СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВАГИНИТОВ У БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН ПО УРОВНЮ ЭКСПРЕССИИ МРНК ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ ВО ВЛАГАЛИЩНЫХ МАЗКАХ Российский патент 2014 года по МПК C12Q1/68 G01N33/50 

1. Область техники

Изобретение относится к области медицины, акушерства, гинекологии, иммунологии и молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики вагинитов у беременных женщин.

2.Уровень техники

Вагинит - воспаление слизистой оболочки влагалища, является одной из наиболее частых причин обращения женщин для консультации к врачу акушеру-гинекологу. У беременных женщин данное заболевание может приводить к преждевременным родам, инфицированию плода и новорожденного, а также развитию послеродовых инфекционно-воспалительных осложнений [Donati L et al]. Заболевание может быть связано как с наличием абсолютных патогенов: Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis и Chlamydia trachomatis (специфические вагиниты), так и условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), таких как грибы, стрептококки, стафилококки, кишечная палочка, а также облигатных анаэробов [Серов В.Н., Eckert L.O., Owen M.K.]. Поэтому диагностика инфекционных агентов при вагинитах остается актуальной, что позволяет выявить этиологический агент заболевания и подобрать соответствующую терапию. Вместе с тем в 30% случаев этиологический агент заболевания остается неустановленным [Anderson M.R.].

Диагноз вагинит, установленный на основании клинической картины (наличие воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища и шейки матки, наличие хотя бы одной из следующих жалоб: обильные выделения из половых путей, зуд, жжение во влагалище, диспареуния, дизурические расстройства), должен быть подтвержден лабораторными методами исследования. На сегодняшний день главным методом лабораторной диагностики вагинитов является микроскопия окрашенного мазка, при которой оценивается количество лейкоцитов в вагинальных соскобах и представленность эпителия. Обнаружение более 10 лейкоцитов в поле зрения у небеременных и более 20 у беременных женщин является признаком воспаления. Результаты данного теста являются субъективными, зависят от квалификации исполнителя и особенностей взятия биоматериала для исследования. Поэтому поиск альтернативных способов лабораторной диагностики вагинитов, основанный на объективных критериях, остается актуальной задачей.

Известно, что персистирование патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на слизистой влагалища приводит к стимуляции клеток иммунной системы, что проявляется в изменении профиля цитокинов, экспрессируемых клетками. Цитокины являются медиаторами сложных взаимодействий между клетками иммунной системы хозяина и принимают участие в активации иммунитета, направленного на уничтожение чужеродных микроорганизмов. По данным литературы, при взаимодействии высококонсервативных структур микроорганизмов с паттерн-распознающими рецепторами, прежде всего толл-подобными рецепторами ТЛР-2, ТЛР-4 на поверхности макрофагов, дендритных и других клетках врожденного иммунитета, происходит активация синтеза ряда провоспалительных цитокинов (ФНО-а, IL1B, IL6, IL8, IL12) [Долгушина В.Ф., Medzhitov R.]. Помимо этого дендритные клетки активируют нативные Т-лимфоциты и способствуют их дифференцировке в эффекторные либо регуляторные Т-клетки, являющиеся частью адаптивного иммунитета. При Т-клеточном ответе синтезируются растворимые медиаторы, включая провоспалительные, противовоспалительные и регуляторные цитокины (IL10, ТГФ-в, IL18 и др.), и другие иммуномодуляторы [Gene M.R.]. Таким образом, по профилю экспрессии генов цитокинов можно объективно оценить степень выраженности локальной воспалительной реакции.

Предложенный метод является объективным способом выявления локальной воспалительной реакции, необходимой для верификации диагноза. К преимуществам предложенного способа диагностики вагинитов с помощью определения экспрессии мРНК цитокинов можно отнести возможность одновременного исследования полученного биоматериала на наличие абсолютно и условно-патогенных микрооганизмов с помощью метода полимеразной цепной реакции, который все чаще применяется для установления этиологического агента заболевания. Предложенный метод может быть полностью автоматизирован.

Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок на использование измерения уровня мРНК цитокинов во влагалищных мазках для диагностики вагинитов вообще и в частности у беременных женщин не известно.

З.Описание изобретения

Предложен способ диагностики вагинитов путем оценки уровня мРНК определенных генов в клетках вагинальных соскобов.

В частности, предложен способ диагностики вагинитов у беременных женщин путем оценки уровня представленности мРНК генов IL1B, IL8, IL10 и IL18 по сравнению с уровнем представленности референсных генов.

В клетках влагалищных соскобов беременных женщин с вагинитами грибковой, бактериальной и смешанной грибково-бактериальной этиологии по сравнению с контрольной группой существенно возрастает относительное количество мРНК IL1B, IL8, IL10 и снижается относительное количество IL18 при нормировке по уровню мРНК стабильно представленных транскриптов референсных генов (В2М, GUS, ТВР или HPRT) (Рисунок 1).

Уровень представленности мРНК генов цитокинов при вагинитах у беременных женщин может служить как самостоятельным, так и дополнительно исследуемым параметром при диагностике заболевания.

Для оценки уровня представленности мРНК исследуемых генов в мазках используются методы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, в том числе метод полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени» (РВ-ПЦР).

На основании экспериментальных данных при сравнении женщин с неспецифическими вагинитами грибковой, бактериальной и смешанной грибково-бактериальной этиологии и условно здоровых женщин без признаков воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы были получены и проанализированы результаты с применением методов математической статистики (дискриминантный анализ), построена математическая модель, позволяющая вычислить значение канонической линейной дискриминантной функции для каждого клинического образца.

Уравнение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ):

Y=1,09*IL1B-0,61*IL8+0,21*IL10-0,11*IL18-0,91 (формула 1),

где IL1B - относительный уровень экспрессии IL1B,

IL8 - относительный уровень экспрессии IL8,

IL10 - относительный уровень экспрессии IL10,

IL18 - относительный уровень экспрессии IL 18,

IL=2^(Cpmin-Cpil)/NF (формула 2),

Где IL - относительный уровень экспрессии гена интерлейкина,

Cpmm - коэффициент минимального значения уровня экспрессии, для

IL1B Cpmin=17,9,

IL8 Cpmin=16,6,

IL10 Cpmin=28,8,

IL18 Cpmin=23,3,

Cpil - значение порогового цикла соответствующего IL в образце, определяемого автоматически,

NF - фактор нормировки, вычисляется по формуле 3:

$$\text{NF}{=}^{\text{4}}\sqrt{\text{NFgus*NFhprt*NFb2m*NFtbp}}$$ (формула 3),

где NF - фактор нормировки, вычисляемый как среднее геометрическое 4 факторов нормировки для референсных генов (см. формулу 4),

NFref=2^(Cpmin-Cpref) (формула 4),

где NFref - фактор нормировки для референсного гена,

Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии референсного гена,

Cpref - показания прибора порогового значения в образце.

Значения Cpmin для референсных генов следующие:

GUS Cpmin=26,5,

HPRTCpmin=26,8,

B2MCpmin=18,9,

ТВР Cpmin=28,4.

Для определения возможности диагностики вагинитов с использованием КЛДФ был выполнен ROC-анализ. Площадь под ROC-кривой составила AUC=0,995 (0,977-1,000, р<0,05). Данное значение согласно экспертной шкале позволило оценить предложенную модель как отличную.

В качестве порогового значения (точка cut-off) выбрано значение, соответствующее максимальной сумме чувствительности и специфичности предложенной модели. Пороговое значение КЛДФ составило 0,1. Чувствительность и специфичность предложенной модели в области порогового значения составила 95,8% и 100% соответственно. Значения показателей КЛДФ выше cut-off классифицировались как маркер вагинитов.

4. Реализация изобретения

Взятие клинического материала (соскобы заднебоковых стенок влагалища) осуществляют в пробирки с транспортной средой, содержащей раствор гуанидинтиоционата в целях избежания деградации РНК. Хранят материал при комнатной температуре в течение суток, при -20°С - в течение 6 месяцев.

Выделение РНК проводят методом фенольной экстракции или аналогичным. Полученные препараты РНК желательно сразу использовать для постановки реакции обратной транскрипции.

Для определения уровня представленности мРНК исследуемых генов используют метод ПЦР «в реальном времени» в стандартных условиях с праймерами, специфичными к последовательности определяемых РНК. Для исключения коамплификации геномной ДНК желательно расположить праймеры на стыках экзонов. Проявку накопления продуктов реакции можно вести с использованием флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов (зондов). Нормированные значения, соответствующие уровню представленности транскриптов каждого гена, можно рассчитывать с помощью метода ΔΔCq или аналогичного.

Полученные автоматически в ходе реакции значения пороговых циклов генов интерлейкинов (Ср) позволяют определить относительный уровень экспрессии соответствующего гена (формула 2). На основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) (формула 1). Если значение КЛДФ≤0.1, делается заключение об отсутствии вагинита. Значения КЛДФ>0.1 соответствуют вагиниту.

Примеры использования изобретения.

Пример №1. Вульвовагинальный кандидоз у беременных женщин более чем в 40% случаев протекает без жалоб и выраженных клинических проявлений в форме вагинитов, так называемое кандидоносительство [Jensen J.S.]. С помощью предложенного метода обследованы 20 беременных женщин, у которых во влагалище обнаружены грибы рода кандида методом ПЦР. Предлагаемый способ диагностики позволяет провести дифференциальную диагностику кандидоносительства (№№63, 81, 93, 95, 99, 102, 103, 121, 127, 130, 134) и кандидозного вагинита (№№65, 80, 88, 104, 110, 133, 136, 146, 148).

№образца Нормированный уровень экспрессии Значение КЛДФ IL1B IL8 IL10 IL18 Заключение: кандидоносительство 63 0,20 0,07 1,74 4,92 -0,91 81 0,57 0,20 0,55 6,92 -1,06 93 0,50 0,11 0,29 9,51 -1,42 95 0,26 0,11 1,68 2,00 -0,56 99 0,21 0,06 1,54 4,66 -0,91 102 0,04 0,02 1,08 8,94 -1,64 103 0,34 0,08 0,86 6,63 -1,14 121 0,04 0,02 0,86 4,23 -1,16 127 0,70 0,11 2,06 3,97 -0,22 130 0,26 0,09 1,21 10,06 -1,53 134 1,68 1,62 2,22 8,88 -,58 Заключение: кандидозный вагинит 65 4,11 0,45 0,86 0,90 3,38 80 1,84 0,27 3,43 3,56 1,26 88 0,14 0,08 7,16 0,59 0,64 104 2,73 0,31 2,22 2,14 2,11 110 1,62 0,41 20,39 2,07 4,67 133 0,44 0,15 13,93 0,87 2,30 136 0,53 0,28 11,55 0,72 1,84 146 2,87 0,77 2,58 3,41 1,91 148 3,76 1,24 5,90 2,39 3,41

Пример №2. Дисбиотические процессы во влагалище, обусловленные факультативно-анаэробной флорой (стрептококки, стафилококки, энтеробактерии) и облигатно-анаэробной флорой (ассоциированной с бактериальным вагинозом), характеризуются разнообразием клинических проявлений: от бессимптомного носительства, до клинически выраженных признаков воспаления [Anderson M.R.].

С помощью предложенного метода обследовано 11 беременных женщин с дисбиотическими процессами во влагалище. Предлагаемый способ позволяет провести дифференциальную диагностику дисбиозов без выраженной воспалительной реакции со стороны слизистой (№№ 53, 67, 82, 96, 107) и дисбиозов, сопровождающихся вагинитом (№№ 71, 72, 77, 90, 122, 124).

№образца Нормированный уровень экспрессии Значение КЛДФ IL1B IL8 IL10 IL18 Заключение: дисбиозы без признаков воспаления 53 0,35 0,11 0,26 2,25 -0,79 67 3,05 9,38 1,40 1,82 -3,21 82 0,09 0,11 0,76 5,50 -1,33 96 1,15 0,84 0,64 5,86 -0,68 107 1,30 0,95 1,50 8,75 -0,72 Заключение: дисбиозы, сопровождающиеся вагинитом 71 2,25 0,88 1,88 1,43 1,24 72 4,23 2,33 0,72 3,43 2,05 77 2,85 0,10 7,21 0,14 3,64 90 3,76 2,31 1,58 6,54 1,39 122 9,71 1,38 5,90 0,10 10,07 124 2,85 0,63 2,19 0,14 2,26

Пример №3. С помощью предложенного метода обследовано 8 беременных женщин с вагинитом неясной этиологии (№№ 59, 125, 142, 144, 145, 147, 163, 164).

№образца Нормированный уровень экспрессии Значение
КЛДФ IL1B IL8 IL10 IL18 59 2,71 1,51 0,90 3,46 0,94 125 7,89 5,21 2,99 8,17 4,24 142 0,91 0,29 2,25 2,17 0,14 144 2,57 0,88 0,74 4,17 1,05 145 5,28 1,04 1,80 1,23 4,45 147 3,20 0,95 2,04 0,67 2,36 163 4,00 2,55 4,60 1,52 2,69 164 4,23 2,35 3,95 1,78 2,90

Заключения, сделанные на основании предложенного метода, подтверждены клиническими данными, результатами бактериальных посевов и ПЦР-анализа, а также результатами микроскопии окрашенных по Граму влагалищных мазков. При проведении ПЦР-анализа использованы следующие тест-системы:

- набор реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени (ФЕМОФЛОР) (регистрационное удостоверение № ФСР2009/04663 от 26 апреля 2010 г., ДНК-Технология, Россия);

- комплект реагентов для ПЦР амплификации ДНК Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis в режиме реального времени (TNC комплекс) (регистрационное удостоверение № ФСР2011/10428 от 31 марта 2011 г., ДНК-Технология, Россия).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Долгушина В.Ф., Долгушин И.И. Телешева Л.Ф. Местный иммунитет половой системы у беременных с генитальной инфекцией. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2000. - №2. - С.92-95.

2. Серов В.Н. Рациональная терапия влагалищных инфекций//. Гинекология. - 2005. - Т.7. - №2.

3. Anderson M.R., Klink K., Cohrssen A. Evaluation of vaginal complains. // JAMA. - 2004. - Vol.291. - P.1368-1379.

4. Donati L., Di Vico A., Nucci M. et al. Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy. Arch Gynecol. Obstet. 2010; 281 (4): 589-600.

5. Eckert L.O. Clinical practice. Acute vulvovaginitis. // N Engi J Med. - 2006. - Vol.21, N 355(12). - P.1244-1252.

6. Gene M.R., Onderdonc A. Endogenous bacterial flora in pregnant women and the influence ofmatermal genetic variation. В JOG. 2011; 118:154-163.

7. Jensen J.S., Sherrard J., Donders G., White D. Guideline on the Management of Vaginal Discharge. 2011 European (IUSTI/WHO). 2011; 1-23.

8. Medzhitov R., Janeway C.A. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition. // Cell. - 1997. - Vol.31, N 91(3). - P.295-298.

9. Owen M.K., Clenney T.L. Management of vaginitis. American Family Physician // 2004. - Vol.70. - P.2125-2132.

10. Vaginitis. ACOG Practice Bulletin No.72. American College of Obstetricians and Gynecologists. // Obstet Gynecol. - 2006. - Vol.107. - P.1195-1206.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Представлен способ, основанный на измерении в вагинальных соскобах уровня экспрессии мРНК генов интерлейкинов IL1B, IL8, IL10 и IL18 относительно представленности мРНК референсных генов B2M, GUS, TBP или HPRT; на основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) следующим образом: Y=1,09*IL1B-0,61*IL8+0,21*IL10-0,11*IL18-0,91 (формула 1), где IL1B - относительный уровень экспрессии IL1B, IL8 - относительный уровень экспрессии IL8, IL10 - относительный уровень экспрессии IL10, IL18 - относительный уровень экспрессии IL18; IL=2^(Cpmin-Cpil)/NF (формула 2), где IL - относительный уровень экспрессии гена интерлейкина, Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии, для IL1B Cpmin=17,9; IL8 Cpmin=16,6; IL10 Cpmin=28,8; IL18 Cpmin=23,3; Cpil - значение порогового цикла соответствующего IL в образце, определяемого автоматически; NF - фактор нормировки, вычисляется по формуле 3: (формула 3), где NF - фактор нормировки, вычисляемый как среднее геометрическое 4 факторов нормировки для референсных генов (см. формулу 4); NFref=2^(Cpmin-Cpref) (формула 4), где NFref - фактор нормировки для референсного гена, Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии референсного гена, Cpref - показания прибора порогового значения в образце; значения Cpmin для референсных генов следующие: GUS Cpmin=26,5; HPRT Cpmin=26,8; B2M Cpmin=18,9; ТВР Cpmin=28,4; при этом, если значение КЛДФ≤0,1, делается заключение об отсутствии вагинита, значения КЛДФ>0,1 соответствуют вагиниту. Изобретение позволяет объективно выявить наличие вагинита у беременной женщины. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Способ диагностики вагинита у беременной женщины, основанный на измерении во влагалищных соскобах уровня экспрессии мРНК генов интерлейкинов IL1B, IL8, IL10 и IL18 и сравнении его с уровнем представленности мРНК референсных генов, отличающийся тем, что в качестве референсных транскриптов используют мРНК генов B2M, GUS, TBP или HPRT; на основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ):
Y=1,09*IL1B-0,61*IL8+0,21*IL10-0,11*IL18-0,91 (формула 1),
где IL1B - относительный уровень экспрессии IL1B,
IL8 - относительный уровень экспрессии IL8,
IL10 - относительный уровень экспрессии IL10,
IL18 - относительный уровень экспрессии IL18;
IL=2^(Cpmin-Cpil)/NF (формула 2),
где IL - относительный уровень экспрессии гена интерлейкина,
Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии, для
IL1B Cpmin=17,9,
IL8 Cpmin=16,6,
IL10 Cpmin=28,8,
IL18 Cpmin=23,3,
Cpil - значение порогового цикла соответствующего IL в образце, определяемого автоматически;
NF - фактор нормировки, вычисляется по формуле 3:
(формула 3),
где NF - фактор нормировки, вычисляемый как среднее геометрическое 4 факторов нормировки для референсных генов (см. формулу 4);
NFref=2^(Cpmin-Cpref) (формула 4),
где NFref - фактор нормировки для референсного гена,
Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии референсного гена,
Cpref - показания прибора порогового значения в образце;
значения Cpmin для референсных генов следующие:
GUS Cpmin=26,5,
HPRT Cpmin=26,8,
B2M Cpmin=18,9,
ТВР Cpmin=28,4;
если значение КЛДФ≤0,1, делается заключение об отсутствии вагинита, значения КЛДФ>0,1 соответствуют вагиниту.

2. Способ по п.1 отличающийся тем, что в качестве метода определения уровня РНК интерлейкинов IL1B, IL8, IL10 и IL18 и мРНК референсных генов используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию «в реальном времени».