СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИН-6-ЗАВИСИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2014 года по МПК A61K39/395 A61P37/00 

Область техники, к которой относится изобретение.

Настоящее изобретение имеет отношение к способам лечения интерлейкин-6(IL-6)-зависимых заболеваний с помощью комбинации антагониста интерлейкина-6 (антагонист IL-6), в особенности антитела к рецептору интерлейкина-6 (IL-6R) (антитело к IL-6R), и иммунодепрессантов, и с помощью введения антитела к IL-6R в высокой дозировке.

Уровень техники.

IL-6 представляет собой цитокин, который также называют фактором-2, стимулирующим В-клетки (BSF2, В cell stimulating factor-2), или интерфероном β2. IL-6 был открыт как фактор дифференцировки, вовлеченный в активацию клеток, происходящих из В-лимфоцитов (Hirano Т. et al., Nature, 324:73-76, 1986), и впоследствии было обнаружено, что IL-6 является полифункциональным цитокином, который влияет на функции различных клеток (Akira S. et al., Adv. in Immunology, 54:1-78, 1993). Было показано, что IL-6 индуцирует созревание клеток, происходящих из Т-лимфоцитов (Lotz М. et al., J. Exp. Med., 167:1253-1258, 1998).

IL-6 сообщает клеткам свою биологическую активность через два типа белков. Один из них - рецептор IL-6 (IL-6R), который является лиганд-связывающим белком с молекулярной массой около 80 кДа, к которому присоединяется IL-6 (Taga Т. et al., J. Exp. Med., 166:967-981, 1987; Yamasaki K. et al., Science, 241:825-828, 1987). Помимо мембрано-связанного типа, который проникает и экспрессируется в клеточной мембране, рецептор IL-6 также был обнаружен в виде растворимого рецептора IL-6, состоящего в основном из экстраклеточной части рецептора.

Международная публикация WO 92/19759 описывает различные типы антител к IL-6R, таких как гуманизированные антитела к IL-6R и химерные антитела к IL-6R. WO 96/11020 описывает терапевтическое средство при ревматоидном артрите и ингибитор роста синовиальных клеток (клетки внутренней оболочки суставов), первичным ингредиентом которого является антагонист IL-6, такой как антитело к IL-6R. WO 96/12503 описывает лечение заболеваний, для которых свойственно продуцирование IL-6, таких как плазмоцитоз, гипериммуноглобулинемия, анемия, нефрит, кахексия, ревматоидный артрит, болезнь Кастлемана (Castleman's disease) и мезангиальный пролиферативный нефрит. WO 98/42377 описывает защитные/терапевтические средства при заболеваниях, имеющих отношение к сенсибилизированным Т-клеткам, таким как множественный склероз, увеит, хронический тиреоидит, замедленная гиперчувствительность, контактный дерматит и атопический дерматит, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R.

WO 98/42377 описывает терапевтические средства при системном эритематозе, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. WO 99/47170 описывает терапевтические средства при болезни Крона, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. WO 00/10607 описывает терапевтические средства при панкреатите, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. WO 02/3492 описывает терапевтические средства при псориазе, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. Кроме того, WO 02/080969 описывает терапевтические средства при ювенильном идиопатическом артрите, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R.

Раскрытие изобретения.

Как было описано выше, были известны различные профилактические и терапевтические средства, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. Однако не было известно, что при лечении IL-6-зависимых заболеваний комбинацией антитела к IL-6R и иммунодепрессантов, таких как метотрексат (МТХ), можно получить синергические эффекты, что иммунодепрессант, такой как метотрексат (МТХ) может ослабить или предупредить аллергические реакции при лечении ревматоидного артрита с помощью антитела к IL-6R, и что антитело к IL-6R в высокой дозировке может снизить или предупредить аллергические реакции при лечении ревматоидного артрита с помощью метотрексата.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для лечения IL-6-зависимых заболеваний, включающую антагонист интерлейкина-6 (антагонист IL-6) и иммунодепрессанты.

Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую иммунодепрессанты, для усиления эффекта при использовании антагониста IL-6R при лечении IL-6-зависимых заболеваний.

Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую иммунодепрессанты, для предупреждения или ослабления аллергических реакций при лечении IL-6-зависимых заболеваний с помощью антагониста IL-6.

Изобретение также обеспечивает терапевтическое средство, включающее антагонист IL-6, для лечения IL-6-зависимых заболеваний путем приема в высокой дозы препарата.

Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую антагонист IL-6 в высокой дозе, для предупреждения или ослабления аллергических реакций при лечении IL-6-зависимых заболеваний.

Антагонист IL-6 предпочтительно является антителом к IL-6R. Антитело к IL-6R предпочтительно является моноклональным антителом к IL-6R. Предпочтительно, чтобы антитело к IL-6R было моноклональным антителом к IL-6R человека. Или предпочтительно, чтобы антитело к IL-6R было моноклональным антителом к IL-6R мыши. Предпочтительно, чтобы антитело к IL-6R было антителом рекомбинантного типа. Предпочтительно, чтобы моноклональное антитело к IL-6R человека было, например, антителом РМ-1. Предпочтительно, чтобы моноклональное антитело к IL-6R мыши было, например, антителом MR16-1. Кроме того, антитело может быть химерным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом к IL-6R. Особенно предпочтительным антителом к IL-6R является, например, гуманизированное антитело РМ-1.

При совместном использовании антагониста IL-6, в особенности антитела к IL-6R, и иммунодепрессанта, дозировка антагониста IL-6, в особенности антитела к IL-6R, составляет, например, при внутривенном введении от 0,02 до 150 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R, предпочтительно использование от 0,5 до 30 мг/кг/за 4 недели или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R, и наиболее предпочтительно использование от 2 до 8 мг/кг/за 4 недели или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

При введении антагониста IL-6, в особенности антитела к IL-6R в высокой дозе, дозировка антагониста IL-6, в особенности антитела к IL-6R, составляет, например, при внутривенном введении не менее чем 4 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R, предпочтительно использование от 6 до 16 мг/кг/за 4 недели или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R, или наиболее предпочтительно использование от 6 до 10 мг/кг/за 4 недели или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

При использовании в качестве иммунодепрессанта МТХ дозировка МТХ составляет, например, от 1 до 100 мг/человек/неделя или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация МТХ, предпочтительно использование от 4 до 50 мг/человек/неделя или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация МТХ, или особенно предпочтительно использование от 10 до 25 мг/человек/неделя или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация МТХ.

Дозировка, при которой в крови обнаруживают лекарственное средство (например, антитело к IL-6R или МТХ), означает дозировку, дающую эквивалентный терапевтический эффект, и даже в том случае, когда достижение определенной концентрации в крови различается из-за способа введения средства, например, при внутривенной инъекции или подкожной инъекции, ее расценивают как дозировку, при которой в крови обнаруживают такую концентрацию лекарственного средства (например, антитела к IL-6R или МТХ), при которой достигается эквивалентный терапевтический эффект.

Примеры IL-6-зависимых заболеваний включают

острые хронические воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания: нефрит, мезангиальный пролиферативный нефрит, болезнь Крона, язвенный колит, панкреатит, ювенильный идиопатический артрит или системный ювенильный идиопатический артрит, васкулит, болезнь Кавасаки, ревматоидный артрит, системный эритематоз, псориаз, синдром Шегрена, болезнь Стилла у взрослых;

опухолевые заболевания: множественная миелома, болезнь Кастлемана, злокачественная лимфома, рак почек;

инфекционные заболевания: инфекция ВИЧ, инфекция вирусом Эпштейна-Барр (EBV);

кахексию: кахексия;

другие заболевания: плазмоцитоз, гипериммуноглобулинемия, анемия и т.д., и предпочтительно это ревматоидный артрит, плазмоцитоз, гипериммуноглобулинемия, анемия, нефрит, кахексия, множественная миелома, болезнь Кастлемана, мезангиальный пролиферативный нефрит, системный эритематоз, болезнь Крона, панкреатит, псориаз, ювенильный идиопатический артрит или системный ювенильный идиопатический артрит.

Фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно вводить перорально или парентерально и систематически или при необходимости. Например, можно выбрать внутривенную инъекцию, такую как введение с помощью капельницы, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, подкожную инъекцию, суппозиторий, инъекцию в прямую кишку, пероральные лекарственный средства, покрытые кишечно-растворимой оболочкой, и т.п., и подходящий способ введения лекарственных средств можно выбирать правильным образом в зависимости от возраста и состояния пациента. Верхний и нижний пределы эффективной дозировки зависят от частоты ввода средства, например, дозировку средства на один прием увеличивают при длительном интервале между приемами, тогда как дозировку средства снижают при коротком интервале между приемами.

Предпочтительной эффективной дозировкой и способом введения антитела к рецептору IL-6, например, является такое количество, при котором в крови обнаруживают свободное антитело. В качестве типичных примеров существуют способы введения лекарственного средства с разделением дозы на несколько приемов, например, с помощью внутривенной инъекции, такой как капельное введение, и подкожной инъекции, которые проводят в соответствии с расписанием приема дважды в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в 4 недели, один раз в 6 недель, один раз в 8 недель и т.п. Расписание приема можно регулировать путем увеличения интервала между приемами от двух раз в неделю или одного раза в неделю до одного раза в 2 недели, одного раза в 3 недели, одного раза в 4 недели, одного раза в 6 недель и одного раза в 8 недель при контроле за состоянием заболевания и изменениями результатов лабораторных исследований крови.

При совместном приеме с МТХ дозировка антитела к IL-6R является обычной, например, при лечении ревматоидного артрита это дозировка более чем 0,5 мг/кг в неделю или дозировка, при которой в крови достигается эквивалентный или более высокий антиревматический эффект. Например, при внутривенном введении, проводимом один раз в четыре недели, дозировка составляет от 0,02 до 150 мг/кг, предпочтительно от 0,5 до 30 мг/кг и более предпочтительно от 2 до 8 мг/кг.

Антитело к IL-6R и иммунодепрессант вводят одновременно или с временным интервалом.

Иммунодепрессанты также включают антиревматические средства, адренокортикоидные гормональные средства и т.п.и включают, например, следующие лекарственные средства.

Иммунодепрессанты, антиревматические средства, средства, включающие адренокортикоидные гормоны

Иммунодепрессанты

Алкилирующие средства

Циклофосфамид

Метаболические антагонисты

Азатиоприн, метотрексат, мизорибин

Ингибиторы активности Т-клеток

Циклоспорин, такролимус

Антиревматические средства:

Гидроксихлороквин, сульфасалазин, лефлуномид, этанерсепт, инфликсимаб, адалимумаб, D-пеницилламин, пероральные препараты золота, инъецируемые препараты золота (для внутримышечной инъекции), миноциклин, золота натрия тиомалат, ауранофин, лобензарит, буцилламин, актарит;

Средства, включающие адренокортикоидные гормоны:

Кортизон, гидрокортизоны

Кортизона ацетат, гидрокортизон, гидрокортизона натрия фосфат, гидрокортизона натрия сукцинат, фторкортизона ацетат,

Преднизолон, преднизолоны

Преднизолон, преднизолона натрия сукцинат, преднизолона натрия фосфат, галопредона ацетат

Метилпреднизолон

Метилпреднизолон, метилпреднизолона ацетат, метилпреднизолона натрия сукцинат

Триамцинолоны

Триамцинолон, триамцинолона ацетат, триамцинолона актинид

Дексаметазоны

Дексаметазон, дексаметазона ацетат, дексаметазона натрия фосфат, дексаметазона пальмитат

Бетаметазоны

Бетаметазон, бетаметазона натрия фосфат

Параметазоны

Параметазона ацетат

Дозировка иммунодепрессанта, например, при совместном приеме МТХ для лечения ревматоидного артрита, например, при пероральном приеме, составляет от 1 до 100 мг/человек в неделю, предпочтительно от 4 до 50 мг, и наиболее предпочтительно от 7,5 до 25 мг/человек.

Также высокая дозировка антитела к IL-6R подразумевает дозировку, способную предупредить или ослабить аллергическую реакцию, эта дозировка эквивалентна или превышает минимальную дозировку, эффективную для лечения IL-6-зависимых заболеваний. Например, при лечении ревматоидного артрита при внутривенном капельном вливании, производимом каждые четыре недели, дозировка включает 4 мг/кг или более, предпочтительно от 6 до 16 мг/кг и наиболее предпочтительно от 6 до 10 мг/кг.

Описанные выше способы приема, интервал между приемами и дозировка представляют собой иллюстрацию предпочтительных примеров, и подходящим образом можно выбрать способ приема, интервал и дозировку, при которой достигается сходный терапевтический эффект. Например, измеряя концентрации различных лекарственных средств в крови, можно выбрать способ приема, интервал и дозировку, при которых достигаются эффекты, сходные с теми, которые приведены выше в качестве примеров. Изобретение включает в себя способ приема, интервал и дозировку, при которых в крови достигаются концентрации, эквивалентные тем, которые описаны в приведенных выше примерах.

Осуществление изобретения.

Антагонисты IL-6, применяемые в настоящем изобретении, могут быть использованы независимо от их происхождения, типа и формы до тех пор, пока они демонстрируют профилактический или терапевтический эффект при IL-6-зависимых заболеваниях.

Антагонисты IL-6 представляют собой вещества, которые ингибируют биологическую активность IL-6. Антагонисты IL-6 предпочтительно являются веществами, обладающими ингибирующей активностью связывания любых белков из IL-6, IL-6R или gp130. Антагонисты IL-6 включают антитело к IL-6, антитело к IL-6R, антитело к gp130, модифицированный IL-6, модифицированный растворимый IL-6R или неполные пептиды IL-6 или IL-6R, а также вещества с низкой молекулярной массой, обладающие подобной активностью.

Антитело к IL-6, применяемое в настоящем изобретении, можно получить в виде поликлональных или моноклональных антител, используя средства, известные в этой области техники. В качестве антитела к IL-6, применяемого в настоящем изобретении, предпочтительными являются моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомами, и антитела, продуцируемые клетками-хозяевами, которые были трансформированы с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированный ген антитела. Это антитело, связываясь с IL-6, блокирует связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, таким образом, блокирует передачу биологически активного сигнала IL-6 в клетки.

Примеры таких антител включают антитело МН166 (Matsuda Т. et al., Eur. J. Immunol., 18:951-956, 1988) и антитело SK2 (Sato K. et al., The 21 st Proceedings of the Japanese Society for Immunology, 21:166, 1991).

Гибридомы, продуцирующие антитела к IL-6, можно в основном сконструировать, используя известную процедуру, описанную ниже. То есть, гибридомы можно получить, проводя иммунизацию, используя в качестве сенсибилизирующего антигена IL-6, в соответствии с традиционным методом иммунизации; сливая полученные иммунные клетки с известными в технологии родительскими клетками в обычном методе слияния клеток; и отбирая клетки, продуцирующие моноклональное антитело, с помощью традиционного метода скрининга.

В частности, антитело к IL-6 можно получить следующим способом. Например, человеческий IL-6, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность IL-6, подробно описанную в Eur. J. Biochem., 168:543-550, 1987; J. Immunol., 140:1534-1541, 1987; или в Agr. Biol. Chem., 54:2685-2688, 1990.

Последовательность гена IL-6 вставляют в известный экспрессионный вектор, которым трансформируют подходящие для этого клетки-хозяева, затем с помощью известного метода интересующий белок IL-6 очищают из клеток или супернатанта культуры клеток, и очищенный белок IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Также, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать слитый белок, образованный комбинацией белка IL-6 и другого белка.

Антитело к рецептору IL-6, применяемое в настоящем изобретении, может быть получено в виде поликлонального или моноклонального антитела с использованием метода, известного в этой области техники. В качестве антитела к рецептору IL-6, применяемого в настоящем изобретении, предпочтение имеет моноклональное антитело, в особенности, антитело, происходящее от млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомами, и антитела, продуцируемые в клетках-хозяевах, которые были трансформированы с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированный ген антитела. Это антитело, связываясь с рецептором IL-6, блокирует связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, таким образом, блокирует передачу биологически активного сигнала IL-6 в клетки.

Примеры таких антител включают антитело MR16-1 (Tamura Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11924-11928, 1993), антитело PM-1 (Hirata Y. et al., J. Immunol., 143:2900-2906, 1989), антитело AUK12-20, антитело AUK64-7 или антитело AUK146-15 (International Patent Application Publication No. WO 92-19759). Среди них наиболее предпочтительным является антитело РМ-1.

Клеточная линия гибридомы РМ-1, которая продуцирует антитело РМ-1, была депонирована для международного признания 12 июля 1989 года по условиям Будапештского договора как FERM ВР-2998 Международным депозитарием для патентуемых микроорганизмов (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.). Клеточная линия крысино-мышиной гибридомы MR16-1, которая продуцирует антитело MR16-1, была депонирована для международного признания 13 марта 1997 года по условиям Будапештского договора как FERM ВР-5875 Международным депозитарием для патентуемых микроорганизмов (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело к рецептору IL-6, могут быть получены с помощью известной процедуры, описанной ниже. То есть, гибридомы можно получить, проводя иммунизацию, используя в качестве сенсибилизирующего антигена рецептор IL-6, в соответствии с традиционным методом иммунизации; сливая полученные иммунные клетки с известными в технологии родительскими клетками в обычном методе слияния клеток; и отбирая клетки, продуцирующие моноклональное антитело, с помощью традиционного метода скрининга.

В частности, антитело к рецептору IL-6 можно получить следующим способом. Например, человеческие рецепторы IL-6, применяемые в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя генную или аминокислотную последовательности рецептора IL-6, подробно описанные в European Patent Application Publication No. EP 325474 и JP-A-3-155795, соответственно.

Существуют два типа белков рецептора IL-6: один из них экспрессирован на клетках, а другой - отделен от клеточной мембраны (растворимый рецептор IL-6) (Yasukawa K. et al., J. Biochem., 108:673-676, 1990). Растворимый рецептор IL-6 формируется в значительной степени из экстраклеточного участка рецептора IL-6 и отличается от мембрано-связанного рецептора IL-6 тем, что не содержит трансмембранный участок или трансмембранный участок вместе с внутриклеточным участком. Оба белка рецептора IL-6 можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена для продукции антитела к рецептору IL-6, применяемого в настоящем изобретении.

Последовательность гена рецептора IL-6 включают в известный экспрессионный вектор, которым трансформируют подходящие клетки-хозяева, затем интересующий белок рецептора IL-6 очищают из клеток или супернатанта культуры с помощью известного метода, и очищенный белок рецептора IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Также, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать клетки, экспрессирующие рецептор IL-6, или слитый белок, образованный комбинацией белка рецептора IL-6 и другого белка.

Штамм E.coli HB101-pIBIBSF2R, клетки которого содержат плазмиду pIBIBSF2R, включающую кДНК, которая кодирует рецептор IL-6 человека, был депонирован для международного признания 9 января 1989 года по условиям Будапештского договора как FERM ВР-2232 Международным депозитарием для патентуемых микроорганизмов (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.).

Антитело к gp130, применяемое в настоящем изобретении, может быть получено в виде поликлонального или моноклонального антитела с использованием известного метода. В качестве антитела к gp130, применяемого в настоящем изобретении, предпочтительно используется моноклональное антитело, происходящее от млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомами, и антитела, продуцируемые в клетках-хозяевах, которые были трансформированы с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированный ген антитела. Это антитело, связываясь с gp130, ингибирует связывание комплекса IL-6/рецептор IL-6 с gp130, блокирует передачу биологически активного сигнала IL-6 в клетки.

Примеры таких антител включают антитело АМ64 (JP-A-3-219894), антитело 4В11 и антитело 2Н4 (US 5571513), антитело B-S12 и антитело В-Р8 (JP-A-8-291199).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело к gp130, могут быть получены с помощью известной процедуры, описанной ниже. То есть, гибридомы можно получить, проводя иммунизацию, используя в качестве сенсибилизирующего антигена gp130, в соответствии с традиционным методом иммунизации; сливая полученные иммунные клетки с известными в технологии родительскими клетками в обычном методе слияния клеток; и отбирая клетки, продуцирующие моноклональное антитело, с помощью традиционного метода скрининга.

В частности, моноклональное антитело можно получить следующим способом. Например, gp130, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность gp130, подробно описанную в European Patent Application Publication No. ЕР 411946.

Последовательность гена gp130 включают в известную систему экспрессионного вектора, которым трансформируют подходящие клетки-хозяева, затем интересующий белок gp130 очищают из клеток или супернатанта клеточной культуры с помощью известного метода, и очищенный белок gp130 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Также в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать клетки, экспрессирующие gp130, или слитый белок, образованный комбинацией gp130 и другого белка.

Млекопитающие животные, иммунизированные с помощью сенсибилизирующего антигена, никак не ограничены, но они предпочтительно отбираются из соображений их совместимости с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Обычно они включают грызунов, таких как мышь, крыса и хомяк.

Иммунизацию животного сенсибилизирующим антигеном проводят, используя известный способ. В качестве основных способов, например, применяют внутрибрюшинную или подкожную инъекцию животного сенсибилизирующим антигеном. В частности, в предпочтительном варианте сенсибилизирующий антиген, который подходящим образом разводят и суспендируют в PBS (фосфатно-солевой буфер) или физиологическом растворе, смешивают для эмульгирования с подходящим количеством обычного адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда, и затем вводят его млекопитающему в течение нескольких приемов с интервалом от 4 до 21 дня. Также во время иммунизации сенсибилизирующим антигеном может быть использован подходящий носитель.

Животное иммунизируют таким способом, и иммунизацию подтверждают тем, что в сыворотке крови повышается уровень интересующего антитела. Затем иммунизированные клетки извлекают из млекопитающего и используют для слияния клеток. Предпочтительными клетками для слияния клеток, в частности, являются клетки селезенки.

В качестве клеток миеломы млекопитающих, применяемых в виде родительских клеток-партнеров для слияния с описанными выше иммунизированными клетками, предпочтительно используют уже известны клеточные линии, такие как P3X63Ag8.653 (Kearney J.F. et al., J. Immunol., 123:1548-1550, 1979), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81:1-7, 1978), NS-1 (Kohler G. and Milstein C., Eur. J. Immunol., 6:511-519, 1976), MOC-11 (Margulies D.H. et al., Cell, 8:405-415, 1976), SP2/0 (Shulman M. et al., Nature, 276:269-270, 1978), FO (de St. Groth S.F. et al., J. Immunol. Methods, 35:1-21, 1980), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med., 148:313-323, 1978) и R210 (Galfre G. et al., Nature, 277:131-133, 1979).

Слияние указанных выше иммунных клеток с клетками миеломы по существу может быть проведено в соответствии с известным способом, таким как способ, описанный в работе Milstein et al. (Kohler G. and Milstein C., Methods Enzymol., 73:3-46, 1981).

Более конкретно, указанное слияние клеток проводят, например, в обычной питательной культуральной среде в присутствии катализатора слияния клеток. В качестве катализатора слияния клеток, например, можно использовать полиэтиленгликоль (PEG), вирус Сендай (HVJ) и нечто подобное, и, кроме того, чтобы усилить эффективность слияния, затем по желанию можно добавить/использовать вспомогательное средство, такое как диметилсульфоксид.

Предпочтительное соотношение иммунных клеток и клеток миеломы составляет, например, от 1- до 10-кратного избытка иммунных клеток по отношению к клеткам миеломы. В качестве среды, применяемой для слияния клеток, возможно использование среды RPMI 1640, среды MEM, подходящей для роста клеточной линии миеломы, и другой стандартной среды, применяемой для такого типа клеточной культуры, и, помимо этого, можно вводить сывороточные добавки, такие как фетальная сыворотка теленка (FCS).

Для слияния клеток целевые слитые клетки (гибридомы) получают путем тщательного смешивания определенного количества описанных выше иммунизированных клеток с клетками миеломы в указанной выше среде, добавляя раствор PEG, например, раствор PEG с молекулярной массой от 1000 до 6000, предварительно прогретый до 37°C, в стандартной концентрации от 30 до 60% (вес/объем), с последующим перемешиванием. Затем, с помощью процедуры повторного, последовательного добавления подходящей культуральной среды и центрифугирования можно удалить супернатант, агенты слияния клеток и т.д., присутствие которых нежелательно для роста гибридомы.

Гибридомы могут быть отобраны с помощью культивирования в обычной селекционной среде, например, в культуральной среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в среде HAT продолжают обычно от нескольких дней до нескольких недель, в течение времени, достаточного для гибели клеток (не слившихся клеток), отличающихся от желаемых гибридом. Затем применяют обычный метод предельного разведения и проводят скрининг и клонирование гибридом, продуцирующих желаемое антитело.

Кроме получения указанной выше гибридомы, иммунизируя антигеном животное (но не человека) с помощью сенсибилизирования лимфоцитов человека белком-антигеном или клетками, экспрессирующими антиген in vitro, и слияния сенсибилизированных В-лимфоцитов с клетками миеломы человека, например, с клетками U266 (см. JP-B-1-59878), можно получить желаемое человеческое антитело, обладающее активностью связывания с желаемым антигеном или клетками, экспрессирующими антиген. Кроме этого, антиген или клетки, экспрессирующие антиген, можно ввести трансгенным животным, имеющим набор генов антител человека, чтобы получить желаемое человеческое антитело в соответствии со способом, описанным выше (см. International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).

Сконструированную таким образом гибридому, продуцирующую моноклональное антитело, можно культивировать в стандартной культуральной среде или можно хранить длительное время в замороженном состоянии при температуре жидкого азота.

Чтобы получить моноклональное антитело из гибридом, можно использовать способ, в котором гибридомы культивируют обычным образом и получают моноклональное антитело в виде супернатанта клеточной культуры, или с помощью способа, в котором гибридому вводят и выращивают в животных, совместимых с указанной гибридомой, а антитела получают в виде асцитов. Первый способ подходит для получения высокоочищенных антител, тогда как последний способ подходит для производства больших количеств антител.

Например, получение гибридомы, продуцирующей антитело к рецептору IL-6, можно проводить, используя способ, раскрытый в JP-A-3-139293. Можно применить способ, в котором гибридомы, продуцирующие антитело РМ-1, депонированные для международного признания 12 июля 1989 года по условиям Будапештского договора как FERM ВР-2998 Международным депозитарием для патентуемых микроорганизмов (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.), вводят внутрибрюшинно мышам BALB/c для получения асцитов, и антитела РМ-1 очищают из этих асцитов. Также, можно применить способ, в котором указанные гибридомы культивируют в подходящей культуральной среде, например, в среде RPMI 1640, в гибридомной среде SFM (производство фирмы GIBCO-BRL), в среде PFHM-II (производство фирмы GIBCO-BRL), содержащих 10%-ную фетальную сыворотку теленка и 5%-ный MB-Condimed H1 (производство фирмы Boehringer Mannheim), и антитело РМ-1 очищают из супернатанта клеточной культуры.

В настоящем изобретении в качестве моноклонального антитела можно использовать антитело рекомбинантного типа, продуцированное с помощью клонирования гена антитела из гибридомы, включения этого гена в подходящий вектор, введения его в клетки-хозяева, и использования генно-инженерных технологий (см., например, Borrebaeck C.A.K., and Larrick J.W. Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by Macmillan Publishers Ltd. 1990).

В частности, мРНК, кодирующую вариабельную (V) область желаемого антитела, выделяют из клеток, продуцирующих интересующее антитело, таких как гибридомы. Для выделения мРНК получают суммарный препарат РНК с использованием известного способа, например, такого как метод ультрацентрифугирования в присутствии гуанидина (Chirgwin J.M. et al., Biochemistry, 18:5294-5299, 1979), метод AGPC (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 162:156-159, 1987), и мРНК получают, используя набор фирмы Pharmacia «mRNA Purification Kit». Также мРНК можно выделить непосредственно, используя набор фирмы Pharmacia «QuickPrep mRNA Purification Kit».

кДНК V-области антитела синтезируют из полученной мРНК, используя обратную транскриптазу. Синтез кДНК проводят, используя набор «AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit» и сходные наборы. Также, для синтеза и амплификации кДНК можно использовать набор «5'-Ampli FINDER RACE kit» (производство фирмы Clontech), и метод 5'-RACE, в котором используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Frohman М.А. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002, 1988; Belyavsky A. et al., Nucleic Acids Res., 17:2919-2932, 1989). Желаемый фрагмент ДНК очищают из продукта ПЦР и лигируют в ДНК вектора. Затем полученный рекомбинантный вектор вводят в Е.coli, и отбирают колонии для выделения желаемого рекомбинантного вектора. Последовательность оснований желаемой ДНК подтверждают с помощью известного способа, такого как дидезокси-метод секвенирования.

Если получают ДНК, кодирующую V-область желаемого антитела, ее лигируют в молекулу ДНК, кодирующую константную область (С-область) желаемого антитела, и затем ее включают в экспрессионный вектор. Или ДНК, кодирующую V-область антитела, можно включить в экспрессионный вектор, содержащий С-область антитела.

Чтобы продуцировать антитело, применяемое в настоящем изобретении, ген антитела включают в экспрессионный вектор для того, чтобы его экспрессия шла под контролем экспрессионных регуляторных участков, например, энхансера и промотора, как описано ниже. Затем, с помощью этого экспрессионного вектора можно трансформировать клетки-хозяева.

В настоящем изобретении в целях снижения аллогенной антигенности для человека можно применять рекомбинантное антитело с искусственно модифицированным геном, например, химерное антитело, гуманизированное антитело и человеческое антитело. Эти модифицированные антитела можно получить с помощью известных методов.

Химерное антитело можно получить с помощью лигирования полученной, как описано выше, ДНК, кодирующей V-область антитела, в ДНК, кодирующую С-область человеческого антитела, с последующим ее включением в экспрессионный вектор, который вводят в клетки-хозяева для продуцирования (см. European Patent Application Publication No. ЕР 125023, International Patent Application Publication No. WO 92/19759). С помощью этих известных методов можно получить химерное антитело, полезное в настоящем изобретении.

Например, плазмиды, которые содержат ДНК, кодирующую V-области L- и Н-цепи химерного антитела РМ-1, были названы рРМ-k3 и рРМ-h1, соответственно, и штаммы Е. coli, обладающие этими плазмидами, были депонированы для международного признания 12 февраля 19991 года по условиям Будапештского договора как NCIMB 40366 и NCIMB 40362, соответственно, Компанией Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, United Kingdom).

Гуманизированные антитела, которые относятся к человеческим антителам с измененной формой, представляют собой антитела, в которых гипервариабельный участок (CDR, complementarity determining region) млекопитающего, но не человека, например, мышиного антитела, трансплантируют в CDR участок антитела человека с помощью известеного, общепринятого метода рекомбинантных ДНК (см. European Patent Application Publication No. ЕР 125023, International Patent Application Publication No. WO 92/19759).

В частности, последовательность ДНК, которая была сконструирована для лигирования CDR мышиного антитела в каракасный участок (FR, framework region) антитела человека, синтезируется с помощью метода ПЦР с использованием олигонуклеотидов, имеющих на концах перекрывающиеся области. Полученную ДНК лигируют в ДНК, кодирующую С-область человеческого антитела, и затем включают в экспрессионный вектор, который вводят в клетки-хозяева для продукции гуманизированного антитела (см. European Patent Application Publication No. ЕР 239400, International Patent Application Publication No. WO 92/19759).

В качестве FR антитела человека, лигированного через CDR, выбирают те, в которых гипервариабельный участок образует хорошую область связывания антигена. При желании можно заменить аминокислоты в каркасном участке вариабельного участка антитела, так чтобы гипервариабельный участок человеческого антитела с измененной формой мог образовывать соответствующую область связывания антигена (Sato K. et al., Cancer Res., 53:851-856, 1993).

Для химерного антитела и гуманизированного антитела используют С-область человеческого антитела. С-область человеческого антитела включает Сγ, и, например, можно использовать Cγ1, Сγ2, Сγ3 и Сγ4. С-область человеческого антитела можно модифицировать для улучшения стабильности антитела или его продукции.

Химерное антитело включает вариабельную область антитела, происходящего из млекопитающего, отличного от человека, и С-область, происходящую из человеческого антитела. Гуманизированное антитело включает CDR участок антитела, происходящий из млекопитающего, отличного от человека, а также каркасный участок и С-область, происходящие из человеческого антитела. В соответствии с этим, они обладают низкой антигенностью в организме человека и, таким образом, полезны в качестве антител, применяемых в настоящем изобретении.

Предпочтительные характерные примеры гуманизированного антитела, применяемого в настоящем изобретении, включают гуманизированное антитело РМ-1 (см. International Patent Application Publication No. WO 92/19759).

Также, в дополнении к способам, описанным выше, для получения человеческого антитела известна технология получения человеческого антитела путем пэннинга с использованием библиотеки человеческих антител. Например, вариабельную область человеческого антитела можно экспрессировать на поверхности фага в виде одноцепочечного антитела (scFv) с помощью метода фагового дисплея (phage display), и из библиотеки можно отобрать фаги, которые связываются с антигеном. При генном анализе отобранного фага можно определить последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область человеческого антитела, которая связывается с антигеном. Если последовательность ДНК цепи scFv, которая связывает антиген, была обнаружена, то с помощью подходящего экспрессионного вектора можно сконструировать последовательность для получения человеческого антитела. Эти способы уже хорошо известны, и их можно найти в WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388.

Ген антител, сконструированный, как было описано выше, можно экспрессировать и получить с помощью известного метода. В случае клеток млекопитающих ген антитела можно экспрессировать с помощью ДНК, в которой эффективно соединены обычно используемый промотор, экспрессируемый ген антитела и сигнальная последовательность поли-А, расположенная на 3'-конце ДНК, или с помощью вектора, включающего их. Например, в качестве промотора/энхансера можно использовать немедленный ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека.

Кроме того, в качестве других промоторов/энхансеров, которые могут быть использованы для экспрессии антитела, применяемого в настоящем изобретении, можно использовать вирусные промоторы/энхансеры ретровируса, вируса полиомы, аденовируса и вируса 40 обезьян (SV40), а также промотор/энхансер, происходящий из гена фактора элонгации человека 1α (HEF1α) клеток млекопитающих.

Например, экспрессию можно проводить с помощью метода Mulligan et al. (Mulligan R. et al., Nature, 277:108-114, 1979) при использовании промотора/энхансера SV40 или с помощью метода Mizushima et al. (Mizushima S. and Nagata S., Nucleic Acids Res., 18:5322, 1990) при использовании промотора/энхансера гена HEF1α.

В случае Е.coli ген можно экспрессировать с помощью эффективного соединения обычно используемого промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и экспрессируемого гена антитела. Например, промоторы могут включать промоторы генов lacZ и araB. При использовании промоторов генов lacZ и araB можно применять метод Ward et al. (Ward E.S. et al., Nature, 341:544-546, 1989; Ward E.S. et al., FASEB J., 6:2422-2427, 1992) и метод Better et al. (Better M. et al., Science, 240:1041-1043, 1988), соответственно.

В качестве сигнальной последовательности для секреции антитела можно использовать сигнальную последовательность pe1B (Lei S.P. et al., J. Bacteriol., 169:4379-4383, 1987) в случае продуцирования белка в периплазме Е.coli. Антитело, продуцируемое в периплазме, выделяют и затем используют после подходящего изменения пространственной структуры антитела (см., например, WO 96/30394).

В качестве точек начала репликации (origin) можно использовать вирусные ориджины, полученные из SV40, вируса полиомы, аденовируса, вируса бычьей папилломы (BPV). Кроме того, для увеличения числа копий гена в системе клеток-хозяев, экспрессионный вектор может включать в качестве селективных маркеров ген аминогликозидфосфотрансферазы (АРН), ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы Е. coli (Ecogpt), ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) и т.п.

Для продуцирования антитела, применяемого в настоящем изобретении, можно использовать любую продуцирующую систему. Для получения антитела существуют системы продуцирования in vitro и in vivo. Система продуцирования in vitro включает продуцирующую систему, в которой используют эукариотические клетки, и продуцирующую систему, в которой используют прокариотические клетки.

При использовании эукариотических клеток существуют продуцирующие системы, в которых используют клетки животных, растительные клетки или клетки грибов. Клетки животных включают (1) клетки млекопитающих, такие как СНО, COS, клетки миеломы, ВНК (клетки из почки детенышей хомяка), HeLa, Vero и т.д. (2) клетки амфибий, такие как ооциты Xenopus или (3) клетки насекомых, такие как sf9, sf21, Tn5 и т.д.. Среди клеток растений известны, например, клетки, которые происходят из Nicotiana tabacum, и которые можно культивировать в виде каллуса (недифференцированная ткань растений, которую можно культивировать in vitro). Клетки грибов включают дрожжи, например, род Saccharomyces, в частности, Saccharomyces cerevisae, или нитевидные грибы, такие как род Aspergillus, в частности, Aspergillus niger.

Если используют прокариотические клетки, то существуют продуцирующие системы, в которых применяют бактериальные клетки. Бактериальные клетки включают Е.coli и Bacillus subtilis.

Антитело можно получить путем введения гена желаемого антитела в эти клетки с помощью их трансформации и культивирования трансформированных клеток in vitro. Культивирование проводят с помощью известных методов. Например, в качестве культуральной среды можно использовать DMEM, MEM, RPMI 1640 и IMDM, и вместе с ними можно использовать сывороточные добавки, такие как фетальная сыворотка теленка (FCS). Антитела можно получать in vivo с помощью переноса клеток, в которые был введен ген антитела, в брюшную полость животного.

С другой стороны, системы, продуцирующие in vivo, включают системы, в которых используют животных, и те, в которых используют клетки растений. При использовании клеток животных существуют продуцирующие системы, в которых применяют млекопитающих и насекомых.

В качестве млекопитающих могут быть использованы козы, свиньи, овцы, мыши, крупный рогатый скот и т.п. (Vicki Glaser, Spectrum Biotechnology Application, 1993). Также, в качестве насекомых может быть использован тутовый шелкопряд. При использовании растений можно применять, например, табак.

Гены антитела вводят в клетки этих животные или растения, и в организме таких животных или растениях продуцируются антитела, которые затем выделяют. Например, ген антитела получают в виде слитого гена путем вставки в середину гена, кодирующего белок, который наследственно продуцируется в молоко, например, в такой, как ген β-казеина козы. Фрагмент ДНК, содержащий слитый ген, в который был вставлен ген антитела, вводят с помощью инъекции в эмбрион козы, и эмбрион вводят в самку козы. Желаемое антитело получают из молока, производимого трансгенной козой, рожденной от козы, которой был подсажен эмбрион, или из молока потомства такой трансгенной козы. Чтобы увеличить количество молока, содержащего желаемое антитело, трансгенной козе можно давать подходящие гормоны (Ebert K.М. et al., Bio/Technology, 12:699-702, 1994).

Если используют тутовый шелкопряд, то его инфицируют бакуловирусом, в который вставили ген желаемого антитела, и желаемое антитело выделяют из жидкости, получаемой из тела шелкопряда (Maeda S. et al., Nature, 315:592-594, 1985). Кроме этого, если используют табак, то ген желаемого антитела вставляют в растительный экспрессионный вектор, например, в pMON 530, и этот вектор вводят в бактерию, такую как Agrobacterium tumefaciens. Табак, например, Nicotiana tabacum, инфицируют этими бактериями, и из листьев этого табака получают желаемое антитело (Julian K.С., Ma, et al., Eur. J. Immunol., 24:131-138, 1994).

Если антитело получают с помощью продуцирующей системы in vitro или in vivo, как описано выше, ДНК, кодирующую тяжелую цепь (Н-цепь) или легкую цепь (L-цепь) антитела можно по отдельности интегрировать в экспрессионные векторы, которыми можно одновременно трансформировать хозяина, или ДНК, кодирующую Н- и L-цепи можно включить в один и тот же экспрессионный вектор, которым можно трансформировать хозяина (см. International Patent Application Publication No. WO 94-11523).

Антитело, применяемое в настоящем изобретении, может быть фрагментами антитела или их модифицированными вариантами до тех пор, пока антитело можно адекватно использовать. Например, фрагменты антитела могут включать Fab, F(ab')², Fv или одноцепочечный Fv (scFv), в которых Fv фрагменты Н-цепи и L-цепи соединены с помощью подходящего линкера.

В частности, чтобы получить фрагменты антитела, антитело обрабатывают с помощью фермента, например, папаина, пепсина, или конструируют ген, кодирующий фрагмент антитела, и вставляют его в экспрессионный вектор, который экспрессируют в подходящих клетках-хозяевах (см., например, Со М.S. et al., J. Immunol., 152:2968-2976, 1994; Better M. and Horwitz A.N., Methods in Enzymology, 178:476-496, 1989; Plueckthun A. and Scerra A., Methods in Enzymology, 178:497-515, 1989; Lamoyi E., Methods in Enzymology, 121:652-663, 1989; Rousseaux J. et al., Methods in Enzymology, 121, 663-666, 1989; Bird R.E. et al., TIBTECH, 9:132-137, 1991).

Фрагмент scFv можно получить лигированием V-области Н-цепи и V-области L-цепи антитела. В этом scFv V-область Н-цепи и V-область L-цепи предпочтительно соединяют через линкер, предпочтительно это пептидный линкер (Huston J.S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988). V-область Н-цепи и V-область L-цепи в scFv могут происходить из любого из упомянутых выше антител. В качестве пептидного линкера для соединения V-областей может быть использован, например, определенный одноцепочечный пептид, включающий 12-19 аминокислотных остатков.

ДНК, кодирующую scFv, получают методом ПЦР с помощью амплификации участка ДНК, кодирующего желаемую аминокислотную последовательность, участка ДНК, кодирующего Н-цепь или V-область Н-цепи указанного выше антитела, которые используют в качестве матриц, применяя пару праймеров, определяющих оба их конца; затем на следующем этапе амплифицируют ДНК, кодирующую участок пептидного линкера, и оба конца указанной ДНК объединяют с парой праймеров, определяющих их соединение с Н-цепью и L-цепью, соответственно.

Кроме того, после конструирования молекул ДНК, кодирующих scFv, с помощью общепринятых методов можно получить экспрессионный вектор, содержащий эти ДНК, и хозяина, который трансформирован экспрессионным вектором, и в соответствии с общепринятыми методами, можно получить scFv, используя полученный трансформированный организм-хозяин.

Для этих фрагментов антитела можно получить их гены, экспрессировать и продуцировать их в организме-хозяине, как было отмечено выше. Применяемый в настоящем изобретении термин «антитело» также включает эти фрагменты антитела.

В качестве модифицированного антитела можно использовать антитело, связанное с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG). Применяемый в настоящем изобретении термин «антитело» также включает эти модификации антитела. Чтобы получить такие модификации антитела, полученное антитело химически модифицируют. Эти методы являются уже устоявшимися в этой области техники.

Произведенное и экспрессированное, как описано выше, антитело можно изолировать из внешних и внутренних компартментов клеток-хозяев и очистить до гомогенного состояния. Разделение и очистка антитела, применяемого в настоящем изобретении, могут быть выполнены с помощью аффинной хроматографии. Колонки, используемые для аффинной хроматографии, включают колонки с белком А и белком G. Носители, используемые в колонке с белком А, включают Hyper D, POROS, Сефарозу F и т.п. Без каких-либо ограничений могут быть использованы любые подходящие общепринятые методы разделения/очистки обычных белков.

Например, антитело, применяемое в настоящем изобретении, может быть выделено с помощью выбранной подходящим образом и комбинированной хроматографии, отличной от указанной выше аффинной хроматографии, с помощью фильтрации, ультрафильтрации, обессоливания, диализа и т.д. Примеры хроматографии включают Ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию и т.п. Эти разновидности хроматографии можно применять в формате ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Также можно использовать обращенно-фазовую ВЭЖХ.

Измерение концентрации антитела, полученного, как описано выше, можно проводить, измеряя оптическое поглощение или с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). То есть, при измерении оптического поглощения, антитело разводят подходящим образом с помощью PBS (-) и затем измеряют оптическое поглощение при 280 нм и рассчитывают концентрацию, принимая, что 1 мг/мл дает поглощение, равное 1,35 OD. При использовании метода ELISA измерение проводят следующим образом. Итак, 100 мкл козьих антител к иммуноглобулинам IgG человека (производство фирмы TAG), разведенных до концентрации 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонатном буфере (pH 9,6), вносят в 96-луночный планшет (производство фирмы NUNC) и инкубируют в течение ночи при 4°C для иммобилизации антител. После блокировки, вносят по 100 мкл каждого разведенного подходящим образом антитела, применяемого в настоящем изобретении, или образца, включающего антитело, или IgG человека (производство фирмы Cappel) в качестве стандарта и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.

После промывания вносят 100 мкл разведенных в 5000 раз антител к иммуноглобулинам IgG человека, меченных щелочной фосфатазой (производство фирмы Bio Source), и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания добавляют и инкубируют раствор субстрата, а затем, чтобы рассчитать концентрацию желаемого антитела, измеряют поглощение при 405 нм с помощью фотометра Microplate Reader Model 3550 (производство фирмы Bio-Rad).

Модифицированный IL-6, применяемый в настоящем изобретении, представляет собой вещества, которые обладают активностью связывания с рецептором IL-6 и которые не передают биологически активный сигнал IL-6. Модифицированный IL-6 не передает биологически активный сигнал IL-6 так как он конкурентно по отношению к IL-6 связывается с рецептором IL-6, блокируя, таким образом, передачу сигнала IL-6.

Модифицированный IL-6 конструируют путем получения вариантов IL-6 с помощью замены аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности IL-6. IL-6, являющийся источником модифицированного IL-6, может быть любого происхождения, но если принимать во внимание антигенность, то предпочтительно он должен быть человеческим IL-6.

В частности, модификацию IL-6 проводят, прогнозируя вторичную структуру аминокислотной последовательности IL-6 с использованием известной в этой области техники программы молекулярного моделирования аминокислотной последовательности, например, программы WHATIF (Vriend et al. J. Mol. Graphics, 8:52-56, 1990), оценивая затем влияние замены отдельных аминокислотных остатков в целом белке. После того, как был сделан выбор подходящих аминокислотных остатков для аминокислотной замены, получают ген, кодирующий модифицированный IL-6, получая его варианты с помощью обычно применяемого для этого метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), в котором аминокислоты замещают, используя в качестве матрицы вектор, включающий последовательность оснований, кодирующую человеческий ген IL-6. Модифицированный IL-6 можно получить, при необходимости, вставляя его в подходящий экспрессионный вектор в соответствии со способами экспрессии, продукции и очистки упомянутого выше рекомбинантного антитела.

Типичные примеры модифицированного IL-6 раскрыты в работе Brakenhoff et al., J. Biol. Chem., 269:86-93, 1994 и Savino et al., EMBO J., 13:1357-1367, 1994, WO 96/18648 и WO 96/17869.

Неполные пептиды IL-6 или неполные пептиды рецептора IL-6, применяемые в настоящем изобретении, обладают активностью связывания с рецептором IL-6 или с IL-6, соответственно, и представляют собой вещества, которые не передают биологическую активность IL-6. То есть, неполные пептиды IL-6 или неполные пептиды рецептора IL-6 специфически ингибируют связывание IL-6 с рецептором IL-6, присоединяясь к рецептору IL-6 или IL-6, соответственно, и фиксируя их. В результате, так как они не передают биологически активный сигнал IL-6, они блокируют передачу сигнала IL-6.

Неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 являются пептидами, включающими некоторую часть или полную аминокислотную последовательность, вовлеченную в связывание IL-6 с рецептором IL-6, в аминокислотной последовательности IL-6 или рецептора IL-6. Такой пептид обычно включает от 10 до 80, предпочтительно от 20 до 50, еще более предпочтительно от 20 до 40 аминокислотных остатков. Неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 могут быть сконструированы путем определения участка, вовлеченного в связывание с IL-6 или с рецептором IL-6 в аминокислотной последовательности IL-6 или рецептора IL-6, и с помощью синтеза некоторой части или всей аминокислотной последовательности общепринятыми методами, такими как генная инженерия или метод пептидного синтеза.

Чтобы получить неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 с помощью генной инженерии, последовательность ДНК, кодирующую желаемый пептид, вводят в экспрессионный вектор, используя способы экспрессии, продукции и очистки, упомянутые выше для рекомбинантного антитела.

Чтобы получить неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 с помощью пептидного синтеза, можно использовать методы, обычно применяемые в пептидном синтезе, например, твердофазный метод синтеза или жидкофазный метод синтеза.

В частности, можно проводить синтез в соответствии с методом, описанным в работе Zoku Iyakuhin, Kaihatsu, Vol. 14, Peptido Gousei, (Ed. Yajima, H., Hirokawa Shoten, 1991). В качестве твердофазного метода синтеза применяется, например, метод, в котором пептидную цепь наращивают путем присоединения аминокислоты, соответствующей С-концу синтезируемого пептида, к подложке, которая нерастворима в органических растворителях, и поочередно повторяют реакцию, в которой определенную аминокислоту последовательно конденсируют в направлении от С- к N-концам в аминокислотах, у которых α-аминогруппа и функциональные группы боковой цепи защищены с помощью подходящих защитных групп, и реакцию, в которой указанную защитную группу α-аминогруппы аминокислоты удаляют из аминокислот или пептида, присоединенных к подложке. Методы твердофазного пептидного синтеза в общих чертах классифицируются как Вос-метод и Fmoc-метод, в зависимости от типа применяемых защитных групп.

После синтеза желаемого пептида, проведенного таким способом, проводят реакцию снятия защиты и реакцию отщепления пептидной цепи от подложки. В реакции отщепления пептидной цепи от носителя в Вос-методе обычно используют фтористый водород или трифторметансульфонат, а в Fmoc-методе - трифторуксусную кислоту (TFA). В Вос-методе упомянутую выше подложку защищенного пептида обрабатывают фтористым водородом в присутствии анизола. Затем для получения пептида проводят удаление защитной группы и отщепление пептида от подложки. Для получения неочищенного препарата пептида его лиофилизируют. С другой стороны, в Fmoc-методе, например, в TFA, реакцию снятия защиты и реакцию отщепления пептида с подложки можно проводить с помощью процедуры, сходной с описанной выше.

Полученный неочищенный пептид можно выделить и очистить с помощью метода ВЭЖХ. Элюцию можно проводить в оптимальных условиях, используя систему растворителей вода-ацетонитрил, которую обычно используют для очистки белков. Фракции, соответствующие пикам профиля результирующей хроматографии, собирают и лиофилизируют. Очищенные таким образом пептидные фракции идентифицируют, анализируя молекулярную массу с помощью масс-спектроскопического анализа, анализа аминокислотного состава или анализа аминокислотной последовательности.

Типичные примеры неполных пептидов IL-6 и рецептора IL-6 раскрыты в JP-A-2-188600, 7-324097 и 8-311098, а также в патенте US 5210075.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать фармацевтически приемлемые носители или добавки, которые зависят от способа введения средства. Примеры таких носителей или добавок включают воду, фармацевтически приемлемые органические растворители, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивиниловый полимер, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, полиакрилат натрия, альгинат натрия, водорастворимый декстран, натриевую соль карбоксиметилированного крахмала, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, ксантановую камедь, гуммиарабик, казеин, желатин, агарозу, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, парафин, стеариновый спирт, стеариновую кислоту, человеческий сывороточный альбумин (HSA), маннит, сорбит, лактозу, фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества и т.п. В зависимости от композиции применяемые добавки выбирают из перечисленных выше соединений или их комбинаций, но ими не ограничиваются.

Примеры

Настоящее изобретение теперь будет детально описано ниже с помощью примеров и типичных примеров, но объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.

Пример 1

MRA представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело (подтипа IgG1) к рецептору интерлейкина-6 человека, которое ингибирует функцию цитокина интерлейкин-6 (IL-6). В ранних исследованиях в Японии и Европе MRA демонстрировал перспективы в лечении ревматоидного артрита и хорошо переносился пациентами.

Это было крупномасштабное клиническое испытание MRA II стадии для определения оптимальной дозы MRA, которое давали в одиночку или в комбинации с метотрексатом для лечения ревматоидного артрита. Потенциальная эффективность многократных внутривенных приемов MRA как при монотерапии, так и в комбинации с метотрексатом, оценивалась у пациентов с активным ревматоидным артритом, несмотря на лечение метотрексатом в течение определенного промежутка времени, и ее сравнивали с монотерапией метотрексатом. Оценивали эффективность, безопасность и переносимость MR А.

Методы

Субъекты. Регистрировали пациентов с ревматоидным артритом, который был диагносцирован на основании классификации заболеваний Американской коллегии ревматологии (ACR) 1987 года, и который продолжался, по меньшей мере, 6 месяцев. У пациентов должна была быть активная форма заболевания и неадекватный ответ или вспышка заболевания после приема только метотрексата (МТХ), который давали пациентам, по меньшей мере, в течение 6 месяцев в дозировке, по меньшей мере, 12,5 мг каждую неделю или 10 мг каждую неделю в случае непереносимости.

Модель изучения. Двойное слепое, рандомизированное исследование с параллельными группами с помощью центрального рандомизированного метода.

Дозировка и прием средства. Семь групп: 0 мг/кг MRA (плацебо, лекарственная форма, содержащая нейтральные вещества) + МТХ, 2 мг/кг MRA + МТХ, 4 мг/кг MRA + МТХ, 8 мг/кг MRA + МТХ, 2 мг/кг MRA + МТХ плацебо, 4 мг/кг MRA + МТХ плацебо и 8 мг/кг MRA + МТХ плацебо. Прием MRA или плацебо осуществляют с помощью внутривенного вливания с интервалами в 4 недели. Прием МТХ или МТХ плацебо осуществляют перорально, один раз в неделю в дозировке 10-25 мг/неделю.

Способ изучения. Назначенную дозу вводили с помощью внутривенного вливания за четыре раза с 4х-недельными интервалами, и эффективность и безопасность оценивали с 2х-недельными интервалами в течение 16 недель, и заключительное наблюдение проводили на 20 неделе. Основным критерием эффективности был уровень ACR 20 на 16 неделе (4 недели после последней дозы). Дополнительные критерии включали уровни ACR 50 и ACR 70, на 16 неделе (4 недели после последней дозы).

Критерии улучшения ACR. Случаи, когда в следующих 7 пунктах по числу опухших суставов и числу болезненных суставов происходит улучшение на 20% или более, и улучшение на 20% или более наблюдается в трех из оставшихся пяти пунктах, определяются как 20%-ный или более высокий процент улучшения по критериям ACR. Кроме этого, случаи 50%- и 70%-ного улучшения означают случаи, когда состояние более 20% частей тела пациента с улучшенными показателями улучшается на 50% и 70%, соответственно:

(1) число опухших суставов;

(2) число болезненных суставов;

(3) оценка боли пациентом;

(4) общая оценка активности болезни пациентом;

(5) общая оценка активности заболевания терапевтом;

(6) оценка физической функции пациентом;

(7) CRP или ESR.

Статистически значимый по сравнению с контрольной группой процент улучшения, более высокий, чем ACR 20, наблюдался во всех группах, за исключением группы, получавшей только MRA в количестве 2 мг/кг. В группе (MRA 8 мг/кг + МТХ) процент улучшения ACR 50 и 70 составлял 53,1% и 36,7%, соответственно, что было статистически более значимо по сравнению с контрольной группой, в которой эти показатели составляли 28,6% и 16,3%, соответственно (таблица 1).

Таблица 1   2 мг/кг MRA 4 мг/кг MRA 8 мг/кг MRA MTX ACR 20 30,8% 61,1% 62,7% 40,8% ACR 50 5,8% 27,8% 41,2% 26,6% ACR 70 1,9% 5,6% 15,7% 16,3%   2 мг/кг MRA + MTX 4 мг/кг MRA + MTX 8 мг/кг MRA + MTX   ACR 20 64,0% 63,3% 73,5%   ACR 50 32,0% 36,7% 53,1%   ACR 70 14,0% 12,2% 36,7%  

В группах, принимавших только MRA, статистически значимую зависимость от дозы наблюдали для ACR 20. Кроме того, для ACR 50 и ACR 70 статистически значимый дозо-зависимый ответ наблюдали как в группе, принимавшей только MRA, так и в МТХ-комбинированной группе.

Уменьшение числа опухших суставов (Таблица 2).

Усредненное количество опухших суставов на исходном уровне было одним и тем же среди всех групп, подвергнутых лечению.

Происходило накапливающееся уменьшение среднего количества опухших суставов при увеличении времени воздействия во всех семи группах, подвергнутых лечению. Среднее уменьшение количества опухших суставов в «MRA 8 мг/кг» группе было статистически значимым по сравнению с уменьшением в «МТХ» группе (р=0,010). На 16-ой неделе среднее различие (95% доверительный интервал (CI)) между «MRA 8 мг/кг» группой и «МТХ» группой составило - 2,31 (-4,07, -0,55). Обнаружена статистически значимая линейная зависимость от дозы между группами, подвергнутыми монотерапии MRA (р<0,001). Среднее уменьшение числа опухших суставов в «MRA 8 мг/кг + МТХ» группе было статистически значимым по сравнению с уменьшением в «МТХ» группе (р<0,001). Среднее различие (95% CI) между «MRA 8 мг/кг» группой и «МТХ» группой составило - 3,62 (-5,39, -1,84). Обнаружена статистически значимая линейная зависимость от дозы между группами, подвергнутыми монотерапии MRA (р=0,004).

Таблица 2   2 мг/кг MRA 4 мг/кг MRA 8 мг/кг MRA МТХ Исходный уровень: N
Среднее ± станд. откл. (SD) 52 54 51 49 11,6±4,6 11,1±4,4 12,2±5,2 12,7±4,2 Изменение от исходного уровня: 16 недель, N
Среднее ± SD 42 43 43 39 -4,5±5,7 -5,8±4,1 -8,4±4,6 -5,7±6,1   2 мг/кг MRA + МТХ 4 мг/кг MRA + МТХ 8 мг/кг MRA + МТХ   Исходный уровень: N
Среднее ± SD 50 49 49   11,9±4,3 11,9±3,9 11,8±3,9 Изменение от исходного уровня: 16 недель, N
Среднее ± SD 46 42 44   -6,2±4,6 -6,8±5,4 -9,4±4,0

Среди 359 зарегистрированных пациентов группы оценки безопасности, полного анализа и PPS (набор по протоколу) составили 359, 354 и 307 человек, соответственно. Всего было зарегистрировано 359 пациентов, 299 прошли полное исследование и 60 пациентов были исключены. Среди исключенных пациентов у 33 были неблагоприятные последствия, у одного возникло осложнение другого заболевания, 7 человек отказались от исследования из-за лекарств, запрещенных для одновременного использования, пять - из-за нежелания довести исследование до конца и 22 - из-за отсутствия эффективности (включая множественные причины).

Среди серьезных неблагоприятных случаев, причинные связи которых не были выяснены, было сообщено о пяти случаях инфекции. То есть, было сообщено об одном пациенте с абсцессом ступни и остеомиелитом в «2 мг/кг MRA» группе, об одном пациенте с инфекцией грудной клетки и плевритом, об одном пациенте с сепсисом в «8 мг/кг MRA + МТХ» группе и об одном пациенте с инфекцией сустава в «8 мг/кг MRA + МТХ» группе. Кроме того, было сообщено о пяти случаях гиперчувствительности как серьезном осложнении, причинная связь которой установлена не была, это четыре пациента с гиперчувствительностью в «2 мг/кг MRA» группе и один пациент с гиперчувствительностью в «4 мг/кг MRA» группе. Все эти случаи гиперчувствительности наблюдались при лечении без МТХ после 3-го и 4-го приема.

Что касается лабораторных данных исследования функций печени, то хотя в результате применения MRA и наблюдали повышение уровней ALT и AST, такое повышение было эквивалентно тем, которые наблюдались у других пациентов с ревматоидным артритом. В «MRA» группах наблюдали повышение показателей в результатах лабораторных исследований, имеющих отношение к липидам (общий холестерин, HDL-холестерин и триглицериды). Однако суммарных изменений в атерогенном индексе обнаружено не было.

У некоторых пациентов наблюдали небольшое временное снижение количества нейтрофилов. Наблюдаемые клинически значимые изменения параметров, характерные для активного заболевания, например, уменьшение CRP и ESR и повышение гемоглобина, происходили дозо-зависимым образом.

Реакция на вливание

Реакцию на вливание определяли как неблагоприятное воздействие, происходившее в течение 24 часов исследования после введения средства. Число пациентов, переживших реакцию на вливание, в каждой группе, подвергнутой лечению, позволило предположить существование возможной обратной зависимости от дозы для MRA.

Антитело к MRA

Исследовали появление антител к MRA. В группах 8 мг/кг (монотерапия или комбинированная терапия с МТХ) таких антител обнаружено не было. В группах 2 или 4 мг/кг число случаев было меньше в группах с комбинированной терапией с МТХ по сравнению с группами, подвергнутыми монотерапии MRA.

Результаты

При монотерапии MRA и комбинированной терапии MRA и метотрексатом наблюдали отчетливый дозо-зависимый ответ. Эффективность MRA для лечения пациентов с ревматоидным артритом была подтверждена как для монотерапии MRA, так и для комбинированной терапии MRA и метотрексатом. Также безопасность использования MRA была подтверждена как для монотерапии MRA, так и для комбинированной терапии MRA и метотрексатом.

Типичный пример 1. Получение растворимого рецетора IL-6 человека

Растворимый рецептор IL-6 получали с помощью метода ПЦР с использованием плазмиды pBSF2R.236, содержащей кДНК, которая кодирует рецептор IL-6, и полученной согласно методу Yamasaki et al. (Yamasaki K. et al., Science, 241:825-828, 1988). Плазмиду pBSF2R.236 расщепляли с помощью рестриктазы SphI, чтобы получить кДНК для рецептора IL-6, которую затем вставили в вектор шр18 (производство фирмы Amersham). Используя синтетические олигонуклеотидные праймеры, сконструированные для ввода стоп-кодона в кДНК рецептора IL-6, с помощью метода ПЦР с использованием «in vitro Mutagenesis System» (производство фирмы Amersham) вводили варианты в кДНК рецептора IL-6. В результате этой процедуры произошел ввод стоп-кодона в 345-ое положение аминокислотной цепи, что привело к получению кДНК, кодирующей растворимый рецептор IL-6.

Для того чтобы экспрессировать кДНК в клетках СНО, кДНК растворимого рецептора IL-6 лигировали в плазмиду pSV (производство фирмы Pharmacia), чтобы получить плазмиду pSVL344. кДНК растворимого рецептора IL-6, расщепленную с помощью рестриктаз Hindlll и Sail, вставляли в плазмиду pECEdhfr, содержащую кДНК dhfr, чтобы получить экспрессионную плазмиду pECEdhfr344 для клеток СНО.

С помощью метода осаждения фосфатом кальция (Chen С. et al., Mol. Cell. Biol., 7:2745-2751, 1987) 10 мкг плазмиды pECEdhfr344 трансфецировали в dhfr-CHO-линию клеток DXB-11 (Urlaub G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220, 1980). Трансфецированные СНО-клетки выращивали в течение 3 недель в селекционной среде α-МЕМ, не содержавшей нуклеозиды и содержавшей 1 мМ глутамина, 10%-ный диализованный FCS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

Селекцию СНО-клеток проводили с помощью метода предельного разведения, чтобы получить клон от единственной СНО-клетки. Клеточный клон СНО был размножен в среде, содержащей от 20 нМ до 200 нМ метотрексата (МТХ), для получения линии СНО-клеток 5Е27, которая продуцирует человеческий растворимый рецептор IL-6. Линию СНО-клеток 5Е27 культивировали в среде Дульбекко в модификации Искова (IMDM, произведено фирмой Gibco), содержащей 5%-ный FBS. Супернатант культуры клеток собирали и опреднляли с помощью метода ELISA концентрацию растворимого рецептора IL-6 в супернатанте клеточной культуры. Результаты подтвердили, что в супернатанте клеточной культуры присутствует растворимый рецептор IL-6.

Типичный пример 2. Получение антитела к человеческому IL-6

Мыши BALB/c были иммунизированы 10 мкг рекомбинантного IL-6 (Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988) совместно с полным адъювантом Фрейнда, и иммунизацию повторяли каждую неделю до тех пор, пока в сыворотке не были обнаружены антитела к IL-6. Иммунные клетки извлекали из локальных лимфатических узлов и затем их сливали с линией клеток миеломы P3U1, используя для этого полиэтиленгликоль 1500. Гибридомы отбирали согласно методу Oi et al. (Selective Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980), в котором используют среду HAT, и убеждались в получении гибридомы, которая продуцирует антитела к IL-6 человека.

Для гибридомы, продуцирующей антитела к IL-6 человека, проводили измерение связывания IL-6, как описано ниже. Итак, 96-луночный микротитровальный планшет, сделанный из гибкого поливинила (производство фирмы Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA), сенсибилизировали 100 мкл козьих антител к иммуноглобулинам IgG мыши (10 мкл/мл, производство фирмы Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) в 0,1 M карбонат-гидрокарбонатном буфере (pH 9,6) при 4°C в течение ночи. Затем планшет обрабатывали 100 мкл PBS, содержащим 1%-ный бычий сывороточный альбумин (BSA) в течение 2 часов при комнатной температуре.

Планшет промывали PBS-буфером, в каждую лунку вносили по 100 мкл супернатанта гибридомной культуры, и инкубировали при 4°C в течение ночи. Планшет промывали, в каждую лунку вносили ¹²⁵I-меченый рекомбинантный IL-6 до концентрации 2000 имп. в мин/0,5 нг/лунку, планшет промывали и затем с помощью гамма-счетчика (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA) измеряли радиоактивность в каждой лунке. В результате из 216 клонов гибридомы 32 клона были позитивными при измерении связывания IL-6. Из этих клонов в конечном итоге был получен стабильный клон MH166.BSF2. Антитела к IL-6 МН166, продуцируемые гибридомой, относились к субтипу IgG1κ.

Затем изучали активность антитела МН166 по нейтрализации роста клеток гибридомы, используя IL-6-зависимый клон MH166.BSF2 мышиной гибридомы. Клетки MH166.BSF2 вносили в количестве 1×10⁴/200 мкл/лунка, туда же вносили образец, содержащий антитела МН166, затем инкубировали в течение 48 часов и добавляли 0,5 мкКи/лунку Н-тимидина (New England Nuclear, Boston, MA). После дополнительного роста в течение следующих 6 часов клетки помещали на фильтр из стекловолокна и обрабатывали его с помощью автоматического устройства «Харвестер» (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan). В качестве контроля использовали кроличьи антитела к IL-6.

В результате антитела МН166 ингибировали дозо-зависимым способом включение ³Н-тимидина в клетки MH60.BSF2, индуцированные IL-6. Это показало, что антитела МН166 нейтрализует активность IL-6.

Типичный пример 3. Получение антитела к человеческому рецептору IL-6

Для очистки специфичного к рецептору IL-6 антитела МТ18, полученного по методу Hirata et al. (Hirata Y. et al. J. Immunol., 143:2900-2906, 1989), оно было присоединено к CNBr-активированой Сефарозе 4В (производство фирмы Pharmacia Fine Chemicals, Piskataway, NJ) в соответствии с прилагаемым протоколом (Yamasaki K. et al., Science, 241:825-828, 1988). Линия клеток человеческой миеломы U266 была солюбилизирована в 1 мМ растворе пара-аминофенилметансульфонилфторидгидрохлорида (производство фирмы Wako Chemicals), растворенном в 1%-ном дититонине, 10 мМ этаноламине (рН 7,8) и 1,5 М NaCl (дигитониновый буфер), и смешана с антителом МТ18, присоединенным к шарикам Сефарозы 4В. Затем шарики промывали шесть раз дигитониновым буфером и предоставляли их как частично очищенный препарат рецептора IL-6 для иммунизации.

Мыши BALB/c были иммунизированы четыре раза через каждые десять дней указанным выше частично очищенным рецептором IL-6, полученным из 3×10⁹ клеток U266, и затем с помощью стандартного метода получали гибридомы. Супернатанты гибридомной культуры из лунок с положительным ростом анализировали на активность связывания с рецептором IL-6 в соответствии со способом, описанным ниже. 5×10⁷ клеток U266 были помечены ³⁵S-метионином (2,5 мКи) и были солюбилизированы в указанном выше дигитониновом буфере. Солюбилизированные клетки U266 были смешаны с 0,04 мл объема антитела МТ18, присоединенного к шарикам сефарозы 4В, и затем были промыты шесть раз дигитониновым буфером, затем ³⁵S-метионин-меченый рецептор IL-6 элюировали 0,25 мл дигитонинового буфера (pH 3,4) и нейтрализовали 0,025 мл 1 М триса (pH 7,4).

Супернатант культуры клеток гибридомы (0,05 мл) смешивали с 0,01 мл Белок G-Сефарозы (производство фирмы Pharmacia). После промывания Сефарозу инкубировали с 0,005 мл раствора ³⁵S-метионин-меченного рецептора IL-6, полученного, как было описано выше. Иммунопреципитат анализировали с помощью ПААГ-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), и исследовали супернатанты культуры клеток гибридомы, которые реагировали с рецептором IL-6. В результате был выявлен реакционно-позитивный клон гибридомы РМ-1 (FERM ВР-2998). Антитело, продуцируемое гибридомой РМ-1, относится к подтипу IgG1κ.

С помощью линии клеток человеческой миеломы U266 изучали ингибирующую активность антитела, продуцируемого гибридомой РМ-1, нацеленную на процесс связывания IL-6 с рецептором IL-6 человека. Человеческий рекомбинантный IL-6 был получен из Е.coli (Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41-45, 1988) и помечен ¹²⁵I (Taga Т. et al., J. Exp. Med., 166:967-981, 1987) с использованием реагента Болтона-Хантера (New England Nuclear, Boston, MA).

Клетки U266 в количестве 4×10⁵ выращивали в 70% (v/v) супернатанте культуры клеток гибридомы РМ-1 и в присутствии IL-6, меченного ¹²⁵I (14000 имп. в мин). Образец (70 мкл) наслаивали на 300 мкл FCS в микроцентрифужной полиэтиленовой пробирке объемом 400 мкл и центрифугировали с последующим измерением радиоактивности клеток.

В результате было показано, что антитело, продуцируемое гибридомой РМ-1, ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6.

Типичный пример 4. Получение мышиного антитела к рецептору IL-6

Моноклональное антитело, направленное против мышиного рецептора IL-6, было получено по методу, описанному в работе Saito et al., J. Immunol., 147:168-173, 1991.

Клетки CHO, которые продуцируют растворимый мышиный рецептор IL-6, выращивали в культуральной среде IMDM, содержащей 10%-ный FCS, и растворимый мышиный рецептор IL-6 очищали из супернатанта культуры клеток с помощью аффинной колонки, в которой антитела RS12 (см. Saito et al., J. Immunol., 147:168-173, 1991) к мышиному рецептору IL-6 были пришиты к гелю Affigel 10 (производство фирмы Biorad).

Полученный таким образом растворимый мышиный рецептор IL-6 (50 мкг) смешивали с полным адъювантом Фрейнда, который вводили с помощью инъекции в брюшную полость крыс Wistar. Спустя две недели животным проводили дополнительную иммунизацию неполным адъювантом Фрейнда. На 45 день отбирали клетки селезенки крысы, и 2×10⁸ клеток сливали с 1×10⁷ клеток мышиной миеломы РЗШ в соответствии с традиционным методом, используя 50%-ный PEG 1500 (производство фирмы Boehringer Mannheim) с последующим скринингом гибридом в культуральной среде HAT.

Супернатанты культуры клеток гибридомы вносили в лунки планшета, покрытые кроличьим антителом к иммуноглобулинам IgG крысы (производство фирмы Cappel), где мышиный растворимый рецептор IL-6 вступал в реакцию. Затем, используя кроличьи антитела к мышиному рецептору IL-6 и бараньи антитела к кроличьим иммуноглобулинам IgG, меченные щелочной фосфатазой, с помощью метода ELISA отбирали гибридомы, продуцирующие антитела к растворимому мышиному рецептору IL-6. Клон гибридомы, для которого была показана способность продуцировать такое антитело, дважды субклонировали и получили единичный клон гибридомы. Этот клон был назван MR16-1.

Нейтрализующую активность антитела, продуцированного этой гибридомой, направленную на процесс передачи сигнала от IL-6 мыши, изучали с помощью включения ³Н-тимидина с использованием клеток MH60.BSF2 (Matsuda Т. et al., J. Immunol., 18:951-956, 1988). Клетки MH60.BSF2 помещали в 96-луночный планшет из расчета 1×10⁴ клеток/200 мкл/лунка. В планшет вносили 10 иг/мл мышиного IL-6 и антитела MR16-1 или антитела RS12 в количестве от 12,3 до 1000 нг/мл, затем клетки выращивали при температуре 37°C в течении 44 часов при 5%-ном содержании СО₂, и затем к ним добавляли 1 мкКи/лунка ³Н-тимидина. Спустя 4 часа измеряли включение ³Н-тимидина. В результате было обнаружено, что антитело MR16-1 подавляло включение ³Н-тимидина в клетки MH60.BSF2.

Таким образом, было показано, что антитело, продуцируемое гибридомой MR16-1 (FERM ВР-5875), ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой терапевтическое средство для лечения ревматоидного артрита для приема в дозе 4 мг/кг/за 4 недели и более или в дозе, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R), включающее антитело к рецептору интерлейкина-6 (антитело к IL-6R). Изобретение обеспечивает одновременное усиление терапевтического воздействия на ревматоидный артрит и уменьшение гиперчувствительности. 6 н. и 40 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

1. Терапевтическое средство для лечения ревматоидного артрита для приема в дозе 4 мг/кг/за 4 недели и более или в дозе, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R), включающее антитело к рецептору интерлейкина-6 (антитело к IL-6R).

2. Терапевтическое средство по п.1, в котором антитело IL-6R является моноклональным антителом к IL-6R.

3. Терапевтическое средство по п.2, в котором антитело к IL-6R является моноклональным антителом к IL-6R человека.

4. Терапевтическое средство по п.2, в котором антитело к IL-6R является моноклональным антителом к IL-6R мыши.

5. Терапевтическое средство по любому из пп.2-4, в котором антитело к IL-6R является рекомбинантным антителом.

6. Терапевтическое средство по п.3, в котором моноклональное антитело к IL-6R человека является антителом РМ-1.

7. Терапевтическое средство по п.4, в котором моноклональное антитело к IL-6R мыши является антителом MR16-1.

8. Терапевтическое средство по любому из пп.1-4, 6 или 7, в котором антитело к IL-6R является химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом к IL-6R человеческого типа.

9. Терапевтическое средство по п.8, в котором гуманизированное антитело к IL-6R является гуманизированным антителом РМ-1.

10. Терапевтическое средство по п.1, в котором дозировка антитела к IL-6R составляет от 6 до 16 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

11. Терапевтическое средство по п.10, в котором дозировка антитела к IL-6R составляет от 6 до 10 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

12. Фармацевтическая композиция, включающая антитело к рецептору интерлейкина-6 (антитело к IL-6R) в дозировке 4 мг/кг/за 4 недели и выше или дозировке, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитело к IL-6R) для ослабления или предупреждения аллергических реакций при лечении ревматоидного артрита.

13. Фармацевтическая композиция по п.12, в которой антитело IL-6R является моноклональным антителом к IL-6R.

14. Фармацевтическая композиция по п.13, в которой антитело к IL-6R является моноклональным антителом к IL-6R человека.

15. Фармацевтическая композиция по п.13, в которой антитело к IL-6R является моноклональным антителом к IL-6R мыши.

16. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-15, в которой антитело к IL-6R является рекомбинантным антителом.

17. Фармацевтическая композиция по п.14, в которой моноклональное антитело к IL-6R человека является антителом РМ-1.

18. Фармацевтическая композиция по п.15, в которой моноклональное антитело к IL-6R мыши является антителом MR16-1.

19. Фармацевтическая композиция по любому из пп.12-15, 17 или 18, в которой антитело к IL-6R является химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом к IL-6R человеческого типа.

20. Фармацевтическая композиция по п.19, в которой гуманизированное антитело к IL-6R является гуманизированным антителом РМ-1.

21. Фармацевтическая композиция по п.12, в которой дозировка антитела к IL-6R составляет от 6 до 16 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

22. Фармацевтическая композиция по п.21, в которой дозировка антитела к IL-6R составляет от 6 до 10 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

23. Применение антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R) для производства терапевтического средства при ревматоидном артрите для приема в дозе 4 мг/кг/за 4 недели и более или в дозе, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R), включающее антитело к рецептору интерлейкина-6 (антитело к IL-6R).

24. Применение антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R) для производства фармацевтической композиции, включающей антитело к рецептору интерлейкина-6 (антитело к IL-6R) в дозе 4 мг/кг/за 4 недели и более или в дозе, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R), для ослабления или предупреждения аллергических реакций при лечении ревматоидного артрита.

25. Применение по любому из пп.23 и 24, при котором антитело IL-6R является моноклональным антителом к IL-6R.

26. Применение по п.25, при котором антитело к IL-6R является моноклональным антителом к человеческому IL-6R.

27. Применение по п.25, при котором антитело к IL-6R является моноклональным антителом к мышиному IL-6R.

28. Применение по любому из пп.23 и 24, при котором антитело к IL-6R является рекомбинантным антителом.

29. Применение по п.26, при котором моноклональное антитело к человеческому IL-6R является антителом РМ-1.

30. Применение по п.27, при котором моноклональное антитело к мышиному рецептору IL-6 является антителом MR16-1.

31. Применение по любому из пп.23 и 24, при котором антитело к IL-6R является химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом к IL-6R человеческого типа.

32. Применение по п.31, при котором гуманизированное антитело к IL-6R является гуманизированным антителом РМ-1.

33. Применение по любому из пп.23 и 24, при котором дозировка антитела к IL-6R составляет от 6 до 16 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

34. Применение по п.33, при котором дозировка антитела к IL-6R составляет от 6 до 10 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

35. Способ, включающий введение антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R) в дозе 4 мг/кг/за 4 недели и более или в дозе, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R) пациенту, нуждающемуся в таком лечении, как способ лечения ревматоидного артрита путем введения антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R) в дозе 4 мг/кг/за 4 недели и более или в дозе, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R).

36. Способ для ослабления или предупреждения аллергической реакции при лечении ревматоидного артрита, включающий введение дозы 4 мг/кг/за 4 недели и более или дозы, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R), антитела к рецептору интерлейкина-6 (антитела к IL-6R) пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

37. Способ по любому из пп.35 и 36, в котором антитело к IL-6R является моноклональным антителом к IL-6R.

38. Способ по п.37, в котором антитело к IL-6R является моноклональным антителом к человеческому IL-6R.

39. Способ по п.37, в котором антитело к IL-6R является моноклональным антителом к мышиному IL-6R.

40. Способ по любому из пп.35 и 36, в котором антитело к IL-6R является рекомбинантным антителом.

41. Способ по п.38, в котором моноклональное антитело к человеческому IL-6R является антителом РМ-1.

42. Способ по п.39, в котором моноклональное антитело к мышиному IL-6R является антителом MR 16-1.

43. Способ по любому из пп.35 и 36, в котором антитело к IL-6R является химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом к IL-6R человеческого типа.

44. Способ по п.43, в котором гуманизированное антитело к IL-6R является гуманизированным антителом РМ-1.

45. Способ по любому из пп.35 и 36, в котором дозировка антитела к IL-6R составляет от 6 до 16 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

46. Способ по п.45, в котором дозировка антитела к IL-6R составляет от 6 до 10 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.