РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ (CSFV), СОДЕРЖАЩИЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БЕЛОК Е2, И СПОСОБЫ СОЗДАНИЯ УКАЗАННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО CSFV Российский патент 2013 года по МПК C12N7/04 A61K39/12 

Изобретение относится к заболеваниям животных. Более конкретно, изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), содержащему модифицированный белок Е2. Кроме того, изобретение относится к вакцине, содержащей указанный рекомбинантный CSFV, который дает возможность дифференцировать зараженное животное от вакцинированного животного, и способам создания указанного рекомбинантного CSFV.

Вирус классической чумы свиней (CSFV) представляет собой покрытый оболочкой, содержащий плюс-цепь РНК вирус, который совместно с вирусом диареи крупного рогатого скота (BVDV) и вирусом пограничной болезни овец (BDV) составляют род Pestivirus семейства Flaviviridae (Pringle, 1998. Arch Virol 143: 203-10). Заражение CSFV поголовья домашних свиней может привести к огромным экономическим потерям (Terpstra and de Smit. 2000. Vet Microbiol 77: 3-15). Вакцинация CSFV, аттенуированным в результате многократных пассажей в кроликах и клеточной культуре, так называемым «Китайским» или «К»-штаммом, дает быстро возникающий и пожизненный иммунитет против вирулентного CSFV. К-штамм вируса успешно используется во всем мире и часто упоминается как наиболее эффективная из когда-либо полученных ветеринарных вакцин. Однако эта вакцина не обеспечивает серологической дифференциации инфицированных и вакцинированных животных (DIVA). Это является крупным недостатком, поскольку невозможность детекции CSF-инфицированных животных в вакцинированной популяции может наложить серьезные торговые ограничения.

На практике CSF можно диагностировать методом ELISA, с помощью которого детектируют антитела к структурному гликопротеину E^rns или E2. Было разработано несколько вакцин-кандидатов, потенциально удовлетворяющих требованиям DIVA при условии проведения соответствующих методов ELISA, которые представляют собой варианты, начиная от субъединичных вакцин (Hulst et al., 1993. J Virol 67: 5435-42) до живых аттенуированных вакцин (van Gennip et al., 2000. Vaccine 19: 447-59; van Zijl et al., 1991. J Virol 65: 2761-2765) и вакцин на основе репликонов (van Gennip et al., 2002. Vaccine 20: 1544-56; Widjojoatmodjo et al., 2000. J Virol 74: 2973-2980).

Коммерчески доступная DIVA-вакцина против CSF основана на продуцируемом в бакуловирусной системе белке E2, которая сопровождается серологическим тестом, детектирующим антитела, направленные против E^rns (Van Aarle, 2003. Dev Biol Stand Basel 114: 193-200). Хотя эта вакцина обеспечивает защиту от CSF, она является менее эффективной, чем вакцина на основе штамма К в отношении как начала, так и продолжительности иммунитета (van Oirschot, 2003. Vet Microbiol 96: 367-84). Более того, ELISA-тесты на E^rns, которые сопровождают эту вакцину, также детектируют другие вирусы из рода Pestivirus (а именно, BVDV и BDV). Поэтому их использование не рекомендуется в регионах, где циркулируют эти вирусы (2003/265/EC; SANCO/10809/2003).

Кроме того, ранее было обнаружено, что чувствительность ELISA-тестов на E^rns является недостаточной для диагностики отдельных животных, и поэтому эти анализы используются только для стада с достаточно большим числом животных (Blome et al., 2006. Rev Sci Tech 25: 1025-38; Floegel-Niesmann, 2003. Dev Biol 114: 185-91). Это объясняет, почему для сопровождения DIVA-вакцины, как правило, ELISA-тесты на Е2 являются более предпочтительными, чем тесты на E^rns.

Белок Е2 содержит два главных антигенных домена, а именно В/С-домен и А-домен (van Rijn et al., 1993. J Gen Virol 74: 2053-60; Wensvoort, 1989. J Gen Virol 70: 2865-76). Домен А, который расположен между аминокислотами 766 и 866 полипротеина CSFV, подразделяется на субдомены А1, А2 и А3 (Wensvoort, 1989. J Gen Virol 70: 2865-76). Несмотря на то что домен А1 является основной мишенью нейтрализующих антител, его структура сохранялась неизменной на протяжении эволюции. Фактически, вследствие консервативности его последовательности и его иммунодоминирования домен А1 является основной мишенью в ELISA-тестах на Е2.

Хотя вспышки CSF в настоящий момент контролируются карантинными ограничениями и убоем подозрительного поголовья, существует острая необходимость введения более гуманных и более экономичных оперативных стратегий для контроля вспышек CSF в будущем. Поэтому срочно необходима DIVA-вакцина, сопровождаемая надежным и CSFV-специфичным методом ELISA.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), содержащему делецию по меньшей мере одной аминокислоты в «TAVSPTTLR»-домене белка Е2, соответствующему положениям 829-837 в родительском полипротеине CSFV.

Под полипротеином понимается примерно 4000-аминокислотный гипотетический полипротеин, который образуется в результате трансляции вирусной РНК. Указанный полипротеин процессируется с образованием конечных продуктов расщепления N^Pro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B.

Белок Е2 CSFV содержит недавно идентифицированный эпитоп, который включает аминокислотную последовательность TAVSPTTLR (остатки 829-837 в полипротеине CSFV; для аминокислот используется однобуквенный код) (Lin et al., 2000. J Virol 74: 11619-25). Этот эпитоп имеет все отличительные признаки А1-домена (являясь иммунодоминантным, эволюционно консервативным, специфичным для CSFV и мишенью для нейтрализующих антител). Сравнение последовательностей в области TAVSPTTLR-домена среди Е2-белков из различных штаммов пестивирусов указывает на то, что последовательность TAVSPTTLR является высококонсервативной среди штаммов CSFV и высоковариабельной среди штаммов BVDV и BDV (Lin et al., 2000. J Virol 74: 11619-25).

Антитела, особенно моноклональные антитела, используемые в специфичных к Е2 методах анализа ELISA, которые узнают TAVSPTTLR-домен, не имеют перекрестной реакции с другими членами рода пестивирусов, и поэтому их можно использовать в областях, где циркулируют эти другие вирусы. Указанные антитела не будут узнавать рекомбинантный CSFV по изобретению, содержащий делецию в указанном домене белка Е2.

Таким образом, указанный рекомбинантный вирус дает возможность дифференциации животных, инфицированных рекомбинантным вирусом, от животных, инфицированных CSFV дикого типа, и от животных, которые не были инфицированы и/или которые не были вакцинированы. Кроме того, использование указанного рекомбинантного вируса позволит использовать пептидный диагностический тест для установления отличий между этими животными.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), содержащему делецию по меньшей мере одной аминокислоты в «TAVSPTTLR»-домене CSFV или его эквиваленте. Эквивалентный домен представляет собой домен в области Е2, в котором одна аминокислота заменена на другую аминокислоту, такую как аминокислота, принадлежащая к той же группе, то есть ароматическая аминокислота, которая заменена другой ароматической аминокислотой, или алифатическая аминокислота, которая заменена другой алифатической аминокислотой.

Указанный родительский геном предпочтительно включает по существу полный вирусный геном из штамма CSFV, предпочтительно природного или рекомбинантного аттенуированного штамма CSFV. Термин родительский геном включает молекулу нуклеиновой кислоты, такую как молекула РНК и/или ее кДНК-копия.

Термин «делеция по меньшей мере одной аминокислоты», используемый в описании, означает удаление по меньшей мере одной аминокислоты. Термин «делеция» не охватывает удаления по меньшей мере одной аминокислоты, за которым следует встраивание другой по меньшей мере одной аминокислоты в то же положение. Поэтому используемый в настоящем описании термин «делеция» не охватывает замену аминокислоты на другую аминокислоту.

Указанная рекомбинантная молекула кДНК предпочтительно содержит по существу полный геном вируса классической чумы свиней (CSFV), при этом указанный геном кодирует белок Е2, содержащий делецию по меньшей мере одной аминокислоты в консервативном «TAVSPTTLR»-домене, соответствующем положениям 829-837 в полипротеине CSFV. Термин «по существу полный» указывает на то, что указанный вирус, получаемый на основе указанного генома, способен инфицировать соответствующую клетку или клеточную линию и может воспроизводиться в соответствующей клетке или клеточной линии. «По существу полный» вирусный геном предпочтительно представляет собой геном, способный к репликации. Более предпочтительным является инфицирующий, способный к репликации и упаковке вирусный геном. Кроме того, также предпочтительно, чтобы рекомбинантный вирус классической чумы свиней (CSFV) содержал «по существу полный» вирусный геном, предпочтительно способный к репликации геном, или, более предпочтительно, инфицирующий, способный к репликации и упаковке вирусный геном.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения делеция по меньшей мере одной аминокислоты в домене TAVSPTTLR рекомбинантного CSFV по изобретению включает делецию центрального пролина указанного «TAVSPTTLR»-домена.

Пролин является уникальным среди 20 стандартных аминокислот в том, что имеет боковую цепь, замкнутую на каркасный атом азота. Это ограничивает конформацию указанного пролина, а также остатка, предшествующего ему. Кроме того, пролин может действовать как конформационный «переключатель», обеспечивая возможность частям белка принимать альтернативные конформации. Замена центрального пролина в домене TAVSPTTLR, по этой причине, не только меняет первичную последовательность, но также изменяет конформацию иммуногенного TAVSPTTLR-домена. Белок Е2, содержащий делецию центрального пролина в TAVSPTTLR-домене, не будет распознаваться антителами, которые узнают указанный домен в белке Е2.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления измененный белок Е2 рекомбинантного CSFV по изобретению содержит делецию по меньшей мере двух аминокислот в домене TAVSPTTLR. Делеция двух аминокислот включает делецию TA, AV, VS, SP, PT, TT, TL и LR соответственно в TAVSPTTLR-домене E2. Наиболее предпочтительной делецией двух аминокислот является делеция остатков PT в положениях 833-834 в домене TAVSPTTLR.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления измененный белок Е2 рекомбинантного CSFV по изобретению содержит делецию по меньшей мере трех аминокислот в указанном TAVSPTTLR-домене, например трех аминокислот, четырех аминокислот, пяти аминокислот, шести аминокислот, семи аминокислот, восьми аминокислот или девяти аминокислот. Еще более предпочтительный белок Е2 содержит делецию аминокислотных последовательностей VSP, SPT, AVSP или SPTTL.

Изобретение дополнительно относится к рекомбинантному CSFV по изобретению, включающему по меньшей мере одно дополнительное изменение генома родительского CSFV. Вирусы, содержащие делецию в указанном консервативном TAVSPTTLR-домене, менее эффективно инфицируют клетки по сравнению с родительским вирусом и/или менее эффективно реплицируются в зараженных клетках, что приводит к более низкому титру по сравнению с родительским вирусом. Продолжительное пассирование клеток, зараженных вирусом, содержащим делецию в консервативном TAVSPTTLR-домене, давало «восстановленный» вирус, который более эффективно инфицировал клетки и/или реплицировался в клетках, приводя к титрам, сравнимым с титрами родительского вируса. В восстановленном вирусе введены одно или более дополнительных изменений относительно родительского генома, которые компенсируют потерю приспособляемости вируса вследствие делеции в консервативном TAVSPTTLR-домене.

В одном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение представляет собой молчащую мутацию, которая меняет геном вируса, но не приводит к изменению аминокислоты. Указанная молчащая мутация присутствует в некодирующей части вирусного генома или кодирующей части вирусного генома, например в части вирусного генома, кодирующей N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, и/или в части, кодирующей неструктурные белки. Молчащая мутация может вносить вклад в восстановление приспособляемости измененных вирусов в какой-либо момент в процессе биосинтеза этих вирусов. Не касаясь какой-либо определенной теории, авторы предполагают, что молчащая мутация, например, приводит к повышению стабильности вирусного генома и/или усилению репликации, поскольку указанная молчащая мутация изменяет конформацию вирусной геномной нуклеиновой кислоты. Кроме того, указанная молчащая мутация может привести к чаще встречающемуся кодону. Предпочтительной молчащей мутацией является замена U на С в положении 1549 гена E^RNS.

В дополнительном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение находится в области, кодирующей белок Е1, который, как известно, собирается в соединенные дисульфидными связями гетеродимеры с белком Е2. Таким образом, делеция в консервативном TAVSPTTLR-домене Е2, по меньшей мере частично, компенсируется изменением по меньшей мере одной аминокислоты в белке Е1. В дополнительном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение находится в области, кодирующей белок N^pro, C, E^rns, E1 или E2. Указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение предпочтительно включает по меньшей мере два изменения в различных областях, выбранных из областей, кодирующих белки N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, или в пределах одной области, кодирующей белок N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2. Указанные по меньшей мере два дополнительных изменения предпочтительно включают по меньшей мере одну молчащую мутацию. Предпочтительной молчащей мутацией является замена U на С в положении 1549 гена E^RNS.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение приводит к введению дополнительного сайта N-гликозилирования в белке Е2. Сайт N-гликозилирования по дополнительному положению в белке Е2, вероятно, компенсирует либо напрямую, либо через свою функцию в качестве якорного сайта для углеводной части, потерю приспособляемости, обусловленной указанной делецией в эпитопе TAVSPTTLR. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный сайт N-гликозилирования вводится в результате изменения домена LFDGTNP (аминокислотные положения 772-778), такого как, например, замена D на N в положении 774. В качестве альтернативы или в качестве дополнения сайт N-гликозилирования вводится в результате замены А на N в положении 830 в белке Е2.

В результате указанного дополнительного изменения предпочтительно меняется кодон, занимающий положения 1547-1549, кодирующий V392 в белке E^rns; кодон, занимающий положения 2273-2275, кодирующий E634 в белке Е1; кодон, занимающий положения 2693-2695, кодирующий D774 в белке Е2; и/или кодон, занимающий положения 2864-2866, кодирующий V831 в белке Е2. Указанное изменение кодона в данных положениях включает либо молчащую мутацию либо включает изменение кодируемой аминокислоты. Предпочтительное по меньшей мере одно дополнительное изменение включает замену валина (V) в положении 831 на глицин (G).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно изменение в родительском геноме приводит к замене S на F в положении 789 и/или к замене А на Т в положении 445. Серин в положении 789 и аланин в положении 445 присутствуют во всех вирусах К-штамма и относятся к лапинизированным штаммам CSFV, в то время как фенилаланин в положении 789 и треонин в положении 445 консервативны в вирулентных штаммах CSFV. Хотя история создания К-штамма вируса полностью не известна, ясно, что аттенуированный вирус был получен пассированием в кроликах несколько сотен раз, для чего могли быть выгодными S в положении 789 и A в положении 445. Замена S на F в положении 789 и замена А на Т в положении 445, по-видимому, выгодна для размножения вируса, содержащего делецию в эпитопе TAVSPTTLR, в то время как они могут быть незначащими для вируса, содержащего эпитоп TAVSPTTLR.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному CSFV, содержащему делецию Р в положении 883 и молчащую замену. Предпочтительной молчащей заменой является замена U на С в положении 1549 гена E^RNS. Другой предпочтительный рекомбинантный CSFV содержит делецию Р в положении 833 и замену S на F в положении 789 и/или замену А на Т в положении 445; делецию Р в положении 833 и замену D на N в положении 774, замену V на G в положении 831 и делецию T в положении 834 либо в сопровождении, либо без замены U на C в положении 1549. Наиболее предпочтительный рекомбинантный CSFV содержит делецию пролина и треонина в положениях 833 и 834, соответственно, домена «TAVSPTTLR» белка E2, замену U на C в положении 1549, замену глутаминовой кислоты (Е) на аспарагиновую кислоту (D) в положении 634, замену аспарагиновой кислоты (D) на аспарагин (N) в положении 774 белка Е2 и замену валина (V) на глицин (G) в положении 831.

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), включающему изменение по меньшей мере одной аминокислоты в домене «TAVSPTTLR» (положения 829-837) в белке Е2 родительского полипротеина CSFV, в результате чего указанное изменение включает замену центрального пролина в домене TAVSPTTLR на аспарагин. Было обнаружено, что указанная замена минимизирует или даже ингибирует связывание Е2-специфичных моноклональных антител с измененным белком Е2.

Помимо изменения первичной аминокислотной последовательности, введение указанного аспарагина приводит к введению сайта N-гликозилирования, содержащего консенсусную последовательность гликозилирования [N-x-S/T], в которой х обозначает любую аминокислоту, за исключением Р или D (Kornfeld and Kornfeld, 1985. Annu Rev Biochem 54: 631-64). N-гликозилирование вирусных белков отвечает на иммуногенность, в результате чего введение сайта N-гликозилирования может ограничить как клеточный, так и гуморальный ответ на вирусный белок. Поэтому указанную замену можно использовать для получения рекомбинантного вируса, который позволяет дифференцировать животных, инфицированных вирусом дикого типа, от животных, инфицированных указанным рекомбинантным вирусом.

В одном варианте осуществления изобретения рекомбинантный CSFV, включающий замену центрального пролина в домене TAVSPTTLR на аспарагин, содержит в геноме по меньшей мере одно дополнительное изменение. Предпочтительное по меньшей мере одно дополнительное изменение приводит к дополнительному сайту N-гликозилирования в N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, и/или в части, кодирующей неструктурные белки. Предпочтительный дополнительный сайт N-гликозилирования присутствует в Е2, например, в пределах TAVSPTTLR-домена или в пределах эпитопа LFDGTNP белка Е2.

Другим предпочтительным по меньшей мере одним дополнительным изменением является молчащая мутация, присутствующая в некодирующей части вирусного генома или в кодирующей части вирусного генома, например в части вирусного генома, кодирующей N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, и/или в части, кодирующей неструктурные белки. Предпочтительной молчащей мутацией является замена U на С в положении 1549 гена E^RNS.

Еще одно другое предпочтительное по меньшей мере одно дополнительное изменение включает изменение по меньшей мере одной аминокислоты в N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, и/или в части, кодирующей неструктурные белки. Указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение предпочтительно выбрано из молчащей замены, например замены U на С в положении 1549 гена E^RNS, замены S на F в положении 789, замены А на Т в положении 445, замены D на N в положении 774, замены V на G в положении 831 и/или делеции T в положении 834. Еще более предпочтительно, чтобы указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение включало по меньшей мере два дополнительных изменения, выбранные из молчащей мутации, дополнительного сайта N-гликозилирования и/или изменения аминокислоты, в дополнение к замене центрального пролина в домене TAVSPTTLR на аспарагин. Указанные по меньшей мере два дополнительных изменения присутствуют в том же белке или в других белках, выбранных из N^pro, C, E^rns, E1, E2 и неструктурного белка. Предпочтительно, чтобы указанные по меньшей мере два дополнительных изменения присутствовали в том же белке или в различных белках, выбранных из N^pro, C, E^rns, E1 и E2.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), содержащему вставку по меньшей мере одной аминокислоты в домен TAVSPTTLR (занимающий положения 829-837) в белке Е2, кодируемом геномом родительского CSFV. Указанная вставка будет минимизировать или даже ингибировать связывание специфичных к Е2 моноклональных антител с измененным белком Е2. Вставку по меньшей мере одной аминокислоты в «TAVSPTTLR»-домене предпочтительно объединяют по меньшей мере с одним дополнительным изменением, выбранным из молчащей мутации, дополнительного сайта N-гликозилирования и/или замены аминокислоты, или их комбинации, в N^pro, C, E^rns, E1, E2 и неструктурном белке. Указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение предпочтительно выбирать из молчащей замены, например замены U на С в положении 1549 гена E^RNS, замены S на F в положении 789, замены А на Т в положении 445, замены D на N в положении 774 и/или замены V на G в положении 831.

Родительский геном рекомбинантного CSFV по изобретению предпочтительно представляет собой геном аттенуированного штамма CSFV.

Аттенуированные штаммы CSFV можно создать мутацией гена E^rns, кодирующего белок с РНКазной активностью (Mayer et al., 2003. Virus Res. 98: 105-16); делецией N^pro из вирулентных штаммов CSFV (Mayer et al., 2004. Vaccine 22: 317-328); объединением мутаций в E^rns и Е2 (van Gennip et al., 2004. J. Virol. 78: 8812-8823); мутацией гена E1 (Risatti et al., 2005. Virology 343: 116-127); и мутацией гена Е2 (Risatti et al., 2007. Virology 364: 371-82).

Предпочтительный аттенуированный штамм CSFV содержит вставку в 3'-концевой некодирующей области. Например, вставка 12 нуклеотидов в 3'-нетранслируемую область приводит к аттенуации CSFV (Wang et al., 2008. Virology 374: 390-8). Указанная вставка предпочтительно содержит последовательность из 12 нуклеотидов, состоящую из 5'-CUUUUUUCUUUU.

Наиболее предпочтительным родительским геномом является геном К-штамма (китайского). Еще более предпочтительным в качестве родительского генома является геном К-штамма Cedipest, который представляет собой вирус К-штамма, адаптированный к суспензионным культурам клеточной линии SK6 почки свиньи (Terpstra et al., 1990. Dtsch Tierarztl Wochenschr. 97:77-9). Свиньи, вакцинированные 400-600 TCID50 штамма Cedipest, полностью защищены от заражения более чем 100 LD50 (для свиней) вирулентного штамма CSFV через 7 дней и через 6 месяцев после вакцинации. Следовательно, изобретение также относится к молекуле кДНК, содержащей копию генома рекомбинантного вируса классической чумы свиней (CSFV), кодирующей измененный «TAVSPTTLR»-домен (положения 829-837) в Е2. Указанная молекула кДНК предпочтительно содержит по существу полный рекомбинантный родительский вирусный геном CSFV по изобретению, причем указанный родительский геном получен из К-штамма (китайского) или, более предпочтительно, из штамма Cedipest. Предпочтительная молекула кДНК содержит копию генома рекомбинантного CSFV, кодирующего белок Е2, содержащий делецию по меньшей мере одной аминокислоты в «TAVSPTTLR»-домене. Изобретение также относится к антителу, предпочтительно моноклональному антителу, которое специфично узнает указанный измененный «TAVSPTTLR»-домен. Изобретение дополнительно относится к конструкции, кодирующей белок, содержащий указанный измененный «TAVSPTTLR»-домен. Изобретение дополнительно относится к белку, содержащему указанный измененный «TAVSPTTLR»-домен, и к пептиду, содержащему указанный измененный «TAVSPTTLR»-домен, и к применению указанных белка или пептида в иммунологическом методе анализа, таком как, например, метод ELISA.

В дополнительном аспекте изобретение относится к живой CSF-вакцине, содержащей рекомбинантный CSFV по изобретению.

Вакцина или иммуноактивная композиция, содержащая рекомбинантный CSFV по изобретению, объединяет быстрое возбуждение иммунного ответа и продолжительность защиты, индуцируемые живым аттенуированным вирусом, с возможностью дифференциации вакцинированных животных и животных, которые заражены вирусом дикого типа, благодаря присутствию отличия, такого как делеция, в консервативном домене TAVSPTTLR белка Е2, который представляет собой важный иммунодоминантный эпитоп белка Е2.

Было разработано несколько вакцин, которые приводят к значительному снижению уровня циркулирующего вируса и последующему снижению количества клинических случаев. Например, была разработана субъединичная вакцина против CSFV на основе гликопротеина Е2 оболочки вируса. Эта субъединичная вакцина позволяет отличать вакцинированных и зараженных свиней на основе детекции антителами к E^RNS (Van Aarle, 2003. Dev Biol Stand (Basel) 114: 193-200). Однако эта вакцина уступает вакцине на основе К-штамма как в отношении индукции, так и в отношении длительности иммунитета. Более того, ELISA-тесты на E^rns, которые сопровождают эту вакцину, также детектируют другие члены рода пестивирусов (а именно, BVDV и BDV). Поэтому их использование не рекомендуется в регионах, где циркулируют эти вирусы (2003/265/EC; SANCO/10809/2003).

Еще одна вакцина получена на основе так называемых вирусных репликонных частиц (VRP). VRP-частица содержит мутантную геномную РНК, которая способна реплицироваться и экспрессировать кодируемые вирусные белки, но которая не содержит полную информацию, необходимую для образования частиц, вследствие делеций по меньшей мере в одном из генов, кодирующих вирусные структурные белки. Эти вирусные частицы не передаются от животного к животному и поэтому удовлетворяют одному из требований к безопасной вакцине. Однако VRP с частичной или полной делецией гена Е2 обеспечивают только частичную защиту против смертельного заражения высоковирулентным CSFV (Maurer et al., 2005. Vaccine 23: 3318-28).

Изобретение дополнительно относится к способу защиты животного от CSF, включающему введение указанному животному эффективного количества вакцины по изобретению.

Эффективное количество определяют как количество указанной вакцины, которое будет вызывать иммунный ответ у индивидуума, которому ее вводят, приводя к развитию у индивидуума секреторного, клеточного и/или гуморального иммунного ответа на вакцину. Указанный секреторный, клеточный и/или гуморальный иммунный ответ на вакцину также эффективен против заражения вирулентным штаммом CSFV.

Указанное эффективное количество предпочтительно вводят перорально, или ороназально, или внутримышечно. Иммуногенную композицию против классической чумы свиней, содержащую рекомбинантный CSFV по изобретению, предпочтительно вводить совместно с фармацевтически приемлемым носителем.

Дополнительный способ защиты животных от CSF включает обеспечение эффективного количества вакцины по изобретению в виде вакцины в приманке, в частности, для защиты диких животных, таких как кабаны.

Эффективные вакцины снижают или предупреждают клинические признаки заболевания путем предотвращения репликации вируса и/или уменьшения передачи вируса. Термин DIVA (дифференциация инфицированных от вакцинированных животных) используют для вакцин и сопровождающих их диагностических тестов, основой которых являются мутантные вирусы и вирусы дикого типа совместно с диагностическим тестом для их дифференциации. Эта система делает возможной массовую вакцинацию восприимчивой популяции животных, не мешая серологической идентификации выздоравливающих животных.

Кроме того, изобретение относится к способу дифференциации животных, инфицированных CSFV, от неинфицированных животных и животных, вакцинированных CSF-вакциной по изобретению, включающему анализ сыворотки животного в серологическом тесте. Предпочтительно, чтобы указанная вакцина против CSFV включала изменение TAVSPTTLR-домена по изобретению и, более предпочтительно, по меньшей мере одно дополнительное изменение в белке Е2, такое как, например, изменение в домене LFDGTNP по аминокислотным положениям 772-778.

Указанный серологический тест предпочтительно включает одно или более антител, таких как моноклональные антитела, узнающие белок Е2, содержащий интактный TAVSPTTLR-домен, и одно или более антител, таких как моноклональные антитела, которые узнают дополнительный эпитоп, кодируемый CSFV, такой как дополнительный эпитоп в белке Е2, например эпитоп LFDGTNP.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) дают возможность диагностики CSF у живых свиней. Предпочтительным типом ELISA является «сэндвич»-ELISA. Предпочтительным ELISA является конкурентный метод ELISA на основе Е2, такой как, например, Ceditest 2.0 ELISA. Путем предварительной инкубации сыворотки животного с мутантным белком Е2, содержащим измененный домен TAVSPTTLR, либо отдельно, либо в комбинации с измененным доменом LFDGTNP, можно истощить указанную сыворотку по антителам, которые направлены против указанных измененного домена TAVSPTTLR и измененного домена LFDGTNP.

Наиболее предпочтительным методом ELISA является пептидный метод ELISA, в котором пептиды сшиты с поверхностью лунок аналитических микропланшетов. Указанную сшивку предпочтительно осуществлять через якорный белок, такой как, например, поли-L-лизин. Методы ELISA, в которых используют сшитые пептиды, обычно являются более чувствительными по сравнению с методами ELISA, в которых используют пассивное нанесение пептидов на лунки. Эта методика относительно проста в исполнении, не требует специального оборудования для тканевой культуры, подходит для автоматизации и может давать результаты за полдня. Можно использовать моноклональные и/или поликлональные антитела, которые однозначно различают полевые и вакцинные штаммы CSFV, с одной стороны, а также CSFV и другие пестивирусы, с другой стороны. Пептид можно использовать для блокирования неспецифичной перекрестной реактивности.

Указанный пептидный метод ELISA предпочтительно представляет собой жидкофазный пептидный ELISA (lp-ELISA). В указанном lp-ELISA для детекции антител против CSFV тестируемую сыворотку инкубируют со смесью модифицированного CSFV-пептида и гетерологичного контрольного пептида, например BVDV-пептида. Указанный модифицированный CSFV-пептид предпочтительно является биотинилированным, в то время как контрольный пептид является небиотинилированным. Специфичные к CSFV антитела будут связывать указанный CSFV-пептид и будут захватываться с помощью указанной модификации, например, в результате связывания авидином или стрептавидином биотинилированного CSFV-пептида. Можно детектировать антитела, которые образуют комплексы с модифицированным CSFV-пептидом, например, образующие комплексы свиные антитела можно детектировать с помощью пероксидазного конъюгата вторичных антител к свиным антителам и последующей инкубации с подходящим субстратом.

Альтернативным тестом для дифференциации животного, инфицированного полевым CSFV или вакцинированного рекомбинантным вирусом по изобретению, является тест с использованием флуоресцентных антител (FAT) и тест, в котором проводят реакцию обратной транскрипции с последующими амплификацией кДНК, например, с помощью ПЦР, и анализом последовательности амплифицированной ДНК. FAT используют для детекции CSFV-антигена в замороженных срезах миндалин, селезенки, почек, лимфатических узлов или дистальных участков подвздошной кишки, полученных от свиньи, которая предположительно инфицирована CSFV или которая привита вакциной по изобретению. В альтернативном тесте CSFV выделяют из, например, миндалин животного, которое инфицировано или предположительно инфицировано полевым CSFV, и инкубируют с клетками РК-15. Затем реплицированный вирус детектируют в клетках РК-15 с использованием антител, которые позволяют отличать полевой вирус от рекомбинантного вируса по изобретению.

Другой предпочтительный серологический тест включает конкурентный метод ELISA для определения того, содержит ли указанная сыворотка антитела, которые ингибируют связывание антитела к белку Е2 с интактным доменом TAVSPTTLR, или содержит ли указанная сыворотка антитела, которые ингибируют связывание антител к белку Е2 с измененным доменом TAVSPTTLR.

Еще другой предпочтительный серологический тест включает одно или более антител, предпочтительно моноклональных антител, которые специфично узнают белок Е2, содержащий измененный домен TAVSPTTLR по изобретению. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный серологический тест включает одно или более антител, таких как моноклональные антитела, которые специфично узнают белок Е2, содержащий измененный домен TAVSPTTLR по изобретению и дополнительный измененный иммуногенный домен указанного белка Е2. Указанная маркерная вакцина требует надежной индукции и детекции (чувствительной и специфичной) антител, используемых для установления отличий, после вакцинации животных. Присутствие указанных антител, используемых для проведения отличий, детектируют с помощью указанного серологического теста, который предпочтительно выбирают из теста нейтрализации вируса флуоресцентными антителами, анализа нейтрализации антителами, конъюгированными с пероксидазой, и метода ELISA с использованием антител.

Изобретение дополнительно относится к способу выделения инфекционного рекомбинантного вируса, который можно использовать в маркерной вакцине, позволяющей дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных животных, причем способ включает отбор иммунодоминантного домена белка, кодируемого указанным вирусом, и который является консервативным по меньшей мере у 90% вирусов, предпочтительно по меньшей мере у 95% вирусов, более предпочтительно по меньшей мере у 99% вирусов; введение изменения, предпочтительно делеции, в область генома указанного вируса, которая кодирует указанный иммунодоминантный домен, так чтобы получить начальный вирус; приведение измененного генома в контакт с подходящей клеткой или клеточной линией; пассирование подходящей клетки или клеточной линии для размножения вируса; и выделение инфекционного вируса из указанной подходящей клетки или клеточной линии, который содержит одно или более дополнительных изменений в геноме, компенсирующих потерю приспособляемости начального вируса.

Указанное изменение в консервативном иммунодоминантном домене белка позволяет получить антитела, такие как моноклональные и поликлональные антитела, которые позволяют отличать вирус, экспрессирующий иммунодоминантный домен дикого типа, от вируса, который экспрессирует измененный иммунодоминантный домен. Следовательно, изобретение также относится к антителу, предпочтительно моноклональному антителу, которое специфично узнает указанный измененный консервативный иммунодоминантный домен.

Изобретение дополнительно относится к конструкции, кодирующей белок, содержащий указанный измененный консервативный иммунодоминантный домен. Изобретение дополнительно относится к белку, содержащему указанный измененный консервативный иммунодоминантный домен, и к пептиду, содержащему указанный измененный консервативный иммунодоминантный домен.

Кроме того, вакцина, включающая изменение в консервативном иммунодоминантном домене, не вызывает у вакцинированного индивидуума синтеза антител, которые узнают неизмененный иммунодоминантный домен. Диагностический тест, направленный на распознавание указанного неизмененного консервативного иммунодоминантного домена, позволяет отличать животное, инфицированное вирусом, который экспрессирует иммунодоминантный домен дикого типа, от вакцинированного животного.

Указанное изменение в консервативном иммунодоминантном домене может привести к вирусу, который менее эффективно инфицирует клетки по сравнению с вирусом дикого типа и/или менее эффективно реплицируется в инфицированных клетках. Пассирование инфицированной клетки или клеточной линии дает возможность введения одного или более вторичных изменений в геном, которые восстанавливают исходные свойства вируса. Указанный восстановленный вирус более эффективно инфицирует и/или реплицируется в клетках по сравнению с измененным вирусом, или восполняет какой-либо другой недостаток, коррелирующий с изменением консервативного иммунодоминантного домена. Поэтому восстановленный вирус содержит одно или более дополнительных изменений в родительском геноме, которые компенсируют потерю приспособляемости вируса, возникающую в результате изменения в консервативном иммунодоминантном домене. Дополнительным преимуществом способа по изобретению является то, что одно или более дополнительных изменений в родительском геноме будут затруднять возникновение ревертанта вируса, содержащего родительский иммунодоминантный домен.

В предпочтительном способе по изобретению указанное изменение в геномной области приводит к делеции по меньшей мере одной аминокислоты. Делеция по меньшей мере одной аминокислоты, например одной аминокислоты, двух аминокислот, трех аминокислот или более аминокислот, будет дополнительно затруднять возникновение ревертанта вируса, содержащего родительский иммунодоминантный домен.

В другом предпочтительном способе по изобретению делеция по меньшей мере одной аминокислоты объединена по меньшей мере с одним дополнительным изменением в геноме родительского вируса. Указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение позволяет пассировать инфицированную начальным вирусом клетку или клеточную линию в случае, когда указанная делеция по меньшей мере одной аминокислоты является губительной для репликации вируса в указанной клетке или клеточной линии. Введение указанного по меньшей мере одного дополнительного изменения в некоторой степени восстанавливает приспособляемость начального вируса, обеспечивая возможность репликации начального вируса в указанной клетке или клеточной линии.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный вирус выбран из вирусов с (-)цепью РНК, таких как вирус бешенства и вирус болезни Ньюкасла, и вирусов с (+)цепью РНК, таких как флавивирусы, предпочтительно пестивирусы, такие как вирус диареи крупного рогатого скота, вирус пограничной болезни овец и CSFV. Наиболее предпочтительным вирусом для способа по изобретению является CSFV.

Изобретение дополнительно относится к инфекционному рекомбинантному вирусу, предпочтительно CSFV, который можно получить способом по изобретению.

Изобретение также относится к применению инфекционного рекомбинантного вируса, предпочтительно CSFV, который можно получить способом по изобретению, такому как применение в вакцине для вакцинации одного или более животных с целью защиты указанных животных от заражения вирулентным полевым вирусом.

Указанное применение вакцины позволяет дифференцировать инфицированных животных от неинфицированных животных или вакцинированных животных.

Главным преимуществом эффективной маркерной вакцины является то, что она позволяет детектировать инфицированных свиней в популяции вакцинированных свиней и, следовательно, дает возможность контролировать распространение или повторное возникновение CSFV в популяции свиней. Таким образом, на основании результатов лабораторных тестов можно с определенной степенью уверенности заявлять, что вакцинированная популяция свиней свободна от CSF.

Последнее может привести к сокращению периода ограничения на экспорт живых свиней или продуктов из свинины. Экономическое преимущество быстрого возобновления торговли является очевидным и, таким образом, целиком связано с использованием любой маркерной вакцины.

Описание фигур

Фиг.1. Введенные и адаптивные мутации в Е2.

^аСравнение аминокислот по положениям 772-791 и 823-842 исследуемых рекомбинантных вирусов.

^bВведенные аминокислотные замены выделены полужирным шрифтом, адаптивные мутации выделены полужирным курсивом.

^сЭпитопы TAVSPTTLR и LFDGTNP выделены рамкой.

^d++; Восстановленный вирус, рост которого сравним с ростом vFlc34 (вирусом дикого типа), +; вирус с нарушенным ростом по сравнению с vFlc34, †; вирус был потерян в культуре через несколько пассажей, -; вирус не детектировался, nd; не определено.

^еОдин из нововведенных AAU-кодонов был удален в ходе размножения вируса.

Фиг.2. In vitro ростовые характеристики vFlc34 (К-штамма дикого типа), мутантов К-штамма по гликозилированию - vFlc-N1 и vFlc-N2 и делеционных мутантов К-штамма - vFlc-ΔP и vFlc-ΔPTa1. Инфицировали монослои SK6.T7, покрывали ростовой средой, содержащей метилцеллюлозу, и инкубировали при 37°C в течение четырех дней. Монослои фиксировали в 4% параформальдегиде и проводили иммуноокрашивание конъюгированными с пероксидазой антителами mAb WB103.

Фиг.3. (А) Многостадийные кривые роста вирусов vFlc34 (◊), vFlc-N1 (□), vFlc-N2 (○), и (B) вирусов vFlc34 (◊), vFlc-ΔP (×) и vFlc-ΔPTa1 (Δ). Клетки SK6.T7 инфицировали с множественностью заражения 0,1.

Фиг.4. Вестерн-блот лизатов клеток SK6.T7, разделенных электрофорезом в денатурирующем PAGE, неинфицированных (пустые клетки) или инфицированных vFlc34, vFlc-N1 или vFlc-N2, соответственно, и эти же образцы после обработки N-гликозидазой F. Белки детектировали антителами mAb C2 и конъюгированными с пероксидазой кроличьими антителами к мышиным иммуноглобулинам в качестве вторичных антител. Указано положение олигомеров (O), мономеров (M) и мономеров, обработанных N-гликозидазой F (M*). Положение белковых стандартов молекулярного веса указаны слева.

Фиг.5. Анализ гуморального ответа на E2 и E^RNS с помощью Ceditest 2.0 E2 ELISA (▲) и CHEKIT E^RNS ELISA (□), соответственно, индуцированного vFlc34 (A), vFlc-N1 (B) или vFlc-ΔP (C). Приведенные величины являются средними (n=4) с указанными среднеквадратичными отклонениями.

Фиг.6А-Е. Левые панели: анализ гуморального ответа на E2 и E^RNS с помощью Ceditest 2.0 E2 ELISA (▲) и CHEKIT E^RNS ELISA (□), соответственно, индуцированного vFlc34 (кролики 1.1 (A) и 1.2 (В)) или vFlc-ΔPTa1 (кролики 2.1 (C), 2.2 (D) и 2.3 (E)). Правые панели: анализ полученной кроличьей антисыворотки на 36 день методом PEPSCAN. Показана реактивность кроличьей антисыворотки со 162 пептидами (ось х). Числа на оси x соответствуют положению N-конца пептида в CSFV полипептиде. На оси y отложены величины ODccd.

Фиг.6F-G. Сравнение реактивности антител из кроличьей антисыворотки, полученной против vFlc34 (F) или vFlc-ΔPTa1 (G), на эпитоп TAVSPTTLR. Числа на оси x соответствуют положению N-конца пептида в CSFV полипептиде. На оси y отложены величины ODccd.

Фиг.7. Предполагаемая антигенная структура эктодомена белка Е2 К-штамма CSFV (приведено с изменениями из Van Rijn et al., 1994. J Virol 68: 3934-42). Указаны антигенные домены В/С и А. Положения потенциальных сайтов N-гликозилирования (PNGS), упомянутых в тексте, указаны стрелками. В этих мутантах указанная аминокислота заменена на остаток Asn. Оригинальные N-гликаны изображены сплошными линиями, нововведенные (потенциальные) N-гликаны изображены пунктирными линиями. Положения в Е2, которые предположительно колокализуются в структуре нативного Е2, заштрихованы. В-клеточные эпитопы ⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷ и ⁷⁷²LFDGTNP⁷⁷⁸ указаны полужирным шрифтом.

Фиг.8. Температура тела (сплошные символы) и клинические показатели (CS; незаштрихованные символы) свиней, вакцинированных vFlc34 (A; свиньи №№ 3166-3170), vFlc-ΔPTa1 (B; свиньи №№ 3171-3175), или свиней, которых прививали только культуральной средой (C; свиньи №№ 3176-3178). Свиней заражали вирулентным штаммом Brescia на 28 день. Лихорадкой считали температуру тела выше 40°C (пунктирная линия).

Фиг.9. Число лейкоцитов (А) и тромбоцитов (В) в периферической крови, полученной от свиней, зараженных смертельной дозой высоковирулентного штамма Brescia. За 28 дней до заражения свиней вакцинировали либо только культуральной средой, либо однократно vFlc34 (свиньи №№ 3166-3170) или vFlc-ΔPTa1 (свиньи №№ 3171-3175).

Фиг.10. Анализ гуморальных ответов свиней, вакцинированных vFlc34 или vFlc-ΔPTa1 и впоследствии зараженных вирулентным штаммом Brescia. Для анализа гуморального ответа использовали PrioCHECK CSFV Ab 2.0 E2 ELISA (A) и Chekit ERNS ELISA (B). Сыворотка, которая обеспечивала более 40% или 50% ингибирования, считалась положительной на антитела к CSFV в E2 ELISA и ERNS ELISA, соответственно. Свиней вакцинировали в 0 день vFlc34 (свиньи №№ 3166-3170; прерывистые линии) или vFlc-ΔPTa1 (свиньи №№ 3171-3175; сплошные линии) и заражали на 28 день (указан стрелкой).

Примеры

Пример 1

Материалы и методы

Вирусы и клетки. Клетки почки свиньи, конститутивно экспрессирующие РНК-полимеразу бактериофага Т7 (SK6.T7) (van Gennip et al., 1999. J Virol Methods 78:117-28), растили на среде К1000, дополненной глутамином (0,3 мг/мл, Gibco), 5% бычьей фетальной сывороткой и антибиотиками пенициллином (100 ед./мл, Gibco), стрептомицином (100 ед./мл, Gibco), амфотерицином B (2,5 мкг/мл, Gibco) и, при необходимости, дигидрохлоридом L-гистидинола (10 мМ, Sigma). Если не указано иное, вирусные стоки получали пассированием вируса от трех до четырех раз в клетках SK6.T7, за которым следовали два последовательных цикла замораживания/оттаивания инфицированных монослоев. Их проводили для максимизации высвобождения К-штамма вируса, который прочно ассоциирован с клетками. Вирусные стоки титровали на клетках в 10-кратных разведениях и оценивали в TCID50/мл.

Конструирование мутантов К-штамма. Плазмиду pPRK-flc34, которая содержит ДНК-копию К-штамма CSFV «Cedipest» под контролем Т7-промотора, использовали в качестве матрицы для введения мутаций сайт-направленным мутагенезом. Было обнаружено, что в ранее опубликованной ДНК-копии К-штамма вируса, названной pPRKflc-133 (Moormann et al., 1996. J Virol 70:763-70), отсутствует цитозин в положении -10 на 3'-конце генома. В pPRK-flc34 эта ошибка была исправлена. Праймеры описаны в таблице 1. Название прямого праймера соответствует названию сконструированного рекомбинантного вируса. Для каждой конструкции в качестве обратного праймера использовали праймер RV-r. ПЦР-амплификацию проводили, используя систему Expand High- Fidelity PCR (Roche). Продукты ПЦР клонировали в вектор pGEM-T Easy согласно инструкциям изготовителя (Promega) и секвенировали, используя генетический анализатор ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). ПЦР-продукты выделяли из плазмид pGEM-T расщеплением с помощью ApaLI и использовали для замены соответствующего геномного фрагмента плазмиды pPRc129, плазмиды на основе pOK12, содержащей кДНК, кодирующую 5'-половину К-штамма вируса. Плазмиды pPRc129 последовательно расщепляли NotI и SalI и полученные фрагменты использовали для замены соответствующего фрагмента плазмиды pPRK-flc34, получая плазмиды pFlc-N1, pFlc-N2, pFlc-N3, pFlc-N4, pFlc-N5, pFlc-ΔP, pFlc-ΔPT, pFlc-ΔSP, pFlc-ΔSPT, pFlc-ΔVSP, pFlc-ΔAVSP и pFlc-ΔSPTTL.

Продукция вирусов мутантами К-штамма. Плазмиды, содержащие полноразмерные кДНК-клоны, линеаризовали XbaI и трансфицировали ими клетки SK6.T7, как описано ранее (van Gennip et al., 1999. J Virol Methods 78:117-28). Через четыре дня после трансфекции экспрессию вирусных белков определяли методом иммунопероксидазного анализа в монослое (IPMA) с использованием антител mAb WB103 к неструктурному белку NS3 вируса CSF (Edwards et al., 1991. Vet Microbiol 29:101-8). Клетки из другой лунки обрабатывали трипсином, переносили в 25-см² культуральный флакон и растили в течение 3-4 дней. При необходимости, клетки многократно пассировали для поддержания роста вируса. Монослои подвергали замораживанию/оттаиванию, центрифугировали для удаления клеточного дебриса и затем хранили при -70°C. Осветленные лизаты использовали для приготовления посевного материала потенциальных вакцин, инфицируя свежие клетки SK6.T7 и собирая лизаты через четыре дня. Вирусы всегда выращивали на клетках SK6.T7. Хотя описанные в настоящем документе вирусы также нормально реплицируются в клетках SK6, выход продукции более точно воспроизводится при использовании клеток SK6.T7.

Для исследования кинетики роста восстановленных вирусов субконфлюэнтные монослои в культуральных флаконах площадью 25 см² инфицировали с множественностью заражения 0,1. Через 24, 48, 72, 96, 120, 144 и 168 часов после инфекции определяли вирусные титры в клеточных лизатах. Материал подвергали замораживанию/оттаиванию два раза, осветляли центрифугированием при 2500×g и 4°C и хранили при -70°C. Вирусные титры (logTCID50/мл) определяли на клетках SK6.T7. У восстановленных вирусов секвенировали гены Е2. При необходимости, также секвенировали гены, кодирующие белки капсида (С), E^RNS и E1 (то есть структурные белки). Для этого выделяли вирусную РНК с помощью набора High Pure Total RNA isolation kit (Roche) и использовали ее для синтеза кДНК с помощью системы Superscript First-Strand Synthesis system (Invitrogen) и ген-специфичного праймера. кДНК секвенировали, как описано выше.

Вестерн-блоты. Лизаты инфицированных клеток SK6.T7 готовили из конфлюэнтных монослоев, выращенных в культуральных флаконах с поверхностью 25 см². Для этого клетки лизировали в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 1% Nonidet P40 (BDH) и смесь ингибиторов протеазы (Complete, Roche). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием в течение 4 минут при 10000×g и 4°C. Белки разделяли в 12% полиакриламидных гелях (NuPAGE system, Invitrogen) и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Protran, Schleicher and Schuell). После блокирования мембраны в PBS, содержащем 0,05% Tween-20 и 1% Protifar (Nutricia), блоты инкубировали с антителами mAb C2, специфичными к К-штамму, направленными против домена В/С белка Е2 (Bognár and Mészáros, 1963. Acta Vet Acad Sci Hung 13:429-438), и затем с конъюгированными с пероксидазой кроличьими антителами к мышиным иммуноглобулинам (DAKO). Пероксидазную активность определяли с помощью усиленной хемилюминесцентной системы (ECL Plus, GE Healthcare), используя для визуализации Storm 860 molecular imager (GE Healthcare).

Иммунопероксидазный анализ в монослое (IPMA). Монослои промывали D-PBS (Gibco), сушили на воздухе и замораживали при температуре -20°C. Монослои фиксировали параформальдегидом (4% масс./об. в PBS) в течение 15 минут и затем промывали PBS. Конъюгированные с пероксидазой специфичные к А-домену mAb b2, b3, b4, b7 (Wensvoort et al., 1989. J Gen Virol 70: 2865-76), c1, c4, c8, с11 (Bognár and Mészáros, 1963. Acta Vet Acad Sci Hung 13:429-438) и mAb, используемые в Ceditest 2.0 ELISA, именуемые mAb 18.4, использовали в PBS, содержащем 0,05% Tween-80 (PBS-T) и 5% лошадиной сыворотки. После инкубации при 37°C в течение 1 часа планшеты промывали три раза PBS-T, после чего определяли активность пероксидазы, используя в качестве субстрата 3-амино-9-этил-карбазол (AEC, Sigma).

Заражение кроликов. Новозеландских белых кроликов весом приблизительно 2 кг содержали группами по 2-4 животных. Температуру тела контролировали ежедневно, начиная за три дня перед заражением до пяти дней после заражения. Нормальная температура тела кроликов варьирует от 38,5 до 40,1°C. Соответственно, лихорадкой считали температуру тела выше 40,1°C. Кроликов заражали через большую ушную вену, используя 200 мкл ростовой среды, содержащей 10³ TCID50 вируса. Сыворотку собирали через каждые семь дней. Для выделения вируса собирали кровь с EDTA через четыре для после заражения.

Выделение вируса. Лейкоциты периферической крови (PBL) концентрировали из образцов крови с EDTA осаждением хлоридом аммония (0,83% NH₄Cl), как описано (Terpstra and Wensvoort, 1988. Vet Microbiol 16:123-8). Клетки PBL ресуспендировали в PBS и замораживали при температуре -70°C. На следующий день субконфлюэнтные монослои клеток SK6.T7 инкубировали с суспензией замороженных/оттаянных PBL в течение 1 часа, после которого суспензию заменяли свежей ростовой средой с последующей инкубацией в течение четырех дней. Чтобы получить достаточное количество вируса для анализа нуклеотидной последовательности, восстановленные вирусы пассировали несколько раз в клетках SK6.T7.

Анализ PEPSCAN. Полный набор перекрывающих 15-аминокислотных пептидов, полученных из белка Е2 штамма Brescia вируса CSF, соответствующего 690-851 аминокислотам в полипротеине CSFV, синтезировали в формате miniPEPSCAN card (размером с кредитную карту), как описано ранее (Geysen et al., 1984. Proc Natl Acad Sci USA 81:3998-4002). Связывание антител из сыворотки с каждым пептидом тестировали методом ELISA в микрообъемах, как описано в публикации Slootstra et al. (Slootstra et al., 1996. Mol Divers 1:87-96).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение и характеристика мутантов К-штамма с нововведенными потенциальными сайтами N-гликозилирования (PNGS). Полноразмерные кДНК-конструкции, кодирующие мутантные вирусы К-штамма с нововведенными потенциальными сайтами N-гликозилирования в эпитопе TAVSPTTLR (фиг.1), были сконструированы путем генетической модификации pPRK-flc34, кДНК-клона К-штамма «Cedipest» под контролем Т7-промотора. Минимальным требованием для N-гликозилирования является присутствие аминокислотной последовательности «аспарагин (Asn)-X-треонин (Thr) или серин (Ser)», в которой X может быть любой аминокислотой, за исключением Pro или аспартата (Asp) (Kornfeld and Kornfeld, 1985. Annu Rev Biochem 54:631-64). Мутантный вирус vFlc-N1 содержит единственный нововведенный PNGS, в то время как мутанты vFlc-N2, vFlc-N3, vFlc-N4 и vFlc-N5 содержат несколько PNGS (фиг.1). В вирусе vFlc-N5 центральный остаток Pro эпитопа TAVSPTTLR (Pro⁸³³) заменен двумя остатками Asn (N), что приводит к двум перекрывающимся PNGS (то есть к последовательности NNTT).

Для продукции рекомбинантного вируса линеаризованные плазмиды трансфицировали в клетки SK6.T7, конститутивно экспрессирующие РНК-полимеразу бактериофага Т7. Через четыре дня после трансфекции присутствие инфекционного вируса в культуральной среде было показано с помощью заражения свежих клеток SK6-T7 во всех случаях. Однако были отмечены значительные отличия в приспособляемости вируса. Хотя очаги инфекции для vFlc-N1 были несколько меньше, чем для vFlc34 (фиг.2), многостадийные кривые роста не показывали значительных отличий в приспособляемости этих двух вирусов (фиг.3А). Вирус vFlc-N2 был явно более аттенуирован, давая значительно меньшие очаги и меньшие конечные титры (фиг.2 и 3А соответственно). Вирус из супернатанта клеток, трансфицированных pFlc-N3 или pFlc-N4, можно было пассировать один или два раза, но впоследствии он исчезал. Чтобы дать возможность вирусам повысить свою приспособляемость с помощью мутаций, клетки, содержащие эти вирусы, многократно пассировали. Однако, к сожалению, число положительно окрашиваемых клеток не увеличивалось в ходе этих пассажей, что позволяло предположить, что мутации, компенсирующие приспособляемость, не были введены.

Интересно, что вирус, продуцируемый с плазмиды pFlc-N5 (фиг.1), мог восстанавливаться после всего нескольких пассажей трансфицированных клеток, впоследствии давая титр 10⁴ TCID50/мл. Ген Е2 этого вируса был секвенирован, и было найдено, что он является неизмененным. Для крупномасштабного получения vFlc-N5 вирус использовали для заражения свежих клеток SK6.T7. Хотя эта процедура фактически приводила к титрам, аналогичным титрам, обычно получаемым для vFlc34 (данные не показаны), секвенирование консенсусной последовательности показало, что вирус потерял один из двух нововведенных остатков Asn и был поэтому по существу идентичен vFlc-N1. Это открытие позволяет предположить, что второй остаток Asn в эпитопе TAVSPTTLR является губительным для вируса на некоторой стадии процесса заражения. Соответственно, было решено, что для дальнейших исследований подходят только вирусы vFlc-Nl и vFlc-N2.

Для того чтобы подходить в качестве DIVA-вакцины, вакцина-кандидат должна быть неспособна индуцировать специфичные к домену А антитела in vivo. Чтобы получить первичные данные о том, влияют ли модификации, введенные в данные вакцины-кандидаты, на антигенную структуру А-домена, авторы определяли, могут ли любые из специфичных к А-домену mAb по изобретению узнавать рекомбинантные вирусы в IPMA. Специфичные к А-домену mAb были получены либо против штамма Brescia вируса CSFV (а именно, mAb b2, b3, b4, b7), либо К-штамма (а именно, c1, c4, c8 и с11). Также в эти эксперименты были включены mAb, используемые в Ceditest 2.0 ELISA, которые названы mAb 18.4. Поскольку некоторые из антител по изобретению лишь слабо окрашивали К-штамм дикого типа, способность антител распознавать мутантные вирусы К-штамма исследовали с помощью окрашивания очагов инфекции, получаемых в результате роста вируса под слоем метилцеллюлозы. В то время как очаги инфекции К-штамма дикого типа явно окрашивались всеми используемыми антителами, эти эксперименты продемонстрировали, что замена Pro⁸³³→Asn была достаточной для предупреждения узнавания А-домена посредством mAb in vitro (данные не показаны).

Несмотря на то что эпитоп TAVSPTTLR А-домена экспонирован на поверхности вириона и то, что он является доминирующей мишенью нейтрализующих антител, этот эпитоп сохраняет свою консервативность на протяжении всей эволюции. Это позволяет предположить, что вирусы, которые содержат эту точную последовательность, обладают избирательным преимуществом относительно других вариантов в популяции вируса, содержащих аминокислотные замены в этой области. Хотя авторы преуспели в восстановлении исходных свойств вирусов, имеющих либо один (т.е. vFlc-N1), либо два (т.е. vFlc-N2) нововведенных PNGS в этом эпитопе, очевидно, что важно было исследовать эволюцию этих мутантов при росте в тканевой культуре. Для этих целей vFlc-N1 пассировали 30 раз в культуре in vitro. Для исследования фенотипической стабильности вируса проводили иммуноокрашивание инфицированных монослоев с использованием антител, направленных против неструктурного белка NS3, названных WB103, а дупликаты монослоев окрашивали смесью специфичных к А-домену антител b3 и b4, чтобы определить присутствие фенотипических ревертантов (то есть вирусов, А-домен которых может окрашиваться этими антителами). После всего трех пассажей очень небольшой процент клеток, инфицированных vFlc-N1, был окрашен смесью b3/b4, что ясно указывало на возникновение фенотипической реверсии. Общий принцип конкурентного исключения в популяционной биологии гласит, что при сосуществовании двух организмов в одной среде с ограниченными ресурсами один в конечном счете подавит рост другого (Gause, 1934. Science 79:16-17). Принимая во внимание этот принцип, авторы хотели определить, может ли фенотипический ревертант подавить vFlc-N1 в результате многократного пассирования вируса. Удивительно, но количество фенотипического ревертанта оставалось на очень низком уровне, в большинстве экспериментов представлено всего несколькими клетками, которые окрашивались смесью mAb b3/b4. Таким образом, по-видимому, фенотипический ревертант вируса постоянно создавался, но всегда поддерживался в качестве минорного варианта в вирусной популяции. Поскольку эти данные говорят о меньшей приспособляемости фенотипического ревертанта относительно приспособляемости vFlc-N1, авторы сочли маловероятным, что ревертантный вирус представляет собой действительную реверсию к последовательности К-штамма дикого типа. Для идентификации мутации, ответственной за ревертантный фенотип, вирусную популяцию необходимо было обогатить ревертантным вирусом для возможности секвенирования его генома. Обогащенные фенотипическими ревертантами популяции можно отобрать, высевая разведения вируса в 96-луночных планшетах. После повторного такого отбора была получена популяция, которая содержала достаточное количество ревертантного вируса для определения его геномной последовательности. В двух отдельных экспериментах было показано, что фенотипический ревертант содержит остаток Ser в положении, в которое был введен Asn (т.е. в положении 833 полипротеина CSFV), что является результатом одной транзиции в Asn-кодоне (с AAU на AGU). Поскольку эта мутация приводит к потере PNGS, не вызывает удивления, что она сопровождается восстановлением способности mAb узнавать А-домен. В заключение детекция ревертантной субпопуляции демонстрирует, что vFlc-N1 выясняет возможности для увеличения своей приспособляемости с помощью мутаций. Несмотря на это, поскольку этот нововведенный AAU-кодон сохраняется в основном генотипе, вирус считается генетически стабильным на популяционном уровне.

Анализ vFlc-N2 выявил фенотипические варианты с характеристиками, аналогичными наблюдаемым в ходе экспериментов с vFlc-N1, но их дальнейший анализ не проводился.

Анализ относительной электрофоретической подвижности Е2-белков с одним или более нововведенными PNGS. Для того чтобы определить, приводят ли нововведенные PNGS в TAVSPTTLR-эпитопе vFlc-N1 и vFlc-N2 к присоединению новых молекул углеводов к Е2, исследовали относительную электрофоретическую подвижность модифицированных Е2-белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) в восстанавливающих условиях с последующим Вестерн-блоттингом. Вестерн-блоты, содержащие разделенные белки клеток, инфицированных vFlc34, vFlc-N1 и vFlc-N2, демонстрируют, что Е2-белок из vFlc-N1 имел более высокий молекулярный вес, чем соответствующий белок из vFlc34 (фиг.4). Также были определены содержащие Е2 олигомеры, однако учитывая то, что анализ белков проводился в денатурирующих условиях, эти олигомеры, вероятно, не являются физиологическими (фиг.4.). Обработка клеточных лизатов N-гликозидазой F, ферментом, который отщепляет N-гликаны от белков, давала белки Е2 с идентичным молекулярным весом.

Вестерн-блоты, содержащие разделенные белки из vFlc-N2, позволяют предположить, что по меньшей мере одна из двух нововведенных последовательностей гликозилирования используется в качестве якорного сайта для молекулы углевода (фиг.4). Эти лизаты, по-видимому, также содержат белки Е2 с еще большим молекулярным весом, позволяя предположить гликозилирование по второму сайту.

Продукция и характеристика мутантов К-штамма с направленными делециями в TAVSPTTLR-эпитопе. Полноразмерные кДНК-конструкции, кодирующие вирусы К-штамма с направленными делециями в TAVSPTTLR-эпитопе (фиг.1), были сконструированы, как описано выше для мутантов по гликозилированию. Делеция центрального остатка Pro в TAVSPTTLR-эпитопе давала vFlc-ΔP, который продуцировал несколько меньшие очаги инфекции по сравнению с vFlc34 (фиг.2) и давал в большинстве экспериментов 10-кратно более низкие титры (фиг.3В). Однако наивысшие титры превышали 10⁶ TCID50/мл. Анализ vFlc-ΔP с помощью IPMA продемонстрировал, что этот мутант К-штамма не определялся любым из специфичных к А-домену mAb по изобретению. Следует отметить, что после 20 пассажей секвенирование консенсусной последовательности показало транзицию в кодоне Ser⁷⁸⁹ (с UCC на UUC), которая приводит к замене Ser на фенилаланин (Phe). Полученный вирус был назван vFlcΔPa1 (фиг.1).

В отличие от vFlc-ΔP вирусы с делециями более одной аминокислоты были сильно ослаблены. Аналогично уже описанным мутантам по гликозилированию, vFlc-N3 и vFlc-N4, вирус из супернатантов клеток, трансфицированных плазмидами, кодирующими эти вирусы, можно пассировать несколько раз, но впоследствии они исчезают. Для того чтобы дать возможность вирусам повысить их приспособляемость с помощью мутаций, клетки, трансфицированные этими конструкциями, многократно пассировали. Пассирование клеток, трансфицированных pFlc-ΔSP, pFlc-ΔSPT, pFlc-ΔVSP, pFlc-ΔAVSP и pFlc-ΔSPTTL, не приводило к увеличению продукции вирусов.

В течение первичного пассирования клеток, трансфицированных pFlc-ΔPT, результаты были аналогичны полученным с другими делеционными конструкциями, постоянно давая очаги инфекции малого размера (приблизительно 10-20 клеток). Однако после нескольких дополнительных пассажей иммуноокрашивание продемонстрировало внезапное увеличение роста вируса, что позволило предположить, что в вирус были введены компенсирующие приспособляемость мутации. Полученный вирус был назван vFlc-ΔPTa1. Для идентификации потенциальных мутаций в vFlc-ΔPTa1, восстанавливающих свойства вируса, была определена консенсусная последовательность гена Е2. К удивлению, это продемонстрировало, что в вирусе сохранилась введенная делеция, а в гене Е2 добавились две мутации. Соответственно, ясный двойной пик на хроматограмме последовательности для одной из мутаций позволяет предположить, что первой возникает транзиция, приводящая к изменению кодона с GAC на ААС (данные не показаны). Эта мутация приводила к замене Asp⁷⁷⁴ на Asn и, что интересно, вводила новый PNGS в А-домен белка E2 (фиг.1 и 7). Вторым изменением была трансверсия в кодоне валина Val⁸³¹ эпитопа TAVSPTTLR (с GUG на GGG), которая приводила к замене Val на глицин (Gly).

Учитывая возможность того, что адаптивные мутации могут также присутствовать в генах, кодирующих другие структурные белки, также определяли консенсусные последовательности генов C, E^RNS и E1. Анализ последовательности гена С и гена E^RNS выявил только одну молчащую мутацию в последнем (U1549→C). Интересно отметить, что в гене Е1 была детектирована трансверсия в положении 2275 (A2275→U), которая приводила к замене глутаминовой кислоты Glu⁶³⁴ на аспарагиновую кислоту (Asp) (таблица 2).

Ростовые характеристики in vitro для vFlc-ΔPTa1 относительно vFlc34 и vFlc-ΔP представлены с помощью многостадийных кривых роста (фиг.3). Хотя вирус vFlc-ΔPTa1 растет несколько медленнее vFlc34, полученные конечные титры были идентичными.

Экспериментальная эволюция вирусов, получаемых с плазмиды pFlc-ΔPT. Результаты, полученные из анализа последовательности vFlc-ΔPTa1, позволили авторам предположить, что молчащая мутация в E^RNS, аминокислотная замена в Е1 и две замены в E2 отвечают за восстановление приспособляемости. Для проверки этой гипотезы было проведено десять независимых трансфекций с pFlc-ΔPT, и для генов, кодирующих структурные белки, была определена нуклеотидная последовательность. Трансфицированные клетки многократно пассировали и присутствие вируса контролировали с помощью IPMA, используя mAb WB103. После всего двух-трех пассажей число положительных клеток явно увеличивалось, что позволяло предположить введение в вирусы мутаций, компенсирующих приспособляемость. Через одиннадцать пассажей был проведен анализ генома вирусов, как описано для vFlc-ΔPTa1. Результаты этого эксперимента приведены в таблице 2. Мутация, приводящая к замене Asp⁷⁷⁴→Asn, была найдена в шести из десяти исследуемых вирусов, что явно указывало на параллельную эволюцию. Однако в одном из этих вирусов была найдена мутация, которая приводит к замене Asp⁷⁷⁴→Glu, а у трех остальных вирусов не было найдено мутации в кодоне 774-й аминокислоты. Мутация, которая отвечала за замену Val⁸³¹→Gly в vFlc-ΔPTa1, была найдена в одном вирусе (а именно, vFlc-ΔPTa8, таблица 2). Интересно отметить, что молчащая мутация в положении 1549 была найдена у всех вирусов. Этот результат позволяет предположить, что естественный отбор также действует на уровне РНК и что дополнительные адаптивные мутации потенциально могут быть найдены в областях генома, которые не были проанализированы в этом эксперименте. Однако потрясающим открытием было то, что три из четырех мутаций, детектированных в геноме vFlc-ΔPTa1, снова возникали в процессе эволюции вирусов в ходе данного эксперимента. Примечательно, что в вирусе vFlc-ΔPTa5 была найдена мутация в пятом положении. Кроме молчащей мутации в гене E^RNS и замены Asp⁷⁷⁴→Asn в E2, в этом вирусе была введена транзиция в кодоне Ala⁴⁴⁵ (с GCA на ACA) гена E^RNS, которая приводила к замене Ala⁴⁴⁵ на Thr (таблица 2).

Анализ гуморального ответа на vFlc-ΔP и vFlc-N1. Неспособность специфичных к А-домену антител узнавать vFlc-ΔP и vFlc-N1 in vitro продемонстрировала, что авторы успешно модифицировали антигенную структуру А-домена. Однако для того чтобы вакцина могла служить в качестве DIVA-вакцины, гуморальный ответ, индуцируемый in vivo, должен быть достаточно изменен для возможности серологической дифференциации между инфицированными и вакцинированными животными. Хотя DIVA-свойство и защитная эффективность вакцин-кандидатов в итоге тестируют на свиньях, в настоящей работе авторы изобретения предпочитали использовать кроликов для анализа гуморального иммунного ответа по двум причинам. Во-первых, авторы изобретения хотели определить, могут ли исследуемые вакцинные вирусы продуцировать инфекцию in vivo. У свиней заражение вирусами К-штамма не вызывает никаких клинических симптомов, в то время как заражение кроликов вызывает временную лихорадку. Следовательно, использование кроликов давало возможность авторам подтверждать продуктивное заражение и, кроме того, позволяло исследовать потенциальные различия в вирулентности отбираемых вакцин-кандидатов, что может дать некоторое представление о приспособляемости вирусов in vivo (de Smit, et al., 2000. Vaccine 18:2351-8). Вторым преимуществом использования кроликов является то, что К-штамм вируса можно выделять из крови, что часто не удается при использовании свиней. Выделение вакцинного вируса после репликации in vivo позволило авторам изобретения определять стабильность поддержания введенных генетических модификаций. Группам кроликов вводили vFlc-ΔP или vFlc-N1. Контрольным животным вводили либо vFlc34, либо культуральную среду. В ходе акклиматизационного периода средняя температура тела кроликов была нормальной (39,2°C, SD±0,28, n=68). Лихорадкой считалась температура тела выше 40,1°C. Лихорадку вначале отмечали у групп, зараженных vFlc34 (40,7°C, SD±0,48, n=4) и vFlc-N1 (40,5°C, SD±0,32, n=4), для двух групп через два дня после заражения. Повышение температуры тела у кроликов, зараженных vFlc-ΔP (40,0°C, SD±0,13, n=4), отмечали через три для после заражения.

Вирус выделялся из PBL трех из четырех кроликов, зараженных vFlc34, трех из четырех кроликов, зараженных vFlc-N1, и двух из четырех кроликов, зараженных vFlc-ΔP. Секвенирование консенсусной последовательности продемонстрировало, что гены Е2 этих вирусов не изменялись в ходе пассирования у кроликов. Чтобы определить, позволяют ли мутанты К-штамма проводить отличия между инфицированными и вакцинированными животными, антисыворотку кроликов анализировали с помощью Ceditest 2.0 E2 ELISA (Prionics). Этот метод ELISA специфично детектирует антитела против А-домена Е2. В качестве эталонного контроля эффективности иммунизации использовали CHEKIT CSF E^RNS ELISA (IDEXX laboratories).

Ответы на E^RNS, индуцируемые vFlc34, vFlc-N1 и vFlc-ΔP, были сопоставимы (фиг.5). Сравнение ответов, специфичных к А-домену Е2, индуцируемых vFlc34 и vFlc-N1, с помощью Ceditest 2.0 ELISA продемонстрировало, что модификация, присутствующая в vFlc-N1, имела минимальный эффект на этот ответ. В противоположность этому, сравнение ответов к Е2 в результате заражения vFlc-ΔP и vFlc34 продемонстрировало, что делеция Pro⁸³³ приводила к количественную сдвигу гуморального ответа против А-домена (фиг.5). Учитывая не оправдавший ожиданий эффект нововведенного сайта N-гликозилирования в vFlc-N1 на специфичный к А-домену гуморальный ответ, авторы не исследовали антигенные свойства vFlc-N2 у кроликов, а сфокусировались в дальнейших экспериментах на исследованиях делеционных мутантов.

Анализ гуморального ответа против vFlc-ΔPTa1. Во втором испытании на животных гуморальный ответ против vFlc-ΔPTa1 сравнивали с ответом, индуцируемым против vFlc34. Средняя температура тела кроликов перед прививкой была нормальной (39,2°C, SD±0,37, n=28). В этом эксперименте только у одного из двух кроликов, привитых vFlc34, наблюдалась лихорадка через два дня после прививки (40,3°C). У данного кролика (кролик 2.1), привитого vFlc-ΔPTa1, не наблюдалось никакого повышения температуры тела. Напротив, у двух других животных, привитых vFlc-ΔPTa1 (кролики 2.2 и 2.3), отмечали лихорадку. У одного из этих животных отмечали температуру 40,6°C через пять дней после прививки, в то время как у другого кролика отмечали температуру 40,4°C через семь дней после прививки. С учетом того, что vFlc-ΔP не вызывал лихорадку, это открытие было весьма неожиданным. Важно отметить, однако, что кролики 2.2 и 2.3 были вовлечены в ссору, которая привела к появлению ран. Учитывая то, что эти раны вызвали инфекцию кожи, и то, что симптомы инфекции совпали с возникновением лихорадки, весьма вероятно, что лихорадка была результатом кожной инфекции, а не последствием заражения вирусом. Через четыре для после прививки вирус выделялся у двух животных, зараженных vFlc34. Из PBL всех трех кроликов, зараженных vFlc-ΔPTa1, вирус не выделялся, что весьма вероятно связано с аттенуацией этого вируса.

Сыворотка двух кроликов, привитых vFlc34 (животные 1.1 и 1.2; фиг. 6, левая панель), давала результаты в E^RNS и E2 ELISA, которые были сравнимы с результатами, полученными в первом эксперименте. Процент блокирования, определенный с помощью E2 ELISA, был выше, чем определенный с помощью E^RNS ELISA. В противоположность этому, анализ сыворотки кролика 2.1, привитого vFlc-ΔPTa1, продемонстрировал, что процент блокирования в E2 ELISA был ниже процента блокирования, детектируемого в E^RNS ELISA. Эти результаты совпадают с результатами, полученными с vFlc-ΔP (фиг.5), которые все вместе демонстрируют специфическое ослабление гуморального ответа, специфичного к А-домену. Однако, неожиданно, анализ сыворотки животных 2.2 и 2.3 не подтвердил этот результат. У этих животных явно индуцировался высокий уровень антител, специфичных к А-домену Е2. С учетом результатов, полученных для животного 2.1, и более ранних результатов, полученных с vFlc-ΔP, это открытие было весьма неожиданным. Индукцию специфичных к А-домену антител у животных 2.2 и 2.3 можно объяснить рефокусированием гуморального ответа к А-домену на другие эпитопы А-домена помимо эпитопа TAVSPTTLR, которые обычно являются субдоминантными.

Для более тщательного анализа гуморального ответа авторы провели PEPSCAN-анализ ранее сконструированных 15-аминокислотных перекрывающихся пептидов на основе последовательности белка Е2 штамма Brescia CSFV. Этот анализ выявил, что сыворотка, полученная на 36 день от животных, привитых К-штаммом дикого типа, распознает два эпитопа в штамме Brescia CSFV (фиг.6, правая панель). Как ожидалось, первым из этих эпитопов был эпитоп ⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷. В частности, остатки ⁸³¹VSPTTLR⁸³⁷, по-видимому, являются наиболее критичными (фиг.6B, верхняя панель). Второй эпитоп содержал аминокислоты ⁷⁵⁴YLASLHKDAPT⁷⁶⁴. Интересно отметить, что этот эпитоп, распознавание которого было показано впервые, расположен вне ранее определенного А-домена (т.е. аминокислот 766-866; фиг.7). Ни одна из сывороток, полученных от кроликов, привитых vFlc-ΔPTa1, не распознавала ни один из этих эпитопов. Хотя отсутствие распознавания эпитопа ⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷ (фиг.6B, нижняя панель) можно было объяснить мутациями, введенными в vFlc-ΔPTa1, отсутствие распознавания ⁷⁵⁴YLASLHKDAPT⁷⁶⁴ было более удивительным. Это открытие позволяет предположить, что эпитоп ⁷⁵⁴YLASLHKDAPT⁷⁶⁴ некоторым образом взаимодействует с эпитопом ⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷ и что эти эпитопы расположены близко друг от друга в структуре нативного Е2 (фиг.7). Хотя PEPSCAN-анализ не выявил эпитопов в А-домене, которые распознает антисыворотка кроликов 2.2 и 2.3, он показал, что ни одна из этих сывороток не распознает эпитоп TAVSPTTLR. Исходя из этого, авторы смогли сделать вывод о том, что vFlc-ΔPTa1 удовлетворяет критерию DIVA в сопровождении ELISA на основе пептида TAVSPTTLR.

ОБСУЖДЕНИЕ

За последние два десятилетия было разработано несколько экспериментальных DIVA-вакцин, которым было необходимо сопровождение анализа ELISA либо на E2, либо на E^RNS. В литературных данных часто утверждается, что оба диагностических теста подходят для детекции CSF в поле. Хотя это в принципе является корректным утверждением, важно отметить, что методы ELISA на E^RNS имеют два основных недостатка относительно методов ELISA на Е2. Во-первых, хотя методы ELISA на E^RNS можно использовать для достоверной детекции зараженных стад, ранее было найдено, что эти методы ELISA недостаточно чувствительны для диагностики индивидуальных животных. Во-вторых, и что более важно, методы ELISA на E^RNS не являются специфичными к CSF (2003/265/EC. SANCO/10809/2003. Европейская комиссия, Центральная дирекция по охране здоровья и защите потребителей, Брюссель). Соответственно, не рекомендуется использование методов ELISA на E^RNS в областях, где циркулируют BVDV и/или BDV вирусы.

Цель данной работы состояла в конструировании DIVA-вакцины на базе К-штамма, которая была бы совместима с E2 ELISA. Авторы планировали решить эту задачу путем введения определенных мутаций в эпитоп TAVSPTTLR А-домена, который представляет собой доминирующую мишень в этих ELISA. В первых двух подходах остаток центрального Pro (т.е. Pro⁸³³) в эпитопе TAVSPTTLR заменяли на Asn, посредством чего вводили PNGS в центр эпитопа TAVSPTTLR. Хотя известно, что N-гликаны способны экранировать иммуногенные домены от гуморальной иммунной системы, они могут не вносить заметного влияния, находясь в функционально важных доменах или рядом с ними; эти два свойства обусловлены структурной гибкостью углеводной цепи. Хотя авторы успешно получили мутант К-штамма, названный vFlc-N1, в котором стабильно сохранялся нововведенный N-гликан, присоединенный к центру эпитопа TAVSPTTLR, эта модификация, по-видимому, оказывала только минорный эффект на гуморальный ответ, специфичный к А-домену. По этой причине авторы решили не продолжать исследования в данном направлении.

В альтернативном подходе целью авторов было изменение антигенной структуры А-домена путем делеции аминокислот из эпитопа TAVSPTTLR. Делеция центрального остатка Pro (т.е. Pro⁸³³) давало вирус, названный vFlc-ΔP, который стабильно сохранял введенную делецию, несмотря на то, что вирус со временем приобретал адаптивную мутацию, приводящую к замене Ser⁷⁸⁹ на фенилаланин (Phe). Авторы сочли, что эта неконсервативная замена представляет интерес, поскольку Ser⁷⁸⁹ присутствует во всех вирусах К-штамма и связан с лапинизированными штаммами CSFV, в то время как Phe⁷⁸⁹ полностью консервативен в вирулентных штаммах CSFV и, кроме того, высоко консервативен среди других членов рода пестивирусов (van Rijn et al., 1997. Virology 237:337-48). Хотя история создания К-штамма вируса полностью не известна, ясно, что аттенуированный вирус был получен пассированием в кроликах несколько сотен раз (van Oirschot, 2003. Vet Microbiol 96:367-84). Поэтому можно предположить, что Ser⁷⁸⁹ дает преимущество при репликации К-штамма в кроликах. Если это предположение является правильным, то интересна причина, по которой К-штамм не ревертирует к Phe⁷⁸⁹ при росте в свиных клетках in vitro. Это можно объяснить с помощью концепции адаптивного ландшафта Райта (Wright, 1931. Genetics 16:97-159). Согласно этой концепции дающие преимущество мутации возникают медленно, когда генотип существует в верхней области адаптивного пика, что, вероятно, происходит в случае К-штамма дикого типа вируса, в то время как они возникают быстрее, когда генотип существует на более низком уровне адаптивного пика, как в случае vFlc-ΔP.

Анализ сыворотки, полученной от кроликов, привитых vFlc-ΔP, продемонстрировал, что делеции Pro⁸³³ уже достаточно для значительного снижения иммуногенности А-домена. Хотя этот результат продемонстрировал правильность подхода авторов, также стало очевидным, что антигенную структуру А-домена необходимо модифицировать более интенсивно, для того чтобы получить вирус, подходящий в качестве DIVA-вакцины. Хотя плазмиды, кодирующие мутанты К-штамма с делециями от двух до четырех аминокислот из эпитопа TAVSPTTLR (ΔSP, ΔPT, ΔSPT, ΔVSP, ΔAVSP), продуцировали инфекционный вирус, эти вирусы были сильно ослаблены и неспособны к продолжительному росту. Однако после нескольких пассажей клеток, содержащих vFlc-ΔPT, было отмечено значительное улучшение приспособляемости. Восстановленный вирус был назван vFlc-ΔPTa1. Авторы решили, что за восстановление приспособляемости наиболее вероятно отвечают адаптивные мутации в гене белка Е2. Действительно, в гене Е2 были детектированы две адаптивные мутации (фиг.1). Первая мутация приводила к замене остатка Val в эпитопе TAVSPTTLR на Gly. Хотя появление адаптивных мутаций можно было ожидать на близком расстоянии от введенной делеции, было найдено, что вторая мутация расположена далеко от эпитопа TAVSPTTLR в линейной последовательности Е2. Еще более интересно то, что эта вторая мутация (Asp⁷⁷⁴→Asn) вводит PNGS в А-домен.

Восстановление мутанта К-штамма с PNGS в А-домене (т.е. vFlc-ΔPTa1, фиг.1 и 7) через короткое время после конструкции аналогичного вируса с помощью обратной генетики (т.е. vFlc-N1; фиг.1 и 7) кажется удивительным совпадением. Однако если обратить внимание на предшествующие открытия, которые послужили основой исследований авторов, можно предположить, что открытия авторов могут не быть совпадением. Основой идеи работы авторов изобретения послужил фенотип мутанта CSFV, который был отобран в результате выращивания вируса в присутствии нейтрализующих mAb (van Rijn, et al., 1994. J Virol 68:3934-42). Этот MAR-мутант (MAR, резистентный к моноклональным антителам) штамма Brescia, названный vPK26.2, имел две аминокислотные замены в Е2, которые влияли на антигенную структуру А-домена, а именно Pro⁸³³→Leu (в эпитопе TAVSPTTLR) и Thr⁸⁵⁸→Asn (24). Анализ других MAR-мутантов также продемонстрировал, что замена Pro⁸³³→Leu отвечала за нечувствительность к нейтрализации и, кроме того, мешала связыванию со вторым специфичным к А-домену mAb. Однако хотя MAR-мутант, содержащий только Leu⁸³³, все еще узнавали два других специфичных к А-домену mAb, MAR-мутант vPK26.2, который содержал как Leu⁸³³, так и Asn⁸⁵⁸, не определялся ни одним из специфичных к А-домену mAb по изобретению. Учитывая то, что Asn⁸⁵⁸ явно оказывал влияние на антигенную структуру А-домена, авторы высказали гипотезу, что положение 858 некоторым образом взаимодействует с эпитопом TAVSPTTLR или расположено близко к нему в структуре нативного Е2. Кроме того, интересно отметить, что замена Thr⁸⁵⁸→Asn вызывала появление нового PNGS в А-домене (фиг.7). Хотя гликозилирование по этому сайту ранее не изучалось, эффект этой мутации на антигенную структуру Е2 можно объяснить экранированием А-домена N-гликаном. Фенотип vPK26.2 побудил авторов изобретения исследовать не только эффект удаления центрального Pro в эпитопе TAVSPTTLR, но также исследовать и возможность экранирования А-домена N-гликанами. Авторы сочли целесообразным то, что замена Pro⁸³³ на Asn, которая дает вирус vFlc-N1, удаляет структурно важный остаток Pro⁸³³ и одновременно вводит новый PNGS в эпитоп TAVSPTTLR. Важно отметить, что эту модификацию можно рассматривать как замену Pro⁸³³ аспарагином (Asn), но также можно рассматривать как вставку остатка Asn в вирус, у которого отсутствует Pro⁸³³. Хотя это кажется вопросом семантики, это открывает абсолютно новую перспективу, которая позволяет объяснить фенотип vPK26.2, а также генетическую стабильность и приспособляемость vFlc-N1. Удивительным общим признаком этих вирусов является то, что у них отсутствует Pro⁸³³, и они оба содержат новый PNGS в А-домене. Исходя из этих данных, заманчиво предположить, что положения 833 и 858 действительно близко расположены в структуре нативного Е2, а также что остаток Asn в любом одном из этих положений, прямо или посредством своей функции в качестве якорного сайта для молекулы углевода, может компенсировать потерю приспособляемости, возникающую в результате делеции или замены Pro⁸³³ (фиг.7).

Возвращаясь к вирусу vFlc-ΔPTa1, интересно отметить, что нововведенный PNGS в vFlc-ΔPTa1 в положении 774 может также располагаться близко от эпитопа TAVSPTTLR в структуре нативного Е2. А именно, замена Asp⁷⁷⁴→Asn в этом вирусе расположена в центре недавно идентифицированного эпитопа, содержащего аминокислоты ⁷⁷²LFDGTNP⁷⁷⁸ (Peng et al., 2008. Virus Res 135: 267-72). Аналогично эпитопу ⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷, эпитоп ⁷⁷²LFDGTNP⁷⁷⁸ обладает всеми тремя признаками, которые определяют А1-домен, являясь CSFV-специфичным, эволюционно консервативным и мишенью нейтрализующих антител. Исходя из вышеприведенных данных и экспериментальных открытий, авторы изобретения предположили, что эпитопы TAVSPTTLR и LFDGTNP колокализованы в нативной структуре Е2 и, возможно, совместно образуют А1-домен.

В итоге авторы выдвинули гипотезу, что мутация в центральном остатке Pro эпитопа TAVSPTTLR может быть компенсирована N-гликанами, расположенными в трех возможных положениях в белке Е2, и что эти положения расположены близко в структуре нативного Е2. Первый расположен в самом эпитопе ⁸²⁹TAVSPTTLR⁸³⁷, второй - в эпитопе ⁷⁷²LFDGTNP⁷⁷⁸, а третий домен включает аминокислотную последовательность ⁸⁵⁸ТТТ⁸⁶⁰ (фиг.7). Возможно, последние аминокислоты также являются частью еще не идентифицированного эпитопа, расположенного в А-домене. Для подтверждения этих гипотез в настоящее время ведутся эксперименты.

Хотя вероятно принять то, что адаптивные мутации в гене Е2 играют важную роль в восстановлении приспособляемости, авторы убеждены, что также могут играть роль мутации в других генах, кодирующих структурные белки. Поэтому также были секвенированы гены C, E^RNS и E1 из vFlc-ΔPTa1. Секвенирование этой части генома в действительности выявило две дополнительные мутации. Первая была обнаружена в гене Е1. Эта мутация приводила к замене полностью консервативного остатка Glu⁶³⁴ на Asp. Учитывая то, что белок Е2, как известно, собирается в гетеродимеры, соединенные дисульфидными мостиками с белком Е1 (Thiel, et al., 1991. J Virol 65:4705-12), можно предположить, что эта мутация вносит вклад в восстановление приспособляемости vFlc-ΔPTa1. Хотя в гене С не было обнаружено ни одной мутации, в гене E^RNS была обнаружена одна молчащая мутация. Принимая во внимание то, что консенсусная последовательность CSFV дикого типа является исключительно стабильной, практически не накапливая мутаций в ходе пассирования in vitro или in vivo (Vanderhallen, et al., 1999. Arch Virol 144:1669-77), детекция такой молчащей мутации в результате секвенирования консенсуса продемонстрировала, что природная селекция также действует на уровне РНК, и, таким образом, другие мутации в других областях генома также могут вносить вклад в восстановление приспособляемости vFlc-ΔPTa1.

Для понимания молекулярного пути восстановления приспособляемости был проведен эволюционный эксперимент. Этот эксперимент продемонстрировал параллельную эволюцию молчащей мутации в гене E^RNS, мутации, которая приводила к замене Val⁸³¹→Gly, и мутации, которая вводила новый PNGS в положении 774 (таблица 2). Хотя для полного объяснения молекулярных механизмов восстановления приспособляемости явно необходимы дополнительные исследования, эти данные поддерживают наблюдение того, что вышеупомянутые мутации действительно вовлечены в восстановление приспособляемости vFlc-ΔPTa1. Весьма возможно, что эти мутации могут восстанавливать приспособляемость мутантов с более крупными делециями в эпитопе TAVSPTTLR.

Заслуживает внимания то, что у одного из вирусов, исследуемых в эволюционном эксперименте (а именно, vFlc-ΔPTa5), в гене E^RNS детектировали мутацию, которая приводила к замене Ala⁴⁴⁵ на Thr (таблица 2). Аналогично ранее описанной замене Ser⁷⁸⁹ на Phe, найденной после эволюции vFlc-ΔP, аминокислота, которая была изменена в vFlc-ΔPTa5, в данном случае Ala⁴⁴⁵, поменялась на аминокислоту, которая консервативна в полевых штаммах CSFV, в данном случае Thr⁴⁴⁵. Хотя это выходит за рамки настоящей работы, это открытие также демонстрирует, что аттенуация CSFV может предоставить ценные данные о его молекулярной эволюции.

Предшествующие исследования с использованием MAR-мутантов, проведенные Van Rijn с коллегами, позволили предположить, что Pro⁸³³ и Thr⁸³⁴ в эпитопе TAVSPTTLR являются очень важными для целостности консервативных эпитопов А-домена (van Rijn, et al., 1994. J Virol 68:3934-42). Успешная продукция хорошо растущего мутанта К-штамма, в котором отсутствуют обе эти аминокислоты и, кроме того, содержащего замену Val⁸³¹→Gly, позволило предположить, что антигенная структура А-домена этого вируса сильно изменилась. Поэтому авторы ожидали, что иммунный ответ, индуцируемый vFlc-ΔPTa1, можно будет отличить от иммунного ответа, индуцируемого CSFV дикого типа с использованием Ceditest 2.0 E2 ELISA. Достаточно неожиданным было то, что vFlc-ΔPTa1 может действительно индуцировать возникновение специфичных к А-домену антител в достаточной степени. Возможным объяснением этого факта может быть то, что разрушение в ином случае иммунодоминантного эпитопа TAVSPTTLR может приводить к рефокусированию гуморального ответа на эпитопы А-домена, которые обычно являются субдоминантными. В попытке идентифицировать эти эпитопы антисыворотку анализировали с помощью PEPSCAN-анализа. Хотя этот анализ не выявил новых распознаваемых эпитопов, он продемонстрировал, что ни одна из антисывороток не узнавала пептиды, содержащие эпитоп TAVSPTTLR. Интересно отметить, что эти данные позволяют предположить, что метод ELISA на основе эпитопа TAVSPTTLR можно использовать в качестве DIVA-теста, сопровождающего вакцинный вирус vFlc-ΔPTa1.

В итоге, данная работа демонстрирует, что форсированная эволюция вируса может быть мощным инструментом для генетической модификации вируса CSF. В настоящем изобретении этот способ успешно использовали для получения генетически стабильного мутанта К-штамма, который можно серологически дифференцировать от CSFV дикого типа.

Пример 2

Материалы и методы

Делеционный мутант К-штамма, вирус vFlc-ΔPTa1, получали, как описано в примере 1. Клетки SK6.T7 представляют собой клетки почки свиньи, которые конститутивно экспрессируют РНК-полимеразу бактериофага Т7 (van Gennip et al., 1999. Vaccine 19(4-5), 447-59). Эти клетки растили в среде К1000, дополненной глутамином (0,3 мг/мл, Gibco, Invitrogen, Breda, The Netherlands), 5% бычьей фетальной сывороткой (FBS) и антибиотиками пенициллином (100 ед./мл, Gibco), стрептомицином (100 ед./мл, Gibco) и амфотерицином B (2,5 мкг/мл, Gibco). Вирусные стоки титровали на клетках SK6.T7 и указывали как 50%-ные дозы заражения тканевой культуры (TCID₅₀).

Тринадцать обычных свиней, не имеющих антител к пестивирусам, разбивали на две группы по пять свиней и одну группу из трех свиней. Свиней из группы 1 (№№ 3166-3170) вакцинировали однократно в 0 день внутримышечно 1 мл культуральной среды, содержащей 2% бычьей фетальной сыворотки (FBS) и 10⁵ TCID₅₀ рекомбинантного вируса К-штамма, vFlc34 (см. пример 1). Свиней из группы 2 (№№ 3171-3175) вакцинировали по аналогичному протоколу вакциной vFlc-ΔPTa1. Свиней из группы 3 (№№ 3176-3178) прививали однократно культуральной средой, содержащей 2% FBS.

На 28 день свиней из групп 1, 2 и 3 заражали интраназально 1 мл (по 0,5 мл в каждую ноздрю), содержащим 200× 50% летальных доз штамма Brescia CSFV. Всех свиней осматривали ежедневно на предмет заболевания и температуру их тела измеряли, начиная за три дня до заражения. Тяжесть клинических симптомов оценивали, используя ранее определенный перечень критериев, специфичных для CSF (Mittelholzer et al., 2000. Vet Microbiol 74(4), 293-308).

Образцы сыворотки забирали еженедельно у всех свиней. Образцы крови в EDTA и образцы ротоглоточной жидкости собирали у всех свиней из групп 1, 2 и 3 в день заражения (28 день) и затем на 30, 32, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 49, 52 и 56 дни. Образцы крови в EDTA использовали для определения числа лейкоцитов и тромбоцитов. Этот анализ проводили с помощью гемоанализатора Medonic CA 620 (Boule Medical AB). У обычно выращенных свиней концентрации лейкоцитов и тромбоцитов в крови находятся в пределах от 11×10⁹ до 23×10⁹ и от 320×10⁹ до 720×10⁹/литр соответственно. Следовательно, лейкопенией считали количество <8×10⁹ клеток/л крови, а тромбоцитопению как <200×10⁹ тромбоцитов/л крови.

Выделение вируса и количественную ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (qRRT-PCR) с использованием лейкоцитов периферической крови (PBL) или мазков из горла проводили по существу, как описано в публикации (Weesendorp et al., 2009. Vet Microbiol 135(3-4), 222-30).

Образцы сыворотки анализировали, используя коммерческий тест ELISA на E2 (PrioCHECK CSFV Ab 2.0 E2 ELISA, Prionics, Lelystad, The Netherlands) и коммерческий тест ELISA на E^RNS (Chekit CSF ERNS ELISA, IDEXX laboratories, Hoofddorp, The Netherlands) согласно инструкциям изготовителей.

Результаты

Авторы сравнили защитную эффективность вируса vFlc-ΔPTa1 с его родительским вирусом, vFlc34, от смертельного заражения высоковирулентным штаммом Brescia. Две группы по пять свиней вакцинировали на 0 день либо vFlc34 (группа 1), либо vFlc-ΔPTa1 (группа 2). Контрольной группе (группа 3), состоящей из трех свиней, вводили только клеточную культуральную среду. Свиней из групп 1, 2 и 3 заражали высоковирулентным штаммом Brescia на 28 день.

У всех свиней в контрольной группе развивались типичные клинические симптомы CSF, включая сильную лихорадку (фиг.8С), лейкопению (фиг.9А) и тромбоцитопению (фиг.9В). Вирус выделялся из PBL у двух из трех свиней на 4 день и у всех трех свиней на 7 и 9 дни после заражения. Вирус выделялся из мазков из горла у двух животных на 7 день после заражения и у одного животного на 9 день после заражения. Свиньи из этой группы находились в агонии, и их усыпляли на 9 день (свинья 3178) или 10 день (свиньи 3176 и 3177) после заражения.

Ни у одной из свиней, вакцинированных вакциной из рекомбинантного К-штамма (т.е. vFlc34), не развивались клинические признаки заболевания после заражения (фиг.8А), хотя у одной свиньи (№ 3168) была лихорадка в течение одного дня, а у одной другой свиньи наблюдалась тромбоцитопения в течение по меньшей мере одного дня (фиг.9В). Из PBL или мазков из горла вирус не выделялся.

У всех свиней, вакцинированных vFlc-ΔPTa1, после заражения развивалась лихорадка в течение 3-6 дней и наблюдались слабо выраженные клинические симптомы (фиг.8В), но все свиньи полностью выздоравливали. Вирус выделялся из PBL одной свиньи (свинья № 3175) на 2 день после заражения. На основании этих данных авторы заключили, что однократная вакцинация vFlc-ΔPTa1 обеспечивает защиту от смертельного заражения высоковирулентым штаммом Brescia.

Все образцы сыворотки анализировали на присутствие антител к Е2 и E^RNS с помощью PrioCHECK CSFV Ab 2.0 E2 ELISA (Prionics) и Chekit CSF ERNS ELISA (IDEXX laboratories) соответственно. Все свиньи, вакцинированные vFlc34, давали положительный ответ в анализе E2 ELISA через 21 день после прививки (фиг.10A), в то время как эти свиньи давали положительный ответ в E^RNS ELISA на 35 день после прививки (фиг.10В). Ни одна из свиней, вакцинированных vFlc-ΔPTa1, не давала положительного ответа в E2 ELISA перед заражением (фиг.10A). В пределах 7 дней после заражения все свиньи давали положительный ответ в E2 ELISA (фиг.10A). Интересно отметить, что у двух свиней (а именно, свиней 3171 и 3172), вакцинированных vFlc-ΔPTa1, сероконверсия на антитела к E^RNS произошла намного раньше, чем у свиней, вакцинированных vFlc34 (фиг.10B).

Таким образом, был сделан вывод о том, что до заражения у всех свиней, вакцинированных vFlc-ΔPTa1, уровень ответа в PrioCHECK E2 ELISA оставался ниже порогового значения, демонстрируя возможность использования vFlc-ΔPTa1 в качестве DIVA-вакцины также для свиней.

В заключение авторами было продемонстрировано, что однократная вакцинация vFlc-ΔPTa1 обеспечивает защиту от высоковирулентного заражения у всех вакцинированных свиней и были приведены доказательства весьма небольшого выделения или отсутствия выделения вируса во внешнюю среду.

Таблицы

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложен рекомбинантный вирус классической чумы свиней (1111), содержащий делецию по меньшей мере одной аминокислоты в домене «TAVSPTTLR» белка Е2, соответствующем положениям 829-837 родительского полипротеина CSFV, а также соответствующая вакцина, молекула кДНК, способ защиты животного от CSFV и способ дифференциации инфицированных CSFV животных. Изобретение может быть использовано для вакцинации животных от чумы свиней.5 н. и 12 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Рекомбинантный вирус классической чумы свиней (CSFV) для получения вакцины против CSFV, содержащий делецию по меньшей мере одной аминокислоты в домене «TAVSPTTLR» белка Е2, соответствующем положениям 829-837 родительского полипротеина CSFV.

2. Рекомбинантный CSFV по п.1, в котором указанная делеция включает делецию пролина в указанном домене «TAVSPTTLR».

3. Рекомбинантный CSFV по п.1 или п.2, в котором указанная делеция включает по меньшей мере две аминокислоты.

4. Рекомбинантный CSFV по п.1 или п.2, содержащий по меньшей мере одно дополнительное изменение родительского генома.

5. Рекомбинантный CSFV по п.4, в котором по меньшей мере одно дополнительное изменение представляет собой молчащую мутацию.

6. Рекомбинантный CSFV по п.5, в котором молчащая мутация представляет собой замену U на C в положении 1549 гена E^RNS.

7. Рекомбинантный CSFV по п.4, в котором по меньшей мере одно дополнительное изменение образует сайт N-гликозилирования в белке Е2.

8. Рекомбинантный CSFV по п.4, в котором по меньшей мере одно дополнительное изменение представляет собой замену аспарагиновой кислоты (D) в положении 774 в белке Е2.

9. Рекомбинантный CSFV по п.4, в котором по меньшей мере одно дополнительное изменение приводит к глицину (G) в положении 831, и/или фенилаланину (F) в положении 789, и/или треонину (T) в положении 445.

10. Рекомбинантный CSFV по п.4, содержащий делецию пролина и треонина в положениях 833 и 834 соответственно домена «TAVSPTTLR» белка Е2, дополнительно содержащий замену U на G в положении 1549, аспарагиновую кислоту (D) в положении 634, аспарагин (N) в положении 774 в белке E2 и глицин (G) в положении 831.

11. Рекомбинантный CSFV по п.1 или п.2, в котором родительский геном представляет собой геном аттенуированного штамма CSFV.

12. Рекомбинантный CSFV по п.1 или п.2, в котором родительский геном представляет собой геном К-штамма (китайского).

13. Живая вакцина против CSF, содержащая рекомбинантный CSFV по любому из пп.1-12.

14. Способ защиты животного от CSF, включающий введение указанному животному эффективного количества вакцины по п.13.

15. Способ дифференциации животных, инфицированных CSFV, от неинфицированных животных или от животных, вакцинированных вакциной против CSF по п.13, включающий анализ сыворотки животного в серологическом тесте.

16. Способ по п.15, в котором серологический тест представляет собой пептидный метод ELISA.

17. Молекула кДНК, содержащая геном рекомбинантного вируса классической чумы свиней (CSFV), кодирующая белок Е2, содержащий делецию по меньшей мере одной аминокислоты в домене «TAVSPTTLR» белка Е2, соответствующем положениям 829-837 родительского полипротеина CSFV.