УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНЫХ РАЗМЕРОВ ВОДНОЙ ОБОЛОЧКИ КЛЕТОК КРОВИ Российский патент 2014 года по МПК G01N21/01 G01N33/49 

В работе [1] Н.Р. Бородюк было теоретически обосновано и экспериментально подтверждено, что биологически активные эритроциты или лейкоциты (В лимфоциты), тромбоциты крови несут на внешней поверхности своих мембран водную оболочку. В образовании водной оболочки участвуют рецепторы, биологическая активность которых находится под контролем генетического аппарата и коррелирует с состоянием некоторых мембранных липидов. Например, у эритроцитов образование водной оболочки связано с биологической активностью ацетилхолинэстеразного (АХЭ) рецептора, у лейкоцитов (B лимфоцитов) - биологической активности ДОФА декарбоксилазного рецептора.

Известно, что активные центры указанных рецепторов взаимодействуют с дипольным моментом воды. При этом образуется упорядоченная, устойчивая к тепловым флуктуациям водная оболочка. Эксперименты подтвердили, что в норме размеры водной оболочки заметно увеличивают эффективные размеры этих красных или белых клеток крови. Показано, что при нормальном функционировании организма человека биологически активные рецепторы указанных клеток крови участвуют в образовании водной оболочки оптимальных размеров.

При воздействии на человека высоких или низких температур, радиационных излучений, ядохимикатов, психосоматических болезней, травмирующих условий социальной среды угнетение биологической активности данных рецепторов связано с изменением определенных мембранных липидов, а также с уменьшением размеров водной оболочки указанных красных или белых клеток крови. Экспериментально установлено, что при определенном значении показателя жесткости эти красные или белые клетки крови сбрасывают водную оболочку. Отсюда следует, что по относительным размерам водной оболочки красных или белых клеток крови, измеренным до или после сбрасывания водной оболочки, можно оценивать биологическую активность эритроцитов или лейкоцитов (B лимфоцитов) крови.

Основываясь на [2], подробнее остановимся на существующих способах, которые используются для измерения биологической активности эритроцитов, а также для анализа патогенеза заболеваний, связанных с появлением и увеличением показателя жесткости эритроцитов.

В Институте Химической Физики АНСССР для оценки активности АХЭ рецептора эритроцитов был разработан потенциометрический способ. В его основе лежит анализ автокинетики протонов, сопровождающий реакцию гидролиза ацетилхолина (АХ), которая осуществляется активным АХЭ рецептором. Анализ гидролиза АХ проводили в линейном приближении, координатах Лануйвера-Берка. Сравнивали константы реакций до и после воздействия на человека физического или химического факторов риска. Изучение повреждающего воздействия на человека указанных факторов показало, что:

- работу внутренних органов, а также АТФ-зависимых соматических процессов можно оценивать in vitro, измеряя биологическую активность эритроцитов;

- повреждение организма человека сопровождается угнетением активности АХЭ-рецептора эритроцитов.

Этот способ очень точный, однако, его можно использовать только для оценки биологической активности эритроцитов, или их деформируемости. Он трудоемкий, поскольку для выделения эритроцитов необходимо центрифугировать цитратную кровь, готовить реакционную смесь на базе АХ, а также активным АХЭ рецептором осуществлять указанную реакцию. Кроме того, нужно измерять и рассчитывать константы реакций гидролиза АХ до и после повреждающего воздействия. Поэтому применение указанного способа предполагает участие квалифицированного специалиста в течение продолжительного времени.

М.В. Мамонтова (1990 г.), изучая влияние гипоксии новорожденных на структурно-функциональное состояние эритроцитов установила, если менялись ПОЛ или кинетические параметры реакции гидролиза АХ, но показатель жесткости эритроцитов отсутствовал, то в клинике этих больных детей неврологическая симптоматика не наблюдалась. Тяжесть асфиксии новорожденных коррелировала с появлением и увеличением показателя жесткости эритроцитов, поскольку в этом случае регистрировали нарушения мозгового кровообращения, а в клинике отмечали развитие невротического синдрома.

В работе Ю.А. Скворцовой [4] (2000 г.) для исследования деформируемости эритроцитов, имеющих различные показатели жесткости, использовался способ лазерной дефрактометрии. Указанный способ основан на экспериментально установленном автором скачкообразном характере набухания сферулированного эритроцита при определенном показателе жесткости в гипотонической среде. Наблюдаемый эффект ученая объясняла скачкообразным уменьшением радиуса сферулированных эритроцитов при данном показателе жесткости этих красных клеток крови.

Для теоретического обоснования и подтверждения наблюдаемого эффекта она разработала однопараметрическую модель набухания сферулированного эритроцита в гипотоническом растворе. На основе этой модели были получены гипотонические кривые для различных размеров дискоцита, причем для каждой кривой рассчитывали точку сферуляции и их показатель жесткости. Ю.А. Скворцова установила, что рассчитанные параметры можно использовать для интерпретации экспериментальных данных, полученных способом лазерной дифрактометрии.

Поскольку теоретический анализ был приближен к эксперименту, показавшему, что в исследуемых образцах типовая функция распределения эритроцитов по размерам с достаточной точностью аппроксимируется с Гауссовым распределением, и задача решалась в приближении дифракции Фраунгофера.

Предложенный Скворцовой способ определения жесткости эритроцитов был апробирован в клинической практике и оказался информативным для анализа больных с заболеванием крови при множественной миеломе. Его применение позволило исследователям уточнить диагностику реологических расстройств, вызванных блокадой микроциркулярного русла, и своевременно начать активную терапию, которая существенно улучшила деформируемость эритроцитов. Отметим, что этот способ исследования ограничивается анализом эритроцитов различной жесткости.

Известна методика измерения биологической активности эритроцитов по величине Берется цитратная кровь, измеряют СОЭ комнатной температуры. Затем капилляры помещают в термостат и в течение часа выдерживают при t=50°C, после этого измеряют СОЭ₅₀ и вычисляют разность комнатной температуры. Было показано, что величина СОЭ изменяется от нескольких единиц у некоторых пациентов, до нескольких десятков единиц у других пациентов. не зависит от указанного начального значения СОЭ при комнатной температуре. Сравнительный анализ обследованных больных показал, что мм/час соответствует стадии обострения болезни, а мм/час характеризует стадию ремиссии.

В работе [1] установлено, что при воздействии на человека факторов риска, вызывающих произвольные эмоции или меняющихся в условиях внешней среды биологически активные белые или красные клетки крови, используют водную оболочку для транспорта нейромедиаторов, дофамина или АХ. Они освобождают указанные нейромедиаторы на комплиментарных активных рецепторах мозговых тканей, клеток скелетной мускулатуры или тканей внутренних органов. При этом генерируются резонансные низкоинтенсивные электромагнитные энергии (НЭМ), которые расходуются на поддержание целостности организма человека к воздействующим факторам риска. В [2, 3] показана важность размеров водной оболочки белых или красных клеток крови, для долговременной социальной или срочной биологической адаптации человека к воздействующему фактору риска.

Предлагаемое нами устройство для определения относительных размеров водной оболочки белых или красных клеток крови основывается на анализе нитратной крови в капилляре после измерения СОЭ комнатной или СОЭ₅₀ (без водной оболочки). При проведении указанного анализа использовалась Теория мутной среды, поскольку в данной нитратной крови содержатся белые или красные клетки, участвующие в продольном светорассеянии.

Известно, что при продольном светорассеянии длина волны (λ) не изменяется. Если λ выбрана меньше, чем расстояние между одноименными белыми или красными клетками крови, связанными с продольным светорассеянием, то последние «независимо» друг от друга взаимодействуют с проходящим светом.

Отметим, что интенсивности света, рассеянного указанными «независимыми» белыми или красными клетками крови, могут находиться в фазе и усиливаться, в промежуточном состоянии или в противофазе - гаснуть. Таким способом при продольном светорассеянии устанавливаются угловые зависимости интенсивностей рассеянного излучения, которые коррелируют с усредненными размерами рассеивающих белых или красных клеток цитратной крови в капилляре.

На базе Теории мутной среды подтверждается функциональная взаимосвязь площадей индикатрис светорассеяния и размеров, рассеивающих белых, а также красных активных «живых» или их аналогов «неживых», без водной оболочки, клеток цитратной крови в капилляре после измерения СОЭ комнатной или СОЭ50.

Имеется устройство для исследования взвесей эритроцитов или лейкоцитов (B лимфоцитов), а также тромбоцитов крови. Это устройство содержит лазер, излучающий свет, который проходит через объект. Приемник, который измеряет интенсивность рассеянного красными или белыми клетками света при углах наблюдения 0=0-30° (индикатрису светорассеяния). Различия индикатрис светорассеяния до и после воздействия повреждающего фактора обусловлены структурными изменениями в биообъекте. Для проведения указанных измерений использовалась плоская кювета, поэтому необходимо было каждый раз готовить суспензии с низкой концентрацией эритроцитов или лейкоцитов (B лимфоцитов), тромбоцитов крови, данная процедура требовала много времени и участия квалифицированного лаборанта. Это затрудняло проведение массовой диспансеризации пациентов.

Целью предлагаемого устройства является реализация способа по заявке №2010123550/15 от 10.06.2010 г. по патенту RU 2436094 C1, опубликованному 10.12.2011 г. Бюл. №34. [5]

Техническим результатом заявленного устройства для определения относительных размеров водной оболочки клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов, В лимфоцитов, тромбоцитов) является сокращение времени исследования биологической активности клеток крови, путем использования свойств цитратной крови в капилляре для приготовления исследуемого материала, а также автоматизация измерений индикатрис светорассеяния до и после воздействия на исследуемый материал высокой температуры.

Для достижения указанного технического результата предложено устройство для определения относительных размеров водной оболочки клеток крови, включающее исследование крови путем воздействия лазерным излучением один - на λ=0,63 мкм для юстировки, другой - на λ=1,35 мкм для измерения, систему формирования светового луча, поступающего через исследуемый материал, гнездо для размещения светопрозрачной кюветы с используемым материалом, снабженное нагревателем, приемник для регистрации угловых зависимостей интенсивностей света, рассеянного клетками крови (индикатрис светорассеяния) при углах наблюдения 0=0-30°, при этом светопрозрачная кювета выполнена в виде капилляра, причем используют капилляры с цитратной кровью после измерения СОЭ комнатной температуры и СОЭ₅₀, через которые пропускается когерентное плоскополяризованное излучение, регистрация угловых зависимостей интенсивностей света, рассеянного клетками крови, осуществляется в диапазоне 1,35-5 мкм, с последующим измерением площадей индикатрис светорассеяния красных или белых клеток крови с водной оболочкой S1 или без нее - S2, после воздействия на эти капилляры высокой температуры, а полученные величины используются для вычисления относительных размеров водной оболочки по формуле: ((S1-S2)/S1)100%.

Фиг.1 - Схема устройства для измерения относительных размеров водной оболочки клеток крови.

Фиг.2 - Оптическая схема испускания и приема света, проходящего через капилляр с цитратной кровью.

Фиг.3 - Схема устройства, связанного с автоматизацией измерения индикатрис светорассеяния до и после воздействия на исследуемый материал высокой температуры.

Устройство содержит два полупроводниковых лазера, с блоками питания (1). Первый лазер на λ=0,63 мкм используется для юстировки, а другой на λ=1,35-5 мкм для измерения. Для измерения индикатрис светорассеяния исследуемого материала используется капилляр с цитратной кровью (2) после измерения СОЭ комнатной температуры или СОЭ₅₀. Свет, рассеиваемый красной и белыми фракциями цитратной крови, формируется в узкий пучок диаметром 1 мм первой оптической системой. Первая оптическая система содержит диафрагму и микрообъектив с подобранным фокусным расстоянием (3). Для модуляции света используется электродвигатель с закрепленным на валу зеркалом (4). Вторая оптическая система (диафрагма) (5) применяется для того, чтобы исключить засветку приемников. Приемники содержат кремниевые или германиевые фотодиоды (6) и усилители (7). Для синхронизации установки используется генератор сигнальной формы (8). Установка имеет термостат или УЗ-генератор (9), преобразователь (10), программы для автоматизированной оценки изучаемого параметра красных или белых клеток крови (11). Оптическая часть прибора смонтирована на оптической скамье (12).

Устройство работает следующим образом.

Через капилляр, содержащий исследуемый материал, пропускают плоскополяризованное когерентное излучение, длина волны которого может лежать в диапазоне 1,35-5 мкм. Измеряются индикатрисы светорассеяния после определения показателей СОЭ комнатной температуры и СОЭ₅₀ и вычисляют площади указанных индикатрис. Затем по формуле ((S₁-S₂)/S₁)100% оценивают относительные размеры водной оболочки красных или белых клеток крови. Этот параметр, выраженный в процентах, соответствует биологической активности красных или белых клеток крови.

Можно на порядок сократить получение красных или белых клеток крови без водной оболочки, если вместо нагревателя использовать УЗ-генератор, настроенный на резонансную частоту, при которой клетки крови сбрасывают водную оболочку.

Пример. Исследовали цитратную кровь больного A в стадии ремиссии или больного B при нефротическом синдроме, связанном с появлением показателя жесткости эритроцитов. Регистрировали угловые зависимости интенсивностей света, проходящего через капилляр с цитратной кровью при комнатной температуре, после измерения СОЭ комнатной, а также связанной с воздействием на нее температуры 50°C, после измерения СОЭ₅₀. Для проведения указанных измерений выбирали λ(1,35-5 мкм). Выбранную λ использовали для измерения индикатрис светорассеяния в этих состояниях, путем пропускания данного излучения через капилляр с цитратной кровью, с последующим вычислением площадей индикатрис светорассеяния S1 - с водной оболочкой или S2 после сбрасывания водной оболочки. Указанные исследования цитратной крови были проведены у больных A или B. При этом были получены следующие величины площадей:

для больного A S1-0,802 Для больного B S1-0,765   S2=0,573   S2-0,705

Указанные величины использовали для оценки относительных размеров водной оболочки:

У больных A (S1-S2)/S1)100%=28,55%, у больных B (S1-S2)/S1)100%=7,84%

Данный результат свидетельствует о том, что у больных A в состоянии ремиссии относительные размеры водной оболочки около 30%, а у больных B при наличии показателя жесткости эритроцитов этот показатель около 8%.

Из приведенного примера следует, что если у больных A биологическая активность эритроцитов поддерживается в организме человека, то при появлении показателя жесткости эритроцитов биологическая активность АХЭ рецептора эритроцитов угнетается, как следствие, связанное с изменением состояния определенных мембранных лепидов.

Литература

1. Н.Р. Бородюк. Адаптация и ее биоэнергетические принципы. М. ФГП. «ПИК ВИНИТИ», 2009. 163 стр.

2. Н.Р. Бородюк, Кровь - живое существо. Биоэнергетический механизм приспособительных реакций, М. Глобус, 1999, 213 стр.

3. Н.Р. Бородюк. Способ контроля патогенеза заболеваний, связанных с накоплением холестерина в мембранах эритроцитов. Описание изобретения RU 2106633 C1 6Ж01N 33/483 10.03.1998. Бюл. №7

4. Ю.А. Сковрова, Применение лазерного излучения для определения деформируемости эритроцитов в условиях гипоосмотического гемолиза, Автореф. дисс. канд. тех. наук, СПб, 2000, 15 стр.

5. Н.Р. Валитова, В.В. Валитов. Способ определения биологической активности эритроцитов или лейкоцитов (B лимфоцитов), тромбоцитов крови. Описание изобретения - заявка №2010123550/15 от 10.06.2010 г. по патенту RU 2436094 C1, опубликованному 10.12.2011 г. Бюл. №34.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при исследовании биологической активности клеток крови. Устройство для определения относительных размеров водной оболочки клеток крови включает систему формирования светового луча, поступающего через исследуемый материал, гнездо для размещения светопрозрачной кюветы в виде капилляра с цитратной кровью, снабженное нагревателем, приемник для регистрации угловых зависимостей интенсивностей света, рассеянного клетками крови (индикатрис светорассеяния) при углах наблюдения 0=0-30°. При этом используют капилляры с цитратной кровью после измерения СОЭ комнатной температуры и СОЭ₅₀, через которые пропускается когерентное плоскополяризованное излучение. Регистрация угловых зависимостей интенсивностей света, рассеянного клетками крови, осуществляется в диапазоне 1,35-5 мкм, с последующим измерением площадей индикатрис светорассеяния красных или белых клеток крови с водной оболочкой S1 и без нее - S2 (после воздействия на эти капилляры высокой температуры). Полученные величины используются для вычисления относительных размеров водной оболочки по формуле:((S1-S2/S1)100%. Изобретение обеспечивает сокращение времени исследования биологической активности клеток крови. 3 ил., 1 пр.

Устройство для определения относительных размеров водной оболочки клеток крови, включающее исследование крови путем воздействия лазерным излучением один, на λ=0,63 мкм для юстировки, другой на λ=1,35 мкм для измерения, систему формирования светового луча, поступающего через исследуемый материал, гнездо для размещения светопрозрачной кюветы с используемым материалом, снабженное нагревателем, приемник для регистрации угловых зависимостей интенсивностей света, рассеянного клетками крови (индикатрис светорассеяния) при углах наблюдения 0=0-30°, отличающееся тем, что светопрозрачная кювета выполнена в виде капилляра, причем используют капилляры с цитратной кровью после измерения СОЭ комнатной температуры и СОЭ₅₀, через которые пропускается когерентное плоскополяризованное излучение, регистрация угловых зависимостей интенсивностей света, рассеянного клетками крови, осуществляется в диапазоне 1,35-5 мкм, с последующим измерением площадей индикатрис светорассеяния красных или белых клеток крови с водной оболочкой S₁ или без нее - S₂, после воздействия на эти капилляры высокой температуры, полученные величины используются для вычисления относительных размеров водной оболочки по формуле:
((S₁-S₂)/S₁)100%.