БИОКОМПОЗИТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2013 года по МПК A61L27/50 A61L27/24 

Изобретение относится к области искусственных биоматериалов, методов их производства и использования. В частности, настоящее изобретение связано с биополимерами и биокомпозитами на основе коллагена

Коллагеновые гели, повязки, губки и волокна часто используются в качестве носителей стволовых клеток. Коллаген является естественным белком, встречающимся во многих тканях организма. Он обеспечивает прочность самих тканей, а также формирует структуры для прикрепления, миграции и размножения клеток. Однако коллагеновые гели и распыленный коллаген не обладают достаточной прочностью и такие структуры распадается в тканях при создании усилий. Поэтому они плохо подходит для поддержания роста клеток в определенных участках.

Коллаген может быть выделен в чистом виде, из некоторых тканей, как раствор белка, из которого затем формируют коллагеновые волокна. Обычно структура коллагена в волокнах отличается от структуры в живых тканях. Это также ограничивает его применение в медицине.

Повреждения тканей сердца, поперечно-полосатых мышц, кожи, костей, хряща, позвоночника и т.д., часто прогрессируют, приводя к дальнейшему распаду окружающей ткани и увеличению области повреждения. Все это сильно затрудняет нормальное функционирование органов. В свете современных представлений, введение в область повреждения стволовых клеток, может предотвратить дальнейший распад или даже способствовать восстановлению поврежденной области. На практике, доклинические и клинические исследования показали улучшение сердечной функции, после введения мезенхимальных стволовых клеток в область повреждения. Однако эти же исследования продемонстрировали и то, что значительная часть введенных клеток, выносится из области введения, а большинство оставшихся клеток в скором времени умирают. Таким образом, существует необходимость создания структур, позволяющих доставлять клетки различных типов в определенные участки поврежденных тканей и обеспечивать их выживание и рост. Однако физико-химические свойства разных тканей существенно различаются (например, сердечные и поперечно-полосатые мышцы и кожа или спинной мозг). Следовательно структура для доставки должны обладать достаточным потенциалом для фиксации клеток в определенных тканях и не вызывать изменений последних в связи с плохой совместимостью их свойств. Это требует материалов, физические свойства которых соответствуют тканям, в которых они будут использованы. Также, клеткам требуются определенные условия для их выживания, миграции и функционирования по восстановлению ткани. И так, лечение поврежденных тканей может быть улучшено новыми средствами, доставляющими и поддерживающими стволовые и другие клетки в определенных местах, и позволяющие тем выживать и участвовать в восстановлении поврежденной ткани.

Повреждения сухожилий и связок относятся к наиболее распространенным проблемам взрослого населения, требующим медицинского вмешательства. В 2000 году в США было проведено около 175000 восстановлений передней крестообразной связки, стоимостью более 2 млрд. долларов. Более 50000 пациентам потребовалось хирургическое восстановление ротаторной манжеты плеча. И каждый год, только в США, отмечается более 5 миллионов случаев бурсита локтевого сустава. Также 11% людей, регулярно занимающихся бегом, страдают от ахиллесовой тендопатии. В 2000 году, лечение болей в плечевых суставах стоило правительству США около 7 млрд. долларов, а общая стоимость травм сухожилий и связок оценивается в 30 млрд. долларов ежегодно (Chen J, Xu J, Wang A, Zheng M Scaffolds for tendon and ligament repair: review of the efficacy of commercial products. Expert Rev Med Devices. 2009 Jan; 6(1): 61-73).

Существующие методы для лечения травм сухожилий и связок конечностей успешны только частично. В некоторых случаях суставы иммобилизуются на срок до 4-х недель, для накопления рубцовой ткани. Рубцовая ткань предназначена для замены ткани связок и сухожилий, однако обладает неудовлетворительными механическими свойствами и низкой степенью компенсации. В других случаях используются не рассасывающиеся швы, концы которых «заякориваются» на костях. Такие швы не обладают нужной эластичностью и часто вызывают иммунный ответ. Иногда полное восстановление не возможно и вводятся различные ограничения на двигательную активность.

В текущей исследовательской и клинической практике использует животные и человеческие трансплантаты в качестве основного материала при восстановление дефектов связок и сухожилий. Биологические заменители включают в себя аутотрансплантаты, аллотрансплантаты и ксенотрасплантаты.

Аутогенные трансплантаты надколенного сухожилия и подколенного сухожилия считаются «золотым стандартом» для восстановления тканей и обычно выбираются во избежание отторжения. Однако такие аутотрансплантаты обладают рядом недостатков: требуются дополнительного хирургического вмешательства, которое может приводить к осложнениям донорского участка, увеличению времени восстановления, и/или болям и заражению донорского участка, повреждению нервов и повреждению колена. Дополнительные трудности вызывает использование подколенного сухожилия для реконструкции передней крестцообразной связки. Недостаточно эффективное восстановление соединений сухожилия с костью из-за нестабильности процесса сращивания затрудняет реабилитацию пациента.

Аллотрансплантаты получают из сухожилий, дермы и других тканей кадавров (трупов). Ксенографты получают из сухожилий, желудочной подслизистой оболочки, дермы и перикарда. Аллотрансплантаты и ксенотрансплантаты в основном состоят из коллагена 1-го типа, имеющего схожие свойства с сухожилиями человека. Однако, аллотрансплантаты и ксенотрансплантаты могут быть переносчиками заболеваний или инфекций, а также могут вызывать неблагоприятный иммунный ответ у донора.

Синтетические трансплантаты показывают отличные краткосрочные результаты, однако долгосрочные прогнозы остаются неудовлетворительными. В 40-78% случаев из-за фрагментации и напряжения новых инородных тканей, усталости, деформации, износу это может приводить к развитию синусита и артрита.

Современными методами высевания клеток являются: а) нанесение смеси геля и клеток на остов; б) доставка суспензии клеток к остову, находящемуся в неподвижном или динамическом состоянии. Однако у этих методов существуют недостатки, такие как низкая степень прикрепления клеток к плотному волокнистому остову или матриксу и плохие механические свойства гель-систем. Эти недостатки существенно затрудняют высевание клеток на плотные тканевые трансплантаты. Таким образом, рамки современных технологий не позволяют использовать стволовые клетки для повышения эффективности больших тканевых трансплантатов при восстановлении ткани. Для преодоления этих ограничений были разработаны методы с обработкой остова ультразвуком и нанесением надрезов, для того чтобы дать возможность клеткам проникать в сухожилие перед имплантацией. Без нанесения надрезов или обработки ультразвуком, клетки, высеянные на внешнюю поверхность сухожилия, с трудом проникают внутрь ткани. Однако такая обработка уменьшает механическую прочность трансплантата, что ограничивает его клинические возможности.

Несколько исследовательских групп предприняли попытки получить новые связки, для замены сухожилий и связок, методами тканевой инженерии, как описано в Hairfield-Stein M and etc., 2007. Development of self-assembled, tissue-engineered ligament from bone marrow stromal cells. Tissue Eng. 2007 Apr;13(4):703-10. Один из первых многообещающих результатов, в этом направлении, был опубликован Голдштейном с соавторами в Goldstein JD and etc., 1989 Development of a reconstituted collagen tendon prosthesis. A preliminary implantation study. J Bone Joint Surg Am. 1989 Sep; 71(8):l183-91 Искусственные остовы коллагеновых волокон упаковывались в различных конфигурациях с или без использования коллагеннового геля для их стабилизации. Дунн с соавторами, а также другие группы, использовали коллагенновые остовы с или без высевания клеток. Основными недостатками данного подхода являлись: (а) скорость деградации коллагена остова, которая была выше скорости синтеза нового коллагена, что приводило к неспосбности коллгена поддерживать нагрузку in vivo и (б) стоимость продукции - слишком высокая при низкой воспроизводимости результатов.

Для уменьшения скорости деградации, несколько исследовательских групп использовали шелк и другие синтетические материалы. Это решило проблему с ферментативной деграцией, однако породило другие, связанные с иммунными реакциями, фиброзом и накоплением продуктов распада. Подходы, основанные на внеклеточных матриксах, привело к разработке так называемой «функциональной тканевой инженерии» и «разработке спонтанных 3-х мерных тканей», как описано в Calve S, Dennis RG, Kosnik РЕ 2nd, Baar К, Grosh К, Arruda ЕМ. Engineering of functional tendon. Tissue Eng. 2004 May-Jun; 10(5-6):755-61. Данный метод не так зависит от свойств материалов уже существующих искусственных или биологических остовов, которые ограничивают механические или физиологические свойства новообразованных тканей. Скорее, такие материалы как коллагеновые гели, фибриновые гели, Матригель или синтетические гели используются для управляемой модификации новой ткани. Хио Чен и др. представляют подробный обзор этого и других методов тканевой инженерии с использованием стволовых клеток для восстановления сухожилий (Xiao Chen, Xiao Hui Zou, Guo Li Yin, Hong Wei Ouyang. Tendon tissue engineering with mesenchymal stem cells and biografts: an option for large tendon defects? Frontiers in Bioscience S1, 23-32, June 1, 2009). Однако упомянутые ранее проблемы (а) и (б) все еще сохраняются и в случае функциональной тканевой инженерии.

Было предпринято несколько попыток по получению коллагенновых структур, воспроизводящих структуры «живых тканей» и обладающих некоторой степенью ориентационной анизотропии. В лабораторных условиях была продемонстрирована возможность ориентации молекул с применением различных технологий: механических сдвиговых нагрузок, использования микрокапиллярных каналов, ориентации магнитным полем или потоком жидкости, электрохимической обработкой подложки, ориентированным электропрядением, метода Лэнгмюра-Блоджетта, прессованием. Коллагеновые матрицы, полученные этими способами, успешно ориентировали разные типы клеток. Однако структура таких матриц существенно отличается от структуры естественных внеклеточных матриц: не учитывается, например, контролируемый диаметр фибрилл, ориентирование фибрилл, волнистость укладки, периодичность и угловое распределение. Отсутствие вторичной структуры искусственного коллагенового матрикса приводит к снижению его прочности и влияет на выживание и поведение клеток. Буллис с соавторами в 2007 году продемонстрировали важность клеточного окружения в новосинтезированном внеклеточном матриксе. Некоторым группам удалось лучше контролировать размер фибрилл и получить образование тканеподобных узоров. Однако в этих экспериментах существуют проблемы с размером производимого материала и большой длительностью процесса. Важность нано- и микроструктур и их ориентации особенно важна для сухожилий и связок, так как этим тканям требуется прочность, эластичность и ориентирование клеток для их прикрепления и миграции. Например, в недавнем обзоре, посвященном клеточной/внеклеточной архитектуре человеческих тканей говорится, что «в тканевой архитектуре все больше осознается важность архитектуры остова, что привело к изменению тренда в проектировании остова, от изотропных остовов к гетерогенным или анизотропным «биоимитирующим» остовам, с целью имитации клеточной организации (такой как ориентация и агрегация) и/или ВКМ рассматриваемой ткани» (Singh M, Berk-land С, Detamore MS. Strategies and applications for incorporating physical and chemical signal gradients in tissue engineering. Tissue Eng Part В Rev. 2008 Dec; 14(4):341-66).

Известна патентная заявка США №2009/0069893 и заявка РСТ WO 2008/070166, где были описаны методы размещения коллагена упорядоченными массивами на стеклянных и пластиковых подложках в виде тонких пленок с коже-подобными, сухожилие-подобными, упорядоченно-сплетенными фибриллярными структурами. Раскрытие сущности изобретения, двух вышеупомянутых патентов приведены в настоящем описание в виде ссылок. Важно, что эти специальным образом выровненные и ориентированные структуры коллагена направляют ориентацию нанесенных на них клеток. В частности клетки прикрепляются и выстраиваются на пленках и затем мигрируют вдоль осей упорядочения. Такие пленки могут быть обработаны вещества, такими как факторы роста, которые улучшают выживание, миграцию и пролиферацию клеток. Другие биополимеры хотя и разрабатывались для доставки клеток в ткани, однако зачастую им не хватает биосовместимости, и они не встраиваются в живую ткань или значительно отличаются от нее по своим свойствам, или изменяют ее функцию.

Несмотря на значительные усилия, приложенные к разработке биоматериалов, имитирующих сухожилия, кожу, и другие фибриллярные ткани на коллагеновой основе, на настоящий момент не существует метода промышленного производства таких материалов. И новые разработки в этой области по-прежнему востребованы.

Техническим результатом настоящего изобретения является упрощение и удешевление способа получения ориентированных биополимерных материалов, повышение технологичности, повышение биосовместимости таких материалов с живыми тканями.

Некоторые варианты настоящего изобретения предоставляют способы производства ориентированных фибриллярных биополимерных материалов, состоящие из следующих шагов:

приготовление раствора или геля фибриллярного биополимера в требуемой фазе; нанесение раствора или геля фибриллярного биополимера достаточно тонким слоем; перевод раствора или геля фибриллярного биополимера из жидкой фазы в твердую для образования ориентированного фибриллярного биополимерного материала.

В некоторых вариантах требуемой фазой, в которой находится раствор или гель фибриллярного биополимера является жидкокристаллическая фаза. В некоторых вариантах растворы или гели фибриллярного биополимера обладают ионной силой от 0,001 до 0,5 М и рН от 2 до 9. В других вариантах ионная сила находится в пределах от 0,1 до 0,3 М, и рН в пределах от 2 до 5. В некоторых вариантах переход раствора или геля фибриллярного биополимера в твердую фазу достигается высушиванием раствора или геля. Высушивание может быть достигнуто различными методами, такими как, например, контролем за влажностью, температурой, электростатическими условия, для стимуляции испарения и т.д..

В некоторых вариантах раствор или гель фибриллярного биополимера наносится на функционализированном субстрате. Субстрат может быть функционализирован любым количеством необходимых компонентов, такими как вещества, способствующие адгезии, разделению, и влияющими на фибриллярную структуру и тому подобное.

Особым преимуществом является то что, биополимеры созданные в соответствии с вариантами настоящего изобретения могут быть дальше использованы для образования биокомпозитных материалов и структур. В одном варианте, предоставляется ориентированный фибриллярный материал, имеющий форму одной или нескольких лент. В некоторых других вариантах фибриллярные биополимерные материалы предоставляются в виде слоя с усредненной ориентацией фибрилл, расположенной параллельно поверхности слоя. В других вариантах поверхность имеет среднюю ориентацию фибрилл перпендикулярную поверхности слоя. В некоторых вариантах фибриллярные биополимерные материалы имеют форму трубы со средней ориентацией фибрилл или паралелльной поверхности, или имеющей угол с осью трубы. Ориентированный фибриллярный биополимерный материал может иметь одинарный извилистый узор. Также ориентированный фибриллярный биополимерный материал может иметь двойной извилистый узор с произвольными углами между завитками. В некоторых вариантах изобретения ориентированный фибриллярный биополимерный материал имеет извилистый рисунок в форме шеврона с параллельными линиями с перемено-равными противолежащими углами.

С другой стороны, варианты настоящего изобретения предоставляют способы формирования одного или более фибриллярных биополимерных материалов, таких как псевдо-волокна и состоящих из следующих этапов: погружение ориентированного биополимерного материала в раствор с нйетральным рН; извлечение ориентированного биополимерного материала из раствора таким образом, что материал коллапсирует в псевдо-волокно на границе воздуха и жидкости.

Сформированное псевдо-волокно может быть высушено и подвергнуто дальнейшим операциям: стериализации, химической сшивки и т.д. в зависимости от желаемой области применения.

Еще одним преимуществом использования фибриллярных биополимерных псевдоволокон является их использование в биокомпозитные материалы и стурктуры. В некоторых вариантах предоставляется биокомпозитная структура состоящая из, по крайней мере, одного ориентированного фибриллярного биополимерного материала и биодеградируемой биосовместимой с ним матрицы. В других вариантах предоставляется биокомпозитная структура, состоящая из множества ориентированных фибриллярных биополимерных материалов, располагающимися под произвольными углами друг к другу и скрепленных вместе биодеградируемой биосовместимой матрицей. Биодеградируемая матрица может состоять из любых подходящих материалов выбранных из группы: глюкозаминогликанов, протиогликанов, ванадата, фосфатов кальция, живых клеток, ростовых факторов и иных.

В некоторых вариантах ориентированный фибриллярный биополимерный материал используется в качестве матрицы и субстрата для применения в клеточных и тканевых методах. В других вариантах ориентированный фибриллярный биополимерный материал используется в качестве направляющего клетки остава in vivo. В еще одном варианте ориентированный фибриллярный биополимерный материал используется в качестве средства доставки требуемых фармацевтических компонентов в определенные ткани и органы человека. В одном варианте материал используется для доставки компонентов плазмы обогащенной тромбоцитами. В другом варианте материал специально сформирован для доставки живых клеток при восстановлении и регенерации тканей. В еще одном варианте материал формируется для доставки пептидов, лекарств, ростовых факторов и малых молекул.

Биополимерный материал может быть сформирован на подложке устройством для нанесения жидких пленок, состоящим из: как минимум двух продольных боковых элементов, имеющих форму параллельных клинообразных рельсов с основаниями расположенным в той же плоскости, что и подложка; поперечного элемента конструкции в форме моста между двумя боковыми элементами, при котором указанный поперечный элемент имеет хотя бы одну плоскую поверхность и контактирует с рельсами хотя бы в одной точке; и систему захватов, обеспечивающую строгую фиксацию моста в любой позиции на указанных рельсах, так что такой мост может совершать движения вдоль обоих рельс, таким образом что плоская поверхность образует двухгранный угол в 0-10 угловых минут с поверхностью субстрата и зазор между плоскостью субстрата и плоской частью моста составляет 5-50 микрон

Биополимерный материал может быть сформирован следующим способом: наносят коллагеновый раствор на поверхность с помощью двух паралельных плашек,, установленных параллельно друг другу с зазором 5-50 микрон между ними; в зазор помещают раствор коллагена; относительным перемещением плашек создают сдвигающую силу, обеспечивающую тонкослойное ориентированное коллагеновое покрытие. Обычно концентрация коллагена в растворе составяет 20 мг/мл - 100 мг/мл. Предпочтительно, чтобы концентрация коллагена была не менее 25 мг/мл. Коллаген в растворе обычно находится в состоянии нематического жидкого кристалла. Ориентированный слой коллагена могут формировать также продавливанием концентрированного раствора коллагена через фильеру.

В некоторых вариантах, в качестве биополимерного раствора используют концентрированный раствор коллагена, выбранного из группы коллагенов I, II, III, VI и XI типов, включая биологически и химически модифицированный коллаген. Раствор может также содержать одну из добавок, способствующих ориентации или адгезивности коллагена, например АТФ. Сущность настоящего изобретения поясняется следующими рисунками:

На Фиг.1 изображена иерархическая диаграмма тканей сухожилия;

На Фиг.2А представлена СЭМ (силового электронного микроскопа) фотография, показывающая спиральную структуру извитых коллагеновых волокон в сухожильных нитях;

На Фиг.2Б изображена спиральная пружина, использованная в математической модели коллагеновых волокон;

На Фиг.2В кривая напряжения растяжения волокна спирального коллагена;

На Фиг.3 приведены фотографии полученные методом атомной силовой микроскопии (АСМ), показывающие различные коллагеновые пленки или материалы, полученные в соответствии с разными воплощениями настоящего изобретения;

На Фиг.4А представлена СЭМ фотография сухожилия хвоста крысы и на Фиг.4Б - АСМ фотография нового матрикса из бычьего коллагена I;

На Фиг.5А-5В представлены АСМ фотографии различных коллагеновых пленок, полученных с использованием настоящего изобретения;

На Фиг.6А представлена СЭМ фотография свиного митрального фактора и на Фиг.6Б АСМ фотография сухожилие-подобного биополимерного матрикса, полученного в соответствии с настоящим изобретением;

На Фиг.7А-7Б приведены фотографии коллагеновых псевдо-волокон, полученных в соответствии с настоящим изобретением;

На Фиг.8А-8В иллюстрируется двойная супер спиральная структуру с различной ориентацией ориентацию петель;

На Фиг.9 представлена схема устройства для осуществления одного из вариантов изобретения;

На Фиг.10 приведена АСМ фотография спирального, неуплотненного, биополимерного материала с линейно-сплетенной ориентацией волокон, полученного с использованием настоящего изобретения;

На Фиг.11 приведена АСМ фотография двойного извитого биополимерного материала, полученного с использованием настоящего изобретения;

На Фиг.12А-В представлены фотографии человеческих фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток и мышечных клеток соответственно на ориентированных коллагеновых слоях, выполненных в соответствии с настоящим изобретением;

На Фиг.13 представлена схема формирования псевдо-волокон в соответствии с настоящим изобретением;

На Фиг.14 приведена фотография клеток, высеянных на псевдо-волокна из ориентированного коллагена, изготовленного в соответствии с настоящим изобретением.

Приведенное описание является лишь иллюстративным и пояснительным и настоящее изобретение не ограничивается комбинациями, пленками и методами, описанными в данном документе. В данном тексте использование единственного числа подразумевает и множественное число, если обратное не указано отдельно. Кроме того, использование «или» означает «и/или» если обратное не указано отдельно. Так же слова «относиться», «относится», «включать», «включает» и «включая» не являются ограничивающими. Термины «пласт» или «слой» или «тонкий слой» или «матрица» могут использоваться взаимозаменяемо повсеместно в описании.

В целом представленное изобретение относится к биокомпозитным материалам и структурам, а так же способам их получения и использования. В некоторых примерах данное изобретение направлено на ориентированные, основанные на коллагене биокомпозитные материалы, конструкции, а так же методы их получения. В других приводятся методы формирования основанных на коллагене пленок, в которых коллаген выстраивается в различных формах (выровненный, изломами, витой или комбинации перечисленных выше форм). Основанные на коллагене пленки могут быть преобразованы или сформированы в отдельные псевдоволокна последовательным применением водного растворителя и сил натяжения на границе раздела растворителя и воздуха. В некоторых примерах такие псевдоволокна могут быть химически сшиты, что увеличит их прочность, а так же обработаны различными реагентами или материалами, такими например как гепарин, что увеличивает их способность вмещать факторы роста и/или увеличить их гидратацию.

Следующее определение, используемое в данном тексте - "волокнистые биополимеры", оно без ограничения общности относится к различным типам коллагена, ламинина, фибронектина, фибрина, шелка, других полипептидов и их комбинаций.

Термин "ориентированные волокнистые биополимерные материалы " относится к материалам, имеющим повторяющийся структурный мотив. В частности это может быть кристаллизованный волокнистый биополимер или полукристаллизованный волокнистый биополимер. В некоторых примерах биополимер относят к "ориентированным", если у его поверхности есть повторяющийся мотив. В частности поверхностный мотив может быть установлен одной из 17 плоскостных кристаллографических групп. Ориентация может быть оценена любым из представленных методов: оптической поляриметрией, поляризационный микроскопией, лазерной дифракцией, рентгеновской дифракцией, микроскопией с использованием атомарного зонда, электронной микроскопией.

Упоминаемые в тексте "волокнистые биополимерные растворы и гели" имеют различные фазовые состояния в зависимости от концентрации, температуры, рН, ионной силы, и добавок. В некоторых примерах эти фазовые состояния - жидкокристаллические фазы с ориентацией дальнего порядка (например, изотропической, холистерической, смектической, нематической, гексагональной). Различные фазовые состояния могут быть определены дифракцией и рассеиванием света, матричной поляриметрией Мюллера, измерением плотности, а так же методом дифференционной поляриметрии. Коллаген, ламинин, ДНК, многие полипептиды, и другие волокнистые биополимеры - хорошие примеры лиотропных жидкокристаллических материалов. Небольшое количество неорганических добавок (например, ортованадат) может изменить переход фазового состояния. Исчерпывающая информация о формировании фазовых состояний коллагена представлена в работе [Mosser G, Anglo A, Helary С, Bouligand Y, Giraud-Guille MM. 2006]; плотные тканеподобные коллагеновые матрицы формируются во внеклеточных условиях [Matrix Biology. 25:3-13]. Известные факты полностью отражены в данном тексте посредством ссылок.

Применение стабильных (безвихревых) условий потока жидкой фазе приводит к формированию регулярной структуры. Другими словами раствор или гель биополимера течет в ламинарном режиме. Примеры таких условий течения включают в себя, но не ограничиваются следующими: течение Куэтта, течение Тэйлора-Куэтта, плоскостное и осесимметричное течение Пуазейля.

Изменение окружающих условий (влажности, температуры, использование УФ, рентгеновского излучения, электронного облучения, электрического или магнитного поля) или основных параметров волокнистого биополимера таких как рН и ионная сила, может привести к процессу самосборки и вызвать переход от фазы жидкости/геля к твердой фазе у ориентированного материала. Типичным примером перехода от фазы жидкости/геля к твердой фазе является процесс высыхания. Структура биополимера в твердой фазе зависит от структуры биополимера в жидкой фазе, а так же от процесса самосборки. В одном из примеров процесс быстрого высыхания коллагена приводит к формированию спиральных волокон с маленьким диаметром (прозрачный материал), а процесс медленного высыхания приводит к формированию спиральных волокон с большим диаметром (матовый материал). В случае с тонким слоем коллагена (толщиной в несколько микрон) получающаяся ориентация существенно зависит от химических и физических свойств подложки. В некоторых случаях функционализация подложки может использоваться для управления ориентацией.

"Псевдоволокно" получают путем продольного скручивания вдоль длинной оси свободно располагающихся лент ориентированного коллагена прочно удерживаемых на месте электростатическими силами.

"Нить" образуется путем переплетения вместе множества псевдоволокон, как правило, трех или более псевдоволокнон.

Под "биологически разлагаемой матрицей" здесь подразумевается материал, который может разрушиться естественным путем и затем резорбироваться в физиологической среде. Под биосовместимыми матрицами подразумеваются биосовместимые материалы, используемые для связи боиполимеров между собой.

Полезно кратко рассмотреть структуру связок и сухожилий, которая обсуждалась в литературе. Хотя характеристики коллагена на молекулярном уровне были хорошо изучены и полностью осмысленны, есть менее четкое представление о его свойствах и структуре на уровне сухожилий и связок.

В некоторых примерах данного изобретения описывается изготовление каркасных материалов, имеющих структуру схожую с сухожилиями и связками млекопитающих. Методика изготовления получение коллагена, как правило, типа I, и сборка его с помощью патентованного метода в молекулярный каркас. При этом создается каркасная структура без присутствия клеточного или другого биологического материала. Отсутствие дополнительных компонентов позволяет получить в исследованиях более четкую картину самой каркасной структуры и ее геометрии. При этом возникает понимание того, как эти части тела млекопитающих организованы и как они создаются, что на сегодняшний день еще не было отражено в литературе.

При описании структуры связок и сухожилий используется модель организационной иерархии, которая проявляет различные свойства на каждом уровне. В зависимости от того, как определяется каждый уровень, исследователи выделяют шесть, семь или восемь уровней. В приведенной ниже таблице 1 показана терминология обычно используемая для описания восьми уровней, ("Tissue Mechanics" by Cowin & Doty, 2007).

Таблица 1 Уровень 1 Полипептид Уровень 2 Тропоколлаген Уровень 3 Микрофибриллярный Уровень 4 Субфибриллярный Уровень 5 Фибриллярный Уровень 6 Волокно Уровень 7 Пучок Уровень 8 Связки и сухожилия

Шесть уровней (2, 3, 4, 5, 7 и 8) показаны на Фиг.1. На Уровне 1, каждая полипептидная альфа цепь которая составляет молекулу коллагена состоит приблизительно из 1000 аминокислотных остатков. Каждая цепочка закручивается в левую спираль около 1,2 HM в диаметре.

На Уровне 2, тропоколлаген или "молекула коллагена" составляет примерно 300 нм в длину и 1,5 нм в диаметре. Она состоит из трех полипептидных альфа цепей. Эти три левозакрученные спирали переплетены вместе и образуют правозакрученный рулон состоящий их трех спиралей. Эта тройная спираль является "супер-спиралью", поскольку она является правозакрученной спиралью состоящей из трех левозакрученных спиралей.

На Уровне 3, микрофибриллы формируются пятью нитями молекул коллагена. Каждая нить состоит из молекул коллагена соединенных конец-к-концу с дискретными разрывами между ними. Эти нити сплетены вместе в левую супер-супер спираль электростатическими силами, и формируют микрофибриллу диаметром от 3,5 до 4 нм.

На Уровне 4, субфибрилла имеет диаметр 10-20 нм и состоит из кластеров микрофибрилл.

На Уровне 5, фибрилла формируется путем сплетения вместе субфибрилл, которые образуют правозакрученную супер-супер-суперспираль с шагом около 1090 нм и диаметром 30-500 нм. Интервалы между концами коллагеновых молекул микрофибрилл выстраиваются и образуют характерный повторяющийся мотив "D-band" размером 67 HM.

На Уровне 6, волокна имеют диаметр 1-20 мкм и состоят из кластеров фибрилл.

На Уровне 7, пучки состоят из волокон собранных в структуры, организованные по модели витков, которые описывают как ундулирующую волнистость, волнообразное колебание или зигзаги. Функция витков - обеспечить эластичность, необходимую тканям, подвергающимся воздействию сил натяжения, таким как связки, сухожилия, перикард сердца, и т.д. Такие витки не встречаются в коллагене костей который в значительной степени подвергается силам сжатия. Клеточные врастания происходят на уровне пучков.

На Уровне 8, связки и сухожилия состоят из групп пучков. Между пучками нет боковых сцеплений, поэтому они могут свободно скользить относительно друг друга, что создает плавно функционирующий механический агрегат.

Проводились многочисленные исследования механического поведения сухожилий и связок, такие как: «Эластичная модель для извитого коллагенового волокна» (A.D. Freed, T.C. Doering, in Freed AD & Doehring TC, 2005, J. Biomech. Eng. 127. 587-593). Авторы отметили, что мягкие ненагруженные ткани являются многокомпонентными структурами, которые, с точки зрения восприятия нагрузки, в основном состоят из двух упругих веществ, коллагена и эластина, погруженных в протеогликановый гель. Они отметили, что пучки состоят из групп волокон и не обсудили промежуточные формы "волокна". Они предположили, что появление извитого образования связано с незначительным коэффициентом сжатия волокна, которое изгибается под действием внутренних сил упругости эластина всякий раз, когда фиброзная ткань освобождается от внешней нагрузки. Такая бугристая форма известна как виток (или извив). Настоящее изобретение описывает другой механизм, приводящий к образованию извивов. Это происходит в результате процесса регенерации коллагена в отличие от явления сморщивания коллагена.

Как упрощающее допущение было предположено, что волокно, формирующее извив, будет рассматриваться как механическая спиралевидная пружина. Это предположение хорошо сопоставимо с наблюдаемым нелинейным поведением извитых коллагеновых тканей при деформации вследствие напряжения. Оно отличается тем, что пружина демонстрирует линейное поведение при низкой нагрузке (нижняя часть кривой) на кривой "напряжение-деформация", представленной на Фиг.2 В, до тех пор, пока спираль не становиться растянутой. В этот момент спираль начинает становиться жестче и жестче, вызывая непрерывное увеличение наклона кривой (область перегиба). После того как спираль полностью растянута, поведение снова становиться линейным, но с куда более крутым уклоном (линейная область). Благодаря своей форме эта кривая называется "J" кривая. Предложенная математическая модель хорошо сопоставима с экспериментальными данными.

На Фиг.2А представлена фотография, сделанная на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) и демонстрирующая спиралевидную природу извитых коллагенных волокон сухожильных нитей полученных из свиного митрального клапана. Фиг.2Б демонстрирует спиральную пружину, используемую Фридом (Freed) и Дьюрингом (Doering) в их математических моделях. Она показывает, как центральная сила, действующей вдоль оси спирали переносится в другие области спирали. Следует обратить внимание, что фотографии СЭМ на Фиг.2А показывает левозакрученную спираль, в то время как диаграммы на Фиг.2Б показывает правозакрученную спираль. Нигде в статье ни указывается разница между данными рисунками, а так же не обсуждается концепция хиральности, что свидетельствует о недостатках понимания и доктрины в известном уровне техники.

Хотя в литературе есть много ссылок на спиралевидную природу извивов сухожилий и связок, не удается найти обсуждения хиральности. Работы Фрида и Дьюринга являются примером того, как понятие хиральности остается незамеченным.

В некоторых примерах настоящего изобретения описывается процесс получения биоэквивалентных реконструированных матриц, полученных из растворов очищенного мономерного коллагена, подобных сухожилиям. Эти новые матрицы несут в себе, ряд преимуществ, не ограничиваясь только этим: а) биосовместимость, б) высокую механическую прочность и свойство "J" - упругости в направлении волокон, в) отсутствие дефектов на большой площади (2"×10"), г) биомиметичность (т.е. приближенно к нативной структуре связки как в макро так и в нано масштабе), д) биоразлагаемость в зависимости от степени сшивания. На Фиг.3А-3Е продемонстрированны примеры коллагеновых пленок и мембран в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. Фиг.4А и 4Б демонстируют подобие структур тонкого сухожилия и коллагеновой матрицей, полученной в соответствии с настоящим изобретения. Совокупность извивов и выровнено-переплетенные структуры матриц могут включать в себя факторы роста с желаемым пространственным градиентом, что увеличивает их биофункциональность. Фибробласты, миобласты, нейроны и мезенхимальные стволовые клетки демонстрируют отличную пролиферативную и миграционную активности, а так же правильное расположение на этих матрицах. Схожие с сухожилиями матрицы могут принимать форму волокнистых структур или многослойных сложных каркасов. Эти каркасы могут быть заселены стволовыми клетками пациента и факторами, полученными из тромбоцитов пациента, что существенно сократит сроки заживления повреждений и повысит эффективность этого. Воплощение настоящего изобретения позволяет создавать нативные тканевые каркасы вне оргонизма.

В настоящее изобретение включены методы получения слоев и/или конструкций из биополимерного материала. В частности на подложке формируют слой многодоменного полукристаллического фибриллярного биополимера, используя преимущественно мономерные растворы. Процесс включает следующие стадии: создание пластического сдвига между подложкой и, по крайней мере, одной из поверхностей устройства для нанесения, создание в растворе молекулярных и фибриллярных ориентации дальнего порядка, контроль над начальным рН и температурой раствора, контроль над рН и температурой раствора во время пластического сдвига, высушивание раствора при контролируемых значениях рН, температуры и/или скорости испарения раствора.

Биополимерный слой может быть получен с заданной ориентацией. Определенная ориентация может быть охарактеризована конкретными параметрами и значениями в зависимости от организации биополимера, что подробно описано ниже.

Порядок ориентации - это кристаллографический термин, означающий максимальное расстояние между локальными областями, находящимися в одной плоскости. В данном случае этот диапазон может простираться от 10 нм (ориентация по принципу кожи) и до 0,5 м (ориентация по принципу сухожилия).

Воплощение методов, представленных в настоящем изобретении, имеет ряд преимуществ, таких как молекулярная ориентация дальнего порядка в растворах жидких кристаллов с низким рН под действием сдвиговой нагрузки и самосборка в процессе высыхания при переменном рН. В частности, процесс сушки можно проводить при нейтральном рН соответствующем 7,4±0,2. Изобретатели обнаружили, что контроль рН, температуры и/или скорости испарения раствора во время процесса сушки помогает в процессе самосборки коллагена, в дополнение к применению пластического сдвига.

Могут использоваться различные виды тонковолокнистых биополимеров:

тонковолокнистые коллагены, фибронекнин, лиминин, шелк и т.д.

Этот метод позволяет получать как равномерные, так и многодоменные полукристаллизованные слои с ориентацией дальнего и ближнего порядков. Эти различия приведены в Таблице 2 и показаны на Фиг.5А-5 В.

Таблица 2 Организация биополимера Порядок ориентации Структура По типу сухожилия Дальняя Равномерная Плетеная, по типу кожи Ближняя Многодоменная Скрученные вдоль одной оси Дальняя Равномерная

Пример коллагенового слоя, полученного методом, описанным выше, показан на фиг.6Б. Каждое волокно вытянуто в вертикальном направлении и имеет волнообразную форму с определенным периодом. Периодичности соседних волокон примерно равны. Волокна образуют структуру называемую "извив", которая формируется группированием соседних волокон. Структура извива располагается в горизонтальном направлении.

Фиг.6А представляет собой СЭМ фотографию структуры сухожилия свиного митрального клапана сердца, которая демонстрирует, характерную для всех сухожилий, структуру извива. Область внутри рамки имеет те же габариты что и сформированный материал, показанный на Фиг.6Б. Видно, что извив искусственной матрицы Фиг.6Б идентичен извиву реального сухожилия на Фиг.6А.

Морфология структуры извива, описанная выше, образуется путем группировки спиральных волокон коллагена. В спиральную структуру входят как правозакрученные так и левозакрученные спирали, сгруппированные вместе и образующие двойную суперспиральную структуру, что показано на Фиг.8А-8В. Показанные на рисунках, заштрихованные "темным" фибриллы - правозакрученные, а заштрихованные "светлым" фибриллы - левозакрученные.

Следует обратить внимание, что извивы фактически являются пучком вершин сгруппированных спиралей. Вершины темных спиралей формируют правозакрученные извивы, а вершины светлых спиралей - левозакрученные извивы.

Эти сгруппированные спирали работают как массив спиральных пружин. Тот факт, что массив состоит из примерно равного числа правозакрученных и левозакрученных пружин не влияет на жесткостную характеристику массива. Однако когда массив сгибается больше чем растягивается, право и левозакрученные пружины уравновешивают друг друга. Одна сторона массива растягивается, в то время как другая сжимается. Право и левозакрученные пружины сцепляются и урвновешивают друг друга создавая естественную устойчивость.

На Фиг.8А-8В продемонстрирована отдельная двойная супер-спираль в нескольких ракурсах.

В зависимости от конкретной организации биополимера, определение "ориентация", будут иметь разный смысл, как показано в Таблице 3, приведенной ниже.

Таблица 3 Организация биополимера Компонент Описание По типу сухожилия Волокно Ось спирали По типу сухожилия "извив" Линия, соединяющая вершины сгруппированных волокон Скрученные вдоль одной оси Волокно Ось спирали Плетеная, по типу кожи Волокно Локальный вектор

Ключевые различия между конструкциями сухожильного типа и конструкциями, скрученными вдоль одной оси, показаны на Фиг.10 и заключаются в плотность упаковки спиралей. В конструкциях сухожильного типа спирали плотно упакованы, тогда как в конструкциях, скрученных вдоль одной оси спирали упакованы свободно. На Фиг.11 представлена фотография дважды извитого биополимерного материала, полученного с использованием настоящего изобретения. Фотография сделана при помощи атомного-силового микроскопа (АСМ).

Основываясь на более полном понимании структуры извива, можно внести изменения в иерархию лигаментов, что отражено в Таблице 4, приведенной ниже.

Таблица 4   Описание Структура спирали Структурные компоненты 1 полипептид левозакрученная 1 альфа цепь 2 тропоколлаген правозакрученная 3 полипептида 3 микрофибрилла левозакрученная 5 молекул тропоколлагена 4 субфибрилла     5 фибрилла правозакрученная, левозакрученная Группа субфибрилл 6 нет данных/волокно нет данных нет данных 7 пучок правозакрученная + левозакрученная Согласованные пары сгруппированных фибрилл 8 Связки и сухожилия    

Мы обнаружили, что эти пленки имеют ориентированную фибриллярную структуру и обладают определенной анизотропной механической прочностью. Плленки могут быть сняты с подложки как до, так и после обработки, модификации, нейтрализации и/или сшивания, и тому подобных операций.

Одним из примеров таких модификаций являются ионно-обменные реакции. Например, обработка коллагеновой пленки путем погружения в раствор ортованадата или пирофосфата. Другим примером является погружение коллагена в раствор гепарина. Такие модификации, изменяют свойства пленки, связанные с гидратированием, связыванием белков или ее способностью усиливать функциональные возможности высаженных на нее клеток. Некоторые примеры возможностей этих коллагеновых матриц контролировать поведение клеток представлены на Фиг.12А-12В. Как правило, выровненные волокна побуждают клетки выстраиваться вдоль их оси. В случае нервных клеток, в то время как сами клетки не проявляют повышенной упорядоченности, их аксоны очень сильно вытянуты и сонаправлены с волокнами. Такое явление как способность матричных структур управлять поведением клеток распространяется на различные типы стволовых клеток.

Ниже приводятся основные моменты процесса получения коллагеновой матрицы сухожильного типа из раствора очищенного мономерного каллагена. Примеры осуществления таких процессов подходят, в том числе, для лиотропных жидкокристаллических материалов. Раствор молекулярного коллагена в жидкокристаллическом состоянии может быть нанесен на стекло и пластик с оптической точностью при помощи насадки оптического аппликатора, что показано и подробно описано в патенте США, опубликованном под номером №2008/0115724 (и, в частности, как показано на Фиг.9). Подробное описание процесса приводится в данном документе посредством ссылки. Обычно стеклянная подложка устанавливается на платформу, которая перемещается, по средствам механизма линейного движения, под стационарную насадку аппликатора. Насадка регулируется по высоте для производства биополимерных матриц различной толщины покрытия. Скорость нанесения покрытия может изменяться в диапазоне от 10 мм/сек до 1000 мм/сек, в зависимости от требуемой структуры покрытия. В некоторых экспериментах использовались растворы очищенного коллагени типа I, любого происхождения. Полученные в результате матрицы снимались со стекла в виде пленок. Они имели разнообразные структуры in situ как показано на Фиг.3А-3Д. Трехмерные структуры могут быть получены объединением двух поперечно ориентированных коллагеновых матриц с тонким слоем гепарина соединяющим их. В полученном образеце в дальнейшем можно создать поперечные связи под воздействием рибофлавина в соответствии с процессом, описанным в работе (Wollensak G., Wilsch M., Spoeri E., Seiler T. 2004). Для сшивания были использованы два типа полимеров, а именно декстран и активированный полиэтиленгликоль. Тонкая коллагеновая матрица сухожильного типа может спонтанно превращаться в псевдоволокна, что подробно описано ниже. Предварительные механические испытания коллагенового псевдоволокна сухожильного типа (диаметр 125 мкм) показывают его грузоподъемность не менее 60 граммов. Эта конструкция имеет значительную прочность в обоих направлениях даже без поперечных сшивок.

На Фиг 9. показан другой пример использования аппликатора 100. В этом примере устройство 100 может включать в себя призму 102 изготовленную из жесткого материала, такого как нержавеющая сталь и т.п.Призма 102 расположена непосредственно над гладкой подложкой 104 (например, стеклянной) и формирует щель 112. Компоненты призмы 102 в некоторых вариантах использования, включают в себя входной профиль 108, который обычно бывает цилиндрической формы. Плоская поверхность 106 отполирована до высокой степени гладкости и плавно переходит во входной профиль и острый край 110, которая формирует переходный участок на выходе из щели 112. Метод позиционирования призмы над подложкой для формирования щели точного размера здесь не описывается. Обычно, узкая полоска 114 водного раствора коллагена наноситься на подложку. При использовании, жидкости с высокой вязкостью полоска 114 имеет стабильные границы. Обычно, призма зафиксирована, а подложка движется слева направо, перенося жидкость к зоне входного профиля, и обеспечивая заполнение ею щели. Размер щели варьируется от 5 до 50 микрон, а скорость нанесения покровного слоя от 10 до 100 мм/сек. Находясь в узкой щели, жидкость подвергается воздействию больших сдвигающих усилий в течение достаточно длительного периода времени, что приводит к возникновению в ней ориентации. Острый край на выходе служит для уменьшения размера естественно возникающего мениска, который, будучи слишком большим, вызовет нежелательное образование штрихов на готовой пленке. В других вариантах использования устройства призма может перемещаться относительно подложки.

Биокомпозиты созданные с использованием настоящего изобретения могут формироваться посредством жидкого пленочного аппликатора, содержащего: (i) как минимум два продольных лонжерона имеющих вид параллельных клиновидных рельс с основаниями, расположенными в той же плоскости, что и подложка; (ii) поперечный элемент имеющий форму моста между упомянутыми лонжеронами, отличающийся тем, что поперечный элемент имеет хотя бы один плоский торец и находится в контакте с каждой из упомянутых рельс, по крайней мере, в одной точке; и (iii) систему зажимов, обеспечивающую четкую фиксацию моста в любом заданном положении, на упомянутых рельсах. При этом упомянутый мост может перемещаться вдоль обоих упомянутых рельс так, что плоский торец моста образует определенный неизменный двухгранный угол с плоскостью подложки. Точность установки угла лежит в пределах 10 угловых минут, а щель между упомянутым плоским торцом и плоскостью подложки имеет величину от О до 50 микрон.

Способ, описанный в настоящем изобретение, позволяет создавать биокомпозиты цилиндрической формы. Принцип действия аналогичен описанному ранее, а зазор формируется при взаимном размещение твердого сердечника внутри полого цилиндра. Биополимерный материал экструдируется через зазор под высоким давлением и создает поток, такой как поток Куэтта, поток Тейлора-Куэтта, плоское или осесимметричное пуазейлевское течение, который образует ориентированную структура остова. Точный контроль зазора может достигаться установкой полого цилиндра и твердого сердечника под небольшим углом уклона. Смещением сердечника относительно оси цилиндра можно добиться точной регулировки. В вышеописанной конструкции трубка создается со средней ориентацией волокон параллельной оси цилиндра и сердечника. Придавая разные скорости вращения центральной оси одного компонента, относительно другого, во время протекания коллагена можно достигнуть спирильной ориентации волокон по отношению к оси циллиндра.

Пленку, полученную вышеописанным способом можно трансформировать в ориентированное биополимерное (коллагеновое) псевдо-волокно. Такой процесс является одним из предметов настоящего изобретения и может быть осуществлен системой изображенной на Фиг.13. Коллагеновая пленка (толщиной 2-6 мкм и шириной 2,5 см) может быть полностью или частично вымочена в подходящем растворе, например растворе ФСБ. Пленка, вынутая из раствора коллапсирует в псевдо-волокно на границе раздела воздуха и раствора (Фиг.7А). Псевдо-волокно может быть высушено с использованием механической и температурной обработки. Несколько псевдо-волокон могут быть сплетены с образованием нитей, отличающихся в диаметре и прочности. Примеры таких нитей и псевдо-волокон приведены на Фиг.7Б. Варианты настоящего изобретения позволяют контролировать степень эластичности конечного псевдо-волокна, посредством размещения коллагена на пластике или стекле, что влияет на вариации в ориентации коллагеновых волокон. К примеру, коллаген, размещенный в переменных условиях, позволяет получать перекручевание или сложение псевдо-волокна и конечной нити с J-типом механического растяжения. Еще большей эластичности можно достичь, формируя из коллагена сплетенные структуры.

Особым преимуществом настоящего изобретения является способность произведенных волокон и псевдо-волокон поддерживать прикрепление, миграцию и пролиферацию клеток. В общем, клетки могут быть нанесены на псевдо-волокно, помещением его в клеточную суспензию в растворе. В качестве альтернативного метода, клетки, представляющие интерес, могут быть нанесены на сухое псевдо-волокно, таким образом, чтобы раствор стекал по нему. Клетки в растворе, прикрепляются к коллагеновому псевдо-волокну в присутствии сыворотки. Процесс может быть повторен для увеличения количества прикрепившихся клеток. Один из пример использования ориентированного псевдо-волокна для доставки стволовых клеток в ткань приведен на Фиг.14.

Обычно клетки, которые необходимо доставить в определенную ткань, являются стволовыми, нервными, индуцированными плюрипотентными стволовыми, эмбриональными стволовыми клетками или клетками, которые, как ожидается, могут улучшить процессы заживления, регенерации или функционирование ткани. Доставка в ткань может быть проведена в виде наложения заплатки или внесением псевдо-волокна в поврежденную часть ткани, используя катетер или иглу - процесс хорошо известный врачам и специалистам в данной области.

Такие материалы как коллаген, ламинин, фибронектин или синтетические материалы, при размещении на пластики и стекле могут использоваться как система для тестирования клеточного ответа. Диагностика осуществляется посредством рассеивания клеток и наблюдением за их поведением, как например, есть ли пролиферация, миграция или прикрепление клеток или нет. Более того, ростовые факторы и биологические материалы, такие как обогащенная тромбоцитами плазма, которые являются богатым источником гормонов, могут быть также включены в различные субстраты. Одним из механизмов, который можно для этого использовать, является впитывание. Другим способом является внесение таких компонентов как гепарин или глюкозоаминогликаны, которые связываются электростатически. Факторы также могут связываться с определенными участками субстрата и обладать аффинностью к различным ростовым влияниям. Сходным образом, биоактивные материалы, такие как ванадат, отрицательно заряженные анти-воспалительные агенты или антипротеазы, содержащие этилендиамин тетрауксусную кислоту или цитрат, плотно связываются с положительно заряженным коллагеновым субстратом. Способность материала изменять поведение клеток, и способность клеток деградировать материал легко проверяются на клеточных культурах. Также, такие модифицированные субстраты удобно использовать для исследований клеточного поведения на измененных субстратах, в том числе высеивание нервных и опухолевых клеток.

Еще одним преимуществом является то, что варианты настоящего изобретения позволяют создавать модифицированные биокомпозитные структуры. В некоторых ситуациях исследования на клеточных культурах требуют плотного прикрепления к субстрату. Это может достигаться использованием модифицированных поверхностей, которые связывают помещенный биополимер через ионные или ковалентные связи. В других случаях, когда требуется удаление размещенного материала для дальнейшей обработки, могут использоваться поверхности, обладающие низкой адгезией.

В некоторых вариантах функциональные особенности таких биополимеров могут быть изменены или улучшены, в зависимости от необходимого применения. Такие модификации включают химическое сшивание биополимера и стерилизация материала после размещения на субстрате или после проведения необходимых манипуляций.

Обычно начальные растворы коллагена приготавливаются следующим образом. Жидкий коллаген степени чистоты "Molecular grade", может быть получен у ряда поставщиков, например BD, с концентрацией 3 мг/мл. Источниками коллагена млекопитающих могут быть крысиные хвосты, ткани быка, свиньи, человека и др. Раствор помещается внутрь диализной мембраны с отсечением молекулярных весов от 12000 до 14000 Дальтон, производства Spectrum Labs. Мембранная трубка помещается в сосуд и со всех сторон заполняется полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 20000, охлажденного до +4°С. Молекулярная масса ПЭГ должны быть больше чем отсекаемая молекулярная масса. Сосуд и его содержимое охлаждают до +4°С в течение времени достаточного для удаления воды из раствора коллагена и увеличения его концентрации. Время выдержки может варьировать в зависимости от объема коллагена и насыщения ПЭГ, и обычно находится в пределах от 10 минут до 3 часов. Концентрированный коллаген вынимается из трубки, и помещается в пробирку, которая центрифугируется при +4°С для удаления воздуха.

Раствор коллагена может быть также приготовлен из сухого коллагена. Обычно к коллагену добавляют кислоту, например уксусную и соляную, выдерживают при +4°С в течение 18 часов и разбавляют до требуемой концентрации.

Увеличение концентрации может быть также достигнуто помещением раствора коллагена в коммерчески доступную пробирку с диализной мембраной, размещенной внизу и центрифугированием при +4°С, до достижения нужной концентрации. Примером такой пробирки является Vivaspin от компании Sartorus Stedim. Доступны разные отсечения молекулярных весов, от 10000 Дальтон и выше. Обычная концентрация коллагена находится в пределах от 20 мг/мл до 100 мг/мл. Предпочтительными концентрациями являются концентрации от 40 мг/мл до 75 мг/мл, которые могут отличаться в зависимости от необходимой ориентации волокон и природы коллагена.

Одним из важных параметров, который определяет фазу лиотропного жидкого кристалла является концентрация. Метод для изменения концентрации описан выше. Двумя другими важными параметрами являются рН и ионная сила. Используемый интервал рН для коллагена и ламинина находится в пределах от 2 до 9. Предпочтительны рН в интервале от 2 до 5. Используемый интервал ионный силы - от 0,001 М до 0,5 М. Предпочтительный интервал для ионной силы находится в пределах от 0,1 М до 0,3 М.

Стандартным процессом фазового перехода является испарение, которое может осуществляться высушиванием с помощью воздушного шабера, вакуумной техники, высокой или низкой температуры. Для тонкого слоя биополимера эффективно УФ-облучение, при условии что к раствору биополимера добавлена УФ-чувствительная добавка, например рибофлавин. При этом УФ обработка может инициировать химическое сшивание биополимера.

Процесс само-сборки во многих фибриллярных биополимерах в большой степени зависит от ионной силы и рН, которые могут регулироваться, например выпариванием аммиака. В случае размещения биополимера на проводящей/металлической поверхности ионная сила может быть изменена приложением электрического поля.

Некоторые полимерные материалы, такие как ПЭТ плохо адгезируются к коллагену и ламинину и следовательно такой тип материала может быть использован для модификации поверхности, если необходимо убрать ориентированный полимер с подложки. Для этой цели можно использовать обычную липкую ленту.

Модификация амино-силилированным стеклом вызывает существенные изменения в структуре тонкой пленки ориентированного коллагена, нанесенной на стекло. Таким образом это приводит к образованию вертикальных фибрилл показанных на Фиг.3Б вместо кожеподобного плетенного узора показанного на Фиг.3Г, полученного без такой обработки.

Определенные ростовые факторы, такие как инсулин, инсулин-подобные ростовые факторы, ФРЭС, ФРТ и им подобные, связываются со своими рецепторами на клеточной поверхности и стимулируя клеточные процессы через домены тирозин-киназных рецепторов внутри клеток. Как правило киназный домен фосфорилирует остатки тирозина на рецепторе, что переводит рецептор в «активное» положение. Ферментативное удаление остатков фосфата определенными клеточными фосфатазами выключает «активное» состояние рецептора и снимает его действие на клетку. Ортованадат ингибирует эти фосфатазы, увеличивая фосфорилирование рецептора и его активность.

Факторы, такие как ростовые факторы и ортованадат могут включаться в коллагеновые структуры для улучшения стабильности и стимулирования клеточных ответов. Ортованадат, включенный без ассоциированного лиганда в структуру коллагеновой матрицы стимулирует ее сохранение и минимизирует растворение матрицы, служа ионным мостиком, скрепляющим соседние молекулы. В такой форме комплекс коллаген/ортованадат стимулирует взаимодействие клеток и матрикса и улучшает клеточные ответы на эндогенные и экзогенные тирозин-эиназные воздействия, особенно воздействия, влияющие на выживаемость клеток, пролиферацию, миграцию и дифференцировку. Известны сообщения о токсичности ортованадата, однако его включение в прочные ионные связи с коллагеном в отсутствие ассоциированных лигандов ограничивает его диффузию и снижает систематический контакт клеток с ним и ограничивает его влияние на клетки, контактирующие с ним или включенные в конструкцию.

Нами были описаны методы приготовления пленок очищенного коллагена из его раствора, в которых коллаген выстраивается в разные формы (упорядоченный, закрученный, плетеный или их комбинация). Такие материалы могут быть превращены в отдельные псевдо-волокна с помощью последующего применения водного раствора и приложения силы на разделе воды и воздуха. Такие псевдо-волокна могут быть химически сшиты для увеличения прочности, а также обработаны различными факторами, такими как гепарин и другими для увеличения способности связывания ростовых факторов а также увеличения гидратации. Нанесение их на ткани, нуждающиеся в лечение производится в соответствии со стандартными процедурами, хорошо известными врачам, владеющими этими методами.

Примеры.

Следующие примеры приводятся только в иллюстративных целях, и не ограничивают возможную сферу применения настоящего изобретения.

Клеточные исследования были выполнены на фибробластах и мезенхимальных стволовых клетках (мышечные полученные из адипозной ткани и человеческие, полученные из костного мозга). Использовались следующие клеточные ростовые среды: ДМЕМ с низким содержанием глюкозы и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) для фибробластов, ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) для стволовых клеток полученных из жировой ткани, альфа-МЕМ с 20% ЭТС для человеческих мезенхимальных стволовых клеток (во все среды были добавлено 1% пенициллин/стрептомицин и 2 мМ глютамина).

Пример 1:

Высаживание клеток на ориентированные пленки коллагена (матрикс) со структурой схожей с сухожилием и размещенных на стеклянных чипах. Использовались фибробласты и мезенхимальные стволовые клетки (мышечные полученные из адипозной ткани и человеческие, полученные из костного мозга). Клетки высеивались с плотностью 4-6000 кл/см² на коллагеновый субстрат, нанесенных на стеклянные чипы, помещенные на 6-луночные планки для клеточных культур, в питательную среду без ЭТС, после чего ждали их прикрепления. Затем среда менялась на полную ростовую среду (с 10% ЭТС) в которой клетки поддерживаются в течение одной недели. Клетки выравниваются на субстрате в соответствии с его узором, как видно на Фиг 2А. Наблюдение за клетками продолжалось до образования монослоя (одна неделя).

Пример 2:

Высаживание клеток на коллагеновые псевдо-волокна. Использовались фиброболасты. Клетки высеивались на ориентированные коллагеновые псевдо-волокна с высокой плотностью клеточной суспензии (10⁶ кл/мл): 3-см псевдо-волокно помещался в 15 мл пробирку Falcon с 1 мл клеточной суспензии и инкубировался на шейкере в течение 30 минут, при 37°С в СО₂-инкубаторе. Засеянный клетками псевдо-волокно затем переносилось в лунку 6-луночного планшета, и его концы прикреплялись к стеклянным чипам. Прикрепление клеток подтверждалось световой микроскопией, и клеточная миграция из псевдо-волокна наблюдалась с помощью световой и флуоресцентной микроскопии, как показано на Фиг.14.

Коллагеновые ленты вымачиваются в кислом растворе ортованадата на солевом буфере. В результате ионообменных реакций ортованадат химически сшивает волокна коллагена и образует коллген-ортованадатный композитный матрикс, который сохраняет структурные характеристики. Нейтрализация в растворе ФСБ (фосфатно-солевой буфер) и промывка в деионизованной воде убирает лишний ортованадат.

Вышеизложенные описания конкретных вариантов настоящего изобретения приводятся исключительно в иллюстрированных целях. Они не исчерпывают все возможности использования изобретения, и естественно, что множество модификаций и вариаций возможно в свете вышеприведенных инструкций. Приведенные варианты изобретения были выбраны с тем, чтобы позволить специалистам, владеющим методами, использовать изобретение и его варианты с различными модификациями наилучшим способом пригодным для выбранной ими цели.

Все патенты, патентные заявки, публикации, и ссылки, процитированные в данном описание, включены путем отсылки (по упоминанию) таким образом, как если бы текст каждого из них был включен в данное описание.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к искусственным биоматериалам, методам их производства и использования. Описаны биополимеры и биокомпозиты на основе коллагена. Для получения ориентированного фибриллярного биополимерного материала готовят раствор геля фибриллярного биополимера в жидкокристаллической фазе, наносят этот раствор равномерным слоем на подложку и высушивают слой ориентированием фибриллярного биополимера. В случае необходимости биополимер снимают с подложки в виде пленки. Для получения фибриллярного биополимерного волокна берут ленту ориентированного биополимерного материала и погружают в раствор, затем извлекают ее из раствора таким образом, что биополимерный материал сворачивается в волокно на границе воздуха и жидкости. Техническим результатом его использования является упрощение и удешевление способа получения ориентированных биополимерных материалов, повышение технологичности, повышение биосовместимости таких материалов с живыми тканями. 4 н. и 32 з.п. ф-лы, 4 табл., 14 ил., 2 пр.

1. Способ получения ориентированного фибриллярного биополимерного материала, включающий:
приготовление раствора или геля фибриллярного биополимера в жидкокристаллической фазе;
нанесение раствора или геля равномерным слоем на подложку;
высушивание раствора или геля с ориентированием фибриллярного биополимера.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что переход в жидкокристаллическую фазу осуществляют изменением параметров, выбранных из группы: концентрация фибриллярного биополимера, температура, рН, ионная сила.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что нанесение раствора или геля приводит к образованию узора биополимера с ориентацией дальнего порядка.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что высушивание ведет к самосборке фибриллярного биополимера.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что высушивание происходит в изменяющихся внешних условиях.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что изменяющиеся внешние условия определяются параметрами, выбранными из группы: влажность, температура, электростатический потенциал.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что поверхность подложки модифицируют.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что модификация ведет к увеличению степени адгезии фибриллярного биополимера к подложке.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что модификация ведет к уменьшению степени адгезии фибриллярного биополимера к подложке.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительно фибриллярный биополимер убирается с подложки.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что ориентированному фибриллярному биополимерному материалу придается форма ленты.

12. Способ по п.7, отличающийся тем, что модификация влияет на степень ориентации жидкокристаллической фазы.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно фибриллярный биополимер химически сшивают и материал стерилизуют.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что жидкокристаллическая фаза является лиотропной.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что биополимер является коллагеном.

16. Способ получения фибриллярного биополимерного волокна, включающий:
погружение ленты ориентированного биополимерного материала в раствор;
последующее извлечение ленты из раствора таким образом, что биополимерный материал сворачивается в волокно на границе воздуха и жидкости.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап высушивания фибриллярного биополимерного волокна.

18. Способ по п.16, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап химической сшивки биополимера в волокне.

19. Способ по п.16, отличающийся тем, что волокно содержит не менее двух лент.

20. Способ по п.16, отличающийся тем, что раствор имеет рН от 2 до 9.

21. Биополимер, полученный в соответствии с п.1.

22. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что имеет форму листа и усредненная ориентация фибрилл параллельна поверхности листа.

23. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что имеет форму листа и усредненная ориентация фибрилл перпендикулярна поверхности листа.

24. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что имеет форму трубки со средней ориентацией фибрилл, расположенной под углом к ее оси.

25. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что имеет одинарный волнистый узор.

26. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что имеет двойной волнистый узор с произвольными углами между завитками.

27. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что имеет волнистый узор, сформированный левозакрученными и правозакрученными спиральными волокнами.

28. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что предназначен для использования в качестве субстрата клеточных культур.

29. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что предназначен для использования в качестве направляющего клетки остава in vivo.

30. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что предназначен для доставки компонентов плазмы обогащенной тромбоцитами.

31. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что предназначен для доставки живых клеток при восстановлении и регенерации тканей.

32. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что предназначен для доставки веществ из группы: пептиды, факторы роста.

33. Биополимер по п.21, отличающийся тем, что предназначен для доставки компонентов плазмы, обогащенной тромбоцитами для восстановления и регенерации тканей.

34. Биокомпозит, состоящий из, по крайней мере, одного слоя ориентированного фибриллярного биополимерного материала и, по крайней мере, одной биодеградируемой биосовместимой с ним матрицы.

35. Биокомпозит по п.34, отличающийся тем, что включает не менее двух слоя ориентированного фибриллярного биополимерного материала и биодеградируемую биосовместимую матрицу между ними.

36. Биокомпозит по п.34, отличающийся тем, что матрица состоит из материалов, выбранных из группы: глюкозаминогликанов, протиогликанов, ванадата, фосфатов кальция, живых клеток, факторов роста.