BVDV-ВАКЦИНА Российский патент 2016 года по МПК A61K39/12 A61K39/295 A61P31/12 

Настоящее изобретение относится к вирусу BVD (вирусной диареи крупного рогатого скота) и его применениям, к вакцинам и комбинированным вакцинам, содержащим такой вирус, их применениям в качестве лекарственного средства, их применению в лечении вирусной диареи крупного рогатого скота и к способам получения таких вакцин.

Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), член рода Pestivirus в семействе Flaviviridae, является этиологическим фактором вирусной диареи крупного рогатого скота, экономически важного заболевания крупного рогатого скота во всем мире. Пестивирусы могут быть подразделены на два различных биотипа, цитопатогенные (cp) и нецитопатогенные (ncp) вирусы, соответственно. Генетически и структурно близкородственными видами вирусов являются Классический Вирус Свиной лихорадки (CSFV) и овечий Вирус рода Pestivirus (BDV).

Большие экономические потери, вызываемые инфекциями BVDV, обусловлены уменьшенным продуцированием молока, замедлением роста, уменьшенной репродуктивностью и увеличенной встречаемостью других заболеваний, таких как транспортная лихорадка. Уменьшенная репродуктивная способность вызывается i.a. уменьшенной фертильностью, выкидышами и генерированием стойко инфицированных телят, которые могут развивать фатальную "Болезнь слизистых оболочек".

В составе BVDV существуют два основных генотипа, которые классифицируются как различные виды в роде Pestivirus: BVDV Типа 1 и Типа 2. Как Тип 1, так и Тип 2 могут вызывать острую и персистирующую инфекцию, но было описано, что Тип 2 вызывает более тяжелые симптомы у остро инфицированных животных.

Однако, что касается вирулентности, обычно нет большого различия между Типом 1 и Типом 2.

Геном пестивируса состоит из одноцепочечной РНК положительной ориентации. Эта РНК имеет длину приблизительно 12,3 т.п.н. и содержит одну открытую рамку считывания (ORF), которая фланкирована нетранслируемыми районами (NTR) на обоих концах генома. Эта пестивирусная ORF транслируется в один полипротеин, который ко- и посттрансляционно процессируется в 12 зрелых белков вирусными и клеточными протеазами. Первым белком пестивирусной ORF является Npro (N-концевая протеаза). Npro является неструктурной аутопротеазой, которая отщепляется сама от остального ORF-кодируемого полипротеина и тем самым создает ее собственный С-конец, а также правильный N-конец для первого структурного белка в этой ORF, C (кор) белка. За этим белком C в ORF следуют другие структурные белки: E^rns, E1, E2 в этом порядке. Вместе, капсидный (C) белок и три гликозилированных белка оболочки (E^rns, E1, E2) составляют пестивирусный вирион.

E2-белок является иммуно-доминантным белком пестивирусов, содержащим главные нейтрализующие эпитопы. Таким образом, он является мишенью защитной иммунной реакции, вызываемой у хозяина после природной инфекции или последующей иммунизации живыми или убитыми вакцинами. E2-белок, вместе с E^rns-белком и Е1-белком, образует поверхностные белки, выступающие из вирусной оболочки. В данном контексте, гетеродимер E1-E2 является очень важной структурой для сборки и присоединения вируса.

В настоящее время как живые аттенуированные, так и убитые вакцины являются коммерчески доступными. Живые аттенуированные вакцины имеют то преимущество, что они имитируют природную инфекцию и они должны вводиться в большинстве случаев только один раз. Однако они имеют некоторую вирулентность, которая делает их иногда менее подходящими для вакцинации молодых животных и особенно для беременных животных или животных, находящихся в контакте с беременными животными. Убитые вакцины признаются безопасными, но обычно они должны вводиться дважды для получения адекватного уровня защиты. Кроме того, эффективность является во многих случаях уменьшенной и часто ограниченной близкородственными штаммами и типами BVDV.

Живые аттенуированные вакцины являются в настоящее время часто используемыми вакцинами. Для BVDV, доступны живые аттенуированные вакцины для защиты животных против инфекции Типа 1 и Типа 2 BVDV. Ясно, что даже только по коммерческим причинам такие вакцины должны преимущественно вводиться в виде комбинированной вакцины, т.е. в одно и то же время и, даже более удобно, в смеси в одном и том же шприце. Однако было обнаружено, что, в то время как аттенуированные вакцины Типа 1 или 2 BVDV при предоставлении в виде единственной вакцинации обеспечивают превосходную защиту, комбинированная вакцина обеспечивает значительно более низкий уровень защиты. Отдельные живые аттенуированные вакцины обеспечивают так называемый стерильный иммунитет (= без экскреции вируса и без виремии), тогда как комбинированная вакцина не обеспечивает стерильного иммунитета. Даже схема вакцинации, в которой эта вакцинация одним типом и вакцинация другим типом разделены во времени 4 неделями, обнаруживает это неблагоприятное действие. Механизм этого действия является неизвестным.

Таким образом, существует необходимость в улучшении комбинированных вакцин BVDV.

Целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенных вакцин BVDV, в которых неблагоприятные действия взаимонегативных эффектов, например, Типа 1 и Типа 2 BVDV, наблюдаемые в комбинированной вакцине, являются менее тяжелыми или даже отсутствуют.

В этом отношении, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к вирусу вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), принадлежащему к первому Типу, характеризующемуся тем, что он является химерным BVDV, несущим ген E2 вируса второго Типа.

В настоящее время было неожиданно обнаружено, что, если BVDV определенного Типа используется в вакцине для защиты восприимчивого жвачного животного против BVD, где этот BVDV дополнительно несет ген Е2 второго Типа BVDV, вышеупомянутые взаимонегативные эффекты являются менее тяжелыми или даже отсутствуют.

Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к вирусу Вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), принадлежащему к первому Типу, отличающемуся тем, что он является химерным BVDV, несущим дополнительно ген Е2 второго Типа BVDV.

Теперь было также неожиданно обнаружено, что, если вирус BVD определенного первого Типа используется в комбинированной вакцине для защиты восприимчивого жвачного животного против BVDV вместе с химерным BVDV, имеющим структуру того же самого первого Типа, но несущего ген E2 второго Типа BVDV, вместо Е2 первого Типа BVDV, эти взаимонегативные эффекты являются также менее тяжелыми или даже отсутствуют.

Затем такой химерный вирус может быть комбинирован для целей вакцинации с вирусом BVD, имеющим тот же самый скелет молекулы, что и химерный вирус, но несущим исходный Е2, обычно присутствующий в этом вирусе. Только в качестве примера, этот химерный BVDV может быть вирусом Типа 1, ген Е2 которого был заменен геном Е2 вируса Типа 2 и он может быть комбинирован с вирусом Типа 1 с его собственным (= Типа 1) геном Е2.

Скелет молекулы BVDV, часть этого вируса, которая не изменяется, для понимания этого изобретения, в основном образуется аппаратом репликации; неструктурные гены. Однако, только для выяснения концепции скелета, в случаях, когда заменен только ген Е2, можно рассматривать вирусный скелет как являющийся полным вирусным геномом, за исключением Е2. В случаях, когда, например, кроме гена Е2, заменен другой структурный ген, такой как, например, ген Е1, можно рассматривать этот вирусный скелет как являющийся полным вирусным геномом за исключением E2 и E1.

Как указано выше, в принципе можно оставлять оригинальный E2-ген химерного вируса на месте. Затем этот химерный вирус мог бы кодировать, например, как Е2 Типа 1 BVDV, так и Е2 Типа 2 BVDV.

Однако предпочтительной была бы замена оригинального гена Е2 геном Е2, кодирующим другой Тип Е2.

Причиной этого является то, что комбинированная вакцина, содержащая 1) химерный вирус BVD в соответствии с этим изобретением с заменой оригинального гена Е2 геном Е2, кодирующим другой Тип Е2, и 2) вирус BVD, имеющий тот же самый скелет и его оригинальный Тип Е2, могла бы гарантировать, что (при условии введения равных количеств этих вирусов) количество Е2 каждого продуцируемого Типа могло бы быть приблизительно сравнимым.

В случае химерного BVDV, содержащего как оригинальный ген Е2, так и второй ген Е2 другого типа, может быть менее легко гарантировать равные уровни экспрессии обоих генов Е2. Это обусловлено тем, что в таком вирусе один из этих двух Е2-генов мог бы инсертироваться в этом вирусе вне его природного контекста.

Ясно, что при использовании BVDV по этому изобретению в вакцине, этот вирус должен вести себя как ослабленный в сравнении с вирусом дикого типа.

Таким образом, предпочтительно BVDV по данному изобретению является живым аттенуированным вирусом.

Другой вариант этого изобретения, относится к вакцинам для защиты восприимчивых жвачных животных против BVDV, где такие вакцины содержат вирус Вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), принадлежащий к первому Типу, отличающийся тем, что от является химерным BVDV, дополнительно несущим ген Е2 второго Типа, и фармацевтически приемлемый носитель. Затем такой химерный вирус кодирует как Е2 Типа 1, так и Е2 Типа 2, как объяснялось выше.

Как указано выше, BVDV определенного типа, в котором Е2 этого типа заменен другим типом, мог бы быть, по приведенным выше причинам, очень подходящим для использования в комбинированной вакцине.

Таким образом, другой вариант осуществления относится к комбинированной вакцине для защиты восприимчивых жвачных животных против BVDV, где эта вакцина содержит первый BVDV, принадлежащий к первому Типу и несущий ген Е2 BVDV этого первого Типа, второй BVDV, также принадлежащий к первому Типу, но отличающийся тем, что в этом втором BVDV ген Е2 BVDV, принадлежащий к первому Типу, заменен геном Е2 BVDV, принадлежащим ко второму Типу, и фармацевтически приемлемый носитель.

Как упоминалось выше, белок E2 образует, вместе с E^rns-белком и Е1-белком, поверхностные белки, выступающие из вирусной оболочки. В этом контексте, гетеродимер E1-E2 является очень важной структурой для сборки и присоединения вируса.

Таким образом, предпочтительной формой комбинированной вакцины является комбинированная вакцина по этому изобретению, в которой, кроме того, в этом втором BVDV ген Е1 BVDV, принадлежащий к указанному первому Типу, заменен геном Е1 BVDV, принадлежащим ко второму Типу.

В принципе, эта система может быть использована для всех родственных пестивирусов, также для атипичных пестивирусов, подобных группе HoBi-вирусов, которую теперь называют будущим Типом BVDV-3.

Однако Тип 1 и Тип 2 BVDV являются обычными вызывающими заболевание типами. Таким образом, предпочтительно скелет этого вируса принадлежит к Типу 1 и ген Е2 принадлежит к Типу 2 или vice versa.

Таким образом, более предпочтительная форма этого варианта относится к комбинированной вакцине по этому изобретению, где скелет первого и второго вируса BVDV принадлежит к Типу 1 и ген Е2 BVDV второго BVD вируса принадлежит в Типу 2.

Равным образом, более предпочтительная форма этого варианта относится к комбинированной вакцине по этому изобретению, где скелет первого и второго вируса BVD принадлежит к Типу 2 и ген Е2 BVDV второго вируса BVD принадлежит к Типу 1.

Первым BVDV, описанным выше как "принадлежащий к первому Типу и несущий ген Е2 BVDV этого первого Типа", мог быть обычно стандартным вирусом BVD Типа 1 или 2 без изменений в E2. Этот первый BVDV мог быть предпочтительно живым аттенуированным вирусом.

Вторым BVDV, описанным выше как "принадлежащий к первому Типу, но отличающийся тем, что этот ген Е2 BVDV этого второго BVDV, принадлежащий к первому Типу, заменен геном Е2 BVDV, принадлежащим ко второму Типу”, мог быть обычно вирусом Типа 1 или 2, теперь, однако, несущим ген Е2 BVDV Типа 2 или 1, соответственно. Этот второй BVDV мог бы быть также предпочтительно живым аттенуированным вирусом.

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области. Только в качестве примера, таким носителем может быть стерильная вода или буферный раствор, такой как ЗФР.

Только по причинам легкого получения вакцины, было бы практичным, если бы как первый, так и второй BVDV имели идентичный скелет молекулы. Как уже указано выше, с использованием одного и того же скелета для обоих вирусов, можно просто добавлять одно и то же количество обоих вирусов, имеющих высоко сравнимые эффективность репликации и свойства, к этой комбинированной вакцине, и на этом основании предполагать, что оба вируса имеют один и тот же уровень аттенуирования и способности к репликации, что приблизительно одно и то же количество клеток могли бы инфицироваться каждым из этих вирусов и что как Е2-белок Типа 1, так и Е2-белок Типа 2 могли бы экспрессироваться в приблизительно одном и том же количестве белка и реплицировать сравнительное количество РНК-молекул in vitro и in vivo.

Таким образом, предпочтительной формой этого варианта осуществления называют комбинированную вакцину согласно этому изобретению, в которой первый BVDV и второй BVDV имеют один и тот же скелет.

Как упоминалось выше, штаммы BVDV для использования в вакцине должны быть аттенуированы. Несколько таких аттенуированных вакцинных штаммов BVDV были описаны и несколько аттенуированных вакцинных штаммов BVDV являются коммерчески доступными. Наиболее многообещающие вакцинные типы содержат делецию в N^pro-гене и/или в E^rns-гене и являются вакцинами цитопатического биотипа. Пестивирусные вакцины на основе таких делеций были описаны i.a. в PCT-заявке на патент WO 99/64604, Заявке на Патент США 2004/0146854, Европейской Заявке на патент EP 1104676, Европейской Заявке на патент EP 1013757, Европейской Заявке на патент EP 1440149, Европейской Заявке на патент EP 1751276 и Mayer, D., et al, Vaccine 22:317-328 (2004).

Таким образом, более предпочтительная форма этого варианта осуществления относится к комбинированной вакцине по этому изобретению, где этот первый BVDV и/или указанный второй BVDV содержат делецию в N^pro-гене и/или в E^rns-гене.

BVDV является только одним из нескольких агентов, вызывающих заболевание у жвачных животных. На практике, жвачных животных вакцинируют против целого ряда вирусов или микроорганизмов, патогенных в отношении жвачных животных. Таким образом, крайне заманчивым, как для практических, так и для экономических целей, является объединение этой комбинированной вакцины этого изобретения с дополнительным антигеном вируса или микроорганизма, патогенного в отношении жвачных животных, антителом против указанного антитела или генетической информацией, кодирующей иммуногенный полипептид указанного вируса или микроорганизма.

Таким образом, одной даже более предпочтительной формой этого варианта осуществления является комбинированная вакцина по этому изобретению, в которой эта вакцина содержит дополнительный антиген вируса или микроорганизма, патогенный в отношении жвачных животных, антитело против указанного антитела или генетическую информацию, кодирующую иммуногенный полипептид указанного вируса или микроорганизма.

Наиболее обычными патогенными вирусами и микроорганизмами, патогенными для жвачных животных, являются ротавирус крупного рогатого скота, герпесвирус крупного рогатого скота, вирус парагриппа Типа 3, парамиксовирус крупного рогатого скота, вирус синего языка овец, вирус ящура, Pasteurella haemolytica и респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота.

Таким образом, еще более предпочтительной формой этого изобретения является комбинированная вакцина по этому изобретению, в которой этот вирус или микроорганизм, патогенный в отношении жвачных животных, выбран из группы, состоящей из ротавируса крупного рогатого скота, герпесвируса крупного рогатого скота, вируса парагриппа Типа 3, парамиксовируса крупного рогатого скота, вируса синего языка овец, вируса ящура, Pasteurella haemolytica и респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота.

Дополнительным антигеном вируса или микроорганизма может быть цельный вирус или микроорганизм (в живой аттенуированной форме или в инактивированной форме) или иммуногенный полипептид или другая иммуногенная часть этого вируса или микроорганизма, такая как, например, (липо-)полисахарид, способный индуцировать защитную иммунную реакцию.

Вакцины, содержащие живые аттенуированные вирусы, должны храниться при низкой температуре или они должны находиться в лиофилизированной форме. Лиофилизированные вакцины могут храниться в умеренно-охлаждающих условиях или даже при комнатной температуре. Часто эту вакцину смешивают со стабилизаторами, например, для защиты склонных к деградации белков от деградации, для увеличения срока хранения вакцины или для улучшения эффективности лиофилизации. Подходящими стабилизаторами являются i.a. SPGA, углеводы, например, сорбит, маннит, трегалоза, крахмал, сахароза, декстран или глюкоза, белки, такие как альбумин или казеин или продукты их деградации, и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов.

Таким образом, предпочтительно комбинированная вакцина по этому изобретению находится в лиофилизированной форме.

Кроме того, эта вакцина может быть суспендирована в физиологически приемлемом разбавителе. Такими буферами могут быть, например, стерильная вода, буфер и т.п.

Само собой разумеется, что разбавители и соединения для эмульгирования или стабилизации вирусов также воплощены в данном изобретении.

Подходящее количество каждого из BVDV в комбинированной вакцине, в соответствии с этим изобретением, может быть между 10²- и 10⁸-TCID₅₀, в зависимости от уровня аттенуации используемого вируса. Литература, цитируемая выше, и сообщения в данной области могут дать квалифицированному в данной области специалисту обильные рекомендации для определения количества необходимого вируса. В случае использования вакцинных штаммов на основе существующих, коммерчески доступных (ср) штаммов BVDV, содержащих аттенуирующую делецию, такую как делеция N^pro-гена и/или E^rns-гена, инструкции изготовителя могут быть достаточными для определения количества вируса, которое должно быть использовано.

Эмпирически, например, для (cp) BVDV-штаммов, несущих мутацию в N^pro- и/или E^rns-гене, количество 10⁵ TCID₅₀ могло бы быть очень подходящим количеством вируса.

Комбинированные вакцины по этому изобретению могут быть введены посредством известных способов введения. Такие способы предусматривают i.a. интраназальный, внутримышечный, внутривенный, интрадермальный, пероральный и подкожный способы.

Еще один вариант осуществления этого изобретения относится к BVDV для применения в качестве лекарственного средства.

Еще один вариант осуществления этого изобретения относится к BVDV для применения в лечении вирусной диареи крупного рогатого скота.

Еще один вариант осуществления этого изобретения относится к способам получения вакцины по этому изобретению, включающим стадию смешивания BVDV, принадлежащего к первому Типу, где этот BVDV является химерным BVDV, дополнительно несущим ген Е2 второго Типа BVDV, и фармацевтически приемлемого носителя.

Наконец, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам получения комбинированной вакцины согласно этому изобретению, включающим стадию смешивания первого BVDV, принадлежащего к первому Типу, второго BVDV, также принадлежащего к первому Типу и несущего ген Е2 BVDV этого первого Типа, и фармацевтически приемлемого носителя.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Схематическое представление генома BVDV и конструирования pBVDV-1b synth ΔN^pro.

Фигура 2: Схематическое представление генома BVDV и констуирования полноразмерного pBVDV-1b_synth.

Фигура 3: Схематическое представление генома BVDV и констуирования химерных конструктов E2/E1E2 на основе pBVDV-1b_synth.

Фигура 4: IF-анализ коровьих клеток (KOP-R), трансфицированных in vitro транскрибированной РНК этих синтетических кДНК-конструктов.

Фигура 5: NS3-блокирующий анализ ELISA BVDV.

Фигура 6: Анализ нейтрализации BVDV.

Ссылки

Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H. J., und Kummerer, B. M. (1996). Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral diarrhoea viruses from cDNA constructs. J. Virol. 70, 8606-8613.

Geiser, M., Cebe, R., Drewello, D. and Schmitz, R. (2001). Integration of PCR fragments at any specific site within cloning vectors without the use of restriction enzymes and DNA ligase. Biotechniques 31, 88-90, 92.

Wolfmeyer, A., Wolf, G., Beer, M., Strube, W., Hehnen, H.R., Schmeer, N. and Kaaden, O.R. (1997). Genomic (5'UTR) and serological differences among German BVDV field isolates. Arch. Virol. 142, 2049-2057.

Примеры

Пример 1

Конструирование синтетических клонов BVDV

1. Введение

Вирус BVDV типа 1b синтезировали полностью на основе синтетического конструкта. Эта последовательность сходна с опубликованной последовательностью штамма-прототипа BVDV 1b "CP7" и опубликованной полноразмерной последовательностью плазмиды pA/BVDV CP7 (Meyers et al. 1996; Genbank Accession no U63479), однако, были включены существенные изменения и адаптации. Кроме того, два рекомбинантных вируса конструировали на основе этого синтетического клона: Npro делетированный вирус, а также химерный вирус, экспрессирующий Е2 BVDV типа 2 вместо исходного BVDV 1b E2.

Данные для конструирования pBVDV-1b_synth_ΔN^pro

Плазмиды амплифицировали в клетках Escherichia coli DH10B™ (Invitrogen). Плазмидную ДНК очищали с использованием Qiagen Plasmid Mini или Midi Kit. Расщепление рестрикционными ферментами и процедуры клонирования выполняли в соответствии со стандартными протоколами. Секвенирование проводили с использованием Big Dye® Terminator v1.l Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems). Нуклеотидные последовательности считывали с использованием автоматического секвенатора (3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) и анализировали с использованием программы Genetics Computer Group software version 11,1 (Accelrys Inc., San Diego, USA). Сайт-направленный мутагенез выполняли с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза (Stratagene) и Phusion PCR (фьюжн ПЦР) (Geiser et al, 2001), соответственно.

Праймеры для мутагенеза синтезировали с использованием MWG-Biotech и biomers.net GmbH и они перечислены в таблице 1.

  ^а нуклеотиды, отличающиеся от последовательности BVDV-1 СР7 (Accession no. U63479), подчеркнуты;
последовательности BVDV-2 CS8644 (неопубликованные) представлены курсивом
^b положение нуклеотида, соответствующее последовательности BVDV CP7
^c положение нуклеотида, соответствующее pBVDV-1b_synth_ΔN^pro  

pBVDV-1b_synth_N^pro состоял из пяти плазмид, несущих фрагменты синтетической последовательности (1. фрагмент_pGA15, 2. фрагмент_pMA, 3. фрагмент_pMK, 4. фрагмент_pMA, Syn_BsaI_фрагмент_pMK_RQ), которые, все, синтезировали in vitro при помощи GENEART AG (Regensburg, Germany). С использованием этих синтетических фрагментов и их уникальных сайтов рестрикции, генерировали один полноразмерный конструкт плазмиды. Расщепления рестриктазами и процедуры клонирования выполняли в соответствии со стандартными протоколами. Эти синтетические фрагменты последовательностей описаны ниже. Конструирование инфекционного кДНК-клона pBVDV-1b_synth_ΔN^pro показано на фигуре 1. Местоположение сайтов рестрикции и положения нуклеотидов, соответствующие геному BVDV (наиболее сходным штаммом является CP7), указаны стрелками.

1. фрагмент_pGA15 содержит нуклеотиды 1-3357 (сайт Acc65I), соответствующие BVDV1bΔN^pro. При 5'-NTR добавляли последовательность промотора T7 для возможности транскрипции in vitro, а также сайты SnaBI и NheI. Второй сайт Acc65I²⁰⁰⁷ удаляли молчащей мутацией GGTACC в ATATCC.

2. фрагмент_pMA содержит нуклеотиды 3357-6228 (сайт BlpI).

3. фрагмент_pMK содержит нуклеотиды 6288-7956 (сайт BstBI).

4. фрагмент_pMA содержит нуклеотиды 7956-11816 (сайт SmaI). Второй сайт BstBI⁷⁹⁶⁵ удаляли молчащей мутацией TTCGAA в TTCGAG.

Syn_BsaI фрагмент_pMK_RQ содержит нуклеотиды 11244-11816 (сайт SmaI) с 3'-NTR и сайтом SmaI для линеаризации плазмидной ДНК перед транскрипцией in vitro.

Для генерирования pBVDV-1b_synth_ΔN^pro плазмиду-носитель расщепляли SmaI и дефосфорилировали и элюировали после электрофореза в агарозном геле.

1. Фрагмент pMA расщепляли SnaBI и SmaI и этот специфический вирусный фрагмент выделяли. Оба фрагмента лигировали с получением плазмиды pAFr1. После этого, плазмиду pA_FrI линеаризовали с использованием Acc65I и BlpI и фрагмент Acc65I³³⁵⁷-BlpI⁶²²⁸, выделенный из плазмиды. 2._фрагмент_pMA, инсертировали с получением плазмиды pA_Fr1/2. Плазмиду pMA_Fr3/4 генерировали лигированием расщепленной NheI и BstB1⁷⁹⁵⁶ плазмидой 4.фрагмент_pMA и фрагмент BlpI^662S/BstBI1⁷⁹⁵⁶ выделяли из плазмиды 3.фрагмент рМК. Затем эту плазмиду расщепляли BlpI1^662S/SmaI¹¹⁸¹⁶ и полученный фрагмент BlpI^662S/SmaI¹¹⁸¹⁶ лигировали в BlpI^662S/SmaI плазмиду pA_Fr1/2. В полученной плазмиде pAFr1/2/3/4 фрагмент BsaI заменяли фрагментом BsaI, выделенным из плазмиды Syn_BsaI_фрагмент_pMK_RQ, с получением полноразмерного кДНК-конструкта pAFr1/2/3/4/5. Для генерирования потомства инфекционного вируса две мутации, G²⁰¹¹T и G⁹⁹⁴⁸T инсертировали сайт-направленным мутагенезом с получением инфекционного полноразмерного кДНК-конструкта pBVDV-1b_synth_ΔN^pro.

Конструирование pBVDV-1b_synth

Полноразмерный кДНК-клон BVDV pBVDV-1b_synth конструировали на основе pBVDV-1b_synth_ΔN^pro инсертированием Acc65I/³¹⁹³ XhoI²⁰⁸-фрагмента плазмиды pBVDV-1b_deltaNS (нуклеотиды 1-4597), в pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (фигура 2). Для этой цели эту плазмиду pBVDV-1b_synth_ΔN^pro расщепляли Acc65I³³⁵¹ и XhoI²³¹ и лигировали c фрагментом Acc65I³¹⁹³ pBVDV-1bdeltaNS.

Конструирование pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е2

Полноразмерный кДНК-клон BVDV pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е2 является химерным конструктом BVDV-1b/BVDV-2, который генерировали заменой геномного района, кодирующего Е2 pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (нуклеотидов 2009-3130), геномным районом, кодирующим Е2 BVDV-2 (изолятом CS8644; Wolfmeyer et al., 1997).

Химерный клон пестивируса pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е2 конструировали с использованием Phusion PCR (Фигура 3а). В первой стадии генерировали Е2-мегапраймер при помощи ПЦР с использованием праймеров Ph-E2CS_F и Ph_E2CS_R. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pGEM_E1E2_CS, которая содержит кодирующий Е1 и Е2 геномный район изолята CS8644 BVDV-2. Во второй ПЦР, Phusion-PCR, E2-CS8644-последовательности вводили в полноразмерную плазмиду pBVDV-1b_synth_ΔN^pro с использованием E2-мегапраймера и pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_в качестве матрицы.

Конструирование pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е1-Е2

Полноразмерный кДНК-клон BVDV pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е1-Е2 является химерным конструктом BVDV-1b/BVDV-2, который генерировали заменой геномного района, кодирующего Е1 и Е2 pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (нуклеотидов 1424-3130), геномным районом, кодирующим Е1 и Е2 BVDV-2 (изолятом CS8644; Wolfmeyer et al., 1997).

Химерный клон пестивируса pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е1-Е2 конструировали с использованием Phusion PCR (Фигура 3b). В первой стадии генерировали Е1-Е2-мегапраймер при помощи ПЦР с использованием праймеров Ph-E2CS_F и Ph_E2CS_R. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pGEM_E1E2_CS. При помощи Phusion-PCR, Е1- и E2-CS8644-последовательности вводили в полноразмерную плазмиду pBVDV-1b_synth_ΔN^pro с использованием Е1-E2-мегапраймера и pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_в качестве матрицы.

Фиг. 1: Схематическое представление генома BVDV и конструирования pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV_Е2. Этот вирусный геном синтезировали в пяти фрагментах (Geneart AG), 1.фрагмент_pGA15, 2.фрагмент_pMA, 3.фрагмент_pMK, 4.фрагмент_pMA и Syn_BsaI_фрагмент_pMK_RQ (светло-синие боксы). Плазмида 1.фрагмент_pGA15 несет N^pro делецию (ΔΝ^ρro). В 5'-NTR добавляли T7-промотор для обеспечения возможности транскрипции in vitro. Для линеаризации плазмиды вводили сайт рестрикции SmaI на 3'-NTR. Местоположение сайтов рестрикции и положения нуклеотидов, соответствующих геному BVDV_1bN^pro (наибольшее сходство со штаммом СР7 BVDV), указаны короткими черными стрелками. Полноразмерный кДНК-конструкт pBVDV-1b_synth_ΔN^pro конструировали исключительно из пяти синтезированных фрагментов, показанных серыми стрелками и темно-синими боксами. Для этого конструирования не использовали вирусной РНК или кДНК.

Стадии мутагенеза in vitro во время этого конструирования указаны звездочками. Затененные боксы представляют район структурного белка BVDV. Линии на левом и правом концах указывают нетранслируемые районы. N^pro, аутопротеаза; С, капсидный белок; E^rns, E1, E2, белки оболочки; p7, NS2-NS5, неструктурные белки.

Фиг. 2: Схематическое представление генома BVDV и конструирование полноразмерного pBVDV-1b_synth. Затененные боксы представляют район структурного белка BVDV. Линии на левом и правом концах указывают нетранслируемые районы. N^pro, аутопротеаза; C, капсидный белок; E^rns, E1, E2, белки оболочки; p7, NS2 - NS5, неструктурные белки. Полноразмерный кДНК-конструкт pBVDV-1b_synth конструировали инсертированием Acc65I/³⁷⁹³ XhoI²⁰⁸-фрагмента плазмиды pBVDV-1bdeltaNS, которая содержит части последовательности BVDV-1b фрагмента (нуклеотиды 1-4597), включающие в себя Npro кодирующий геномный район, в pBVDV-1b_synth_ΔN^pro.

Фиг. 3: Схематическое представление генома BVDV и конструирование химерных конструктов E2/E1E2 на основе pBVDV-1b_synth. Затененные боксы представляют район структурного белка BVDV. Линии на левом и правом концах указывают нетранслируемые районы. N^pro, аутопротеаза; C, капсидный белок; E^rns, E1, E2, белки оболочки; p7, NS2-NS5, неструктурные белки. Химерные клоны пестивируса pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_E2 (a) и pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_E1E2 (b) конструировали с использованием полноразмерного кДНК-клона pBVDV-1b_synth_ΔN^pro. Геномный район, кодирующий Е2 pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (нуклеотиды 2009-3130) и E1 и E2 pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (нуклеотиды 1424-3130), соответственно, заменяли соответствующим геномным районом изолята BVDV-2 CS8644 (Wolfmeyer et al., 1997) при помощи Phusion PCR с использованием праймеров Ph_E1_F и Ph_E2_R. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pGEM_E1E2_CS, которая содержит кодирующий E1 и E2 геномный район изолята CS8644 BVDV-2.

Фиг. 4: IF-анализ коровьих клеток (KOP-R), трансфицированных in vitro-транскрибированной РНК этих синтетических кДНК-конструкций. Для детектирования белков BVDV использовали белки моноклональных антител C16 (анти-NS3, Institute for Virology, TiHo Hannover), WB215 (анти-E2 BVDV-1, CVL, Weybridge), BA-2 (VMRD) и WB210 (анти-E^rns, CVL, Weybridge).

Культура клеток и размножение вируса

Клетки и вирусы выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% не содержащей BVDV эмбриональной коровьей сывороткой, при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂. pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV_Е2 размножали на исходных клетках MDBK или интерферон-некомпетентных клетках MDBK (Rie728; CCLV), обеспечиваемых Gunther Keil, FLI, Insel Riems. Титры вируса определяли по конечным точкам титрований. Клетки, засеянные в микротитрационных планшетах, инфицировали 10-кратными серийными разведениями осветвленных супернатантов. Титры, выраженные в TCID₅₀ на миллилитр, получали иммунофлуоресцентным окрашиванием этих культур с моноклональным антителом (mAb) C16, направленным против пестивирусного белка NS3 (любезно предоставленного Institute of Virology, TiHo, Hannover, Germany), и Alexa Fluor^®488-конъюгированного фрагмента F(ab')₂ козьего антимышиного IgG (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands). Препараты вируса тестировали на отсутствие N^pro и микоплазмы.

In vitro транскрипция и РНК-трансфекция

In vitro транскрипцию синтетических полноразмерных кДНК-конструктов выполняли с использованием системы широкомасштабного получения РНК T7 RiboMax Large-Scale (Promega) в соответствии с инструкциями изготовителя после линеаризации этой плазмиды SmaI. Количество РНК определяли окрашиванием этидийбромидом после электрофореза в агарозном геле. Для трансфекции РНК коровьи клетки отделяли с использованием раствора трипсина, промывали дважды забуференным фосфатным буфером солевым раствором без Ca++/Mg++ (ЗФР-) и смешивали с 1-5 мкг in vitro синтезированной РНК. Электропорацию выполняли с использованием ячейки трансфекции GenePulser (Biorad) (два импульса при 850 В, 25 мкФ и 156 ω).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Культуры клеток фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) и делали проницаемыми окрашиванием 0,01% дигитонином (IF окрашиванием NS3) или фиксировали/делали проницаемыми 80% ацетоном (E^rns, E2) и инкубировали с подходящим рабочим разведением соответствующих антител в течение 30 минут. После одной стадии промывки ЗФР клетки инкубировали с Alexa⁴⁸⁸-конъюгированным вторым антителом в течение 30 минут и в конце концов промывали. IF анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа (Olympus).

Пример 2

Испытание вакцинации-заражения CP7 ΔN^pro

Схема СР ΔN^pro экспериментального дизайна испытания 1 животных

Не имеющих BVDV телят (n=4 на группу) вакцинировали или псевдовакцинировали и спустя 52 дня выполняли инфицирование штаммом SE5508 BVDV типа 1b (Wolfineyer et al., 1997).

Вакцинация: единственное применение 6,7 log₁₀ TCID₅₀ BVDV CP7 ΔN^pro i.m. (5 мл)

Псевдовакцинация: супернатант культуры неинфицированных клеток i.m. (5 мл)

Провокационное инфицирование: 6,5 log₁₀ TCID₅₀ BVDV SE5508 (Ib) i.n., распылитель, 2 мл

Результаты

Лейкоциты очищали из ЭДТА-крови после щелочного лизиса эритроцитов.

100 мкл жидкости мазка или 3×10⁶ лейкоцитов инокулировали на коровьи клетки в 4 повторностях. Спустя 5-6 дней сокультивирования репликацию вируса проверяли непрямым иммунофлуоресцентным тестированием (IIFT). Выполняли один дополнительный слепой пассаж этих супернатантов (6 д → IIFT).

В 1 из 4 телят детектировали клеточно-связанную виремию. Низкие количества CP7 ΔΝ^ρro могли быть изолированы в день 4 после вакцинации после первого пассажа культуры клеток. Не была зарегистрирована назальная экскреция вакцинного вируса.

После провокационного инфицирования, не детектировали выделения из носа BVDV SE5508 у вакцинированных животных. Все вакцинированные животные были полностью защищены против виремии, и ни один провокационный вирус не был повторно выделен из очищенных лейкоцитов ("стерильный иммунитет").

В противоположность этому, все контрольные телята обнаруживали назальную экскрецию BVDV в течение 6-8 дней, а также клеточно-связанную виремию во время 6-8 дней.

После вакцинации все животные, иммунизированные CP7 ΔΝ^ρro, обнаруживали умеренное снижение количества лейкоцитов с возвращением до величин перед вакцинацией до 7 дней после инокуляции.

После провокационного инфицирования не наблюдали значимого уменьшения лейкоцитов у иммунизированных телят. Среднее количество клеток крови оставалось в пределах физиологического диапазона. У контрольных животных наблюдали заметную лейкопению с появлением при 3 днях после провокации. Средние количества лейкоцитов оставались низкими в течение более 2 недель.

В сравнении с температурами перед вакцинацией, регистрировали только слабое повышение ректальной температуры тела.

После провокационного инфицирования, иммунизированные животные не обнаруживали изменений температурных кривых. Что касается температурной реакции, эти животные явно были защищены от клинической BVD.

У всех контрольных телят появлялось умеренное повышение температур при 3 днях после инокуляции. После периода, большего, чем одна неделя, температуры тела возвращались к уровням перед провокационным введением.

Всех животных подвергали мониторингу на измененные общие состояния и респираторные или желудочно-кишечные симптомы, типичные для BVDV.

На протяжении всего дня периода наблюдения (4 недели перед иммунизацией до 12 недель после этого), в этих вакцинированных животных наблюдали чередующиеся мягкие респираторные симптомы, такие как выделения из носа и спорадический кашель. После вакцинации не наблюдали вредных клинических реакций. У этих вакцинированных животных не наблюдали обострения в баллах в сравнении с оценками перед вакцинированием.

После провокационного инфицирования, эти иммунизированные животные не обнаруживали клинических симптомов. У контрольных телят регистрировали слабые респираторные симптомы, и прием пищи уменьшался в течение 1-2 дней. Эти животные не обнаруживали ни желудочно-кишечных нарушений, ни повреждений слизистой оболочки.

Серологические реакции этих животных подвергали мониторингу с использованием BVDV ELISA (NS3-блокирование; Фигура 5), а также специфического в отношении BVDV типа I и типа II анализа нейтрализации (Фигура 6).

Все животные, инокулированные CP7 ΔΝ^ρro, сероконвертировались в отношении BVDV NS3-специфических антител до 3 недель после вакцинации, как тестировали при помощи Ceditest BVDV ELISA (Cedi diagnostics). Контрольные телята оставались отрицательными до 2-3 недель после провокационного инфицирования (Фигура 5).

После вакцинации, все животные развивали нейтрализующие антитела против BVDV типа I при умеренных титрах (Фигура 6). После провокационного инфицирования (с), эти иммунизированные животные не обнаруживали усиленного бустер-эффекта титров нейтрализующих антител. Псевдовакцинированные животные тестировались отрицательно до 2 недель после провокационного инфицирования штаммом SET5508 BVDV типа I. BVDV типа II (штамм US980)-специфические нейтрализующие антитела при низких титрах также индуцировались после вакцинации. Титры нейтрализующих антител были сравнимым с этими величинами контрольных животных при 3 неделях после инокуляции полевым штаммом SE5508 BVDV типа I.

Пример 3

Испытание NCP7 ΔΝ^ρro - трансплацентарная инфекция

Не имеющих BVDV первотелок (n=4 на группу) внутривенно и интраназально инокулировали NCP7 ΔΝ^ρro или родительским вирусом NCP7 между днями 71 и 79 беременности (= первый триместр), применение 6,0 log₁₀ TCID₅₀ BVDV NCP7: 10 мл i.v. + 5 мл i.n.

6,1 log₁₀ TCID₅₀ BVDV NCP7 ΔN^pro: 10 мл i.v. + 5 мл i.n.

Результаты

До 2 недель после инокуляции вируса, первотелок подвергали мониторингу на виремию и назальное выделение вируса 100 мкл жидкости мазка или 3×10⁶ очищенных лейкоцитов крови инокулировали на коровьи клетки в 4 повторностях. Спустя 5-6 дней сокультивирования репликацию вируса проверяли непрямым иммунофлуоресцентным тестированием (IIFT). Выполняли один дополнительный слепой пассаж этих супернатантов (6 д → IIFT).

Короткое и имеющее низкий титр выделение вируса наблюдали во всех NCP7-животных, но оно могло подтвердиться только для 1 из 4 первотелок после инокуляции мутанта с N^pro-делецией. Виремия могла детектироваться во всех инфицированных животных с продолжительностью, большей чем 2 дня, в сравнении с родительским вирусом.

В обеих инокулированных группах наблюдали заметное уменьшение количества лейкоцитов после инфицирования. Количества лейкоцитов крови снижались так рано, как спустя один день после инокуляции NCP7ΔN^pro, с возвращением до величин перед инфицированием после 7 дней. После инфицирования родительским штаммом СР7 наблюдали более замедленной ход восстановления лейкоцитов с появлением при 4 днях p.i. и регрессией при 8 дней p.i. Максимальные величины восстановления между обеими группами были сравнимыми.

В сравнении со средними величинами температуры тела перед инфицированием, регистрировали только слабое повышение ректальных температур тела для группы NCP7, но оно оставалось в пределах физиологического диапазона.

Этих животных подвергали мониторингу на измененные общие состояния и респираторные или желудочно-кишечные симптомы, типичные для BVDV. У всех животных слабое назальное и глазное выделение, а также кашель спорадически наблюдались на протяжении всего периода времени. После инфицирования вредные реакции не встречались, и в обеих группах наблюдали только слабое увеличение респираторного нарушения.

Развитие антител подвергали мониторингу с использованием BVDV NS3-блокирующего ELISA. Все инокулированные животные сероконвертировались в отношении NS3-специфических антител до 2-3 недель после вакцинации, как тестировали при помощи Ceditest BVDV ELISA (Cedi Diagnostics).

Характеристика беременности:

NCP7: животное 5: выкидыш в день 71 p.i.

Плод мумифицирован, выделение вируса из всех органов и проб крови является отрицательным, но является положительным из лаважа костного мозга (1/4 повторности)

NCP7ΔN^pro: животное 4: выкидыш в день 46 p.i.

Запущенная мацерация, умирал в течение 2-3 недель, выделение из всех проб органов и крови отрицательное

Этих первотелок умерщвляли приблизительно при 12 неделях после инфицирования BVDV. Макроскопическая аутопсия не выявила каких-либо фетопатогенных эффектов. Развитие, размер и масса этих зародышей не привлекали к себе внимания.

Выделение вируса в культуре клеток выполняли из 0,3 г материала органа (замораживали немедленно, измельчали с морским песком) с последующими 2 последовательными пассажами супернатантов в случае первых отрицательных результатов.

Выделение вируса проводили на клетках KOP-R, интерферон-некомпетентных клетках MDBK и на высокочувствительном MDBK-клоне 6.

Кроме того, 1 г материала эмбриональной ткани гомогенизировали и культивировали в колбах на интерферон-некомпетентных клетках MDBK и на MDBK-клоне 6. Эти культуры, а также 2 дополнительных пассажа окрашивались отрицательно на BVDV в анализах иммунофлуоресцентности.

Эмбриональные ткани также подвергали количественным ОТ-ПЦР-анализам реального времени (qRT-PCR). В настоящее время авторы изобретения тестировали лейкоциты, легкое и почку.

Копии генома экстраполировали до 1,0 г тканевого материала, 1 мл цельной крови или 1 мл лаважа костного мозга.

Родительский штамм BVDV NCP7, а также N^pro-делеционный мутант пересекали плаценту и были способны устанавливать инфекцию во всех эмбрионах. Однако, инфекционный вирус NCP7ΔΝ^ρro не выделялся обратно из большой панели эмбриональных органов. Кроме того, вирусные геномы не детектировались в очищенных лейкоцитах крови NCP7ΔΝ^ρro-эмбрионов. В сравнении с нагрузками РНК BVDV NCP7, копийности NCP7ΔΝ^ρro были в 5000 раз (легкие) - 20000 раз (почка) уменьшенными.

Пример 4

Сравнение вакцин/стратегий вакцинирования.

1-е испытание животных: испытание вакцинного заражения

v890FLΔC, cp7ΔN^pro; v890FLΔN^pro и комбинацию обоих мутантов N^pro в единственном применении использовали для вакцинирования групп крупного рогатого скота (2 разные схемы вакцинации).

2-е испытание животных: испытание вакцинного заражения

cp7ΔN^pro и v890FLΔN^pro вводили в виде последовательной вакцины (1-я инъекция: cp7ΔN^pro/2-я инъекция: v890FLΔN^pro)

3-е испытание животных: испытание вакцинного заражения

cp7ΔN^pro_E2CS8644, химеру, состоящую из cp7ΔN^pro в качестве скелета с cp7 E2, замененным E2-кодирующим районом штамма BVDV-2 CS8644, использовали в качестве вакцинного кандидата, либо отдельно, либо в комбинации с cp7ΔN^pro в едином применении.

Штамм для заражения

Для всех трех испытаний использовали вирулентный немецкий полевой изолят, штамм BVDV-2 HI916, который вызывает репродуктивные и явные клинические симптомы, как определено в предварительном испытании.

Дополнительное указание для всех меток/подписей приведенных ниже схем и диаграмм (если мутанты не названы особо):

- BVDV-2 или 890 обозначает v890FL

- BVDV-1 обозначает cp7ΔN^pro

- ΔΝ обозначает ΔΝ^ρro

Схема (дизайн) испытания вакцинации/заражения cp7ΔN^pro/v890FLΔN^pro/v890FLΔAC

Временная шкала, периоды взятия проб и схема эксперимента испытания 1 животных

Животные:

25 не имеющих BVDV телят (n=5 на группу) вакцинировали в соответствии с этим протоколом и спустя 60 дней проводили провокационное инфицирование штаммом HI916 BVDV-2 (немецкий полевой изолят, установленный в качестве провокационного штамма в предыдущем испытании животных).

Вакцинация:

двойное применение BVDV v890FLΔNC: 1-я инъекция: 1,02×10⁶/2-я инъекция: 6,32×10⁵ TCID50 (2 мл i.m.)

единственное применение 9,28×10⁵ TCID50 BVDV cp7ΔN^pro (2 мл i.m.)

единственное применение 9,28×10⁵ TCID50 BVDV v890FLΔN^pro (2 мл i.m.)

единственное применение 1,26×10⁶ TCID50 BVDV cp7ΔN^pro и v890FLΔN^pro (2 мл i.m.)

Провокационное инфицирование:

2,25×10⁶ TCID50 BVDV-2 HI916 интраназально - с использованием распылителя (ингалятора)

Периоды взятия проб:

- один раз в день в течение 10 дней после вакцинации (v890FLΔС-группа: в течение 8 дней после 1-й вакцинации, без взятия проб после 2-й вакцинации/без взятия проб контрольной группы)

- все группы в течение 14 дней после провокационного инфицирования.

Результаты 1

I.I вакцинация:

v890FLΔС (вакцинация в день 0 и день 25)

1-я вакцинация (день 0):

Клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- животные не обнаруживали ни вредных реакций, ни повышения температуры или клинических признаков заболевания.

- не наблюдали лейкопении,

выделение вируса:

- ни выделение вируса через назальные экскреции, ни виремию псевдовирионов не детектировали выделением вируса → следовательно, в этой группе не брали пробы после второй вакцинации.

Серология:

- развивалось только минимальное повышение уровней ингибирования, и оно оставалось отрицательным до бустерной вакцинации с использованием ELISA NS3-специфического блокирования (Prionics)

- титры нейтрализующего антитела против всех трех тестируемых штаммов (BVDV-1: SE5508/BVDV-2: 890 и HI916) не детектировались после первой вакцинации

2-я вакцинация (день 25):

- пробы не брали для vi и формулы крови

серология:

- показала явное усиление в развитии антител, являющихся ELISA-положительными, так быстро, как в день 7 после второй вакцинации

- оставалась при базовых - недетектируемых уровнях титров нейтрализации до провокационного инфицирования - очень низких - несуществующих - даже против родительского штамма BVDV-2 890.

cp7ΔN^pro (день 25 вакцинации)

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- одно животное обнаруживало небольшое повышение температуры в течение одного дня (дня 28)

- некоторая клиническая реакция после вакцинации; животные имели слегка повышенные величины средней клинической оценки в течение 2 дней (в день 28 и в день 35) вследствие слабых респираторных симптомов

- короткое и однофазное снижение количеств лейкоцитов (до 20% уменьшения в дни 29/30)

- количества тромбоцитов также слегка снижались параллельно с количествами лейкоцитов

выделение вируса:

- не было назального выделения вируса, и была очень ограниченная виремия (3 животных, 2 дня)

серология:

- положительная в ELISA NS3-блокирования со дня 14 после вакцинации

- титры нейтрализующующего антитела были обнаружены во всех иммунизированных группах так скоро, как спустя 14 дней после вакцинации:

BVDV-1 SE5508: наивысшие титры из всех групп

BVDV-2 HI916: средние титры

BVDV-2 890: сходные величины и тенденции, что и против HI916

v890FLΔN^pro (день 25 вакцинации)

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- одно животное обнаруживало небольшое повышение температуры в течение двух дней (день 31, день 32)

- клинические оценки не повышались

- короткое и однофазное снижение количеств лейкоцитов (до 20% уменьшения в день 30)

- количества тромбоцитов также слегка снижались параллельно с количествами лейкоцитов

выделение вируса:

- вирус вакцины детектировали в пробе назального мазка из одного иммунизированного животного в один единственный день (день 32, после слепого пассажа) - очень ограниченная виремия вакцинного вируса у 2 животных, в течение 3-4 дней

- положительная в ELISA NS3-блокирования со дня 14 после вакцинации

- титры нейтрализующующего антитела так скоро, как спустя 14 дней после вакцинации:

BVDV-1 SE5508: оставались базовыми в их титрах

BVDV-2 HI916: наивысшие титры

BVDV-2 890: сходные величины и тенденции, что и против HI916

cp7ΔN^pro и v890FLΔN^pro (день 25 вакцинации)

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- температура не повышалась после вакцинации

- клинические оценки не повышались

- короткое и однофазное снижение количеств лейкоцитов (максимально 28%)

- количества тромбоцитов также слегка снижались параллельно с количествами лейкоцитов

выделение вируса:

- не было назального выделения вируса, и была очень ограниченная виремия вакцинного вируса (3 животных, 1-2 дня)

серология:

- положительная в NS3-блокирующем ELISA со дня 14 после вакцинации

- титры нейтрализующующего антитела обнаруживали так скоро, как спустя 14 дней после вакцинации:

BVDV-1 SE5508: наивысшие титры

BVDV-2 HI916: высокие титры (меньшие, чем только титры в группе с использованием BVDV-2N^pro)

BVDV-2 890: сходные величины и тенденции

контроли (неактивированные)

- оставались серонегативными во время периода вакцинации, оставались базовыми в их титрах

I.II провокационное инфицирование (день 60)

контроли:

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- двухфазное повышение температур тела: небольшое повышение в день 3 и явно выраженное повышение в дни 8 и 9 после провокационного инфицирования с максимальными средними величинами групп до 41°C.

- обнаруживали типичные и явные признаки клинического заболевания: явное повышение клинических баллов с максимумами в дни 8-10: заметные респираторные симптомы (кашель и слизисто-гнойное назальное выделение), депрессию с уменьшенным аппетитом, 2 животных имели водянистый стул в течение 2-3 дней

- развивали тяжелую лейкопению: двух-трехфазное уменьшение (в дни 3, 7 и 13 после провокационного инфицирования) количества лейкоцитов с максимальными уровнями 48% уменьшения в день 7 после провокационного инфицирования

- количества тромбоцитов не испытывали такого сильного воздействия, как ожидалось: среднее уменьшение составляло максимально 35% в день 3 после провокационного инфицирования

- количества заметно увеличивались после острого инфицирования в контролях (до средних величин 195%), в соответствии с тяжестью инфекции и заболевания

выделения вируса:

- провокационный вирус был детектируемым в пробах назального мазка всех контрольных животных с дня 61 до дня 71 - длительная и явная виремия провокационного вируса в контрольной группе до 11 дней (день 62 - день 73)

Серология:

- все контрольные животные оценивались положительно в ELISA NS3-блокирования со дня 14 и далее

- титры детектируемой нейтрализации со дня 4 и далее против всех трех штаммов, с более высокими титрами против BVDV-2-штаммов

BVDV-2ΔC

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- температуры тела повышались в день 7, но оставались в физиологическом диапазоне

- клинические действия провокационного инфицирования явно уменьшались в сравнении с контролями

- только единственное снижение количеств лейкоцитов: максимальное уменьшение приблизительно 12% в день 4 после провокационного инфицирования, быстро восстанавливающееся до количеств перед инициированием (день 7 после провокационного инфицирования)

- количества тромбоцитов: единственное менее заметное уменьшение.

выделение вируса:

- продолжительность и уровни назального выделения вируса заметно уменьшалось: все животные выделяли вирус в дни 1-4 - виремия провокационного вируса также явно уменьшалась по времени и по количеству BVDV-2AC: 4 животных, 1 день

серология:

- NS3-антитела были слегка повышены; средние блокирующие величины 100% достигались в день 89

- бустер-эффект в титрах нейтрализующих антител, детектируемый после 7, соответственно, 14 дней после инфицирования и максимумы были в день 14 - день 29 после провокационного инфицирования

BVDV-1 SE5508 увеличивался, но средние величины давали пики при заметно более низком уровне, чем против BVDV-2-штаммов

BVDV-2 штамм 890: титры после 7 дней; в пределах этого изобретения, конечные титры были очень сходными во всех группах

BVDV-2 штамм HI916: титры оставались слегка более низкими, чем против штамма 890

BVDV-1ΔN^pro

Клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- повышение температуры тела в день 7 после провокационного инфицирования до 40°C

- клинические действия провокационного инфицирования явно уменьшались; отмечались умеренные респираторные симптомы

- только единственное снижение количеств лейкоцитов: максимальное уменьшение приблизительно 12% в день 4 после провокационного инфицирования); животные быстро восстанавливались до количеств перед инициированием (день 7 после провокационного инфицирования)

- количества тромбоцитов: без заметного уменьшения; после острого инфицирования заметно увеличивалось (175%) выделение вируса:

- назальное выделение вируса: продолжительность (день 62 - день 68) (день 62 - день 68) и уровни заметно уменьшались: 4 животных, 1-3 дня - виремия провокационного вируса: ясное уменьшение во времени (день 63 - день 68) и в количестве: все животные, 1-5 дней;

серология:

- NS3-антитела (ELISA блокирования (Prionics)): слегка увеличивались; средние величины блокирования 100% достигались в день 89

- бустер-эффект на титрах нейтрализующих антител с пиками в день 14 - день 28 после провокационного инфицирования

BVDV-1 SE5508: максимальные титры достигались спустя 14 дней после провокационного инфицирования

BVDV-2 890: максимальные титры достигались спустя 14 дней после провокационного инфицирования; в пределах этого исследования конечные титры были очень сходными в этих группах

BVDV-2 HI916: максимальные титры спустя 14 дней после провокационного инфицирования; оставались слегка более низкими, чем против штамма 890

BVDV-2ΔN^pro

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- без повышения температуры тела

- без клинических эффектов

- без уменьшения количества лейкоцитов

- количества тромбоцитов: единственное уменьшение до 20% в день 4 после провокационного инфицирования,

выделение вируса:

- отсутствие выделения провокационного вируса и виремии провокационного вируса

серология:

- NS3-антитела (ELISA блокирования (Prionics)): слегка усиленные; средние величины блокирования 100% достигались в день 89

- бустер-эффект на титрах нейтрализующих антител с пиками в день 14 - день 28 после провокационного инфицирования

BVDV-1 SE5508: увеличивался, но средние величины давали пики при заметно более низком уровне, чем группы, получающие BVDV-1.

BVDV-2 890: максимальные титры спустя 14 дней после провокационного инфицирования; в пределах этого испытания конечные титры были очень сходными в этих группах

BVDV-2 HI916: максимальные титры спустя 14 дней после провокационного инфицирования; сходные с титрами против BVDV-2 890

BVDV-1ΔN^pro + BVDV-2ΔN^pro

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- единственное повышение температуры в день 7 (39,8°C)

- клинические эффекты провокационного инфицирования были явно уменьшенными; не было повышения клинических признаков

- единственное уменьшение количеств лейкоцитов (максимальное уменьшение 24% в день 10 после провокационного инфицирования), уменьшенные количества лейкоцитов сохранялись до конца этого испытания (день 89 - среднее уменьшение 20%)

- количества тромбоцитов: единственное уменьшение 25% в день 5 после провокационного инфицирования; увеличивались после дня 10

выделение вируса:

- назальное выделение вируса: продолжительность и уровни заметно уменьшались: 2 животных, 1-2 дня - виремия провокационного вируса: явное уменьшение во времени и в количестве: 2 животных, 1-3 дня

серология:

- NS3-антитела (ELISA блокирования (Prionics)): слегка увеличивались; средние величины блокирования 100% достигались в день 89

- бустер-эффект на титрах нейтрализующих антител имел максимум в день 14 - день 28 после провокационного инфицирования

BVDV-1 SE5508: увеличивался, но средние величины имели максимум при явно более низком уровне, чем группы, получающие BVDV-1

BVDV-2 890: максимальные титры спустя 14 дней после провокационного инфицирования; в пределах этого испытания конечные титры были очень сходными в этих группах

BVDV-2 HI916: максимальные титры спустя 14 дней после провокационного инфицирования, сходные с титрами против BVDV-2 890

Общее заключение

- В этом испытании не наблюдали клинических эффектов, подобных диарее, петехии или гематоме в местах инъекции/повреждения.

- Проведенные в этом исследовании анализы нейтрализации показали, что титры получающих BVDV-2 животных против штаммов BVDV-2 были более низкими, чем титры вакцинированных BVDV-1 животных против используемого штамма BVDV-1.

- Вследствие широко различающихся результатов NS3-специфического ELISA и анализа нейтрализации для BVDV-2ΔC-иммунизированной группы, авторы секвенировали район репликона, кодирующий белок Е2. Этот белок Е2 является главным иммуногеном BVDV и преобладающим индуктором нейтрализующих антител. Авторы обнаружили изменение одного нуклеотида в сравнении с соответствующей последовательностью исходного полноразмерного кДНК-клона. Он находится в положении 2736 нуклеотидов относительно полноразмерной кДНК и приводит к замене аминокислоты лейцина на гистидин.

Выводы:

Все BVDV-вакцинные кандидаты, тестированные на безопасность и эффективность, уменьшали результат после провокационного инфицирования гетерологичным BVDV-2 у крупного рогатого скота, обнаруживая градуированные защитные эффекты в отношении клинических симптомов, назального выделения вируса и виремии. Мутант v890FLΔN^pro обеспечивал полную защиту, приводя к "стерильному иммунитету" против инфицирования высоко вирулентным BVDV-2 у всех иммунизированных животных. Вакцина, содержащая как cp7ΔN^pro, так и v890FLΔN^pro штаммы, не обеспечивала стерильного иммунитета против инфицирования тем же самым высоко вирулентным BVDV-2.

Схема (дизайн) испытания последовательных вакцинации-провокационного инфицирования cp7ΔN^pro/v890FLΔN^pro

Временная шкала, периоды взятия проб и экспериментальная схема испытания 2 животных

Животные:

9 не имеющих BVDV телят (n=5 вакцинированная/n=4 невакцинированная контрольная группа) вакцинировали последовательно; 2 инъекции с интервалом 28 дней в соответствии с протоколом и спустя 28 дней после 2-й вакцинации проводили провокационное инфицирование штаммом BVDV-2 HI916 (немецкий полевой изолят, установленный как провокационный штамм в предыдущем испытании)

Вакцинация:

1-я инъекция CP7 ΔNpro: 1,12×10⁶TCID50/животное (2 мл i.m.)

2-я инъекция v890FLΔN^pro v890FLΔNpro: 1,26×10⁵ TCID50/животное (2 мл i.m.)

Провокационное инфицирование:

1,66×10⁵ TCID50 BVDV-2 HI916 интраназально - с использованием распылителя

Результаты II

II. I вакцинация (день -56 и день -28)

CP7ΔΝ^ρro/v890FLΔN^pro

1-я вакцинация, день 56 (cp7ΔN^pro)

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- температуры тела этих животных оставались в физиологическом диапазоне

- не встречались клинические реакции; слабые клинические (в основном респираторные) 7-8 дней после вакцинации приводили к повышенной оценке, но, вероятно, не были ассоциированными с вакцинацией, так как перемежающиеся слабые респираторные симптомы, такие как назальное выделение и спорадический кашель, наблюдали во время всего периода мониторинга в обеих группах

- количества лейкоцитов (с недельными интервалами): снижались во время первых 4 недель

- количества тромбоцитов (с недельными интервалами): оставались неизмененными

серология:

- положительные в анализе ELISA используемого антитела (IDEXX) со дня 14 после вакцинации

- нейтрализующие антитела были детектируемыми в анализах нейтрализации со дня 14 после вакцинации

BVDV-1 SE5508: явное повышение со дня 14 после вакцинации

BVDV-2 890: низкие - средние титры, детектируемые в день 14

BVDV-2 HI916: титры от базовых до недектируемых до второй вакцинации

2-я вакцинация, день 28 (v890FLΔN^pro)

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- температуры тела этих животных оставались в физиологическом диапазоне

- нет повышения клинической оценки

- количества лейкоцитов (с недельными интервалами): очень слабое уменьшение (около 5%), отражающееся в двухфазной кривой с выступами между днями -26 и -21

- количества тромбоцитов (с недельными интервалами): оставались неизмененными

выделение вируса:

- не наблюдали ни выделения вакцинного вируса, ни виремии вакцинного вируса

серология:

- явный бустер-эффект в анализе ELISA антител с 7-го дня после второй вакцинации

- нейтрализующие антитела явно увеличивались со дня 7 после второй вакцинации

BVDV-1 SE5508: явный бустер-эффект; максимальные титры уже достигались перед провокационным инфицированием

BVDV-2 890: явный бустер-эффект; максимальные титры достигались уже перед провокационным инфицированием

BVDV-2 HI916: детектируемый бустер-эффект, но очень низкие титры

контроли:

серология:

- оставались сероположительными на протяжении периода взятия проб (ELISA и NAs)

Общее заключение:

Общее снижение количеств лейкоцитов в обеих группах на протяжении первых 4 недель периода вакцинации может быть указанием на повышенные количества лейкоцитов в начале этого испытания, обусловленные, например, предыдущей (общей) инфекцией).

II.II провокационное инфицирование (день 0):

контроли:

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- двухфазное повышение температур тела животных: очень слабое в день 2 и 4 (остающееся в физиологическом диапазоне) и умеренное в дни 8 и 9 после провокационного инфицирования с максимальными средними величинами групп 39,7°C.

- обнаруживали типичные и ясные признаки клинического заболевания: повышение пиков клинических оценок в дни 8-10: респираторные симптомы (кашель и слизисто-гнойное выделение), слабую депрессию с уменьшенным аппетитом

- развивали ясную лейкопению: двух-трехфазное уменьшение (дни 3, 7 и 11 после провокационного инфицирования) количеств лейкоцитов с максимальными уровнями 45% уменьшения в день 7 после провокационного инфицирования

- количества тромбоцитов не изменялись тяжело, как ожидалось: двухфазное падение (день 7 и 11) со средним уменьшением максимально до 40-50%, после чего количества заметно увеличивались до дня 21 после острого инфицирования в контролях (до средних величин 270%)

выделение вируса:

- провокационный вирус был детектируемым в пробах назального мазка всех контрольных животных со дня 1 до дня 10 - продолжительная и явная виремия провокационного вируса в контрольной группе до 10 дней (день 2 - день 11)

серология:

- животные оценивались как положительные в анализе антител ELISA со дня 14 и далее после провокационного инфицирования

- детектируемые титры нейтрализации со дня 14 и далее против всех трех штаммов против штаммов BVDV-2

BVDV-1 SE5508: положительные, но с низкими титрами до конца испытания

BVDV-2 890: ясный бустер-эффект

BVDV-2 HI916: ясный бустер-эффект

СР7ΔN^pro/v890FLΔN^pro

Клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- слабое повышение температуры тела в день 8, но остающееся в физиологическом диапазоне

- клинические эффекты провокационного инфицирования ясно уменьшались в сравнении с контролями; инфекция не приводила к повышению средних клинических оценок

- двухфазное снижение количеств лейкоцитов в день 3 и 12; максимальное уменьшение приблизительно 12% в день 3 после провокационного инфицирования; быстро восстанавливающиеся количества до количеств перед инфицированием после каждого снижения (день 7/соответственно день 14 после провокационного инфицирования)

- количества тромбоцитов: два очень слабых уменьшения (около 10%) в день 3 и день 11 параллельно с картиной количеств лейкоцитов

выделение вируса:

- продолжительности и уровни назального выделения вируса заметно уменьшались: одно животное было vi-положительным в двух днях (день 3 и день 5); виремия провокационного вируса: также очень слабо уменьшенная во времени и количестве: 2 животных, 1 - 2 дня.

серология:

- антитела были явно увеличены в количестве, максимальная OD достигалась спустя 14 дней после провокационного инфицирования

- бустер-эффект в титрах нейтрализующих антител, наблюдаемый после 7 (соответственно 14) дней с максимумом во всех случаях в день 28 после провокационного инфицирования против всех трех штаммов, обнаруживали в конце этого испытания

BVDV-1 SE5508 только слабое увеличение

BVDV-2 штамм 890: бустер-эффект до одинаковых с контролями конечных титров

BVDV-2 штамм HI916: ясный бустер-эффект только низких титров нейтрализующих антител перед провокационным инфицированием

Выводы:

Ни виремию, ни выделение вакцинного вируса не наблюдали в этом испытании. Клинические реакции и лихорадку также не наблюдали у животных после вакцинации.

Уменьшения количеств лейкоцитов после второй вакцинации не были сильно выраженными, и также уменьшение лейкоцитов после провокационного инфицирования не было сильным (~12%). Титры нейтрализующих антител устанавливались до сходных уровней, когда они находились в смешанной аппликации cp7ΔN^pro/v890FLΔN^pro.

Виремия провокационного вируса (2 животных 1-2 дня) и его выделение (1 животное 2 дня) не могли полностью задерживаться и были сходными с группой, получающей смешанную аппликацию - тем не менее ясно уменьшались в сравнении с контрольной группой. Последовательная вакцинация cp7ΔN^pro и v890FLΔN^pro не приводила к стерильному иммунитету у всех животных, как это было в случае вакцинации одним мутантом v890FLΔN^pro.

Схема (дизайн) испытания вакцинации-провокационного инфицирования химеры BVDV-1/2 (cp7ΔN^pro_E2CS8644)

Временная шкала, периоды взятия проб и экспериментальная схема испытания 3 животных

Животные:

14 не имеющих BVDV телят (n=5 на вакцинированную группу/n=4 невакцинированных контроля) вакцинировали в соответствии с протоколом, и при 28 днях после вакцинации проводили провокационное инфицирование штаммом BVDV-2 HI916 (немецкий полевой изолят, установленный как провокационный штамм в предыдущем испытании).

Вакцинация:

группа 1: cp7ΔN^pro_E2CS8644: 9,36×10⁵ TCID50/животное (2 мл i.m.)

группа 2: cp7ΔN^pro_E2CS8644 + cp7ANpro:2,04×10⁶ TCID50/животное (3 мл i.m.)

Провокационное инфицирование:

1,66×10⁵ TCID50 BVDV-2 HI916 интраназально - с использованием распылителя

Периоды взятия проб:

- один раз в день в течение 11 дней после вакцинации (без взятия проб контрольной группы)

- все группы в течение 14 дней после провокационного инфицирования

Результаты

III.I вакцинация (день -28):

Общее заключение:

серология после вакцинации:

выполняли анализы нейтрализации против исходных штаммов этой химеры (BVDV-1 cp7 и BVDV-2 CS8644)

cp7 ΔNpro_E2CS8644

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- температуры тела этих животных оставались в физиологическом диапазоне на протяжении всего периода вакцинации

- не встречались клинические реакции; слабые клинические (респираторные) симптомы на протяжении периода вакцинации приводили скачкообразно к повышенной оценке (пики в дни -25, -15, -11, -10 и -8), но, вероятно, не были ассоциированы с вакцинацией, так как слабые респираторные симптомы, такие как назальное выделение и спорадический кашель, перемежающиеся по интенсивности, наблюдали во время всего периода мониторинга в обеих группах

- количества лейкоцитов: слабое двухфазное снижение (около 10% в дни 3 и 7 после вакцинации); в день -19 животные опять достигали их уровней перед вакцинацией

- количество тромбоцитов: имелось постоянное уменьшение на протяжении периода вакцинации - в целом 25-30% в обеих вакцинированных группах, снижения после вакцинации были только минимальными (до 5%)

выделение вируса:

- не наблюдали выделения вакцинного вируса - вакцинный вирус выделялся из этих лейкоцитов одного животного в одном дне (день -24)

серология:

- в применяемом анализе NS3-блокирования ELISA (Prionics) группа оставалась сероотрицательной до провокационного инфицирования

- нейтрализующие антитела против BVDV-1 (cp7) и BVDV-2 (CS8644)

BVDV-1 cp7: минимальные титры детектировались спустя 3 недели после провокационного инфицирования; и оставались низкими до провокационного инфицирования

BVDV-2 CS8644: детектировали спустя 3 недели после провокационного инфицирования; более высокие, чем в день 0

cp7 ΔNpro_E2CS8644 + cp7ΔN^pro

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- температуры тела животных оставались в физиологическом диапазоне на протяжении периода вакцинации

- не наблюдали вредных клинических реакций; слабые клинические (респираторные) симптомы на протяжении периода вакцинации приводили чередующимся образом к повышенной оценке, но, вероятно, не были ассоциированы с вакцинацией, так как слабые респираторные симптомы, такие как назальное выделение и спорадический кашель, перемежающиеся по интенсивности, наблюдали во время всего периода мониторинга в обеих вакцинированных группах

- количества лейкоцитов: слабое снижение в течение 3-7 дней после вакцинации с пиком при дне 7 после провокационного инфицирования (около 20%); увеличивались в день -19, но с уровнями на 10% более низкими, чем уровни перед вакцинацией

- количество тромбоцитов: имелось постоянное уменьшение на протяжении периода вакцинации - в целом 25-30% в обеих вакцинированных группах, снижения после вакцинации не были ясно различимыми

выделение вируса:

- не наблюдали ни выделения вакцинного вируса, ни виремии вакцинного вируса

серология:

- NS3-блокирующий ELISA (Prionics): минимально положительные 3 недели после провокационного инфицирования; явно положительные в день провокационного инфицирования

- нейтрализующие антитела против BVDV-1 (cp7) и BVDV-2 (CS8644)

BVDV-1 cp7: детектируется со дня 14 после вакцинации, повышаясь до провокационного инфицирования

BVDV-2 CS8644: детектируется спустя 3 недели после вакцинирования провокационного инфицирования; но явно имеет более низкие титры, чем против BVDV-1

контроли:

- серология:

- оставались сероотрицательными на протяжении периода взятия проб (ELISA и NAs)

Общее заключение:

- количества лейкоцитов: имелось снижение около 20% в обеих вакцинированных группах, которое оставалось при константном уроне до провокационного инифицирования (эти количества устанавливали как 100% перед инфицированием)

III.II провокационное инфицирование (день 0)

Общее заключение:

Серология после провокационного инфицирования:

Выполняли дополнительно анализ нейтрализации против провокационного штамма (BVDV-2 HI916)

контроли:

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- двухфазное повышение температур тела: слабое в день 3 и ясно выраженное в дни 7 и 8 после провокационного инфицирования с максимальными средними величинами групп до 40,1°C.

- показывали типичное и ясное клиническое заболевание: отчетливое повышение в клинических признаках с максимумом в дни 8 и 11: заметные респираторные симптомы (кашель и слизисто-гнойное назальное выделение), депрессию с уменьшенным аппетитом (ярко выраженную у 2 животных)

- развивали тяжелую лейкопению: трехфазное уменьшение (дни 3, 7 и 11 после провокационного инфицирования) в количествах лейкоцитов с максимальными уровнями 44% в день 3 после провокационного инфицирования

- количества тромбоцитов: уменьшение на протяжении 9 дней после провокационного инфицирования до максимума 48% в день 9 после провокационного инфицирования, с быстрым резким увеличением после этого до средних величин 115% в конце этого испытания

выделение вируса:

- провокационный вирус был детектируемым в пробах назальных мазков всех контрольных животных в день 2 и 3 и дни 5-13 - виремия провокационного вируса в течение до 12 дней (день 2 - день 13)

серология:

- все контрольные животные оценивались как положительные в NS3 блокирующем ELISA со дня 14 после провокационного инфицирования и далее

- детектируемые титры нейтрализации со дня 14 после провокационного инфицирования против всех штаммов, более высокие титры против штаммов BVDV-2

cp7ΔN^pro_E2CS8644 ANpro_E2CS8644

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- температуры тела: единственное, но ярко выраженное повышение с пиком в день 7 с максимальными средними величинами групп до 40,5°C

- отсутствие пика или явного повышения клинических оценок в сравнении с уровнями периода вакцинации

- количества лейкоцитов: единственное снижение (22% в день 3 после провокационного инфицирования); быстрое возвращение опять до их уровней перед вакцинацией (день 7 после провокационного инфицирования)

- количества тромбоцитов: уменьшение на протяжении 7 дней после провокационного инфицирования; максимум 19% в день 7 после провокационного инфицирования с быстрым увеличением после этого.

выделение вируса

- выделение провокационного вируса: 2 животных в день 3 - виремия провокационного вируса у 2 животных в течение 1-2 дней (дней 3-5)

серология:

- явное усиление в NS3 блокирующем ELISA (Prionics), величины блокирования около 100% в конце этого испытания

- нейтрализующие антитела против BVDV-1 (cp7) и BVDV-2 (CS8644 и HI916) были усилены; титры против BVDV-1 оставались более низкими в группе со смешенной аппликацией

cp7 ΔN^pro_E2CS8644 + cp7ANpro

клинические признаки и формула крови (гемограмма):

- температуры тела: единственное повышение с пиком в день 7 с максимальными средними величинами групп до 39,6°C

- отсутствие пика или явного повышения клинических признаков в сравнении с уровнями периода вакцинации

- количества лейкоцитов: единственное снижение (15% в день 4 после провокационного инфицирования); быстрое восстановление опять до их уровней перед вакцинацией (день 7 после провокационного инфицирования)

- количества тромбоцитов: уменьшение на протяжении 7 дней после провокационного инфицирования; максимум 22% в день 7 после провокационного инфицирования, количества быстро увеличивались после этого

выделение вируса:

- не наблюдали ни выделения провокационного вируса, ни виремии провокационного вируса

серология:

- явное усиление в NS3 блокирующем ELISA (Prionics), величины блокирования около 100% в конце этого испытания

- нейтрализующие антитела против BVDV-1 (cp7) и BVDV-2 (CS8644 и HI916) были усилены; титры против BVDV-1 были более высокими, чем в группе, получающей только эту химеру

Выводы:

Хотя можно было наблюдать очень слабую клиническую реакцию в обеих вакцинированных группах после провокационного инфицирования (лихорадку cp7ANpro_E2CS8644, тогда как в группе со смешанной аппликацией только повышенную температуру), вакцинация cp7ΔN^pro_E2CS8644 + cp7ΔN^pro в одной единственной аппликации приводила к стерильному иммунитету после провокационного инфицирования.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использована для защиты восприимчивых жвачных животных против BVDV. Комбинированная вакцина содержит первый BVDV, принадлежащий к первому типу и несущий ген Е2 BVDV указанного первого типа, второй BVDV, принадлежащий к первому типу, где этот ген Е2 BVDV, принадлежащего к указанному первому типу, заменен геном Е2 BVDV, принадлежащего ко второму типу, и фармацевтически приемлемый носитель. Группа изобретений также относится к способу получения вышеуказанной вакцины против BVDV. Использование химерной BVDV вакцины, содержащей оригинальный ген Е2 и второй ген Е2 другого типа, позволяет гарантировать равные уровни экспрессии обоих генов Е2. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 пр., 1 табл., 6 ил.

1. Комбинированная вакцина для защиты восприимчивых жвачных животных против BVDV, отличающаяся тем, что эта вакцина содержит первый BVDV, принадлежащий к первому Типу и несущий ген Е2 BVDV указанного первого Типа, второй BVDV, принадлежащий к первому Типу, где этот ген Е2 BVDV, принадлежащего к указанному первому Типу, заменен геном Е2 BVDV, принадлежащего ко второму Типу, и фармацевтически приемлемый носитель.

2. Комбинированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что, кроме того, во втором BVDV ген Е1 BVDV, принадлежащего к указанному первому Типу, заменен геном Е1 BVDV, принадлежащего ко второму Типу.

3. Комбинированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что скелет молекулы первого и второго вируса BVD принадлежит к Типу 1 и ген Е2 BVDV второго вируса BVD принадлежит к Типу 2.

4. Комбинированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что скелет молекулы первого и второго вируса BVD принадлежит к Типу 2 и ген Е2 BVDV второго вируса BVD принадлежит к Типу 1.

5. Комбинированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что указанные первый и второй BVDV являются живыми аттенуированными вирусами.

6. Комбинированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что указанный первый BVDV и указанный второй BVDV имеют один и тот же скелет молекулы.

7. Комбинированная вакцина по п.6, отличающаяся тем, что указанный скелет является Типом 1 BVDV.

8. Комбинированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что указанный первый BVDV и/или указанный второй BVDV содержит делецию в гене N^pro и/или делецию в гене E^rns.

9. Комбинированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что указанная вакцина или комбинированная вакцина содержит дополнительный антиген вируса или микроорганизма, патогенного в отношении жвачных животных, антитело против указанного антигена или генетическую информацию, кодирующую иммуногенный полипептид указанного вируса или микроорганизма.

10. Комбинированная вакцина по п.9, отличающаяся тем, что указанный вирус или микроорганизм, патогенный в отношении жвачных животных, выбран из группы, состоящей из ротавируса крупного рогатого скота, герпесвируса крупного рогатого скота, вируса парагриппа Типа 3, парамиксовируса крупного рогатого скота, вируса синего языка овец, вируса ящура, Pasteurella haemolytica и респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота.

11. Комбинированная вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она находится в лиофилизированной форме.

12. Способ получения комбинированной вакцины по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что указанный способ включает стадию смешивания первого BVDV, принадлежащего к первому Типу и несущего ген Е2 BVDV указанного первого типа, второго BVDV, принадлежащего к первому Типу, где ген Е2 BVDV, принадлежащего к указанному первому Типу, заменен геном Е2 BVDV, принадлежащего ко второму Типу, и фармацевтически приемлемого носителя.