Способ выделения личинок Toxocara canis из яиц для наработки диагностического антигена Российский патент 2022 года по МПК A01K67/33 A61K39/44 G01N33/48 

Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии, может быть использовано для прижизненной и посмертной диагностики токсокароза животных и получения личинок токсокар II-ой стадии из инкубируемых яиц с целью получения диагностически полноценных белков, обладающих антигенными свойствами.

Применение данного метода в практической ветеринарии позволит существенно уточнить эпизоотологическую обстановку по токсокарозу и оценить риск заражения людей этого рода гельминтами, обосновать необходимость контроля над развитием популяции паразита в городах, получить специфический материал для создания диагностических тест-систем или вакцин.

Токсокароз (Тохоса riasis) - одна из тяжелых паразитарных болезней человека, вызываемая миграцией личинок кишечных паразитов домашних и диких животных, в основном собак (домашних кошек, рысей, леопардов, волков, лисиц, енотовидных собак, шакалов, енотов, крупного рогатого скота, кроликов, кур др.).

Последние годы в связи с ростом численности собак, их безнадзорным содержанием, доступностью к разным объектам и массивным загрязнением внешней среды фекалиями, это заболевание стало серьезной медико-социальной проблемой для многих стран мира. В качестве примера: о токсокарозе как важной экологической проблеме свидетельствуют данные, что зараженность токсокарами собак составляет 21,9%, щенков - 87,4%, кошек - 9,5% [8, 10]. Высока загрязненность почвы, зелени, овощей, ягод яйцами токсокар [9, 11, 12]. При обследовании населения на токсокароз в возрастной группе от 4 до 10 лет экстенсинвазированность (ЭИ) детей достигает 10,1% [1-7]. Отмечается высокая загрязненность яйцами токсокар почвы игровых площадок в детских дошкольных учреждениях, парках, дворах. У человека различают личиночный (висцеральный, глазной) и имагинальный (кишечный) токсокароз.

С медицинской точки зрения, токсокароз (В83.0 по МКБ-10) - зоонозный тканевой гельминтоз с геооральным механизмом инфицирования, вызываемый миграцией личинок круглых червей из группы нематод плотоядных млекопитающих, характеризующийся длительным рецидивирующим течением и полиорганным поражением, ведущую роль в патогенезе которого играют иммунопатологические реакции.

В патологии человека наиболее изучена роль собачей токсокары - Toxocara canis, меньше кошачьей - Toxocara mystax (cati). Высокий процент зараженности собак токсокарами является следствием пожизненного бессимптомного носительства личинок [13]. Роль других видов токсокар в патологии человека практически не изучена.

Жизненный цикл токсокар сложный. У животных (псовые) выделяют основной цикл развития и два вспомогательных. Основной цикл происходит по схеме: окончательный хозяин (псовые) - почва - окончательный хозяин (псовые). Возбудитель токсокароза находится в тонком кишечнике и желудке собак, волков, лисиц, песцов и других плотоядных животных. Средняя продолжительность жизни гельминтов составляет 4-6 месяцев. Самка гельминта в сутки откладывает до 200000 яиц и более. Зараженные животные ежедневно загрязняют внешнюю среду миллионами яиц, при этом у щенка в кале может находиться их около 100 тыс. на один грамм. Яйца возбудителей с фекальными массами выходят из прямой кишки кошек и собак во внешнюю среду, но собачьи особенности испражнения делают паразитирующий в них вид токсокар более распространенным, а значит более опасным для человека.

Как кошачьей, так и собачьей токсокаре требуется несколько недель для созревания в сырых влажных условиях за пределами хозяина, прежде чем яйца станут инфекционными. Недавно вышедшие наружу с животного яйца гельминта никакой опасности не представляют. Созревание и развитие яйца происходит во внешней среде (песок, почва) в зависимости от температуры, влажности и насыщенности почвы кислородом в течение 15-36 суток. В процессе созревания яйца внутри его формируется живая личинка (личинка I-ой стадии). В почве яйца длительное время сохраняют жизнеспособность и инвазионность. В связи с этим актуальным является разработка и совершенствование способов диагностики, позволяющих повысить эффективность обнаружения специфических антител (иммуноглобулины IgM, IgG и др.) к возбудителю токсокароза у восприимчивых животных.

Аналогами изобретения являются методы физического (механического) и химического воздействия на инкубируемые яйца аскаридат. Механическое воздействие заключается в компрессионном сдавливании культуры яиц нематод в компрессории МИС-7, между предметными и/или покровными стеклами, в чашке Петри и другой посуде [14]. При таких экспресс способах получают быстро культуру личинок (через несколько секунд), но в ограниченных количествах, так как отсутствует контроль на поверхности сдавливания суспензии из яиц возбудителя. Биомасса выделенного материала представлена жизнеспособными личинками, погибшими при механическом воздействии (раздавленные) и заключенными личинками в оболочки яйца. Получение данным методом экскреторно-секреторного антигена от подобной биомассы возможно в ограниченных количествах и трудоемко, за счет выполнения большого количества манипуляций с культурой яиц и личинок.

Выделение личинок из яйцевых оболочек в растворе Тироде с определенной рН среды отработал О'Коннор (1951) [цит. по 14]. Способы выхода личинок в органических средах (яичный альбумин, сыворотка крови) не подтвердились другими исследователями (Иошида, Тойода, 1938). Фенвик (1939) и Питтс (1948) рекомендуют различные физические и химические воздействия на яйца аскаридат для получения личинок, которые вызывают не только разрушение яйцевых оболочек, но и нарушают целостность личинок нематод. Освобожденные личинки могут находиться на разном сроке развития, даже те, которые не сформировались.

Промежуточным аналогом изобретения является посмертный способ выделения личинок III-ей стадии Т. canis методом переваривания паренхимы легких и печени плотоядных животных аппаратами типа АВТ [15]. При этом методе идет химическое воздействие искусственным желудочным соком (кислоты, ферменты) и физическое (лопасти мешалки) на биологические измельченные ткани изъятых от тушек или трупов животных. В данном случае в течение 1 часа получают культуру личинок токсокар с иной специфичной антигенной структурой. Мигрирующие личинки нематод в организме специфического хозяина дважды линяют и увеличиваются в размерах, в связи с этим, возможно, кардинально изменился состав синтезируемых антигенных белков. К тому же метод, предложенный И.Г. Гламаздиным и соавторами (2015), работает только при посмертном диагностическом исследовании животных.

Известен метод получения культуры личинок Т. canis, разработанный П.А. Солоповым (2009), из оплодотворенных яиц токсокар, полученные из гонад оплодотворенных самок гельминтов. Суспензию яиц токсокар выдерживают в помещении лаборатории 30 суток при температуре 22°С, относительной влажности воздуха 85% и естественном освещении. Культивирование яиц токсокар выполняют в среде, содержащей 1% глютамин. К созревшим яйцам добавляли искусственный желудочный сок, состоящий из панкреатина, свиной желчи и 1% соляной кислоты. Обработка яиц токсокар искусственным желудочным соком проводилась в термостате при температуре 37,5°С до 10 ч. После освобождения личинок нематод из яйцевых оболочек их отделяли от жидкости путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 15 минут. При микроскопическом исследовании в осадке содержались подвижные личинки токсокар II-ой стадии. Метод получения культуры личинок Т. canis П.А. Солопова требует затраты длительного временного промежутка (8-10 ч) для обработки яиц желудочным соком и их центрифугирования. Также для проведения данной работы необходимо иметь лабораторный парк габаритного оборудования (термостат, центрифуга) и лабораторию подготовки питательных сред.

Прототипом изобретения считается методика воспроизводства естественных условий прохождения яиц гельминта Т. canis через пищеварительный тракт собаки Прошина И.Г. (1953). Вначале, обработку яиц нематоды проводили в искусственном желудочном соке (ИЖС) от 17 до 24 ч при температуре 39°С термостата. Затем, культивирование яиц проводили в течение нескольких часов на среде искусственного кишечного сока (ИКС) не меняя температуры. Данный метод требует большого количества химических реагентов (кислоты, ферменты, неорганические соли, питательные среды). Обязательным условием представленной методики является предварительное 24 ч выдерживание яиц Т. canis в соляной кислоте, либо в Рингеровском растворе, дистиллированной воде, желчи, при температуре 39°С. Вторым этапом культивирования считается нахождение культур яиц в ИКС (с наличием желчи, панкреатина) или желчи на протяжении 0,5-3,5 ч в аналогичных условиях, что и в первом этапе.

Цель изобретения сводится к использованию быстрого, одноэтапного биотехнологического способа получения полноценных жизнеспособных личинок Т. canis из яиц. Изобретение позволяет использовать культуры личинок токсокар для получения различных вариантов диагностического антигена.

Технический результат решается тем, что для искусственного выделения личинок токсокар из яиц применили метод инкубирования в желчи жвачных животных (крупного (КРС) или мелкого (МРС) рогатого скота) на магнитной мешалке с подогревом. Для этого взвесь (суспензию объемом 0,25 мл) свежеполученных или хранившихся яиц Т. canis с личинками I-ой стадии в стабилизирующих средах (1%-ный раствор соляной кислоты, 4%-ный р-р формалина, 0,4%-ный р-р медного купороса и др.) помещали Пастеровской полиэтиленовой пипеткой (1,5 мл) в химический стакан с 5 мл желчи. Желчь КРС или МРС получали в свежем виде на убойном пункте мясокомбинатов, опорожняя желчные пузыри печени убойного скота. В опытах использовали свежеполученную желчь или замороженную (хранившуюся при температуре -20±2°С до 12 мес). Химический стакан с пробой помещали на платформу магнитной мешалки с подогревом. Далее, клали в суспензию магнит в пластике размером 1,5 см, включали подогрев до температуры 43±1°С. Контроль температуры взвеси яиц с личинками в желчи проводили с помощью термогигрометра с выносным датчиком температуры. Температура суспензии яиц с личинками составляла 39±1°С. Режим вращения перемешивающего элемента 50 об/мин устанавливали вручную. Период выделения личинок гельминта составил 40-50 мин. Полученный биологический материал с жизнеспособными подвижными личинками Т.canis II-ого порядка можно использовать для последующих стадий получения диагностических антигенов, в исследовании морфологических структур личинок и биологии развития возбудителя заболевания, в заражении лабораторных моделей и др.

Преимущество метода заключается в том, что этим методом можно получить большую массу жизнеспособных, подвижных, естественно вышедших из яиц личинок Т. canis за короткий период времени (до 50 мин.) с помощью магнитной мешалки. Данный технологический способ исключает процесс предварительного этапа подготовки яиц с личинками для их выхода, что позволяет значительно ускорить работу. В ходе работы возможные антигены, получаемые от инкубируемого жизнеспособного материала токсокар с использованием одного естественного компонента - желчи, при этом личинок из яиц не нарушены каким-либо другим воздействием в процессе выхода. Так как, первичный контакт гельминтозом начинается с внедрения вылупившейся из яйца личинки II стадии в кишку организма хозяина, данная биомасса с наличием имеющихся белково-углеводных структур считается наиболее антигенно-полноценной [2, 3, 7, 11, 12]. Выделенные личинки гельминта Т. canis можно использовать для искусственного (на питательных средах) и естественного (на лабораторных животных) культивирования соматического, экскреторно-секреторного и других видов антигенов.

Результаты проведенных исследований позволят быстро разрабатывать и совершенствовать диагностические методы токсокароза и, соответственно, эффективнее проводить противоэпизоотические мероприятия, направленные на борьбу с зоонозом.

Пример 1. Яйца гельминта Т. canis выделены флотационным методом (Фюллеборна) из фекалий естественно инвазированных щенков домашних собак (5-ти шенков, возрастом 1,5 мес), привезенные из Московского региона. Далее, провели инкубирование яиц в условиях термостата (при 25±2°С) в течение 16 суток до получения личинок I-порядка. Хранение полученных личинок заключенные в яйцевую оболочку проводили в 1,0%-м растворе соляной кислоты и 4%-м растворе формалина 13 месяцев при температуре 8±1°С. Суспензию яиц с личинками, объемом 1,5 мл, помещали пипеткой в химический стакан (объемом 50,0 мл) с 5 мл размороженной желчи КРС. Химический стакан с пробой помещали на платформу магнитной мешалки с подогревом (Мешалка магнитная IKA RT-10, многоместная). Далее, клали в суспензию магнит в пластике размером 1,5 см, включали подогрев до температуры 43±1°С. Температуру взвеси яиц (39±1°С) с личинками в желчи контролировали с помощью термогигрометра (Термометр-гигрометр цифровой KTJ ТА138). Вращение магнита в приготовленном растворе составляло 50 об/мин. Время начала выхода личинок гельминта из яйца составило 10 мин. Через 45-50 минут все личинки (91-95%) вышли из яйцевых оболочек (таблица 1).

Пример 2. Оплодотворенные яйца нематод получены из гонад самок половозрелых гельминтов Т. canis. Возбудитель токсокароза собран из патологического материала (тонкого отдела кишечника бродячих домашних собак) на утильзаводе «Эколог» Московского региона. Созревание яиц токсокар проводили при температуре 28±2°С в течение 14 суток. После инкубирования сформировывавшихся личинок из полученных яиц оказалось - 65,4%. Остальные яйца, выделенные из гельминта, оказались неоплодотворенными и неполноценными. Свежеполученную суспензию яиц с личинками помещали в чашку Петри в 0,4%-й раствор медного купороса. Личинки Т. canis I-го порядка в яйцах хранили в течение 7 суток при температуре 6±2°С. В химический стакан объемом 50 мл поместили осадок хранившихся яиц из бытового холодильника. Затем, в емкость добавили 10 мл свежевыделенной желчи барана. Стакан с культурой яиц из нематод устанавливали на магнитную мешалку с подогревом. В посуду клали магнит размером 1,0 см и взвесь разогревали до 40±1°С. Вращение магнита в емкости составляло 50 об/мин. В течение 50 минут во взвеси регистрировалось от 59 до 63,0% вышедших жизнеспособных личинок нематод Т. canis II-го порядка (таблица 2).

Литература

1. Ивашкин В.М., Лейкина Е.С., Шихошова Н.П. Нематоды животных, паразитирующих у человека. (Морфология, систематика, экология, физиология). Труды ГЕЛАН, М., "Наука", 1978, 28, с. 5-9.

2. Лысенко А.Я., Константинова Т.Н., Авдюхина Т.И. Токсокароз. Учебное пособие. Российская медицинская академия последипломного образования. М., 1999 ISBN 5-7249-0368-7.

3. Астафьев Б.А. Очерки по общей патологии гельминтозов человека, М., 1975.

4. Гельминтозы человека, под ред. Ф.Ф. Сопрунова, М., 1985.

5. Озерецковская Е.Е., Зальнова Н.С. и Тумольская Н.И. Клиника и лечение гельминтозов, Л., 1985.

6. Золотова И.А. Бронхиальная астма и токсокароз (клиническое, иммунологическое и функциональное исследование) // Автореф. дисс. к.м.н. - М., 2003.

7. Конанихина С.Ю. Клинико-иммунологические аспекты токсокароза у детей // Автореф. дис. к.м.н. - М., 2004.

8. Петров A.M. Пути заражения серебристо-черных лисиц токсокарозом. ДАН СССР, нов. серия, 1942, Т. 36, Вып. 8, с. 271-272.

9. Радун Ф.А., Ввеличкин П.А. Развитие яиц Toxocara canis (Werner, 1782) в зависимости от температуры. // Тр. Всесоюз. сельхоз. ин-та заочного образования. Вып. 44. Совершенствование, кормление и воспроизводство сельхоз животных. М., 1971, с. 202-206.

10. Радун Ф.А. К эпизоотологии токсокароза собак. Проблемы паразитологии. Труды науч. конференции паразитологов УССР, 1972, ч. 2, с. 150-151.

11. Токсокароз. Клиника. Диагностика. Лечение. Профилактика. Информационно-методическое пособие - Новосибирск, 2004. - 48 с. (Организации-разработчтки - Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского Московской медицинской академии им И.М. Сеченова, Кафедра паразитологии, паразитарных и тропических болезней ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, Москва).

12. Сергиев В.П. Паразитарные болезни человека (протозоозы и гельминтозы). Изд. Фолиант. 2006 г. - 3-е испр. и доп., 640 с.

13. Солопов П.А. Иммуноферментный метод диагностики токсокароза собак, сероэпизоотологический мониторинг и терапия. Дисс. канд. вет. наук. Рязань, 2009. - 114 с.

14. Прошин И.Г. К методике искусственного выделения личинок аскаридат из яиц // Медицинская паразитология. - 1954. - №2. - с. 126-131.

15. Гламаздин И.Г., Шибитов С.К., Панова О.А., Концевая С.Ю. Патент на изобретение "Способ выделения личинок Т. canis методом переваривания паренхимы легких и печени плотоядных животных", 10.11.2015. Бюл. №31. № RU 2567845 G01N 33/48 (2006/01).

ПРИЛОЖЕНИЕ

Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии и биотехнологии. Предложен способ выделения личинок Toxocara canis из яиц для наработки диагностического антигена, включающий инкубирование яиц Т. canis в желчи жвачных животных с использованием магнитной мешалки в режиме 50 об/мин с подогревом при температуре культивируемой среды 39±1°С в течение 50 мин. Изобретение обеспечивает расширение арсенала биотехнологических способов получения полноценных жизнеспособных личинок токсокар для получения диагностического антигена для прижизненной и посмертной диагностики токсокароза животных. 2 табл., 2 пр.

Способ выделения личинок Toxocara canis из яиц для наработки диагностического антигена, включающий проведение физико-химического процесса с целью ускорения выхода личинок нематоды, отличающийся тем, что для дальнейшего биотехнологического процесса проводят одноэтапную инкубацию их в желчи жвачных животных с использованием магнитной мешалки в режиме 50 об/мин с подогревом при температуре культивируемой среды 39±1°С в течение 50 мин.