Способ отбора теплокровных животных, чувствительных к неблагоприятному воздействию Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине к сельскому хозяйству и может быть использовано для отбора теплокровных животных, чувствительных к неблагоприятным факторам внешней среды.

Известен способ определения чувствительности живых организмов (растений) к неблагоприятным факторам внешней среды, основанный на факте накопления в организме обработанного растения веществ неизвестной природы, причем в тем болй- шем количестве, чем более чувствительно растение к данному фактору. Согласно данному техническому решению растения подвергают воздействию неблагоприятным фактором физической либо химической природы, после чего выделяют из обработанного растения фракцию липидов, которую вводят в реакционную смесь, содержащую данную фракцию, фермент, гемолизин, субстрат для него в виде суспензии эритроцитов. После

инкубации реакционной смеси устанавливают скорость реакции гемолиза.

Чем более чувствительно растение к неблагоприятному еЬактору, тем больше инги- бируется реакция гемолиза. Однако данный способ не решает задачи отбора теплокровных животных в группу чувствительных к исследуемому фактору воздействия.

Наиболее близким к предлагаемому является способ отбора животных, чувствительных к низким температурным воздействиям. При этом животных (крыс) подвергают дробно/i адаптации к холоду, выделяют митохондрии печени, исследуют скорость окисления субстратов (НАД и ФАД - зависимых) в присутствии ингибиторов ферментативных реакций, регистрируют уровень сопряжения дыхания и фосфорилиро- вания и по степени разобщения .проводят отбор животных в группу чувствительных к хододовому воздействию (адап-,

О

1

тированных и неадаптированных животных).

Однако по данному методу отбор проводят не индивидуально, а группой, при этом одно или несколько животных данной группы декапитируют перед получением препарата митохондрий.

Целью изобретения является упрощение способа за счет сохранения поголовья экспериментальных животных.

Способ осуществляется следующим образом.

После воздействия исследуемым фактором проводят отбор крови. Выделяют эритроциты и готовят две пары реакционных смесей.

1а. Суспензия эритроцитов, выделенных из организма животного, подвергнутого воздействию неблагоприятного фактора, субстрат для содержащейся в эритроцитах ацетилхолинэстеразы - ацетилхолиниодид, ингибитор реакции ферментативного гидролиза ацетилхолина (фенантролин).

16, То же без ингибитора.

2а. Суспензия эритроцитов, выделенных из организма животного, не подвергнутого воздействию неблагоприятного фактора, субстрат для содержащейся в эритроцитах ацетилхолинэстеразы - ацетилхолиниодид, ингибитор реакции ферментативного гидролиза ацетилхолина (фенантролин).

26. То же без ингибитора.

Верхний предел концентрации субстрата определяется значением, при котором наблюдается ингибирование активности ацетилхолинэстеразы. Предварительно для ряда концентраций субстрата измеряют скорость гидролизной реакции. По полученным значениям строят зависимость обратной скорости реакции от обратной концентрации (координаты Лануйвера-Бер- ка) и определяют максимальную скорость реакции гидролиза. Ингибитор добавляют в реакционную смесь в постоянной концентрации. Результатом действия ингибитора считают изменение максимальной скорости реакции.

По значениям максимальных скоростей реакции гидролиза до воздействия ингибитора W0 и при воздействии Wi ингибитора и по величине постоянной концентрации вычисляют константу ингибирования К, из выражения

К,

Wo/Wi - 1

где 1о - начальная концентрация ингибитора;

WQ - максимальная скорость реакции в контроле;

Wi - максимальная скорость реакции при ингибировании.

Константа ингибирования характеризует устойчивость организма к воздействию. Чем больше константа ингибирования, тем выше устойчивость организма к действию повреждающих факторов, тем ниже его чувствительность к ним.

В качестве ингибитора ферментативной реакции используют диметилдихлорвинил фосфат, фенантролин, хлорофос.

Пример 1. Клетки эритроцитов были

приготовлены из 3 мл свежей цитратной крови путем трехразового центрифугирования ее и промывания клеток эритроцитов 0,9%-ным раствором хлористого натрия. В суспензии использовали изотонический

раствор хлористого натрия NaCI, в котором растворялся 2,5 мл трисбуфера (рН 8,0, te 38°С), концентрация клеток эритроцитов 108-109 клеток/мл, субстрат - ацетилхолиниодид. Общий обьем реакционной смеси

составлял 5 мл.

Изучили зависимость скорости реакции от концентрации ацетилхолина, которая отражает гидролитическое разрушение субстрата, осуществляемое ацетилхолинэстеразой эритроцитарных клеток при ингибировании каталитической активности фермента пестицидом фензнтролином различной концентрации.

Результаты расчета константы ингибирования ацетилхолинэстеразного фермента клеток эритроцитов трех опытов сведены в табл.1

Из приведенных данных видно, что способ позволяет разделить обследуемых по их

чувствительности к повреждающим факторам.

Пример 2. Для подтверждения вывода о том, что ацетилхолинэстераза является ферментом, отражающим чувствительность

организма теплокровных животных к повреждающим факторам, изучили влияние трех химических ингибиторов: диметилх- лорвинилфосфата (ДДВФ) дипирид ла, фе- нантролина - на ацетилхолинэстеразную

активность клеток эритроцитов крыс. Для оценки использовали параметр Iso. определяющий концентрацию препарата, инакти- вирующего фермент на 50%. Этот параметр определяют графически по зависимости относительной актионости (соотношения скоростей реакции в присутствии и без препарата Wi/Wo) от концентрации препарата. Эта зависимость представлена на чертеже, где кривая 1 соответствует ДДВФ,

кривая 2 - дипиридилу, кривая 3 - фенант- ролину.

Полученные данные свидетельствуют о том, что крысы наиболее чувствительны к фенантролину, менее чувствительны к дипиридилу и практически нечувствительны к ацепоксу.

При сравнительном изучении влияния этих токсикантов на организм крыс были получены такие же результаты (см. табл.2).

П р иг м е р 3. Опытную группу крыс содержали в термостатированном помещении при температуре 45 ± 1°С в течение 1 мес, контрольную - при температуре 18- 22°С. Затем у обеих групп крыс отбирали кровь и определяли константу ингибирова- ния ацетилхолинэстеразы клеток эритроцитов. Влияние температурных условий содержания крыс на значения константы ингибирования Kj ацетилхолинэстеразы клеток эритроцитов следующее:

Температурные условия содержания,

°С

45 ± 1 (опыт) 18-22 (контроль)

Приведенные данные показывают возможность оценить предложенным способом наличие отрицательной реакции опытной группы крыс на постоянное воздействие неблагоприятного фактора внешней среды (повышенной температуры). Так. в опытной группе значения Ki колебались в пределах 0,80-1,25 мМ. а в контрольной группе эти значения были достоверно выше и колебались в пределах 1.41-1.55 мМ.

Результаты оценки чувствительности крыс опытной группы к неблагоприятному фактору- повышенной температуре следующие:

30

0,90-1,00 1,01-1,10 1,11-1,20

64

14

К|,мМ

0,80-0,90 0.91-1.00 1,01-1,10 1.11-1,20 1.21-1,30

Приведенные данные показывают, что животных опытной группы можно было разделить на 5 подгрупп по их чувствиПриведенные данные показывают, что из 100 опытных животных 22 животных ока- 35 зались наиболее чувствительными к неблагоприятному фактору (пониженной температуре), о чем свидетельствует самая низкая величина Ki (0,90-1,00 мМ).

Формула изобретения 40 Способ отбора теплокровных животных, чувствительных к неблагоприятному воздействию, путем воздействия исследуемым фактором на животное с последующим Число живот-выделением биологического материала, инных из опыт- 45 кубацией его в присутствии субстрата и ин- нойгруппыгибитора, регистрацией активности

42фермента, сравнением полученного показа25теля с контролем и отбором животных по

21результатам сравнения, отличающий250 с я тем, что, с целью упрощения способа за

10счет сохранения поголовья животных, в качестве биологического материала используют эритроциты, которые инкубируют в присутствии ацетилхолина и фенантролина, 55 при этом регистрируют активность ацетилхолинэстеразы.

тельности к неблагоприятному фактору (повышенной температуре) и отобрать подгруппу наиболее чувствительных животных, т.к. 42 из них имели наименьшую величину

Ki (0,80-0,90 мМ).

Пример 4. Опытную группу крыс содержали в термостатированном помещении при температуре -3 ± 1°С в течение 1 мес, контрольную - при температуре 1822°С. Результаты измерения KI следующие1

Температурные условия содержания, °С -3 ± 1 (опыт) 18-22 (контроль)

Ki, мМ

0.90-1,19 1,40-1,52

Приведенные данные показывают, что значения Ki у животных опытной и контрольной групп различны. Распределение живо- тных опытной группы на подгруппы следующее:

К,, мМ

0,90-1,00 1,01-1,10 1,11-1,20

Число животных

из опытной

группы

22

64

14

Таблица 1

Использование: биология, медицина. Сущность изобретения: из организма выделяют клетки эритроцитов,, носителей мемб- раносвязанной ацетилхолинэстеразы, для разной концентрации ацетилхолина осуществляют реакцию гидролиза, ингибируя ее ингибитором постоянной концентрации. Рассчитывают константу ингибирования, по которой судят о чувствительности теплокровного животного и биологической системы к неблагоприятному воздействию, ил.1. табл. 2.

Q20

Таблица 2

м- 10

-з