не-HJURP-опухолеспецифические антигенные пептиды могут быть также использованы по существу одновременно для увеличения иммунной реакции посредством HLA класса I и/или класса II. Хорошо установлено, что раковые клетки экспрессируют более одного опухолеспецифического гена. В рамках рутинного экспериментирования квалифицированного в данной области специалиста можно определить, экспрессирует ли конкретный субъект дополнительные опухолеспецифические гены, и затем включить связывающие HLA класса I и/или HLA класса II пептиды, полученные из продуктов экспрессии таких генов, в HJURP-композиции или вакцины в соответствии с данным изобретением.

[0066] Примеры связывающих HLA класса I и/или HLA класса II пептидов будут известны квалифицированному в данной области специалисту (например, смотрите Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995), и могут быть использованы в этом изобретении способами, подобными описанным здесь способам. Специалист с обычной квалификацией в данной области может приготовить полипептиды, включающие в себя HJURP-пептиды и один или более не-HJURP-пептидов, или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды, в соответствии со стандартными процедурами молекулярной биологии.

[0067] Вышеописанные связанные пептиды называют здесь "политопами", т.е. группами из двух или более потенциально иммуногенных или стимулирующих иммунную реакцию пептидов, которые могут быть соединены вместе в различных расположениях (например, в виде цепочки, с перекрыванием). Этот политоп (или нуклеиновая кислота, кодирующая этот эпитоп) может вводиться в стандартный протокол иммунизации, например, в животных, для тестирования эффективности этого политопа в стимулировании, усилении и/или возбуждения иммунной реакции.

[0068] Эти пептиды могут быть соединены вместе непосредственно или посредством использования фланкирующих последовательностей с образованием политопов, и применение политопов в качестве вакцин хорошо известно в данной области (смотрите, например, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995; Gilbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997; Thomson et al., J Immunol. 157(2):822-826, 1996; Tarn et al., J Exp. Med. 171(l):299-306, 1990). Политопы, содержащие различные количества и различные комбинации эпитопов, могут быть приготовлены и тестированы на распознавание цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) и на эффективность в увеличении иммунной реакции.

[0069] Кроме того, пептиды данного изобретения могут быть дополнительно связаны с другими веществами, пока полученный связанный пептид сохраняет необходимую CTL-индуцибельность исходного пептида. Такие вещества могут включать в себя: пептиды, липиды, сахар и цепи сахаров, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Эти пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование; пока эти модификации не разрушают биологическую активность исходного пептида, описанную здесь. Эти типы модификаций могут быть выполнены для придания дополнительных функций (например, функции нацеливания и функции доставки) или для стабилизации этого полипептида.

[0070] Например, в данной области известно, что для увеличения стабильности полипептида in vivo вводят D-аминокислоты, миметики аминокислот или неприродные аминокислоты; эта концепция может быть также заимствована для рассматриваемых полипептидов. Стабильность полипептида может анализироваться рядом способов. Например, пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка человека, могут быть использованы для теста на стабильность (смотрите, например, Verhoef et al., Eur J Drag Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

[0071] Кроме того, как отмечалось выше, среди модифицированных пептидов, которые являются замещенными, делетированными или дополненными одним, двумя или несколькими аминокислотными остатками, пептиды, имеющие ту же самую или более высокую активность в сравнении с исходными пептидами, могут быть подвергнуты скринингу или отобраны. Таким образом, данное изобретение обеспечивает также способ скрининга на модифицированные пептиды или селекции модифицированных пептидов, имеющих ту же самую или более высокую активность в сравнении с исходными пептидами. Например, этот способ может предусматривать стадии:

a: замены, делетирования или добавления по меньшей мере одного аминокислотного остатка пептида данного изобретения,

b: определения активности этого пептида, и

c: отбора пептида, имеющего ту же самую или более высокую активность в сравнении с исходным пептидом.

[0072] Здесь, эта активность может включать в себя активность связывания MHC, APC или CTL-индуцибельность и цитотоксическую активность.

Здесь, пептиды данного изобретения могут также описываться как "HJURP-пептид(-ы)" или "HJURP-полипептид(-ы)".

[0073] III. Получение HJURP-пептидов

Пептиды данного изобретения могут быть получены с использованием известных способов. Например, пептиды могут быть получены синтетически, с использованием технологии рекомбинантных ДНК или химического синтеза. Пептиды данного изобретения могут быть синтезированы индивидуально или в виде более длинных полипептидов, состоящих из двух или более пептидов. Затем эти пептиды могут быть выделены, то есть, очищены или выделены таким образом, чтобы быть по существу свободными от других природно-встречающихся белков клетки-хозяина и их фрагментов или любых других химических веществ.

[0074] Пептиды данного изобретения могут также содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, при условии, что такие модификации не разрушают биологическую активность исходных пептидов. Другие иллюстративные модификации включают в себя введение D-аминокислот или других аминокислотных миметиков, которые могут использоваться, например, для увеличения периода полувыведения из сыворотки этих пептидов.

[0075] Пептид данного изобретения может быть получен посредством химического синтеза, основанного на выбранной аминокислотной последовательности. Например, способы общепринятого пептидного синтеза, которые могут быть заимствованы для этого синтеза, включают в себя:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; и

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

[0076] Альтернативно, эти пептиды могут быть получены путем применения любых известных способов генетической инженерии для получения пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds Wu et al.) 1983, 101:347-62). Например, сначала, подходящий вектор, несущий полинуклеотид, кодирующий пептид-мишень, в экспрессируемой форме (например, справа от регуляторной последовательности, соответствующей последовательности промотора), готовят и трансформируют в подходящую клетку-хозяина. Такие векторы и клетки-хозяева также обеспечены данным изобретением. Затем эту клетку-хозяина культивируют для получения представляющего интерес пептида. Этот пептид может также быть получен in vitro посредством заимствования системы трансляции in vitro.

[0077] IV. Полинуклеотиды

Данное изобретение обеспечивает также полинуклеотиды, которые кодируют любой из вышеупомянутых пептидов данного изобретения. Эти полинуклеотиды включают в себя полинуклеотиды, полученные из природно-встречающегося гена HJURP (GenBank Accession No. NM_018410 (например, SEQ ID NO:49)), а также полинуклеотиды, имеющие их консервативно модифицированную нуклеотидную последовательность. Здесь фраза "консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность" относится к последовательностям, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. Вследствие вырожденности генетического кода, большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой конкретный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU, все, кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин указан кодоном, этот кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются "молчащими вариациями", которые являются одной разновидностью консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты здесь, которая кодирует пептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию этой нуклеиновой кислоты. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Таким образом, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид, полностью описана в каждой раскрытой последовательности.

[0078] Полинуклеотид данного изобретения может состоять из ДНК, РНК и их производных. Как хорошо известно в данной области, молекула ДНК предпочтительно состоит из оснований, таких как природно-встречающиеся основания A, T, C, и G, и Т заменен на U в РНК. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что основания, не встречающиеся в природе, могут быть также включены в полинуклеотиды.

Полинуклеотид данного изобретения может кодировать многочисленные пептиды данного изобретения с промежуточными аминокислотными последовательностями или без промежуточных аминокислотных последовательностей между ними. Например, промежуточная аминокислотная последовательность может обеспечивать сайт расщепления (например, последовательность, распознаваемую ферментом) полинуклеотида или транслированных пептидов. Кроме того, этот полинуклеотид может включать в себя любые дополнительные последовательности в кодирующую последовательность, кодирующую пептид данного изобретения. Например, этот полинуклеотид может быть рекомбинантным полинуклеотидом, который включает в себя регуляторные последовательности, требуемые для экспрессии этого пептида, или может быть экспрессирующим вектором (плазмидой) с маркерными генами и т.п. Обычно, такие рекомбинантные полинуклеотиды могут быть получены манипуляцией полинуклеотидов посредством обычных рекомбинантных способов с использованием, например, полимераз и эндонуклеаз.

[0079] Как рекомбинантные способы, так и способы химического синтеза могут быть использованы для получения полинуклеотидов данного изобретения. Например, полинуклеотид может быть получен инсертированием в подходящий вектор, который может экспрессироваться при трансфицировании в компетентную клетку. Альтернативно, полинуклеотид может быть амплифицирован с использованием ПЦР-способов или экспрессии в подходящих хозяевах (смотрите, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Альтернативно, полинуклеотид может быть синтезирован с использованием твердофазных способов, как описано в Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48:2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3:801-5.

[0080] V. Экзосомы

Данное изобретение дополнительно обеспечивает внутриклеточные пузырьки, называемые экзосомами, которые презентируют комплексы, образованные между пептидами данного изобретения и HLA-антигенами, на их поверхности. Экзосомы могут быть получены, например, с использованием способов, подробно описанных в Japanese Patent Application Kohyo Publocations Nos. Hei 11-510507 и WO99/03499, и могут быть получены с использованием APC, полученных из пациентов, которые подвергаются лечению и/или предотвращению (болезни). Экзосомы этого изобретения могут быть инокулированы в качестве вакцины аналогично инокуляции пептидов этого изобретения.

[0081] Тип HLA-антигенов, содержащихся в этих комплексах, должен соответствовать типу HLA-антигенов субъекта, требующего лечения и/или профилактики. Например, в Японской популяции, часто являются подходящими HLA-А24 или HLA-А2, в частности, HLA-А*2402 и HLA-А*0201 и HLA-А*0206. Применение типа HLA-A24 или типа HLA-А2, который является высоко экспрессируемым среди японцев и индивидуумов, принадлежащих к Индо-Европейской (европеоидной) расе, является благоприятным для получения эффективных результатов, и подтипы, такие как A*0201 и A*0206, также находят применение. Обычно, в клинике тип HLA-антигена пациента, требующего лечения, исследуется заранее, что позволяет сделать подходящий выбор пептидов, имеющих высокие уровни аффинности связывания с конкретным антигеном или имеющих CTL-индуцибельность, посредством презентации антигена. Кроме того, для получения пептидов, обнаруживающих высокие уровни аффинности связывания с этим антигеном и CTL-индуцибельность, замена, делеция или добавление 1, 2 или нескольких аминокислот могут быть выполнены на основании аминокислотной последовательности природно-встречающегося неполного пептида HJURP.

При использовании HLA-антигена типа A24 для экзосомы данного изобретения, пептиды, имеющие последовательность любой из SEQ ID NO:2-24, находят конкретное применение. Альтернативно, при использовании HLA-антигена типа А2 для экзосомы данного изобретения, находят применение пептиды, имеющие последовательность любой из SEQ ID NO:26-48.

[0082] VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)

Данное изобретение обеспечивает также выделенные антигенпрезентирующие клетки (APC), которые презентируют на их поверхности комплексы, образованные между HLA-антигенами и пептидами этого изобретения. Эти APC, могут быть получены из пациентов, которые являются субъектами для лечения и/или предотвращения, и могут быть введены в качестве вакцин сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включающими в себя пептиды данного изобретения, экзосомы или CTL.

APC не ограничиваются конкретным видом клеток и включают в себя дендритные клетки (DC), клетки Лангерганса, макрофаги, B-клетки и активированные T-клетки, которые, как известно, презентируют белковые антигены на их клеточной поверхности таким образом, что они могут распознаваться лимфоцитами. Поскольку DC является репрезентативной APC, имеющей самую сильную CTL-индуцирующую активность среди APC, DC находят применение в качестве APC данного изобретения.

[0083] Например, APC данного изобретения могут быть получены индуцированием DC из моноцитов периферической крови и затем контактированием (стимулированием) их пептидами этого изобретения in vitro, ex vitro или in vivo. При введении пептидов этого изобретения субъектам, APC, которые презентируют пептиды этого изобретения, индуцируются в теле этого субъекта. Таким образом, APC данного изобретения могут быть получены сбором APC из субъекта после введения пептидов данного изобретения этому субъекту. Альтернативно, APC данного изобретения могут быть получены контактированием APC, собранных из субъекта, с пептидом этого изобретения.

[0084] APC данного изобретения могут вводиться субъекту индуцирования иммунной реакции против рака в субъекте, сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включающими в себя пептиды, экзосомы или CTL данного изобретения. Например, введение ex vivo может включать в себя стадии:

a: сбора APC из первого субъекта;

b: приведения APC в контакт из стадии a с пептидом; и

c: введения APC стадии b, второму субъекту.

[0085] Первый субъект и второй субъект могут быть одним и тем же индивидуумом, или они могут быть разными индивидуумами. APC, полученные стадией b, могут быть введены в качестве вакцины для лечения и/или предотвращения рака, примеры которого включают в себя, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка, но не ограничиваются ими. Альтернативно, согласно данному изобретению, обеспечено применение пептидов данного изобретения для приготовления фармацевтического агента или композиции индуцированием антигенпрезентирующих клеток. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ или процесс приготовления фармацевтической композиции индуцирования APC, где этот способ предусматривает стадию смешивания или приготовления пептида данного изобретения с фармацевтически приемлемым носителем.

[0086] Согласно одному аспекту данного изобретения, APC данного изобретения имеют высокий уровень CTL-индуцибельности. В термине "высокий уровень CTL-индуцибельности" этот высокий уровень является уровнем относительноно уровня CTL-индуцибельности APC, которые не контактируют с пептидом или пептидами, которые не могут индуцировать CTL. Такие APC, имеющие высокий уровень CTL-индуцибельности, могут быть получены способом, который предусматривает стадию переноса полинуклеотида, кодирующего пептид этого изобретения, к APC in vitro, а также способом, упомянутым выше. Введенные гены могут быть в форме ДНК или РНК. Примеры способов введения включают в себя, без конкретных ограничений, различные способы, традиционно выполняемые в этой области, такие как липофекция, электропорация и способ с использованием фосфата кальция. Более конкретно, это может быть выполнено, как описано в Cancer Res 1996, 56:5672-7; J Immunol 1998, 161:5607-13; J Exp Med 1996, 184:465-72; Published Japanese Translation of International Publication No 2000-509281. Посредством переноса этого гена в APC, этот ген подвергается транскрипции, трансляции и т.д. в этой клетке, и затем полученный белок процессируется МНС Класса I или Класса II, и направляется посредством презентирующего пути для презентации неполных пептидов.

[0087] VII. Цитотоксические T-клетки (цитотоксические T-лимфоциты: CTL)

CTL (цитотоксическая T-клетка), индуцированная против любого из пептидов данного изобретения, усиливает иммунную реакцию, поражающую раковые клетки in vivo, и, следовательно, может быть использована в качестве вакцин, аналогично пептидам. Таким образом, данное изобретение обеспечивает также выделенные CTL, которые специфически индуцированы или активированы любым из рассматриваемых пептидов.

Такие CTL (цитотоксические T-клетки) могут быть получены (1) введением пептида данного изобретения субъекту или (2) контактированием (стимулированием) полученных из субъекта APC и CD8-положительных клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с пептидами этого изобретения in vitro или (3) контактированием CD8-положительных клеток или мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro с АРС или экзосомами, презентирующими комплекс HLA-антигена и этого пептида на его поверхности или (4) введением гена, который включает в себя полинуклеотид, кодирующий субъединицу Т-клеточного рецептора, связывающуюся с пептидом этого изобретения. Такие АРС или экзосомы могут быть получены способами, описанными выше, и детали этого способа (4) описаны ниже в разделе "VIII. Т-клеточный рецептор (TCR)".

[0088] CTL данного изобретения могут быть получены из пациентов, которые подвергаются лечению и/или предотвращению, и могут вводиться в них сами по себе или в комбинации с другими лекарственными средствами, включающими в себя пептиды данного изобретения или экзосомы с целью регулирующих действий. Полученные CTL действуют специфически против клеток-мишеней, презентируя пептиды этого изобретения, или, например, те же самые пептиды, что и использованные для индукции. Эти клетки-мишени могут быть клетками, которые эндогенно экпрессируют HJURP, такие как раковые клетки, или клетками, которые трансфицированы геном HJURP; и клетки, которые презентируют пептид данного изобретения на клеточной поверхности благодаря стимуляции пептидом, могут также служить в качестве мишеней атаки активированного CTL.

[0089] VIII. T-клеточный рецептор (TCR)

Данное изобретение обеспечивает также композицию, содержащую нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые способны к образованию субъединицы Т-клеточного рецептора (TCR), и способы ее применения. Субъединицы TCR, обладают способностью образования TCR, которые придают специфичность Т-клеткам против опухолевых клеток, презентирующих HJURP. При помощи известных в данной области способов, нуклеиновые кислоты альфа- и бета-цепей в виде TCR-субъединиц CTL, индуцированных одним или несколькими пептидами данного изобретения, могут быть идентифицированы (W02007/032255 и Morgan RA et al., J Immunol, 171, 3287 (2003)). Например, способ ПЦР является предпочтительным для анализа TCR. Праймерами ПЦР для анализа могут быть, например, 5'-R праймеры (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') в качестве праймеров 5'-стороны (SEQ ID NO:51) и 3-TRa-C-праймеры (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'), специфические в отношении C-района альфа-цепи TCR (SEQ ID NO:52), 3-TRb-C1-праймеры (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3'), специфические в отношении С1-района бета-цепи TCR (SEQ ID NO:53) или 3-TRbeta-C2-праймеры (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3'), специфические в отношении C2-района бета-цепи TCR (SEQ ID NO:54) в качестве праймеров 3'-стороны, но не ограничивающиеся ими. Эти производные TCR могут связывать клетки-мишени, презентирующие HJURP-пептид, с высокой авидностью и, необязательно, опосредовать эффективное убивание клеток-мишеней, презентирующих HJURP-пептид, in vivo и in vitro.

[0090] Нуклеиновые кислоты, кодирующие субъединицы TCR, могут быть включены в подходящие векторы, например, ретровирусные векторы. Эти векторы хорошо известны в данной области. Нуклеиновые кислоты или векторы, содержащие их, могут быть успешно перенесены в Т-клетку, например, Т-клетку из пациента. Преимущественно, изобретение обеспечивает готовую композицию, позволяющую проводить быструю модификацию собственных Т-клеток пациента (или Т-клеток другого млекопитающего) для быстрого и легкого получения модифицированных Т-клеток, имеющих превосходные свойства убивания раковых клеток.

[0091] Специфический TCR является рецептором, способным специфически распознавать комплекс пептида данного изобретения и HLA-молекулы, придавая Т-клетке специфическую активность против клетки-мишени, когда TCR присутствует на поверхности этой Т-клетки. Специфическое распознавание вышеупомянутого комплекса может быть подтверждено любыми известными способами, и предпочтительные способы включают в себя, например, анализ окрашивания мультимера HLA с использованием HLA-молекул и пептидов данного изобретения, и ELISPOT-анализ. Посредством проведения ELISPOT-анализа, можно подтвердить, что Т-клетка, экпрессирующая TCR на клеточной поверхности, распознает клетку посредством TCR и что этот сигнал передается внутриклеточно. Подтверждение, что вышеупомянутый комплекс может придавать Т-клеточную цитотоксическую активность, когда комплекс существует на поверхности Т-клетки, может также быть проведено известным способом. Предпочтительный способ включает в себя, например, определение цитотоксической активности против HLA-положительной клетки-мишени, например, анализ высвобождения хрома.

[0092] Данное изобретение обеспечивает также CTL, которые получают трансдукцией нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептиды субъединиц TCR, которые связываются с HJURP-пептидом, например, SEQ ID NO:2-24 в контексте HLA-A24, а также пептиды SEQ ID NO:26-48 в контексте HLA-А2.

Трансдуцированные CTL способны к хомингу к раковым клеткам in vivo и могут быть размножены хорошо известными способами культивирования in vitro (например, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Т-клетки этого изобретения могут использоваться для образования иммуногенной композиции, применимой в лечении или предотвращении рака в пациенте, нуждающемся в терапии или защите (WO2006/031221).

[0093] IX. Фармацевтические вещества или композиции

Поскольку экспрессия HJURP является специфически повышенной в случае рака, такого как AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярная карцинома, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфома, остеосаркома, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка, в сравнении с нормальной тканью, пептиды или полинуклеотиды данного изобретения могут быть использованы для лечения и/или для профилактики рака и/или предотвращения его послеоперационного рецидива. Таким образом, данное изобретение обеспечивает фармацевтический агент, вещество или композицию для лечения и/или профилактики рака, и/или для предотвращения его послеоперационного рецидива, причем такой агент, такое вещество или такая композиция включает в себя в качестве активного ингредиента один или более пептидов, или полинуклеотиды данного изобретения в качестве активного ингредиента. Альтернативно, эти пептиды могут экспрессироваться на поверхности любых из вышеуказанных экзосом или клеток, таких как АРС, для применения в виде фармацевтических веществ или композиций. Кроме того, вышеуказанные CTL, которые нацелены на любой из пептидов данного изобретения, могут быть также использованы в качестве активного ингредиента этих фармацевтических веществ или композиций.

[0094] В данном изобретении фраза "активный ингредиент" относится к веществу в агенте или композиции, которое является биологически или физиологически активным. В частности, в фармацевтическом агенте или фармацевтической композиции, "активный ингредиент" относится к веществу, которое обнаруживает рассматриваемое фармакологическое действие. Например, в случае фармацевтического агента или фармацевтических композиций для применения в лечении или предотвращении рака, активные ингредиенты в этих агентах или композициях могут приводить по меньшей мере к одному биологическому или физиологическому действию на раковых клетках и/или тканях прямо или опосредованно. Предпочтительно, такое действие может включать в себя уменьшение или ингибирование роста раковых клеток, повреждение или убивание раковых клеток и/или тканей и т.д. Перед приготовлением, "активный ингредиент" называют также "основной массой", "лекарственным веществом" или "техническим продуктом".

Эти фармацевтические агенты или композиции находят применение в качестве вакцины. В данном изобретении, фраза “вакцина” (также называемая иммуногенной композицией) относится к веществу, которое имеет функцию индуцирования противоопухолевого иммунитета после инокуляции в животных.

[0095] Фармацевтические агенты или композиции данного изобретения могут быть использованы для лечения и/или предотвращения рака и/или предотвращения его послеоперационного рецидива в субъектах или пациентах, включающих в себя человека и любого другого млекопитающего, в том числе, но не только, мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, козу, свинью, крупный рогатый скот, лошадь, обезьяну, павиана и шимпанзе, в частности, коммерчески важного животного или одомашненного животного.

[0096] В другом варианте осуществления, данное изобретение обеспечивает также применение активного ингредиента в приготовлении фармацевтической композиции или агента для лечения рака или опухоли, причем активный ингредиент выбран из:

(a) пептида данного изобретения;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описанный здесь, в экспрессируемой форме;

(c) APC или экзосомы, презентирующей пептид данного изобретения на ее поверхности; и

(d) цитотоксической Т-клетки данного изобретения.

[0097] Альтернативно, данное изобретение дополнительно обеспечивает активный ингредиент для применения в лечении или предотвращении рака или опухоли, причем активный ингредиент выбран из:

(a) пептида данного изобретения;

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описанный здесь, в экспрессируемой форме;

(c) APC или экзосомы, презентирующей пептид данного изобретения на ее поверхности; и

(d) цитотоксической Т-клетки данного изобретения.

[0098] Альтернативно, данное изобретение обеспечивает дополнительно способ или процесс для приготовления фармацевтической композиции или вещества для лечения или предотвращения рака или опухоли, где этот способ или процесс предусматривает стадию образования фармацевтически или физиологически приемлемого носителя с активным ингредиентом, выбранным из:

(a) пептида данного изобретения,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описанный здесь, в экспрессируемой форме,

(c) APC или экзосомы, презентирующих пептид данного изобретения на ее поверхности, и

(d) цитотоксической Т-клетки данного изобретения.

[0099] В другом варианте осуществления, данное изобретение обеспечивает также способ или процесс для приготовления фармацевтической композиции или вещества для лечения рака или опухоли, где этот способ или процесс предусматривает стадию смешивания активного ингредиента с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, где этот активный ингредиент выбран из:

(a) пептида данного изобретения,

(b) нуклеиновой кислоты, кодирующей такой пептид, как описанный здесь, в экспрессируемой форме,

(c) APC или экзосомы данного изобретения, и

(d) цитотоксической Т-клетки данного изобретения.

[0100] Эти фармацевтические агенты, вещества или композиции данного изобретения могут быть использованы для лечения и/или предотвращения рака или опухолей и/или предотвращения их послеоперационного рецидива в субъектах или пациентах, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, человека и любого другого млекопитающего, в том числе, но не только, мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, козу, свинью, крупный рогатый скот, лошадь, обезьяну, павиана и шимпанзе, в частности, коммерчески важного животного или одомашненного животного.

[0101] Согласно данному изобретению, было обнаружено, что пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-24, являются HLA-А24-рестриктированными эпитопными пептидами или кандидатами, а также было обнаружено, что SEQ ID NO:26-48 являются HLA-А2-рестриктированными эпитопными пептидами или кандидатами, которые могут индуцировать сильную и специфическую иммунную реакцию. Таким образом, эти фармацевтические вещества или композиции, которые включают в себя любой из этих пептидов с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:2-24 и 26-48, являются особенно подходящими для введения субъектам, HLA-антиген которых является HLA-А24 или HLA-А2. То же самое относится к фармацевтическим веществам или композициям, которые включают в себя полинуклеотиды, кодирующие любой из этих пептидов (т.е. полинуклеотиды данного изобретения).

[0102] Типы рака, подлежащие лечению фармацевтическими веществами или композициями этого изобретения, не являются ограниченными и включают в себя любой рак, в котором участвует (например, сверхэкспрессируется) HJURP, в том числе, но не только, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка.

[0103] Эти фармацевтические вещества или композиции могут содержать, наряду с вышеупомянутыми активными ингредиентами, другие пептиды, которые способны индуцировать CTL против раковых клеток, другие полинуклеотиды, кодирующие эти другие пептиды, другие клетки, которые презентируют эти другие пептиды, или т.п. Здесь, эти другие пептиды, которые способны индуцировать CTL против раковых клеток, иллюстрируются специфическими в отношении рака антигенами (например, идентифицированными TAA), но не ограничиваются ими.

[0104] Если необходимо, фармацевтические вещества или композиции данного изобретения могут произвольно включать в себя другие терапевтические вещества в качестве активного ингредиента, пока это вещество не ингибирует противоопухолевое действие этого активного ингредиента, например, любого из этих пептидов. Например, композиции могут включать в себя противовоспалительные вещества, болеутоляющие средства, химиотерапевтические вещества и т.п. Кроме включения других терапевтических веществ в сам лекарственный препарат, лекарственные препараты данного изобретения могут также вводиться последовательно или одновременно с одним или несколькими другими фармакологическими агентами или композициями. Количества лекарственного средства и фармакологического вещества или композиции зависит, например, от того, какой тип фармакологического агента (фармакологических агентов) или композиции (композиций) используется/используются, и от подлежащего лечению заболевания и схемы и способов введения.

Должно быть понятно, что кроме ингредиентов, конкретно упомянутых здесь, фармацевтические вещества или композиции данного изобретения могут включать в себя другие вещества или композиции, общепринятые в данной области, имеющие отношение к типу рассматриваемой композиции.

[0105] В одном варианте осуществления данного изобретения, эти фармацевтические вещества или композиции могут быть включены в изделия и наборы, содержащие материалы, полезные для лечения патологических состояний подлежащего лечению заболевания, например, рака. Это изделие может включать в себя контейнер любого из этих фармацевтических веществ или композиций с этикеткой. Подходящие контейнеры включают в себя бутылки, флаконы и тест-пробирки. Эти контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Этикетка на контейнере должна указывать вещество или композицию, которые используются для лечения или предотвращения одного или нескольких состояний этого заболевания. Этикетка может также содержать инструкции в отношении введения и т.д.

[0106] Кроме вышеописанного контейнера, набор, включающий в себя фармацевтический агент, вещество или композицию данного изобретения, может дополнительно произвольно включать в себя второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель. Он может дополнительно включать в себя другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включающие в себя другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши упаковки с инструкциями в отношении применения.

Фармацевтические композиции могут при желании быть представлены в упаковке или дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Эта упаковка может, например, включать в себя металлическую или пластиковую пленку, такую как блистерная упаковка. Эта упаковка или дозирующее устройство могут сопровождаться инструкциями для введения.

[0107] (1) Фармацевтические вещества или композиции, содержащие эти пептиды в качестве активного ингредиента

Пептиды данного изобретения могут вводиться непосредственно в виде фармацевтического агента, вещества или композиции, или, если желательно, может быть приготовлена общепринятыми способами приготовления. В последнем случае, кроме пептидов данного изобретения, могут быть включены носители, эксципиенты и т.п., которые обычно используются для лекарственных средств, в случае необходимости, без конкретных ограничений. Примерами таких носителей являются стерилизованная вода, физиологический раствор, фосфатный буфер, культуральная жидкость и т.п. Кроме того, эти фармацевтические вещества или композиции могут содержать в случае необходимости стабилизаторы, суспензии, консерванты, поверхностно-активные вещества и т.п. Эти фармацевтический агент, вещество или композиции данного изобретения могут быть использованы для противораковых целей.

[0108] Пептиды данного изобретения могут быть получены в виде комбинации, состоящей из двух или более пептидов данного изобретения, индуцирования CTL in vivo. Эти пептиды могут находиться в коктейле или могут быть коньюгированы друг с другом стандартными способами. Например, пептиды могут быть химически связаны или экспрессированы в виде одной слитой полипептидной последовательности, которая может иметь одну или более аминокислот в качестве линкера (например, лизинового линкера: K.S. Kawamura et al., J. Immunol, 2002, 168: 5709-5715). Пептиды в этой комбинации могут быть одинаковыми или различными. Посредством введения пептидов этого изобретения, эти пептиды презентируются при высокой плотности HLA-антигенами на APC, затем индуцируются CTL, которые специфически воздействуют на комплекс, образованный между представленным пептидом и HLA-антигеном. Альтернативно, APC (например, DC) удаляются из субъектов и затем стимулируются пептидами данного изобретения для получения АРС, которые презентируют любой из пептидов данного изобретения на их клеточной поверхности. Эти АРС повторно вводят в субъектов индуцирования CTL в этих субъектах, и в результате агрессивность в отношении опухолеспецифического эндотелия может увеличиваться.

[0109] Фармацевтические агенты или композиции для лечения и/или предотвращения рака или опухоли, которые включают в себя любой из пептидов этого изобретения в качестве активного ингредиента, могут также включать в себя адъювант, так что будет эффективно устанавливаться клеточный иммунитет, или они могут вводиться с другими активными ингредиентами, и они могут вводиться приготовлением в виде гранул. Адъювант относится к любым соединению, веществу или композиции, которые увеличивают иммунную реакцию против белка при введении вместе (или последовательно) с белком, имеющим иммунологическую активность. Адъюванты, которые могут применяться, включают в себя адъюванты, описанные в литературе (Clin Microbiol Rev 1994, 7:277-89). Примеры адъювантов включают в себя фосфат алюминия, гидроксид алюминия, квасцы, холерный токсин, токсин сальмонеллы, неполный адъювант Фрейнда (IFA), полный адъювант Фрейнда (CFA), ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, O/W-эмульсию и т.п., но не ограничиваются ими.

Кроме того, могут быть удобным образом использованы липосомные композиции, гранулярные композиции, в которых пептид связан с гранулами с диаметром, равным нескольким микрометрам, и композиции, в которых липид связан с пептидом.

[0110] В другом варианте осуществления данного изобретения, пептиды данного изобретения могут быть также введены в форме фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительные примеры этих солей включают в себя соли со щелочным металлом, соли с металлом, соли с органическим основанием, соли с органической кислотой и соли с неорганической кислотой. В данном контексте, термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к тем солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства этого соединения и которые получены реакцией с неорганическими кислотами или основаниями, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и т.п. Примеры предпочтительных солей включают в себя соли со щелочным металлом, соли с металлом, соли с органическим основанием, соли с органической кислотой и соли с неорганической кислотой.

[0111] В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические агенты или композиции данного изобретения могут дополнительно включать в себя компонент, который примирует CTL. Липиды были идентифицированы в качестве агентов или композиций, способных к примированию CTL in vivo против вирусных антигенов. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут быть присоединены к эпсилон- и альфа-аминогруппам остатка лизина и затем связаны с пептидом данного изобретения. Липидированные пептиды могут быть затем либо введены непосредственно в мицелле или частице, включенными в липосому, либо эмульгированными в адъюванте. В качестве другого примера примирования липидом CTL-реакций, липопротеины E. coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинилсерилсерин (P3CSS), могут быть использованы для примирования CTL при ковалентном присоединении к соответствующему пептиду (смотрите, например, Deres et al., Nature 1989, 342:561-4).

[0112] Способ введения может быть пероральным способом, внутрикожной, подкожной, внутривенной инъекций или т.п., и системным введением или локальным введением вблизи участков-мишеней. Это введение может быть выполнено одиночным введением или может быть усилено множественными введениями. Доза пептидов этого изобретения может корректироваться подходящим образом в соответствии с подлежащим лечению заболеванием, возрастом пациента, массой, способом введения и т.п., и равна обычно 0,001-1000 мг, например, 0,01-100 мг, например, 0,1-10 мг, и может вводиться один раз в несколько дней - несколько месяцев. Специалист, с квалификацией в данной области, может соответствующим образом выбрать подходящую дозу.

[0113] (2) Фармацевтические агенты или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента

Фармацевтические агенты или композиции данного изобретения могут также содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды, описанные здесь, в экспрессируемой форме. Здесь, фраза "в экспрессируемой форме" означает, что этот полинуклеотид, при введении в клетку, будет экспрессироваться in vivo в виде полипептида, который индуцирует противоопухолевый иммунитет. В одном иллюстрируемом варианте осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты представляющего интерес полинуклеотида включает в себя регуляторные элементы, необходимые для экспрессии этого полинуклеотида. Полинуклеотид (полинуклеотиды) могут быть оснащены таким образом, чтобы устойчиво инсертироваться в геном клетки-мишени (смотрите, например, Thomas KR % Capecchi MR, Cell 1987, 51:503-12 в отношении описания гомологичных рекомбинантных кассетных векторов). См., например, Wolff et al., Science 1990, 247:1465-8; патенты США с номерами: 5580859, 5589466, 5804566, 5739118, 5736524, 5679647; и WO 98/04720. Примеры технологий на основе ДНК-доставки включают в себя "голую ДНК", облегченную (бупивакаин-опосредованную, опосредованную полимерами, пептид-опосредованную) доставку, катионные липидные комплексы и доставку посредством частиц ("генную пушку") или опосредованную давлением доставку (смотрите, например, патент США № 5922687).

[0114] Пептиды данного изобретения могут также экпрессироваться вирусными или бактериальными векторами. Примеры экспрессирующих векторов включают в себя аттенуированных вирусных хозяев, таких как коровья оспа или оспа птиц. Этот подход включает в себя использование вируса коровьей оспы, например, в качестве вектора для экспрессии нуклеотидных последовательностей, которые кодируют этот пептид. После введения в хозяина этот рекомбинантный вирус коровьей оспы экспрессирует иммунногенный пептид, и посредством этого индуцирует иммунную реакцию. Векторы коровьей оспы и способы, применимые в протоколах иммунизации, описаны, например, в патенте США № 4722848. Другим примером является BCG (Bacille Calmette Guerin). Векторы BCG описаны в Stover et al., Nature 1991, 351:456-60. Большое разнообразие других векторов, применимых для терапевтического введения или иммунизации, например, адено- и аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы Salmonella typhi, детоксифицированные векторы токсина сибирской язвы и т.п., будут очевидными. См., например, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6:66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68:793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14:571-85.

Доставка полинуклеотида в субъекта может быть или прямой, когда субъект непосредственно подвергается действию несущего полинуклеотид вектора, или опосредованной, когда, клетки сначала трансформируют представляющим интерес полинуклеотидом in vitro, затем эти клетки трансплантируют в этого субъекта. Эти два подхода известны, соответственно, как генная терапия in vivo и ex vivo.

[0115] В отношении общих обзоров способов генной терапии смотрите Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215. Способы, обычно известные в области технологии рекомбинантных ДНК, которые также могут использоваться для данного изобретения, описаны в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York 1993; и Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, 1990.

[0116] Способ введения может быть пероральным способом, внутрикожной, подкожной, внутривенной инъекцией или т.п., и системное введение или локальное введение вблизи участков-мишеней находит применение. Введение может быть выполнено одиночным введением или усилено множественными введениями. Доза полинуклеотида в подходящем носителе или клетках, трансформированных полинуклеотидом, кодирующим пептиды этого изобретения, может корректироваться подходящим образом в соответствии с подлежащим лечению заболеванием, возрастом пациента, массой, способом введения и т.п., и равна обычно 0,001-1000 мг, например, 0,01-100 мг, например, 0,1-10 мг, и может вводиться один раз каждые несколько дней - один раз каждые несколько месяцев. Специалист, с квалификацией в данной области, может соответствующим образом выбрать подходящую дозу.

[0117] X. Способы применения этих пептидов, экзосом, APC и CTL

Пептиды и полинуклеотиды данного изобретения могут использоваться индуцирования APC и CTL. Экзосомы и APC данного изобретения могут также использоваться индуцирования CTL. Пептиды, полинуклеотиды, экзосомы и APC могут использоваться в комбинации с любыми другими соединениями, пока эти дополнительные соединения не ингибируют их CTL-индуцибельность. Таким образом, любой из вышеупомянутых фармацевтических веществ или композиций данного изобретения может использоваться индуцирования CTL. Кроме того, фармацевтические вещества или композиции, включающие в себя пептиды и полинуклеотиды, могут также применяться индуцирования APC, как обсуждается ниже.

[0118] (1) Способ индуцирования антигенпрезентирующих клеток (APC)

Данное изобретение обеспечивает способы индуцирования АРС с высокой CTL-индуцибельностью с использованием пептидов или полинуклеотидов данного изобретения.

Способы данного изобретения предусматривают стадию приведения APC в контакт с пептидами данного изобретения in vitro, ex vivo или in vivo. Например, способ контактирования АРС с пептидами ex vivo может предусматривать стадии:

a: сбора APC из субъекта, и

b: контактирования АРС стадии а с пептидом.

APC не ограничиваются конкретным видом клеток и включают в себя LC, клетки Лангерганса, макрофаги, В-клетки и активированные Т-клетки, о которых известно, что они презентируют белковые антигены на их клеточной поверхности так, чтобы быть распознаваемыми лимфоцитами. Предпочтительно, DC могут быть использованы, так как они имеют самую сильную CTL-индуцибельность среди APC. Любые пептиды данного изобретения могут быть использованы сами по себе или с другими пептидами данного изобретения.

[0119] С другой стороны, когда пептиды данного изобретения вводят субъекту, эти АРС контактируют с пептидами in vivo, следовательно, эти АРС с высокой CTL-индуцибельностью индуцируются в теле этого субъекта. Таким образом, данное изобретение предусматривает введение пептидов данного изобретения субъекту. Подобным образом, при введении полинуклеотидов данного изобретения субъекту в экспрессируемой форме, пептиды данного изобретения экспрессируются и контактируют с АРС in vivo, следовательно, эти АРС с высокой CTL-индуцибельностью индуцируются в теле этого субъекта. Таким образом, данное изобретение может также включать в себя введение полинуклеотидов данного изобретения субъекту. "Экспрессируемая форма" описана выше в разделе "IX. Фармацевтические вещества или композиции, (2) Фармацевтические вещества или композиции, содержащие полинуклеотиды в качестве активного ингредиента".

[0120] Кроме того, данное изобретение может предусматривать введение полинуклеотида данного изобретения в АРС для индукции APC с CTL-индуцибельностью. Например, этот способ может предусматривать стадии:

a: сбора АРС из субъекта; и

b: введения полинуклеотида, кодирующего пептид данного изобретения.

Стадия b может выполняться, как описано выше в разделе "VI. Антигенпрезентирующие клетки".

[0121] Альтернативно, данное изобретение обеспечивает способ получения антигенпрезентирующей клетки (АРС), которая специфически индуцирует CTL-активность против HJURP, где этот способ может предусматривать следующие стадии:

(a) приведения APC в контакт с пептидом данного изобретения in vitro, ex vivo или in vivo; и

(b) введения полинуклеотида, кодирующего пептид данного изобретения, в АРС.

[0122] (2) Способ индуцирования CTL

Данное изобретение обеспечивает также способы индуцирования CTL с использованием пептидов, полинуклеотидов, экзосом или APC данного изобретения.

Данное изобретение обеспечивает также способы индуцирования CTL с использованием полинуклеотида, кодирующего полипептид, который способен образовывать субъединицу Т-клеточного рецептора (TCR), распознающую комплекс пептидов данного изобретения и HLA-антигенов. Предпочтительно, эти способы индуцирования CTL могут включать в себя по меньшей мере одну стадию, выбранную из:

a) контактирования CD8-положительной Т-клетки с антигенпрезентирующей клеткой и/или экзосомой, которая презентирует на ее поверхности комплекс HLA-антигена и пептида данного изобретения, и

b) введения полинуклеотида, кодирующего полипептид, который способен образовывать субъединицу TCR, распознающую комплекс пептида данного изобретения и HLA-антигена, в CD8-положительную T-клетку.

[0123] При введении пептидов, полинуклеотидов, АРС или экзосом данного изобретения субъекту, CTL индуцируются в теле субъекта, и сила иммунной реакции, нацеленной на раковые клетки, увеличивается. Таким образом, способы данного изобретения предусматривают стадию введения пептидов, полинуклеотидов, АРС или экзосом данного изобретения субъекту.

[0124] Альтернативно, CTL могут быть также индуцированы с использованием их ex vivo, и после индуцирования CTL, эти активированные CTL могут быть возвращены субъекту. Например, этот способ может включать в себя стадии:

a: сбора APC из субъекта;

b: контактирования АРС стадии а с этим пептидом; и

c: сокультивирования АРС стадии b с CD8-положительными клетками.

[0125] APC, подлежащие сокультивированию с CD8-положительными клетками в вышеуказанной стадии c, могут быть также получены переносом гена, который включает в себя полинуклеотид данного изобретения, в АРС, как описано выше в разделе "VI. Антигенпрезентирующие клетки"; хотя данное изобретение не ограничивается этим и включает в себя любые APC, которые эффективно презентируют на их поверхности комплекс HLA-антигена и пептида данного изобретения.

Вместо таких APC, могут быть также использованы экзосомы, которые презентируют на их поверхности комплекс HLA-антигена и пептида данного изобретения. А именно, данное изобретение может также предусматривать стадию сокультивирования экзосом, презентирующих на их поверхности комплекс HLA-антигена и пептида данного изобретения. Такие экзосомы могут быть получены способами, описанными в разделе "V. Экзосомы".

[0126] Кроме того, CTL могут быть индуцированы введением гена, который включает в себя полинуклеотид, кодирующий субъединицу TCR, связывающуюся с пептидом данного изобретения, в CD8-положительные клетки. Такая трансдукция может выполняться, как описано выше в разделе "VIII. T-клеточный рецептор (TCR)".

Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ или процесс для приготовления фармацевтических агента, вещества или композиции, индуцирующих CTL, где этот способ предусматривает стадию смешивания или образования пептида данного изобретения с фармацевтически приемлемым носителем.

[0127] (3) Способ индуцирования иммунной реакции

Кроме того, данное изобретение обеспечивает способы индуцирования иммунной реакции против заболеваний связанных с HJURP. Подходящие заболевания могут включать в себя рак, примеры которого включают в себя, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка.

[0128] Способы данного изобретения могут включать в себя стадию введения вещества (веществ) или композиции (композиций), содержащих любые из пептидов данного изобретения или полинуклеотидов, кодирующих их. Способ этого изобретения может также рассматривать введение экзосом или АРС, презентирующих пептиды данного изобретения. В отношении подробностей, смотрите пункт "IX. Фармацевтические вещества или композиции", в частности, часть, описывающую применение фармацевтических веществ или композиций данного изобретения в качестве вакцин. Кроме того, экзосомы и АРС, которые могут быть использованы для данных способов индуцирования иммунной реакции, описаны детально под пунктами "V. Экзосомы", "VI. Антигенпрезентирующие клетки (APC)" и (1) и (2) "X. Способы применения пептидов, экзосом, АРС и CTL", supra.

[0129] Данное изобретение обеспечивает также способ или процесс для приготовления фармацевтических агента, вещества или композиции, индуцирующих иммунную реакцию, где этот способ может включать в себя стадию смешивания или приготовления пептида данного изобретения с фармацевтически приемлемым носителем.

[0130] Альтернативно, способ данного изобретения может включать в себя стадию введения вакцины или фармацевтической композиции данного изобретения, которая содержит:

(a) пептид данного изобретения;

(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую такой пептид, как описанный здесь, в экспрессируемой форме;

(c) APC или экзосому, презентирующую пептид данного изобретения на ее поверхности; или

(d) цитотоксическую Т-клетку данного изобретения.

[0131] В контексте данного изобретения, рак, сверхэкспрессирующий HJURP, может лечиться этими активными ингредиентами. Примеры таких типов рака включают в себя, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка. Таким образом, перед введением вакцин или фармацевтических композиций, содержащих эти активные ингредиенты, предпочтительно подтвердить, увеличен ли уровень экспрессии HJURP в биологических пробах, подлежащих лечению, в сравнении с нормальными клетками того же самого органа. Таким образом, в одном варианте осуществления, данное изобретение обеспечивает способ лечения рака, сверхэкспрессирующего HJURP, который может предусматривать стадии:

i) определения уровня экспрессии HJURP в биологической пробе (биологических пробах), полученных из субъекта с подлежащим лечению раком;

ii) сравнения этого уровня экспрессии HJURP с нормальным контролем; и

iii) введения по меньшей мере одного компонента, выбранного из (a)-(d), описанных выше, субъекту с раком, сверхэкспрессирующим HJURP в сравнении с нормальным контролем.

[0132] Альтернативно, данное изобретение обеспечивает также вакцину или фармацевтическую композицию, которая содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из (a)-(d), описанных выше, для применения во введении субъекту, имеющему рак, сверхэкспрессирующий HJURP. Другими словами, данное изобретение обеспечивает дополнительно способ идентификации субъекта, подлежащего лечению полипептидом HJURP данного изобретения, причем такие способы предусматривают стадию определения уровня экспрессии HJURP в полученной из субъекта биологической пробе (биологических пробах), причем увеличение этого уровня в сравнении с уровнем нормального контроля этого гена указывает на то, что этот субъект имеет рак, который может лечиться полипептидом HJURP данного изобретения. Способы лечения рака данного изобретения описаны более подробно ниже.

[0133] Любая полученная из субъекта клетка или ткань может быть использована для определения экспрессии HJURP, пока эта клетка или ткань включает в себя продукт транскрипции или трансляции HJURP, являющийся мишенью. Примеры подходящих проб включают в себя, но не ограниваются ими, ткани и жидкости тела, такие как кровь, слюна и моча. Предпочтительно, проба клеток или ткани, полученная из субъекта, содержит клеточную популяцию, включающую в себя эпителиальную клетку, более предпочтительно раковую эпителиальную клетку или эпителиальную клетку, полученную из ткани, которая предположительно является раковой. Далее, в случае необходимости, эта клетка может быть очищена из полученных тканей и жидкостей тела, и затем использована в качестве пробы, полученной из субъекта.

Субъект, подлежащий лечению данным способом, является предпочтительно млекопитающим. Примерные млекопитающие включают в себя, но не ограничиваются ими, например, человека, примата не человека, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь и корову.

[0134] Согласно данному изобретению, может быть определен уровень экспрессии HJURP в биологических пробах, полученных из субъекта. Этот уровень экспрессии может быть определен по уровню продукта транскрипции (нуклеиновой кислоты) с использованием способов, известных в данной области. Например, мРНК HJURP может быть количественно определена с использованием зондов способами гибридизации (например, Нозерн-гибридизации). Это детектирование может проводиться на чипе или микроэррее или т.п. Применение микроэррея является предпочтительным для детектирования уровня экспрессии HJURP. Специалисты, квалифицированные в данной области, могут приготовить такие зонды с использованием информации последовательности HJURP. Например, в качестве зондов может быть использована кДНК HJURP. Если необходимо, эти зонды могут быть помечены подходящей меткой, такой как красители, флуоресцентные вещества и изотопы, и уровень экспрессии этого гена может быть детектирован в виде интенсивности гибридизуемых меток.

Кроме того, продукт транскрипции HJURP (например, SEQ ID NO:49) может быть количественно определен с использованием праймеров способами детектирования на основе амплификации (например, ОТ-ПЦР). Такие праймеры могут быть получены на основе доступной информации последовательности этого гена.

[0135] Конкретно, зонд или праймер, используемые для данного способа, гибридизуются при строгих, умеренно строгих условиях или при условиях низкой строгости с мРНК HJURP. В данном контексте, фраза, "строгие условия (гибридизации)" относится к условиям, при которых зонд или праймер будет гибридизоваться с его последовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями. Строгие условия являются последовательность-зависимыми и будут различаться при различных обстоятельствах. Специфическая гибридизация более длинных последовательностей наблюдается при более высоких температурах, чем гибридизация более коротких последовательностей. Обычно, температура строгих условий выбирается таким образом, что она приблизительно на 5 градусов Цельсия ниже температуры тепловой точки плавления (Тм) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и pH. Тм является температурой (при определенных ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных их последовательности-мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в равновесном состоянии. Поскольку эти последовательности-мишени обычно присутствуют в избытке, при Тм, 50% этих зондов являются занятыми в равновесном состоянии. Обычно, строгими условиями являются условия, при которых концентрация соли меньше, чем приблизительно 1,0 М ионов натрия, обычно приблизительно 0,01-1,0 М ионов натрия (или других солей) при pH 7,0-8,3, и температура равна по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов и праймеров (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для более длинных зондов и праймеров. Строгие условия могут также быть достигнуты добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид.

[0136] Зонд или праймер данного изобретения является обычно по существу очищенным олигонуклеотидом. Этот олигонуклеотид обычно включает в себя район нуклеотидной последовательности, который гибридизуется при строгих условиях с имеющей по меньшей мере приблизительно 2000, 1000, 500, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 или 25 последовательных нуклеотидов последовательностью смысловой цепи нуклеиновой кислоты, включающей в себя последовательность HJURP, или природно-встречающегося мутанта этих последовательностей. В частности, например, в предпочтительном варианте осуществления, олигонуклеотид, имеющий 5-50 нуклеотидов в длину, может быть использован в качестве праймера для амплификации генов, подлежащих детектированию. Более предпочтительно, мРНК или кДНК гена HJURP могут быть детектированы с олигонуклеотидным зондом или праймером конкретного размера, обычно с длиной 15-30 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления, длина этого олигонуклеотидного зонда или праймера может быть выбрана из 15-25. Процедуры анализа, устройства или реагенты для детектирования гена с использованием таких олигонуклеотидных зондов или праймеров хорошо известны (например, олигонуклеотидный микроэррей или ПЦР). В этих анализах зонды или праймеры могут также включать в себя метку или линкерные последовательности. Далее, зонды или праймеры могут быть модифицированы детектируемой меткой или аффинным лигандом для их улавливания. Альтернативно, в процедурах детектирования на основе гибридизации, полинуклеотид, имеющий несколько сотен (например, приблизительно 100-200) оснований - несколько тысяч (например, приблизительно 1000-2000) оснований в длину, может быть также использован для зонда (например, в нозерн-блоттинг-анализе или анализе с использованием кДНК-микроэррея).

[0137] Альтернативно, продукт трансляции может детектироваться для диагностики данного изобретения. Например, может быть определено количество белка HJURP (SEQ ID NO:50). Способы определения количества белка в продукте трансляции включает в себя способы иммуноанализа, которые используют антитело, специфически распознающее этот белок. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, любой фрагмент или любая модификация (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab')₂, Fv и т.д.) антитела могут быть использованы для детектирования, пока этот фрагмент или модифицированное антитело сохраняет способность связывания с белком HJURP. Такие антитела против пептидов данного изобретения и их фрагменты также обеспечены данным изобретением. Способы получения этих видов антител для детектирования белков хорошо известны в данной области, и любой способ может использоваться в данном изобретении для получения таких антител и их эквивалентов.

[0138] В качестве другого способа детектирования уровня экспрессии гена HJURP, основанного на его продукте трансляции, может быть измерена интенсивность окрашивания посредством иммунногистохимического анализа с использованием антитела против белка HJURP. А именно, в данном измерении сильное окрашивание указывает на увеличенное присутствие/увеличенный уровень этого белка и, в то же самое время, на высокий уровень экспрессии гена HJURP.

Уровень экспрессии гена-мишени, например, гена HJURP, в раковых клетках может быть определен как увеличенный, если этот уровень увеличивается выше контрольного уровня (например, уровня в нормальных клетках) гена-мишени, например, на 10%, 25% или 50%; или увеличивается более чем в 1,1 раза, более чем в 1,5 раза, более чем в 2,0 раза, более чем в 5,0 раз, более чем в 10,0 раз, или более.

[0139] Этот контрольный уровень может быть определен в то же самое время, что и в раковых клетках, с использованием пробы (проб), собранных ранее и сохраненных, из субъекта/субъектов, состояние болезни которого/которых (ракового или неракового) известно. Кроме того, нормальные клетки, полученные из незлокачественных областей органа, который имеет подлежащий лечению рак, могут использоваться в качестве нормального контроля. Альтернативно, уровень контроля может быть определен статистическим способом, основанным на результатах, полученных анализом ранее определенного уровня (ранее определенных уровней) экспрессии гена HJURP в пробах из субъектов, состояния болезни которых известны. Кроме того, этот контрольный уровень может быть получен из базы данных картин (паттернов) экспрессии из ранее тестированных клеток. Кроме того, согласно одному аспекту данного изобретения, уровень экспрессии гена HJURP в биологической пробе можно сравнить с многочисленными контрольными уровнями, определенными из множественных ссылочных проб. Предпочтительно использовать контрольный уровень, определенный для ссылочной пробы, полученной из типа ткани, сходного с типом ткани биологической пробы, полученной из субъекта. Кроме того, предпочтительно использовать стандартную величину уровней экспрессии гена HJURP в популяции с известным состоянием болезни. Эта стандартная величина может быть получена любым способом, известным в данной области. Например, диапазон среднего +/-2 S.D. или среднего +/-3 S.D. может быть использован в качестве этой стандартной величины.

[0140] В контексте данного изобретения, контрольный уровень, определенный из биологической пробы, которая, как известно, является нераковой, называют "нормальным контрольным уровнем". С другой стороны, если этот контрольный уровень определен из раковой биологической пробы, его называют "раковым контрольным уровнем". Различие между уровнем экспрессии пробы и контрольным уровнем может быть нормализовано относительно уровня экспрессии контрольных нуклеиновых кислот, например, генов домашнего хозяйства, уровни экспрессии которых, как известно, не различаются в зависимости от ракового или неракового состояния клетки. Примерные контрольные гены включают в себя, но не ограничиваются ими, гены бета-актина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и рибосомного белка P1.

Когда уровень экспрессии гена HJURP является увеличенным в сравнении с нормальным контрольным уровнем или является сходным/эквивалентным относительно ракового контрольного уровня, этот субъект может диагностироваться как имеющий подлежащий лечению рак.

[0141] Данное изобретение обеспечивает способ (i) диагностирования наличия у субъекта подлежащего лечению рака, и/или (ii) отбора субъекта для лечения рака, предусматривающий стадии:

a) определения уровня экспрессии HJURP в биологической пробе (биологических пробах), полученных из субъекта, который предположительно имеет подлежащий лечению рак;

b) сравнения этого уровня экспрессии HJURP с нормальным контрольным уровнем;

c) диагностирования этого субъекта как имеющего подлежащий лечению рак, если этот уровень экспрессии HJURP является увеличенным в сравнении с нормальным контрольным уровнем; и

d) отбора субъекта для лечения рака, если этот субъект диагностирован как имеющий подлежащий лечению рак, на стадии c).

[0142] Альтернативно, такой способ может включать стадии:

a) определения уровня экспрессии HJURP в биологической пробе (биологических пробах), полученных из субъекта, который предположительно имеет подлежащий лечению рак;

b) сравнения уровня экспрессии HJURP с раковым контрольным уровнем;

c) диагностирования этого субъекта как имеющего подлежащий лечению рак, если этот уровень экспрессии HJURP является сходным или эквивалентным относительно ракового контрольного уровня; и

d) отбор субъекта для лечения рака, если этот субъект диагностирован как имеющий подлежащий лечению рак, на стадии c).

[0143] Данное изобретение обеспечивает также диагностический набор для диагностики или определения субъекта, страдающего от рака, который может лечиться полипептидом HJURP данного изобретения, который может быть также применим в оценивании и/или мониторинге эффективности или применимости противораковой иммунотерапии. Предпочтительно этот рак включает в себя, но не ограничивается ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка. Более конкретно, этот набор предпочтительно может включать в себя по меньшей мере один реагент для детектирования экспрессии гена HJURP в полученной из субъекта клетке, причем такой реагент выбран из группы:

(a) реагента для детектирования мРНК гена HJURP;

(b) реагента для детектирования белка HJURP или его иммунологического фрагмента; и

(c) реагента для детектирования биологической активности белка HJURP.

[0144] Примеры реагентов, подходящих для детектирования мРНК гена HJURP, могут включать в себя нуклеиновые кислоты, которые специфически связываются с мРНК HJURP или идентифицируют мРНК HJURP, такие как олигонуклеотиды, которые имеют последовательность, комплементарную части мРНК HJURP. Эти виды олигонуклеотидов иллюстрируются праймерами и зондами, которые являются специфическими в отношении мРНК HJURP. Эти виды олигонуклеотидов могут быть получены на основе способов, хорошо известных в этой области. Если необходимо, реагент для детектирования мРНК HJURP может быть иммобилизован на твердом матриксе. Кроме того, в этом наборе может быть включен более чем один реагент для детектирования мРНК HJURP.

[0145] С другой стороны, примеры реагентов, подходящих для детектирования белка HJURP или его иммунологического фрагмента, могут включать в себя антитела к белку HJURP или к его иммунологическому фрагменту. Это антитело может быть моноклональным или поликлональным. Кроме того, любой фрагмент или модификация (например, химерное антитело, scFv, Fab, F(ab')₂, Fv и т.д.) этого антитела может использоваться в качестве этого реагента, пока этот фрагмент или модифицированное антитело сохраняют способность связывания с белком HJURP. Способы получения этих видов антител для детектирования белков хорошо известны в данной области, и любой способ может быть использован в данном изобретении для получения таких антител и их эквивалентов. Кроме того, это антитело может быть меченым генерирующими сигнал молекулами посредством образования прямой связи или способом непрямого мечения. Метки и способы для мечения антител и детектирования связывания антител с их мишенями хорошо известны в данной области, и любые метки и способы могут быть использованы для данного изобретения. Кроме того, в этом наборе может быть включен более чем один реагент для детектирования белка HJURP.

[0146] Этот набор может содержать более чем один из вышеупомянутых реагентов. Этот набор может дополнительно включать в себя твердый матрикс и реагент для связывания зонда против гена HJURP или антитела против пептида HJURP, среду и контейнер для культивирования клеток, реагенты положительного и отрицательного контроля, и вторичное антитело для детектирования антитела против пептида HJURP. Например, пробы ткани, полученные из субъектов без рака или страдающих от рака, могут служить в качестве контрольных реагентов. Набор данного изобретения может дополнительно включать в себя другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, в том числе буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши упаковки (например, написанные, в виде магнитной ленты, CD-ROM и т.д.) с инструкциями для применения. Эти реагенты и т.п. могут храниться в контейнере с этикеткой. Подходящие контейнеры могут включать в себя бутылки, флаконы и тест-пробирки. Эти контейнеры могут быть выполнены из различных материалов, таких как стекло или пластик.

[0147] В одном варианте осуществления данного изобретения, когда этот реагент является зондом против мРНК HJURP, этот реагент может быть иммобилизован на твердом матриксе, таком как пористая полоска, для образования по меньшей мере одного участка детектирования. Зона измерения или детектирования этой пористой полоски может включать в себя множество участков, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту (зонд). Тест-полоска может также включать в себя участки для отрицательных и/или положительных контролей. Альтернативно, контрольные участки могут быть расположены на полоске, отдельной от этой тест-полоски. Необязательно, эти различные участки детектирования могут содержать различное количество иммобилизованных нуклеиновых кислот, то есть, более высокое количество в первом участке детектирования и меньшие количества в последующих участках. После добавления тест-пробы, количество участков, демонстрирующих детектируемый сигнал, обеспечивает количественный показатель количества мРНК HJURP, присутствующей в этой пробе. Эти участки детектирования могут иметь конфигурацию любой удобно детектируемой формы и находятся обычно в форме столбика или точки, охватывающих ширину тест-полоски.

[0148] Этот набор данного изобретения может дополнительно включать в себя пробу положительного контроля или пробу стандарта HJURP. Проба положительного контроля данного изобретения может быть изготовлена сбором HJURP-положительных проб и оцениванием их уровня HJURP. Альтернативно, очищенный белок или полинуклеотид HJURP может быть добавлен к клеткам, которые не экспрессируют HJURP, для образования положительной пробы или пробы стандарта HJURP. В данном изобретении очищенный HJURP может быть рекомбинантным белком. Уровень HJURP пробы положительного контроля является, например, большим, чем предельная величина.

В одном варианте осуществления данное изобретение дополнительно обеспечивает диагностический набор, включающий в себя белок или его частичный белок, способный специфически распознавать антитело данного изобретения или его фрагмент.

[0149] Примеры частичного пептида белка данного изобретения включают в себя полипептиды, состоящие из по меньшей мере 8, предпочтительно 15 и более предпочтительно 20 смежных аминокислот в аминокислотной последовательности белка данного изобретения. Рак может быть диагностирован детектированием антитела в пробе (например, крови, ткани) с использованием белка или пептида (полипептида) данного изобретения. Способ получения белка данного изобретения и пептидов является таким же, какой описан выше.

Способы диагностирования рака данного изобретения может выполняться определением различия между количеством анти-HJURP-антитела и количества в соответствующей контрольной пробе, как описано выше. Субъект предположительно страдает от рака, если биологические пробы этого субъекта содержат антитела против продуктов экспрессии (HJURP) этого гена, и определено, что количество этого анти-HJURP-антитела является большим, чем величина отсечения (предельная величина) в уровне, в сравнении с величиной в нормальном контроле.

[0150] В другом варианте осуществления диагностический набор данного изобретения может включать в себя пептид данного изобретения и HLA-молекулу, связывающуюся с ним. Способ детектирования антигенспецифических CTL с использованием антигенных пептидов и HLA-молекул уже был установлен (например, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6). Таким образом, комплекс пептида данного изобретения и HLA-молекулы может быть применен к этом способу детектирования для детектирования специфических в отношении опухолевого антигена CTL, позволяя раннее детектирование рецидива и/или метастазирования рака. Далее, его можно использовать для выбора субъектов, подходящих для лечения фармацевтическими веществами, включающими в себя пептид данного изобретения в качестве активного ингредиента, или для оценивания эффекта лечения этими фармацевтическими веществами.

[0151] Конкретно, согласно известному способу (смотрите, например, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6), можно приготовить олигомерный комплекс, такой как тетрамер, радиоактивной HLA-молекулы и пептида данного изобретения. С использованием этого комплекса, может быть выполнена диагностика, например, количественным определением специфических в отношении антигена-пептида CTL в лимфоцитах периферической крови, полученных из субъекта, предположительно страдающего от рака.

[0152] Данное изобретение дополнительно обеспечивает способ или диагностические агенты для оценивания иммунологической реакции субъекта с использованием пептидных эпитопов, описанных здесь. В одном варианте осуществления этого изобретения, HLA-A24- или HLA-A02-рестриктированные пептиды, описанные здесь, могут быть использованы в качестве реагентов для оценивания или прогнозирования иммунной реакции субъекта. Подлежащая оцениванию иммунная реакция может быть индуцирована контактированием иммуногена с иммунокомпетентными клетками in vitro или in vivo. В предпочтительных вариантах осуществления, эти иммунокомпетентные клетки для оценивания иммунологической реакции могут быть выбраны из периферической крови, лимфоцитов периферической крови (PBL) и мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Способы сбора или выделения таких иммунокомпетентных клеток, хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления, любые вещества или композиции, которые могут приводить к продуцированию антиген-специфических CTL, которые распознают пептидные эпитопы и связываются с пептидными эпитопами, могут быть использованы в качестве этого реагента. Эти пептидные реагенты не должны обязательно использоваться в качестве этого иммуногена. Системы анализа, которые используются для такого анализа, включают в себя относительно недавние технические новшества, такие как тетрамеры, окрашивание на внутриклеточные лимфокины и анализы высвобождения интерферона или ELISPOT-анализы. В одном предпочтительном варианте осуществления, иммунокомпетентными клетками для контактирования с пептидным реагентом могут быть антигенпрезентирующие клетки, в том числе дендритные клетки.

[0153] Например, пептиды данного изобретения могут быть использованы в анализах окрашивания тетрамера для оценивания мононуклеарных клеток периферической крови на присутствие антигенспецифических CTL после подвергания их действию антигена опухолевых клеток или иммуногена. Этот HLA-тетрамерный комплекс может быть использован для прямой визуализации антигенспецифических CTL (смотрите, например, Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; и Altman et al, Science 174: 94-96, 1996) и определения частоты встречаемости популяции антигенспецифических CTL в пробе мононуклеарных клеток периферической крови. Тетрамерный реагент, использующий пептид этого изобретения, может быть генерирован, как описано ниже.

[0154] Пептид, который связывается с HLA-молекулой, подвергается рефолдингу в присутствии соответствующей тяжелой цепи HLA и бета-2-микроглобина для генерирования тримолекулярного комплекса. В этом комплексе, карбоксильный конец тяжелой цепи является биотинилированным в сайте, который предварительно конструировали в этот белок. Затем, к этому комплексу добавляют стрептавидин для образования тетрамера, состоящего из этого тримолекулярного комплекса и стрептавидина. При помощи флуоресцентно меченого стрептавидина этот тетрамер может быть использован для окрашивания антигенспецифических клеток. Затем эти клетки идентифицируют, например, проточной цитометрией. Такой анализ может быть использован для диагностических или прогностических целей. Клетки, идентифицированные посредством этой процедуры, могут быть также использованы для терапевтических целей.

[0155] Данное изобретение обеспечивает также реагенты для оценивания иммунных анамнестических реакций (смотрите, например, Bertoni et al, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997 и Penna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991), включающие в себя пептиды данного изобретения. Например, пробы PBMC пациента из индивидуумов с раком, подлежащим лечению, могут быть анализированы на присутствие антигенспецифических CTL с использованием специфических пептидов. Проба крови, содержащая мононуклеарные клетки, может быть оценена культивированием этих PBMC и стимуляцией этих клеток пептидом этого изобретения. После подходящего периода культивирования, размноженная популяция клеток может быть анализирована, например, на CTL-активность.

[0156] Эти пептиды могут быть также использованы в качестве реагентов для оценивания эффективности вакцины. PBMC, полученные из пациента, вакцинированного иммуногеном, могут быть анализированы с использованием, например, любого из вышеописанных способов. Пациента HLA-типируют, и пептидные эпитопные реагенты, которые распознают аллель-специфические молекулы, присутствующие в пациенте, отбирают для этого анализа. Иммуногенность вакцины может быть показана присутствием эпитопспецифических CTL в пробе PBMC. Пептиды этого изобретения могут быть также использованы для получения антител, с использованием способов, хорошо известных в данной области (смотрите, например, CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; и Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), которые могут найти применение в качестве реагентов для диагностики, детектирования или мониторинга рака. Такие антитела могут включать в себя антитела, которые распознают пептид в контексте HLA-молекулы, т.е. антитела, которые связываются с комплексом пептид-МНС.

[0157] Пептиды и композиции данного изобретения имеют ряд дополнительных применений, некоторые из которых описаны здесь. Например, данное изобретение обеспечивает способ диагностики или детектирования нарушения, характеризуемого экспрессией или презентацией иммуногенного полипептида HJURP. Эти способы включают в себя определение экспрессии или презентации HLA-связывающего пептида HJURP или комплекса HLA-связывающего пептида HJURP и молекулы HLA класса I в биологической пробе. Эта экспрессия или презентация пептида или комплекса пептида и молекулы HLA класса I может быть определена или детектирована анализом с партнером связывания для этого пептида или комплекса. В одном предпочтительном варианте осуществления, партнером связывания для этого пептида или комплекса может быть антитело, которое распознает этот пептид или комплекс и специфически связывается с этим пептидом или комплексом. Экспрессия HJURP в биологической пробе, такой как биопсия опухоли, может быть также тестирована стандартными протоколами ПЦР-амплификации с использованием праймеров HJURP. Один пример экспрессии опухоли представлен здесь, и дополнительное описание примерных условий и праймеров для амплификации HJURP может быть найдено в WO2003/27322.

[0158] Предпочтительно, эти диагностические способы включают в себя контактирование биологической пробы, выделенной из субъекта, с веществом, специфическим в отношении HLA-связывающего пептида HJURP, для детектирования присутствия HLA-связывающего пептида HJURP в этой биологической пробе. В данном контексте, "контактирование" означает помещение биологической пробы в достаточной близости относительно этого агента и при подходящих условиях, например, концентрации, температуры, времени, ионной силы, для возможности специфического взаимодействия между этим агентом и HLA-связывающим пептидом HJURP, который присутствует в этой биологической пробе. Обычно, этими условиями для контактирования этого агента с биологической пробой являются условия, известные специалистам с обычной квалификацией в данной области, для облегчения специфического взаимодействия между молекулой и ее родственным партнером (например, белком и его родственным рецептором, антителом и его родственным белковым антигеном, нуклеиновой кислотой и ее родственной комплементарной последовательностью) в биологической пробе. Примерные условия для облегчения специфического взаимодействия между молекулой и ее родственным веществом описаны в патенте США № 5108921, выданным Low et al.

[0159] Диагностический способ данного изобретения может выполняться как in vivo, так и in vitro или в обоих условиях. Таким образом, биологическая проба может находиться in vivo или in vitro в данном изобретении. Например, этой биологической пробой может быть ткань in vivo, и агент, специфический в отношении иммуногенного полипептида HJURP, может быть использован для детектирования присутствия таких молекул в этой ткани. Альтернативно, эта биологическая проба может быть собрана или выделена in vitro (например, проба крови, биопсия опухоли, экстракт ткани). В одном особенно предпочтительном варианте осуществления, этой биологической пробой может быть содержащая клетки проба, более предпочтительно проба, содержащая опухолевые клетки, собранные из субъекта, которому предстоит диагностика или лечение.

[0160] Альтернативно, дианостика может выполняться способом, который позволяет прямое количественное определение антигенспецифических Т-клеток окрашиванием меченых флуоресцеином HLA-мультимерных комплексов (например, Altman, J. D. et al., 1996, Science 274: 94; Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330). Было также обеспечено окрашивание на внутриклеточные лимфокины и анализы высвобождения интерферона-гамма ELISPOT. Окрашивание мультимеров, окрашивание внутриклеточных лимфокинов и анализы ELISPOT, все, являются по меньшей мере в 10 раз более чувствительными, чем более общепринятые анализы (Murali-Krishna, K. et al., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413). Могут быть также использованы пентамеры (например, US 2004-209295A), декстрамеры (например, WO 02/072631) и стрептамеры (например, Nature medicine 6. 631-637 (2002)).

[0161] Например, в некоторых вариантах осуществления, данное изобретение обеспечивает способ диагностики или оценивания иммунологической реакции субъекта, получающего по меньшей мере один из пептидов HJURP данного изобретения, причем этот способ предусматривает стадии:

(a) контактирования иммуногена с иммунокомпетентными клетками при условиях, подходящих для индукции CTL, специфических в отношении этого иммуногена;

(b) детектирования или определения уровня индукции CTL, индуцированных в стадии (a); и

(c) корреляции иммунологической реакции субъекта с уровнем индукции CTL.

[0162] В данном изобретении этим иммуногеном является по меньшей мере один из (a) пептида HJURP, выбранного из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2-24 и 26-48, пептидов, имеющих такие аминокислотные последовательности, и пептидов, в которых такие аминокислотные последовательности были модифицированы 1, 2 или более аминокислотными заменами. Тем временем, условия, подходящие для индукции иммуноген-специфических CTL, хорошо известны в данной области. Например, иммунокомпетентные клетки могут быть культивированы in vitro в присутствии иммуногена (иммуногенов) индуцирования иммуногенспецифических CTL. Индуцирования иммуногенспецифических CTL в культуру клеток могут быть добавлены любые стимулирующие факторы. Например, IL-2 является предпочтительным стимулирующим фактором для индукции CTL.

[0163] В некоторых вариантах осуществления, стадия мониторинга или оценивания иммунологической реакции субъекта, которому предстоит лечение пептидной противораковой терапией, может выполняться до, во время и/или после этого лечения. Обычно, во время протокола противораковой терапии иммуногенные пептиды вводят повторяющимся образом каждую неделю в течение 3-10 недель. Таким образом, иммунологическая реакция этого субъекта может оцениваться или подвергаться мониторингу во время этого протокола противораковой терапии. Альтернативно, стадия оценивания или мониторинга иммунологической реакции на противораковую терапию может выполняться при завершении протокола терапии.

[0164] Согласно данному изобретению, усиленная индукция иммуногенспецифических CTL в сравнении с контролем указывает на то, что субъект, который оценивался или диагностировался, иммунологически реагировал на иммуноген (иммуногены), которые были введены. Подходящие контроли для оценивания иммунологической реакции могут включать в себя, например, уровень индукции CTL при контактировании иммунокомпетентных клеток с не-пептидом или контрольным пептидом (контрольными пептидами), имеющими аминокислотные последовательности, другие, чем любой из пептидов HJURP, например, случайную аминокислотную последовательность). В предпочтительном варианте осуществления, эту иммунологическую реакцию субъекта оценивают последовательность-специфическим образом, сравнением с иммунологической реакцией между каждым иммуногеном, вводимым субъекту. В частности, даже когда субъекту вводят смесь нескольких типов HJURP-пептидов, иммунологическая реакция может варьироваться в зависимости от этих пептидов. В этом случае, сравнением иммунологической реакции между каждым пептидом, могут быть идентифицированы пептиды, с которыми этот субъект обнаруживает более высокую реакцию.

[0165] XI. Антитела

Данное изобретение обеспечивает дополнительно антитела, которые связываются с пептидами этого изобретения. Предпочтительные антитела специфически связываются с пептидом данного изобретения и не будут связываться (или будут слабо связываться) с не-пептидом данного изобретения. Альтернативно, антитела будут связываться с пептидом этого изобретения, а также с его гомологами. Антитела против пептида этого изобретения могут найти применение в диагностических и прогностических анализах и методологиях визуализации. Подобным образом, такие антитела могут найти применение в лечении, диагностике и/или прогнозировании других раков, в том смысле, что HJURP также экспрессируется или сверхэкспрессируется в раковом пациенте. Кроме того, внутриклеточно экспрессируемые антитела (например, одноцепочечные антитела) могут терапевтически найти применение в лечении рака, в котором участвует экспрессия HJURP, примеры которых включают в себя, но не ограничиваются ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка.

[0166] Данное изобретение обеспечивает также различные иммунологические анализы для детектирования и/или количественного определения белка HJURP (SEQ ID NO:50) или его фрагментов, включающих в себя полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-24 и 26-48. Такие анализы могут включать в себя одно или более анти-HJURP-антител, способных распознавать и связывать белок HJURP или его фрагменты, по необходимости. В данном изобретении, анти-HJURP-антитела, связывающиеся с полипептидом HJURP, распознают предпочтительно полипептид, имеющий аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO:2-24 и 26-48. Специфичность связывания антитела может быть подтверждена тестом ингибирования. То есть, когда связывание между антителом, которое подлежит анализу, и полноразмерным полипептидом HJURP ингибируется в присутствии любых полипептидов-фрагментов, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-24 и 26-48, это антитело специфически связано с этим фрагментом. В данном изобретении, такие иммунологические анализы выполняют в различных форматах иммунологических анализов, хорошо известных в данной области, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, различные типы радиоиммуноанализов, иммуно-хроматографический способ, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), ферментсвязанные иммунофлуоресцентные анализы (ELIFA), и т.п.

[0167] Родственные иммунологические, но не связанные с антителами анализы этого изобретения могут также включать в себя анализы иммуногенности Т-клеток (ингибиторные или стимуляторные), а также анализы связывания MHC. Кроме того, данным изобретением обеспечены способы визуализации, способные детектировать типы рака, экспрессирующие HJURP, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, способы радиосцинтиграфической визуализации с использованием меченых антител этого изобретения. Такие анализы могут найти клиническое применение в детектировании, мониторинге и прогнозировании экспрессирующих HJURP типов рака, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, AML, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, холангиоцеллюлярную карциному, CML, колоректальный рак, рак пищевода, желудочный рак диффузного типа, рак печени, NSCLC, лимфому, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, SCLC, опухоль мягкой ткани и опухоль яичка.

[0168] Данное изобретение обеспечивает также антитело, которое связывается с пептидом этого изобретения. Антитело этого изобретения может быть использовано в любой форме, такой как моноклональные или поликлональные антитела, и включают в себя антисыворотку, полученную иммунизацией животного, такого как кролик, пептидом этого изобретения, все классы поликлональных и моноклональных антител, антитела человека и гуманизированные антитела, продуцируемые генетической рекомбинацией.

Пептид этого изобретения, используемый в качестве антигена для получения антитела, может быть получен из любого вида животного, но предпочтительно получен из млекопитающего, такого как человек, мышь или кролик, более предпочтительно из человека. Происходящий из человека пептид может быть получен из нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, описанных здесь.

Согласно данному изобретению, пептид для использования в качестве антигена иммунизации может быть полным белком или частичным пептидом этого белка. Частичный пептид может включать в себя, например, амино (N)-концевой или карбокси (С)-концевой фрагмент пептида данного изобретения.

[0169] Здесь, антитело определяется как белок, который реагирует либо с полноразмерным HJURP-пептидом, либо с фрагментом HJURP-пептида. В одном предпочтительном варианте осуществления, антитело данного изобретения может распознавать пептиды-фрагменты HJURP, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:2-24 и 26-48. Способы синтеза олигонуклеотида хорошо известны в данной области. После синтеза, пептиды могут быть необязательно очищены перед использованием в качестве иммуногена. В данном изобретении, этот олигонуклеотид (например, 9- или 10-мер) может быть конъюгирован или связан с носителями для усиления иммуногенности. Гемоглобин фиссуреллы (Fissurella) (KLH) хорошо известен в качестве этого носителя. Способ конъюгирования KLH и пептида также хорошо известен в этих областях.

[0170] Альтернативно, ген, кодирующий пептид этого изобретения или его фрагмент, может быть инсертирован в известный экспрессирующий вектор, который затем используют для трансформации клетки-хозяина, как описано здесь. Этот желаемый пептид или его фрагмент может быть извлечен из наружной или внутренней частей клеток-хозяев любым стандартным способом и может быть затем использован в качестве антигена. Альтернативно, в качестве этого антигена могут быть использованы цельные клетки, экспрессирующие этот пептид, или их лизаты и химически синтезированный пептид.

[0171] Любое млекопитающее животное может быть иммунизировано этим антигеном, но предпочтительно с учетом совместимости с исходными клетками, используемыми для слияния клеток. Обычно, могут быть использованы животные семейства Rodentia, Lagomorpha или Primate. Животные семейства Rodentia включают в себя, например, мышь, крысу и хомяка. Животные семейства Lagomorpha включают в себя, например, кролика. Животные семейства Primate включают в себя, например, обезьяну Catarrhini (низшие узконосые обезьяны, мартышки), такую как Macaca fascicularis, (макака)-резуса, гамадрила (плащеносного павиана)и шимпанзе.

[0172] Способы иммунизации животных антигенами известны в данной области. Внутрибрюшинная инъекция или подкожная инъекция антигенов является стандартным способом иммунизации млекопитающих. Более конкретно, антигены могут быть разведены и суспендированы в подходящем количестве забуференного фосфатом солевого раствора (PBS), физиологического раствора и т.д. Если желательно, эта суспензия антигена может быть смешана с подходящим количеством стандартного адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда, приготовлена в виде эмульсии и затем введена млекопитающим животным. Предпочтительно, за этим следуют несколько введений антигена, смешанного с подходящим количеством неполного адъюванта Фрейнда, каждые 4 дня - 21 день. Для иммунизации может быть также использован подходящий носитель. После иммунизации, как описано выше, сыворотка может испытываться стандартным способом на увеличение количества желаемых антител.

[0173] Поликлональные антитела против пептидов данного изобретения могут быть получены сбором крови из иммунизированного млекопитающего, исследуемого на увеличение желаемых антител в этой сыворотке, и отделением сыворотки от крови любым общепринятым способом. Поликлональные антитела включают в себя сыворотку, содержащую эти поликлональные антитела, а также фракция, содержащая эти поликлональные антитела, может быть выделена из этой сыворотки. Иммуноглобулин G или M может быть получен из фракции, которая распознает только пептид данного изобретения, с использованием, например, аффинной колонки, связанной с пептидом данного изобретения, и дополнительной очисткой этой фракции с использованием белок А- или белок G-колонки.

[0174] Для получения моноклональных антител, иммунные клетки собирают из млекопитающего, иммунизированного этим антигеном, и проверяют на увеличенный уровень желаемых антител в сыворотке, как описано выше, и подвергают слиянию клеток. Иммунные клетки, используемые для слияния клеток, могут быть предпочтительно получены из селезенки. Другие предпочтительные исходные клетки для слияния с вышеуказанным иммуноцитом включают в себя, например, миеломные клетки млекопитающих и более предпочтительно миеломные клетки, имеющие приобретенное свойство для селекции слитых клеток посредством лекарственных средств.

[0175] Вышеуказанные иммуноциты и миеломные клетки могут быть слиты известными способами, например, способом Milstein et al. (Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).

Образующиеся гибридомы, полученные слиянием клеток, могут быть отобраны культивированием их в стандартной элективной (избирательной) среде, такой как среда HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование клеток обычно продолжают в среде HAT в течение нескольких дней - нескольких недель, причем это время является достаточным для умирания всех других клеток, за исключением желаемых гибридомных (неслитых клеток). Затем, может выполняться стандартное лимитирующее разведение для скрининга и клонирования гибридомных клеток, продуцирующих желаемое антитело.

[0176] Кроме вышеуказанного способа, в котором животного (не человека) иммунизируют антигеном для получения гибридомы, лимфоциты человека, такие как лимфоциты, инфицированные вирусом EB, могут быть иммунизированы пептидом, экспрессирующими пептид клетками или их лизатами in vitro. Затем эти иммунизированные лимфоциты сливают с полученными из человека миеломными клетками, которые способны к бесконечным делениям, такими как U266, с получением гибридомы, продуцирующей желаемое антитело человека, которое способно связываться с этим пептидом (Нерассмотренная опубликованная Японская заявка на патент No. Sho 63-17688).

[0177] Полученные гибридомы затем трансплантируют в брюшную полость мыши и экстрагируют асциты. Полученные моноклональные антитела могут быть очищены, например, осаждением сульфатом аммония, с использованием белок А- или белок G-колонки, ДЭАЭ-ионообменной хроматографии или аффинной колонки, с которой связан пептид данного изобретения. Антитело данного изобретения может быть использовано не только для очистки и детектирования пептида данного изобретения, но также в качестве кандидата для агонистов и антагонистов пептида данного изобретения.

Альтернативно, иммунная клетка, такая как иммунизированный лимфоцит, продуцирующая антитела, может быть иммортализована онкогеном и использована для получения моноклональных антител.

[0178] Полученные таким образом моноклональные антитела, могут быть также рекомбинантно получены с использованием способов генетической инженерии (смотрите, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD (1990)). Например, ДНК, кодирующая антитело, может быть клонирована из иммунной клетки, такой как гибридома или иммунизированный лимфоцит, продуцирующие антитело, инсертированное в подходящий вектор, и введена в клетки-хозяева для получения рекомбинантного антитела. Данное изобретение обеспечивает также рекомбинантные антитела, полученные, как описано выше.

[0179] Кроме того, антитело данного изобретения может быть фрагментом антитела или модифицированным антителом, пока оно связывается с одним или несколькими пептидами этого изобретения. Например, этим фрагментом антитела может быть Fab, F(ab')₂, Fv или одноцепочечный Fv (scFv), в котором Fv-фрагменты из H и L цепей лигированы подходящим линкером (Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). Более конкретно, фрагмент антитела может быть генерирован обработкой антитела ферментом, таким как папаин или пепсин. Альтернативно, ген, кодирующий антитело, может быть сконструирован, инсертирован в экспрессирующий вектор и экспрессирован в подходящей клетке-хозяине (смотрите, например, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).

Антитело может быть модифицировано конъюгированием с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). Данное изобретение обеспечивает такие модифицированные антитела. Это модифицированное антитело может быть получено химической модификацией антитела. Эти способы модификации являются общепринятыми в данной области.

[0180] Альтернативно, антитело данного изобретения может быть получено в виде химерного антитела, между вариабельным районом, происходящим из антитела не человека, и константным районом, происходящим из антитела человека, или в виде гуманизированного антитела, включающего в себя определяющий комплементарность район (CDR), происходящий из антитела не человека, каркасный район (FR) и константный район, происходящий из антитела человека. Такие антитела могут быть получены в соответствии с известной технологией. Гуманизация может выполняться заменой CDR или CDR-последовательностями грызунов соответствующих последовательностей антитела человека (смотрите, например, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). Таким образом, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами, в которых по существу менее чем интактный вариабельный район человека был заменен соответствующей последовательностью из вида не человека.

[0181] Полностью человеческие антитела, включающие в себя вариабельные районы, наряду с каркасом и константными районами человека, также могут быть использованы. Такие антитела могут быть получены с использованием различных способов, известных в данной области. Например, in vitro способы включают в себя применение рекомбинантных библиотек фрагментов антител человека, представленных на бактериофаге (например, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991). Подобным образом, антитела человека могут быть получены введением локусов иммуноглобулина человека в трансгенных животных, например, мышей, в которых эндогенные гены иммуноглобулина были частично или полностью инактивированы. Этот подход описан, например, в патентах США №№ 6150584, 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016.

[0182] Антитела, полученные, как описано выше, могут быть очищены до гомогенности. Например, отделение и очистка антитела может выполняться в соответствии со способами отделения и очистки, используемыми для обычных белков. Например, антитело может быть отделено и выделено применением подходящим образом выбранных и комбинированных способов колоночной хроматографии, таких как аффинная хроматография, фильтрования, ультрафильтрации, высаливания, диализа, электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле и изоэлектрического фокусирования (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но не ограничивающихся ими. Белок А-колонки и белок G-колонки могут быть использованы в качестве аффинной колонки. Примерные белок А-колонки, которые могут быть использованы, включают в себя, например, колонки Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Pharmacia).

[0183] Примерная хроматография, за исключением аффинной хроматографии, включает в себя, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенной фазой, адсорбционную хроматографию и т.п. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Хроматографические процедуры могут проводиться жидкостной хроматографией, например, ВЭЖХ и FPLC.

[0184] Например, могут быть использованы измерение оптической плотности, твердофазный иммуноферментный (ферментный иммуносорбентный) анализ (ELISA), ферментный анализ (EIA), радиоиммуноанализ (RIA) и/или иммунофлуоресценция для измерения антигенсвязывающей активности антитела этого изобретения. В ELISA, антитело данного изобретения иммобилизовано на пластине, пептид этого изобретения наносят на эту пластину и затем наносят пробу, содержащую желаемое антитело, такую как культуральный супернатант продуцирующих антитело клеток или очищенные антитела. Затем наносят вторичное антитело, которое распознает первичное антитело и помечено ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и эту пластину инкубируют. Затем, после промывания, к этой пластине добавляют субстрат фермента, такой как п-нитрофенилфосфат, и измеряют оптическую плотность для оценивания антигенсвязывающей активности этой пробы. Фрагмент этого пептида, такой как С-концевой или N-концевой фрагмент, может быть использован в качестве антигена для оценивания связывающей активности этого антитела. BIAcore (Pharmacia) может быть использован для оценивания активности антитела в соответствии с данным изобретением.

Описанные выше способы позволяют детектирование или измерение пептида этого изобретения, экспонированием антитела этого изобретения пробе, предположительно содержащей пептид этого изобретения, и детектированием или измерением иммунного комплекса, образованного этим антителом и этим пептидом.

Поскольку способ детектирования или измерения пептида по этому изобретению может специфически детектировать или измерять пептид, этот способ может найти применение в различных экспериментах, в которых используется этот пептид.

[0185] XII. Векторы и клетки-хозяева

Данное изобретение обеспечивает также вектор и клетку-хозяина, в которую вводят нуклеотид, кодирующий пептид данного изобретения. Вектор данного изобретения может найти применение для хранения нуклеотида, особенно ДНК, данного изобретения в клетке-хозяине, для экспрессии пептида данного изобретения, или для введения нуклеотида данного изобретения для генной терапии.

[0186] Когда клеткой-хозяином является E. coli и вектор амплифицируется и продуцируется в большом количестве в E. coli (например, JM109, DH5 alpha, HB101 или XL1Blue), этот вектор должен иметь "ориджин репликации" для амплификации в E. coli и маркерный ген для отбора трансформированной E. coli (например, ген устойчивости к лекарственному средству, выбранному из таких лекарственных средств, как ампициллин, тетрациклин, канамицин, хлорамфеникол или т.п.). Например, могут быть использованы векторы М13-ряда, векторы pUC-ряда, pBR322, pBluescript, pCR-Script, и т.д. Кроме того, pGEM-T, pDIRECT и pT7 могут быть также использованы для субклонирования и экстрагирования кДНК, а также векторы, описанные выше. При использовании вектора для получения белка данного изобретения, может найти применение экспрессирующий вектор. Например, экспрессирующий вектор для экспрессии в E. coli должен иметь вышеуказанные характеристики для амплификации в E. coli. При использовании E. coli, такой как JM109, DH5 alpha, HB101 или XL1 Blue, в качестве клетки-хозяина этот вектор должен иметь промотор, например, промотор lacZ (Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), промотор araB (Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)), промотор T7 или т.п., который может эффективно экспрессировать желаемый ген в E. coli. В этом отношении, могут быть использованы, например, pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP и pET (в этом случае хозяином является предпочтительно BL21, который экспрессирует РНК-полимеразу T7), вместо вышеупомянутых векторов. Дополнительно, этот вектор может также содержать сигнальную последовательность для секреции пептида. Одной примерной сигнальной последовательностью, которая направляет этот пептид для секреции в периплазму E. coli, является сигнальная последовательность pelB (Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). Способы введения этих векторов в клетки-хозяева-мишени включают в себя, например, способ с хлоридом кальция и способ электропорации.

[0187] Кроме E. coli, например, могут быть использованы экспрессирующие векторы, полученные из млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen) и pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), экспрессирующие векторы, полученные из клеток насекомых (например, "бакуловирусная система экспрессии Вас-to-BAC" (GIBCO BRL), pBacPAK8), экспрессирующие векторы, полученные из растений (например, pMH1, pMH2), экспрессирующие векторы, полученные из вирусов животных (например, pHSV, pMV, pAdexLcw), экспрессирующие векторы, полученные из ретровирусов (например, pZIpneo), экспрессирующий вектор, полученный из дрожжей (например, "Набор для экспрессии Pichia" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) и экспрессирующие векторы, полученные из Bacillus subtilis (например, pPL608, pKTH50), для получения полипептида данного изобретения.

[0188] Для экспрессии вектора в клетках животных, таких как клетки CHO, COS или NIH3T3, этот вектор должен иметь промотор, необходимый для экспрессии в таких клетках, например, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), промотор MMLV-LTR, промотор EF1 alpha (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), промотор CMV и т.п., и предпочтительно маркерный ген для отбора трансформантов (например, ген устойчивости к лекарственным средствам, выбранный посредством лекарственного средства (например, неомицина, G418)). Примеры известных векторов с этими характеристиками включают в себя, например, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.

Следующие примеры представлены для иллюстрации данного изобретения и для помощи специалисту с обычной квалификацией в его осуществлении и использовании. Эти примеры не предназначены никоим образом для ограничения объема этого изобретения.

ПРИМЕРЫ

[0189] Пример 1

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Клеточные линии

TISI, HLA-A*2402-положительную B-лимфобластоидную клеточную линию, покупали из IHWG Cell and Gene Bank (Seattle, WA). COS7, клеточную линию почки африканской зеленой мартышки покупали в ATCC.

[0190] Отбор кандидатов пептидов, произведенных из HJURP

9-мерный и 10-мерный пептиды, произведенные из HJURP, которые связываются с молекулой HLA-A*2402, были предсказаны с использованием программного обеспечения для предсказания связывания "BIMAS" (www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75), Kuzushima et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)) и "NetMHC 3.0" (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al. (Tissue Antigens., 62:378-84, 2003), Nielsen et al. (Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004)). Эти пептиды синтезировали посредством Biosynthesis (Lewisville, Texas) в соответствии со стандартным твердофазным способом и очищали жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (ВЭЖХ). Чистоту (>90%) и идентичность этих пептидов определяли при помощи аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) при 20 мг/мл и хранили при -80°С.

[0191] Индукция CTL in vitro

Полученные из моноцитов дендритные клетки (DC) использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток (APC) для индукции реакций цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) против пептидов, презентируемых на антигене лейкоцитов человека (HLA). DC генерировали in vitro, как описано в другом месте (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). Конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), выделенные из здорового волонтера (HLA-A*2402-положительного) с использованием раствора Ficoll-Plaque (Pharmacia), отделяли прикреплением к пластиковой чашке для культивирования ткани (Becton Dickinson) таким образом, чтобы обогатить их в виде фракции моноцитов. Обогащенную моноцитами популяцию культивировали в присутствии 1000 Е/мл гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (R&D System) и 1000 Е/мл интерлейкина (IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированную нагреванием аутологичную сыворотку (AS). После 7 дней культивирования цитокин-индуцируемые DC импульсно обрабатывали 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета-2-микроглобулина в течение 3 часов при 37°С в среде AIM-V. Эти генерированные клетки, по-видимому, экспрессировали DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класса II, на их поверхностях (данные не показаны). Затем эти импульсно обработанные пептидами DC инактивировали рентгеновским облучением (20 грэй) и смешивали при соотношении 1:20 с аутологичными CD8+ T-клетками, полученными положительным отбором с набором для CD8-положительного выделения (Dynal). Эти культуры устанавливали в 48-луночных планшетах (Corning); каждая лунка содержала 1,5Ч10⁴ импульсно обработанных пептидом DC, 3Ч10⁵ CD8+ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл AIM-V/2% AS-среде. Спустя три дня, эти культуры дополняли IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 МЕ/мл. В дни 7 и 14, эти Т-клетки дополнительно стимулировали аутологичными импульсно обработанными пептидом DC. Эти DC получали каждый раз одним и тем же путем, описанным выше. CTL тестировали против импульсно обработанных пептидом клеток TISI после 3-го раунда стимуляции пептидом в день 21 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

[0192] Процедура размножения CTL

CTL размножали в культуре с использованием способа, сходного со способом, описанным Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). В целом 5Ч10⁴ CTL суспендировали в 25 мл среды AIM-V/5% с 2 типами B-лимфобластоидных клеточных линий человека, инактивированных Митомицином С, в присутствии 40 нг/мл моноклонального анти-CD3-антитела (Pharmingen). Спустя один день после начала культивирования, к этим культурам добавляли 120 МЕ/мл IL-2. Культуры подпитывали свежей средой AIM-V/5% AS, содержащей 30 МЕ/мл IL-2, в дни 5, 8 и 11 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

[0193] Установление CTL-клонов

Готовили разведения для получения 0,3, 1 и 3 CTL на лунку в 96-луночном круглодонном микротитрационном планшете (Nalge Nunc International). CTL культивировали с 1Ч10⁴ клетками на лунку 2 типов В-лимфобластоидных клеточных линий человека, 30 нг/мл анти-CD3-антитела и 125 Е/мл IL-2 в целом 150 мкл на лунку среды AIM-V, содержащей 5% AS. 50 мкл на лунку IL-2 добавляли к этой среде спустя 10 дней, так чтобы достичь конечной концентрации 125 Е/мл IL-2. CTL-активность тестировали на 14-ый день, и CTL-клоны размножали с использованием того же самого способа, который описан выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

[0194] Специфическая активность CTL

Для испытания специфической активности CTL, выполняли иммуноферментный спот-анализ интерферона (IFN)-гамма (ELISPOT) и иммуноферментный твердофазный спот-анализ IFN-гамма (ELISA). Конкретно, импульсно обработанную пептидом TISI (1Ч10⁴ клеток на лунку) готовили в качестве стимуляторных клеток. Культивируемые клетки в 48 лунках использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ELISPOT IFN-гамма и анализ ELISA IFN-гамма выполняли с использованием процедуры изготовителя.

[0195] Трансфекция плазмид

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания генов-мишеней или HLA-A*2402, амплифицировали при помощи ПЦР. Эти ПЦР-амплифицированные продукты клонировали в вектор и в вектор pIRES (Clontech Laboratories, Inc., Cat. No. 631605). Эти плазмиды трансфицировали в линию клеток COS7, которая является отрицательной в отношении генов-мишеней и HLA-A24-отрицательной клеточной линией, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с рекомендуемыми изготовителем процедурами. После 2 дней от трансфекции трансфицированные клетки собирали версеном (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней (5Ч10⁴ клеток на лунку) для анализа активности CTL.

[0196] Результаты

Усиленная экспрессия HJURP в случае рака

Эти глобальные данные профилей экспрессии генов, полученные из различных раковых заболеваний с использованием кДНК-микроэррея, выявили, что экспрессия HJURP (GenBank Accession No. NM_018410; SEQ ID NO:49) была повышенной. Экспрессия HJURP была валидно повышенной в 3 из 15 AML, 25 из 26 случаев рака мочевого пузыря, 29 из 33 случаев рака молочной железы, 8 из 9 случаев рака шейки матки, 11 из 11 холангиоцеллюлярных карцином, 25 из 33 CML, 4 из 12 случаев колоректального рака, 29 из 40 случаев рака пищевода, 1 из 3 случаев рака желудка диффузного типа, 4 из 4 случаев рака печени, 12 из 12 NSCLC, 2 из 3 лимфом, 8 из 11 остеосарком, 3 из 5 случаев рака яичника, 4 из 4 случаев рака поджелудочной железы, 12 из 18 случаев рака предстательной железы, 4 из 7 случаев рака почки, 13 из 13 SCLC, 8 из 14 опухолей мягкой ткани и 6 из 9 опухолей яичка в сравнении с соответствующей нормальной тканью (таблица 1).

[0197]

Таблица 1
Отношение случаев наблюдаемой повышающей регуляции HJURP в раковой ткани в сравнении с нормальной соответствующей тканью AML 3/5 Рак мочевого пузыря 25/26 Рак молочной железы 29/33 Рак шейки матки 8/9 Холангиоцеллюлярная карцинома 11/11 CML 25/33 Колоректальный рак 4/12 Рак пищевода 29/40 Рак желудка диффузного типа 1/3 Рак печени 4/4 NSCLC 12/12 Лимфома 2/3 Остеосаркома 8/11 Рак яичника 3/5 Рак поджелудочной железы 4/4 Рак предстательной железы 12/18 Рак почки 4/7 SCLC 13/13 Опухоль мягкой ткани 8/14 Опухоль яичка 6/9

[0198] Предсказание HLA-A24-связывающих пептидов, произведенных из HJURP

Таблицы 2a и 2b показывают HLA-A24-связывающие 9-мерные и 10-мерные пептиды HJURP в порядке высокой связывающей аффинности. 15 пептидов (SEQ ID NO:1-6 и SEQ ID NO:10-18) были выбраны с использованием BIMAS, и 9 пептидов (SEQ ID NO:7-9 и SEQ ID NO:19-24) были предсказаны при помощи NetMHC3.0. В целом 24 пептида с потенциальной HLA-A24-связывающей способностью были отобраны и испытаны для определения эпитопных пептидов.

[0199]

Таблица 2
HLA-А24-связывающие 9-мерные пептиды, произведенные из HJURP Исходное положение Аминокислотная последовательность Балл SEQ ID NO 149 KYLTQVDIL 600 1 576 RYDEIKEEF 369,5 2 28 RFQRRMQRL 72 3 263 LYAGMLHSM 25 4 403 RFRTLKWLI 12 5 388 IYFDSSATY 6 6 Исходное положение Аминокислотная последовательность Kd (нМ) SEQ ID NO 408 KWLISPVKI 55 7 544 VQGNSSGIF 3458 8 280 SSIISTKTF 6673 9

Таблица 2b
HLA-А24-связывающие 10-мерные пептиды, произведенные из HJURP Исходное положение Аминокислотная последовательность Балл SEQ ID NO 149 KYLTQVDILL 840 10 395 TYNLDEENRF 180 11 729 SYRMEEKSDF 100 12 56 TYETPQGLRI 75 13 590 KYCLKSPGQM 50 14 635 GFQKLPSSPL 30 15 389 YFDSSATYNL 20 16 28 RFQRRMQRLI 15 17 383 KYSSLIYFDS 14 18 Исходное положение Аминокислотная последовательность Kd (нМ) SEQ ID NO 379 VTPSKYSSLI 458 19 235 SLQETSSSSF 8454 20 218 LHPSSTDMAL 13453 21 388 IYFDSSATYN 13358 22 162 EYFECAGNRA 14992 23 627 LNPDPHFQGF 19791 24

Исходное положение указывает номер аминокислотного остатка от N-конца HJURP. Балл связывания и константу диссоциации [Kd (нМ)] получали из "BIMAS" и "NetMHC3.0".

[0201] Индукция CTL предсказанными пептидами из HJURP, рестриктированными по HLA-A*2402, и установление CTL-линий, стимулированных произведенными из HJURP пептидами

CTL для пептидов, произведенных из HJURP, генерировали в соответствии с протоколами, описанными в "Материалах и Способах". Пептидспецифическую CTL-активность определяли анализом IFN-гамма ELISPOT (фиг.1a-e). Лунка № 4 с HJURP-A24-9-28 (SEQ ID NO:3) (a), № 4 с HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4) (b), № 4 с HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7) (c), № 6 с HJURP-A24-10-383 (SEQ ID NO:18) (d) и № 4 с HJURP-A24-10-162 (SEQ ID NO:23) (e) демонстрировали сильное продуцирование IFN-гамма в сравнении с контрольными лунками. С другой стороны, не смогли детектировать сильного продуцирования IFN-гамма стимуляцией другими пептидами, показанными в таблицах 2a и 2b, несмотря на то, что эти пептиды имели возможную связывающую активность с HLA-A*2402. В качестве типичного случая отрицательных данных, специфическую CTL-реакцию не наблюдали из импульсно обработанных пептидом клеток-мишеней с HJURP-A24-9-149 (SEQ ID NO:1) (f). В результате 5 пептидов, произведенных из HJURP, идентифицировали как имеющие потенциал индукции сильных CTL.

[0202] Установление CTL-линий и клонов против HJURP-специфических пептидов

Клетки, которые обнаруживали пептидспецифическую CTL-активность, детектированную анализом IFN-гамма ELISPOT, в лунке № 4 с HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4) и в #4 с HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7), размножали и CTL-линии устанавливали лимитирующим разведением, как описано в разделе "Материалы и способы" выше. CTL-активность этих CTL-линий определяли анализом IFN-гамма ELISA (фиг.2a и b). Эти CTL-линии демонстрировали сильное продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующим пептидом, в сравнении с клетками-мишенями без пептидного импульса. Кроме того, CTL-клон устанавливали лимитирующим разведением из CTL-линии, и продуцирование IFN-гамма из CTL-клона против клеток-мишеней, импульсно обработанных пептидом, определяли анализом IFN-гамма ELISA. Сильное продуцирование IFN-гамма определяли из CTL-клона, стимулированного HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7), на фиг.3.

[0203] Специфическая CTL-активность против клеток-мишеней, экзогенно экспрессирующих HJURP и HLA-A*2402

Установленные CTL-линии, индуцированные против этих пептидов, испытывали на их способность распознавать клетки-мишени, которые эндогенно экспрессируют ген HJURP и ген HLA-A*2402. Специфическую CTL-активность против COS7-клеток, трансфицированных как полноразмерным геном HJURP, так и геном HLA-A*2402 (конкретная модель для клеток-мишеней, которые эндогенно экспрессируют ген HJURP и ген HLA-A*2402), тестировали с использованием CTL-линий, индуцированных соответствующим пептидом, в качестве эффекторных клеток. COS7-клетки, трансфицированные либо полноразмерными генами HJURP, либо генами HLA-A*2402, готовили в качестве контролей. На фиг.4, эти CTL, стимулированные HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7) (a) и HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4) (b), обнаруживали сильную CTL-активность против COS7-клеток, экспрессирующих как HJURP, так и HLA-A*2402. С другой стороны, не детектировали значимой специфической CTL-активности против контролей. Таким образом, эти данные ясно демонстрировали, что пептиды HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7) и HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4) процессировались эндогенно и экспрессировались на клетках-мишенях с молекулой HLA-A*2402 и распознавались этими CTL. Эти результаты показывают, что этот пептид, произведенный из HJURP, может быть применим в качестве противораковой вакцины для лечения пациентов с экспрессирующими HJURP опухолями.

[0204] Анализ гомологии антигенных пептидов

CTL, стимулированные HJURP-A24-9-28 (SEQ ID NO:3), HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4), HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7), HJURP-A24-10-383 (SEQ ID NO:19) и HJURP-A24-10-162 (SEQ ID NO:23), обнаруживали значимую и специфическую CTL-активность. Этот результат может быть обусловлен тем фактом, что последовательности HJURP-A24-9-28 (SEQ ID NO:3), HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4), HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7), HJURP-A24-10-383 (SEQ ID NO:18) и HJURP-A24-10-162 (SEQ ID NO:23) являются гомологичными пептидам, произведенным из других молекул, о которых известно, что они являются чувствительными к иммунной системе человека. Для исключения этой возможности, выполняли анализы гомологии в отношении этих пептидных последовательностей с использованием в качестве запросов алгоритм BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), который не выявил последовательностей со значимой гомологией. Эти результаты анализов гомологии указывают на то, что последовательности HJURP-A24-9-28 (SEQ ID NO:3), HJURP-A24-9-263 (SEQ ID NO:4), HJURP-A24-9-408 (SEQ ID NO:7), HJURP-A24-10-383 (SEQ ID NO:18) и HJURP-A24-10-162 (SEQ ID NO:23), являются уникальными и, следовательно, насколько известно авторам этого изобретения, возможность того, что эти молекулы индуцируют непредумышленную иммунологическую реакцию на некую неродственную молекулу, является малой.

В заключение можно сказать, что были идентифицированы новые эпитопные пептиды HLA-A24, произведенные из HJURP. Кроме того, приведенные здесь результаты демонстрируют, что эпитопный пептид HJURP может быть подходящим для применения в противораковой иммунотерапии.

[0205] Примеры 2

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Клеточные линии

T2, HLA-A*0201-положительную B-лимфобластоидную клеточную линию, и COS7, линию клеток почки Африканской зеленой мартышки, приобретали из ATCC.

[0206] Отбор кандидатов пептидов, произведенных из HJURP

9-мерные и 10-мерные пептиды, произведенные из HJURP, которые связываются с молекулой HLA-A*0201, были предсказаны с использованием программы для предсказания связывания "NetMHC 3.0" (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al. (Tissue Antigens., 62:378-84, 2003), Nielsen et al. (Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004)). Эти пептиды синтезировали с использованием Biosynthesis (Lewisville, Texas) в соответствии со стандартным твердофазным способом синтеза и очищали жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (ВЭЖХ). Чистоту (>90%) и идентичность этих пептидов определяли аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрическим анализом, соответственно. Пептиды растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) при 20 мг/мл и хранили при -80°С.

[0207] Индукция CTL in vitro

Произведенные из моноцитов дендритные клетки (DC) использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток для индукции реакций цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) против пептидов, презентируемых на антигене лейкоцита человека (HLA). DC генерировали in vitro, как описано в другом месте (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). Конкретно, мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные из здорового волонтера (HLA-A*0201-положительные) раствором Ficoll-Plaque (Pharmacia), отделяли прикреплением к пластиковой чашке для культивирования ткани (Becton Dickinson) таким образом, чтобы обогатить их в виде фракции моноцитов. Обогащенную моноцитами популяцию культивировали в присутствии 1000 Е/мл гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (R&D System) и 1000 Е/мл интерлейкина (IL)-4 (R&D System) в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2% инактивированную нагреванием аутологичную сыворотку (AS). После 7 дней культивирования цитокин-индуцируемые DC импульсно обработывали 20 мкг/мл каждого из синтезированных пептидов в присутствии 3 мкг/мл бета 2-микроглобулина в течение 3 часов при 37°С в среде AIM-V. Эти генерированные клетки, по-видимому, экспрессировали DC-ассоциированные молекулы, такие как CD80, CD83, CD86 и HLA класса II, на их поверхностях (данные не показаны). Затем эти импульсно обработанные пептидами DC инактивировали рентгеновским облучением (20 грэй) и смешивали при соотношении 1:20 с аутологичными CD8+ T-клетками, полученными положительным отбором с набором для CD8-положительного выделения (Dynal). Эти культуры устанавливали в 48-луночных планшетах (Corning); каждая лунка содержала 1,5Ч10⁴ импульсно обработанных пептидом DC, 3Ч10⁵ CD8+ T-клеток и 10 нг/мл IL-7 (R&D System) в 0,5 мл AIM-V/2% AS-среде. Спустя три дня, эти культуры дополняли IL-2 (CHIRON) до конечной концентрации 20 МЕ/мл. В дни 7 и 14, эти Т-клетки дополнительно стимулировали аутологичными импульсно обработанными пептидом DC. Эти DC получали каждый раз одним и тем же путем, описанным выше. CTL тестировали против импульсно обработанных пептидом клеток TISI после 3-го раунда стимуляции пептидом в день 21 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

[0208] Процедура размножения CTL

CTL размножали в культуре с использованием способа, сходного со способом, описанным Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). В целом 5Ч10⁴ CTL суспендировали в 25 мл среды AIM-V/5% с 2 типами B-лимфобластоидных клеточных линий человека, инактивированных Митомицином С, в присутствии 40 нг/мл моноклонального анти-CD3-антитела (Pharmingen). Спустя один день после начала культивирования, к этим культурам добавляли 120 МЕ/мл IL-2. Культуры подпитывали свежей средой AIM-V/5% AS, содержащей 30 МЕ/мл IL-2, в дни 5, 8 и 11 (Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

[0209] Установление CTL-клонов

Готовили разведения для получения 0,3, 1 и 3 CTL на лунку в 96-луночном круглодонном микротитрационном планшете (Nalge Nunc International). CTL культивировали с 1Ч10⁴ клетками на лунку 2 типов В-лимфобластоидных клеточных линий человека, 30 нг/мл анти-CD3-антитела и 125 Е/мл IL-2 в целом 150 мкл на лунку среды AIM-V, содержащей 5% AS. 50 микролитров на лунку IL-2 добавляли к этой среде спустя 10 дней, так чтобы достичь конечной концентрации 125 Е/мл IL-2. CTL-активность тестировали на 14-ый день, и CTL-клоны размножали с использованием того же самого способа, который описан выше (Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

[0210] Специфическая активность CTL

Для испытания специфической активности CTL, выполняли иммуноферментный спот-анализ интерферона (IFN)-гамма (ELISPOT) и иммуноферментный твердофазный спот-анализ IFN-гамма (ELISA). Конкретно, импульсно обработанную пептидом T2 (1Ч10⁴ клеток на лунку) готовили в качестве стимуляторных клеток. Культивируемые клетки в 48 лунках использовали в качестве клеток-респондеров. Анализ ELISPOT IFN-гамма и анализ ELISA IFN-гамма выполняли с использованием процедуры изготовителя.

[0211] Установление клеток, принудительно экспрессирующих любой или оба из гена-мишени и HLA-A02

кДНК, кодирующую открытую рамку считывания генов-мишеней или HLA-A*0201, амплифицировали при помощи ПЦР. Эти ПЦР-амплифицированные продукты клонировали в вектор pIRES (Clontech Laboratories, Inc., Cat. No. 631605). Эти плазмиды трансфицировали в линию клеток COS7, которая является отрицательной в отношении генов-мишеней и HLA-A02-отрицательной клеточной линией, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen), в соответствии с рекомендуемыми изготовителем процедурами. После 2 дней от трансфекции трансфицированные клетки собирали версеном (Invitrogen) и использовали в качестве клеток-мишеней (5Ч10⁴ клеток на лунку) для анализа активности CTL.

[0212] Результаты

Предсказание HLA-A*0201-связывающих пептидов, произведенных из HJURP

Таблицы 3a и 3b показывают HLA-A2-связывающие 9-мерные и 10-мерные пептиды HJURP в порядке высокой аффинности связывания. В целом были отобраны 24 пептида с потенциальной HLA-A2-связывающей способностью и испытаны для определения эпитопных пептидов.

[0213]

Таблица 3a
HLA-А2-связывающие 9-мерные пептиды, произведенные из HJURP Исходное положение Аминокислотная последовательность Kd (нМ) SEQ ID NO 150 VLTQVDILL 14 25 496 SLSEAFENL 21 26 354 KLEKAFLEV 52 27 266 GMLHSMSRL 84 28 51 QMATLTYET 100 29 406 TLKWLISPV 118 30 129 VAWALAPAV 135 31 599 MTVPLCIGV 153 32 226 ALVPRNDSL 204 33 274 LLSTKPSSI 305 34 386 SLIYFDSSA 324 35 244 FLSSQPFED 5111 36

Таблица 3b
HLA-А2-связывающие 10-мерные пептиды, произведенные из HJURP Исходное положение Аминокислотная последовательность Kd (нМ) SEQ ID NO 405 RTLKWLISPV 15 37 128 SVAWALAPAV 50 38 649 SLLGSTAIEA 75 39 273 RLLSTKPSSI 167 40 266 GMLHSMSRLL 240 41 598 QMTVPLCIGV 246 42 54 TLTYETPQGL 281 43 731 RMEEKSDFML 366 44 397 NLDEENRFRT 2637 45 157 LLQGAEYFEC 3384 46 455 RMCLPDSWAM 5539 47 156 ILLQGAEYFE 14204 48

Исходное положение указывает номер аминокислотного остатка от N-конца HJURP. Константу диссоциации [Kd (нМ)] получали из "NetMHC3.0".

[0215] Индукция CTL предсказанными пептидами из HJURP, рестриктированными по HLA-A*0201, и установление CTL-линий, стимулированных произведенными из HJURP пептидами

CTL для пептидов, произведенных из HJURP, генерировали в соответствии с протоколами, описанными в "Материалах и способах". Пептидспецифическую CTL-активность определяли анализом IFN-гамма ELISPOT (фиг.5a-i). Следующие лунки демонстрировали сильное продуцирование IFN-гамма в сравнении с контрольными лунками: № 4 стимулировался HJURP-A02-9-496 (SEQ ID NO:26) (a), № 2 HJURP-A02-9-354 (SEQ ID NO:27) (b), № 4 HJURP-A02-9-406 (SEQ ID NO:30) (c), № 5 HJURP-A02-9-129 (SEQ ID NO:31) (d), № 3 HJURP-A02-9-599 (SEQ ID NO:32) (e), № 1 HJURP-A02-9-386 (SEQ ID NO:35) (f), № 5 HJURP-A02-10-405 (SEQ ID NO:37) (g), № 3 HJURP-A02-10-128 (SEQ ID NO:38) (h) и № 6 HJURP-A02-10-54 (SEQ ID NO:43) (i). С другой стороны, не смогли детектировать сильного продуцирования IFN-гамма стимуляцией другими пептидами, показанными в таблицах 3a и 3b, несмотря на то, что эти пептиды имели возможную связывающую активность с HLA-A*0201. В качестве типичного случая отрицательных данных, специфическую CTL-реакцию не наблюдали из импульсно обработанных пептидом клеток-мишеней, стимулированных HJURP-A02-9-150 (SEQ ID NO:25) (j). В результате 9 пептидов, произведенных из HJURP, идентифицировали как имеющие потенциал индукции сильных CTL.

[0216] Установление CTL-линий и клонов против HJURP-специфических пептидов

Клетки, которые обнаруживали пептидспецифическую CTL-активность, детектированную анализом IFN-гамма ELISPOT, в лунке № 4 HJURP-A02-9-496 (SEQ ID NO:26) (а), в № 4 HJURP-A02-9-406 (SEQ ID NO:30) (b), в № 5 HJURP-А02-9-129 (SEQ ID NO:31) (с), в № 5 HJURP-А02-10-405 (SEQ ID NO:37) (d) и в № 3 HJURP-А02-10-128 (SEQ ID NO:38) (е), размножали и CTL-линии устанавливали лимитирующим разведением, как описано в разделе "Материалы и способы" выше. CTL-активность этих CTL-линий определяли анализом IFN-гамма ELISA (фиг.6a-е). Эти CTL-линии демонстрировали сильное продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, импульсно обработанных соответствующим пептидом, в сравнении с клетками-мишенями без пептидного импульса.

[0217] Кроме того, CTL-клоны устанавливали лимитирующим разведением из CTL-линии, как описано в "Материалах и способах", и продуцирование IFN-гамма из CTL-клонов против клеток-мишеней, импульсно обработанных пептидом, определяли анализом IFN-гамма ELISA. Сильное продуцирование IFN-гамма определяли из CTL-клонов, стимулированных HJURP-A02-9-406 (SEQ ID NO:30) (а), HJURP-А02-9-129 (SEQ ID NO:31) (b), HJURP-А02-10-405 (SEQ ID NO:37 (с) и HJURP -А02-10-128 (SEQ ID NO:38) (d), на фиг.7а-d).

[0218] Специфическая CTL-активность против клеток-мишеней, экзогенно экспрессирующих HJURP и HLA-A*0201

Установленные CTL-линии, индуцированные против этих пептидов, испытывали на их способность распознавать клетки-мишени, которые эндогенно экспрессируют ген HJURP и ген HLA-A*0201. Специфическую CTL-активность против COS7-клеток, которые трансфицировали как полноразмерным геном HJURP, так и геном HLA-A*0201 (конкретная модель для клеток-мишеней, которые эндогенно экспрессируют ген HJURP и ген HLA-A*0201), тестировали с использованием CTL-клонов, индуцированных соответствующим пептидом, в качестве эффекторных клеток. COS7-клетки, трансфицированные либо полноразмерными генами HJURP, либо генами HLA-A*0201 в качестве контролей. На фиг.8, этот CTL-клон, стимулированный HJURP-A02-10-128 (SEQ ID NO:38), обнаруживал сильную CTL-активность против COS7-клеток, экспрессирующих как HJURP, так и HLA-A*0201. С другой стороны, не детектировали значимой специфической CTL-активности против контролей. Таким образом, эти данные ясно демонстрировали, что пептиды HJURP-A024-10-128 (SEQ ID NO:38) процессировались эндогенно и экспрессировались на клетках-мишенях с молекулой HLA-A*0201 и распознавались этими CTL. Эти результаты показывают, что этот пептид, произведенный из HJURP, может быть применим в качестве противораковой вакцины для лечения пациентов с экспрессирующими HJURP опухолями.

[0219] Анализ гомологии антигенных пептидов

CTL, стимулированные HJURP-A02-9-496 (SEQ ID NO:26), HJURP-A02-9-354 (SEQ ID NO:27), HJURP-A02-9-406 (SEQ ID NO:30), HJURP-A02-9-129 (SEQ ID NO:31), HJURP-A02-9-599 (SEQ ID NO:32), HJURP-А02-9-386 (SEQ ID NO:35), HJURP-А02-10-405 (SEQ ID NO:37), HJURP-А02-10-128 (SEQ ID NO:38) и HJURP-А02-10-54 (SEQ ID NO:43) обнаруживали значимую и специфическую CTL-активность. Этот результат может быть обусловлен тем фактом, что последовательности HJURP-A09-9-496 (SEQ ID NO:26), HJURP-A02-9-354 (SEQ ID NO:27), HJURP-А02-9-406 (SEQ ID NO:30), HJURP-A02-9-129 (SEQ ID NO:31), HJURP-A02-9-599 (SEQ ID NO:32), HJURP-А02-9-386 (SEQ ID NO:35), HJURP-А02-9-405 (SEQ ID NO:37), HJURP-А02-10-128 (SEQ ID NO:38) и HJURP-А02-10-54 (SEQ ID NO:43) являются гомологичными пептидам, произведенным из других молекул, о которых известно, что они являются чувствительными к иммунной системе человека. Для исключения этой возможности, выполняли анализы гомологии в отношении этих пептидных последовательностей с использованием в качестве запросов алгоритм BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi), который не выявил последовательностей со значимой гомологией. Эти результаты анализов гомологии указывают на то, что последовательности HJURP-A02-9-496 (SEQ ID NO:26), HJURP-A02-9-354 (SEQ ID NO:27), HJURP-A02-9-406 (SEQ ID NO:30), HJURP-A02-9-129 (SEQ ID NO:31), HJURP-А02-9-599 (SEQ ID NO:32), HJURP-А02-9-386 (SEQ ID NO:35), HJURP-А02-10-405 (SEQ ID NO:37), HJURP-А02-10-128 (SEQ ID NO:38) и HJURP-А02-10-54 (SEQ ID NO:43) являются уникальными и, следовательно, насколько известно авторам этого изобретения, возможность того, что эти молекулы индуцируют непредумышленную иммунологическую реакцию на некую неродственную молекулу, является малой.

В заключение можно сказать, что были идентифицированы новые эпитопные пептиды HLA-A*0201, произведенные из HJURP. Приведенные здесь результаты демонстрируют, что эпитопный пептид HJURP может быть подходящим для применения в противораковой иммунотерапии.

[0220] Промышленная применимость

Данное изобретение обеспечивает новые TAA, конкретно ТАА, которые произведены из HJURP, которые индуцируют сильные и специфические иммунные реакции и имеют применимость в большом разнообразии типов рака. Такие ТАА могут найти применение в качестве пептидных вакцин против заболеваний, ассоциированных с HJURP, например, рака, более конкретно, AML, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака шейки матки, холангиоцеллюлярной карциномы, CML, колоректального рака, рака пищевода, желудочного рака диффузного типа, рака печени, NSCLC, лимфомы, остеосаркомы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака почки, SCLC, опухоли мягкой ткани и опухоли яичка

[0221] Хотя это изобретение описывается здесь подробно и со ссылкой на его конкретные варианты осуществления, должно быть понятно, что предшествующее описание является примерным и пояснительным по характеру и предназначено для иллюстрации этого изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. Посредством рутинного экспериментирования специалист, квалифицированный в данной области техники, легко поймет, что различные изменения и модификации могут быть произведены в этом изобретении без отклонения от сущности и объема этого изобретения, границы и пределы которого определяются прилагаемой формулой изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделенному пептиду, который имеет индуцибельность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), а также к его применению. Предложенный пептид может использоваться в противораковой иммунотерапии, более конкретно, в противораковых вакцинах. Предложенное изобретение позволяет с высокой эффективностью лечить рак. 15 н. и 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл., 2 пр.

1. Выделенный пептид, выбранный из группы, состоящей из элементов (i)-(ii), приведенных ниже, где указанный пептид имеет индуцибельность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL):
(i) выделенный пептид согласно (а) или (b), приведенным
ниже:
(a) выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, 3, 4, 18 и 23; или
(b) выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, 3, 4, 18 и 23, в котором 1 или 2 аминокислоты заменены или добавлены;
(ii) выделенный пептид согласно (с) или (d), приведенным ниже:
(c) выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:38, 26, 27, 30, 31, 32, 35, 37 и 43; или
(d) выделенный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:38, 26, 27, 30, 31, 32, 35, 37 и 43, в котором 1 или 2 аминокислоты заменены или добавлены.

2. Выделенный пептид (i) по п. 1, где пептид имеет одну или обе из следующих характеристик:
(а) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7, 3, 4, 18 и 23 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, метионина и триптофана; и
(b) С-концевая аминокислота аминокислотной
последовательности SEQ ID NO:7, 3, 4, 18 и 23 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из фенилаланина, лейцина, изолейцина, триптофана и метионина.

3. Выделенный пептид (ii) по п. 1, где пептид имеет одну или обе их следующих характеристик:
(a) вторая аминокислота от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO:38, 26, 27, 30, 31, 32, 35, 37 и 43 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из лейцина и метионина; и
(b) С-концевая аминокислота аминокислотной последовательности SEQ ID NO:38, 26, 27, 30, 31, 32, 35, 37 и 43 заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из валина и лейцина.

4. Выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид, имеющий CTL-индуцибельность, по любому из пп. 1-3.

5. Композиция для индуцирования CTL, где эта композиция содержит эффективное количество одного или более пептидов по любому из пп. 1-3.

6. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака или предотвращения его послеоперационного рецидива, где эта фармацевтическая композиция содержит эффективное количество одного или более пептидов по любому из пп. 1-3.

7. Фармацевтическая композиция по п. 6, где указанная фармацевтическая композиция приготовлена для введения субъекту, HLA-антиген которого представляет собой HLA-A24.

8. Фармацевтическая композиция по п. 6, где указанная фармацевтическая композиция приготовлена для введения субъекту, HLA-антиген которого представляет собой HLA-A2.

9. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 6-8, где указанная фармацевтическая композиция приготовлена для лечения рака.

10. Способ индуцирования антигенпрезентирующей клетки (АРС) с CTL-индуцибельностью, где способ включает приведение АРС в контакт с пептидом по любому из пп. 1-3 in vitro или ex vivo.

11. Способ индуцирования CTL способом, который включает сокультивирование CD8-положительных Т-клеток с АРС, которые презентируют на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп. 1-3.

12. Выделенная АРС, которая презентирует на ее поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по любому из пп. 1-3, которая индуцирована способом по п. 10.

13. Выделенный CTL, мишенью которого является пептид по любому из пп. 1-3, где указанный CTL индуцирован способом по п. 11.

14. Способ индуцирования иммунного ответа против рака у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий стадию введения этому субъекту композиции, содержащей пептид по любому из пп. 1-3.

15. Антитело или его иммунологически активный фрагмент против пептида по любому из пп. 1-3, полученные посредством иммунизации животного указанным пептидом.

16. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий любой из пептидов пп. 1-3.

17. Применение пептида по любому из пп. 1-3 в производстве фармацевтической композиции для индуцирования антигенпрезентирующей клетки (АРС) с CTL-индуцибельностью.

18. Применение пептида по любому из пп. 1-3 в производстве фармацевтической композиции для индуцирования CTL.

19. Применение (а), (b) или (с), приведенных ниже, в производстве фармацевтической композиции для лечения рака:
(a) пептид по любому из пп. 1-3;
(b) АРС, презентирующая пептид по любому из пп. 1-3 на ее поверхности; и
(c) цитотоксическая Т-клетка, мишенью которой является пептид по любому из пп. 1-3.

20. Применение пептида по любому из пп. 1-3 в производстве фармацевтической композиции для индуцирования иммунного ответа против рака у субъекта, нуждающегося в этом.