СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗ КРОВИ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА ЛИЧИНОК ФИЛЯРИАТ -МИКРОФИЛЯРИЙ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к паразитологии, в частности к сбору личинок филяриат (микрофилярий) из крови животных и человека.

Известен способ исследования крови на наличие личинок филяриат по Фюллеборну (Петров, A.M. Гельминтологическое исследование тканей [Текст] / A.M. Петров // Ветеринарная лабораторная практика. - Т.2. - М.: Изд. сельхоз. литературы, журн. и плакатов, 1963. - С.218-219). Для этого несколько миллилитров крови смешивают с жидкостью, состоящей из 95 мл 5%-ного раствора формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл концентрированного алкогольного раствора генцианвиолета; полученный раствор центрифугируют, а осадок исследуют на наличие личинок нематод.

Известен способ выделения из крови больных сахарным диабетом личинок гельминтов (патент РФ №2287815 С2, 2006.01, G01N 33/48, G01N 1/28), при котором пробы крови смешивают с антикоагулянтом К3-ЭДТА и физиологическим раствором 1:1, готовят на основе первого раствора второй раствор, с 0,5% NaOH соответственно берут 2:1, инкубируют полученный раствор при 60°С в течение 5-10 минут, центрифугируют его при 3000 об/мин в течение 5 минут, удаляют надосадочную жидкость, инкубируют осадок при 37°С в течение 10 минут, обрабатывают осадок 1% раствором Люголя при соотношении 1:1, готовят мазки, сушат при 37°С в течение 15-20 минут и проводят микроскопирование с объективами 10 и 40.

Известен способ, предложенный J.I. Knott (1939), сущность которого заключается в том, что в пробирку с 1 мл свежей крови добавляется 10 мл 2%-ного раствора формалина, и смесь центрифугируется в течение 5 минут при 1000-1500 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость удаляют, осадок смешивают в равных количествах с 0,1%-ным раствором метиленовой сини. Из окрашенного осадка делают мазок и исследуют под микроскопом (Knott J.I. Method for making microfilarial surveys on day blood // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 1939. - V.33. - P. 191-196).

Недостатком этих трех способов является то, что во время центрифугирования личинки подвергаются жесткому механическому воздействию, становятся мало- или неподвижными, меняется их морфологическая структура, затрудняющая их идентификацию до вида. Кроме того, выделение микрофилярий (личинок) из осадка, состоящей из клеток белой крови, разрушенных гемолизированных эритроцитов, паразитических организмов иной этиологии, кристаллов холестерина, раствора краски и неподвижных микрофилярий, требует выполнения очень большой кропотливой работы лаборанта.

Известен способ исследования крови на наличие личинок филариат по Т.И.Поповой (Петров A.M. Гельминтологическое исследование тканей [Текст] / A.M. Петров // Ветеринарная лабораторная практика. - Т.2. - М.: Изд. сельхоз. литературы, журн. и плакатов, 1963. - С.218-219). Кровь берут из яремной вены и смешивают ее с 4%-ным раствором лимоннокислого натрия в соотношении 1:10. Цитрированную кровь разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:7 или 1:10 и центрифугируют. Полученный осадок исследуют под микроскопом. В подготовленной таким образом крови личинки филяриат (микросетарии) остаются живыми (при температуре 13-15°С) в течение трех суток и при микроскопическом исследовании легко обнаруживаются.

Недостатком этого способа является то, что при добавлении воды резко меняется осмотическое давление, вызывающее разрушение эритроцитов. Выделение микрофилярий (личинок) из осадка, состоящего из клеток белой крови, разрушенных гемолизированных эритроцитов, паразитических организмов иной этиологии, кристаллов холестерина, раствора краски и неподвижных микрофилярий, требует выполнения очень большой кропотливой работы лаборанта.

Известен способ прямого исследования мазка крови при малом увеличении микроскопа (Архипов И.А. Дирофиляриоз [Текст] / И.А. Архипов, Д.Р. Архипова. - М., 2004. - 194 с.).

Недостатком этого способа является то, что при низкой интенсивности инвазии данный способ неэффективен без концентрации личинок, и кроме того, микрофилярии трудно увидеть из-за эритроцитов и провести дифференцировку по видам.

Технической задачей заявляемого изобретения является выделение из крови животных и человека личинок филяриат (микрофилярий), свободных от примесей, с концентрацией личинок без центрифугирования.

Технический результат решается тем, что для выделения из крови животных и человека личинок филяриат (микрофилярий), свободных от примесей, с концентрацией личинок без центрифугирования, пробы крови в пробирке с антикоагулянтом К3-ЭДТА, ставят в прохладное место при температуре 4-15°С в течение 20-24 часов, при этом кровь разделяется на плазму и осадок, последний на своей поверхности, граничащей с плазмой, образует форму воронки, на дне которой концентрируются личинки филяриат (микрофилярий). Из дна воронки отбирают жидкость (плазму) 15-20 мкл, смешивают с 1% раствором Люголя, готовят мазки и проводят микроскопирование. Форма воронки на поверхности осадка образуется вследствие чтение выпуклого в нижнюю сторону дна стеклянной пробирки, в которой была набрана кровь с антикоагулянтом К3-ЭДТА.

Заявленный способ выделения из крови животных и человека личинок филяриат (микрофилярий), свободных от примесей, с концентрацией личинок:

- отличается от прототипов 1-3 тем, что концентрация личинок производится без центрифугирования;

- отличается от прототипов 1-4 тем, что выделение концентрированных личинок производится не с осадка, а с плазмы, представляющей прозрачную жидкость соломенного цвета;

- отличается от прототипа 5 способом концентрации личинок. Технической эффективностью предлагаемого изобретения является

выделение из стабилизированной крови животных и человека концентрированных без центрифугирования личинок филяриат (микрофилярий), свободных от примесей, скопившихся в воронкообразном дне плазмы крови, образованной поверхностью осадка, вследствие чтения последним выпуклого в нижнюю сторону дна стеклянной пробирки. В целом, предлагаемое изобретение позволяет уменьшить трудоемкость выделения из крови микрофилярий с концентрацией последних без центрифугирования и без посторонных примесей.

Изобретение относится к паразитологии. Для выделения и обнаружения личинок филяриат-микрофилярий, получают микроскопические препараты, для чего пробу крови помещают в пробирку с антикоагулянтом К3-ЭДТА, отделяют плазму от форменных элементов путем осаждения в течение 20-24 часов при температуре 4-15°С без центрифугирования. При этом осадок на своей поверхности, граничащей с плазмой, образует форму воронки, на дне которой концентрируются личинки филяриат-микрофилярий, из дна воронки отбирают 15-20 мкл жидкости - плазмы, смешивают с 1% раствором Люголя, готовят мазки, проводят микроскопирование и сбор гельминтов. Изобретение позволяет уменьшить трудоемкость выделения из крови микрофилярий.

Способ выделения из стабилизированной крови животных и человека концентрированных без центрифугирования личинок филяриат - микрофилярий, свободных от примесей, предусматривающий получение пробы крови в пробирке с антикоагулянтом К3-ЭДТА, отделение плазмы от форменных элементов - осадка при температуре 4-15°С в течение 20-24 ч, при этом кровь разделяется на плазму и осадок, последний на своей поверхности, граничащей с плазмой, образует форму воронки, на дне которой концентрируются личинки филариат - микрофилярий, из дна воронки отбирают жидкость - плазму 15-20 мкл, смешивают с 1%-ным раствором Люголя, готовят мазки и проводят микроскопирование и сбор гельминтов.