СПОСОБ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВИЧ, ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ВИЧ ИЛИ АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИЧ, В ТОМ ЧИСЛЕ СПИДА Российский патент 2014 года по МПК A61K39/00 A61P31/12 

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для комплексной профилактики инфицирования ВИЧ, комплексной профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа, на основе антиретровирусных препаратов.

Из уровня техники известно использование фармацевтической композиции на основе одного или нескольких действующих веществ для лечения ретровирусных инфекций, включая ВИЧ (ЕА 002437 В1, А61К 31/7068, 2002). Основным недостатком данного препарата является наличие выраженных побочных эффектов, что ограничивает возможности их применения.

Изобретение направлено на создание эффективной и безопасной композиции на основе одного или нескольких антиретровирусных препаратов для профилактики инфицирования ВИЧ, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе профилактики инфицирования ВИЧ, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа, включающем введение одного или нескольких антиретровирусных препаратов (или их действующих веществ), согласно изобретению, одновременно и сочетано вводят активированную - потенцированную форму антител к белку или пептиду (полипептиду) иммунной системы (или, преимущественно, вырабатываемому в иммунной системе), который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ.

При этом активированную - потенцированную форму антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ, используют в виде активированного потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, при этом конечные разведения содержат сверхмалые дозы (СМД) антител.

Предпочтительно в качестве антиретровирусного препарата используют препарат, выбранный из группы: нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (в том числе, препараты на основе действующего вещества зидовудин, ламивудин, эмтрицитабин, зальцитабин, абакавир, тенофовир, диданозин, ставудин или их сочетаний), ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (в том числе, препараты на основе действующего вещества делавирдин, эфавиренз, невирапин или их сочетаний), ингибиторы протеазы (в том числе, препараты на основе действующего вещества ампренавир, индинавир, саквинавир-МЖК, саквинавир-ТЖК, лопинавир, ритонавир, фосампренавир, азатанавир, нелфинавир или их сочетаний), ингибиторы слияния (в том числе, препараты на основе действующего вещества энфувиртид, маравирок, викривирок, ибализумаб или их сочетаний), ингибиторы созревания (вивекон, бевиримат и другие), ингибиторы раздевания вируса (TRIM5 альфа), ингибиторы транскрипции (tat антагонисты), ингибиторы трансляции (трихозантин) и прочие.

При этом в качестве активированной - потенцированной формы антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ, используют активированную - потенцированную форму антител к антигену, преимущественно связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы и/или активированную -потенцированную форму антител, преимущественно, к растворенным антигенам (или растворимым антигенам, т.е. антигенам, не связанным с наружной мембраной клеток иммунной системы).

При этом в качестве антигена, преимущественно связанного с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют, например, рецепторы иммунокомпетентных клеток, или, например, кластеры дифференцировки (например, CD4, CD8 и др.).

При этом в качестве растворенного антигена используют, преимущественно, цитокины.

Причем активированную - потенцированную форму антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ, получают путем многократного последовательного разведения матричного - исходного - раствора антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или антител к растворенным антигенам в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

Решение поставленной задачи обеспечивается также тем, что композиция для профилактики инфицирования ВИЧ, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа, включающая один или несколько антиретровирусных препаратов, согласно изобретению, дополнительно содержит активированную - потенцированную формы антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ.

При этом в качестве антиретровирусного препарата используют препарат, выбранный из группы: нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (в том числе, препараты на основе действующего вещества зидовудин, ламивудин, эмтрицитабин, зальцитабин, абакавир, тенофовир, диданозин, ставудин или их сочетаний), ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (в том числе, препараты на основе действующего вещества делавирдин, эфавиренз, невирапин или их сочетаний), ингибиторы протеазы (в том числе, препараты на основе действующего вещества ампренавир, индинавир, саквинавир-МЖК, саквинавир-ТЖК, лопинавир, ритонавир, фосампренавир, азатанавир, нелфинавир или их сочетаний), ингибиторы слияния (в том числе, препараты на основе действующего вещества энфувиртид, маравирок, викривирок, ибализумаб или их сочетаний), ингибиторы созревания (вивекон, бевиримат и другие), ингибиторы раздевания вируса (TRIM5 альфа), ингибиторы транскрипции (tat антагонисты), ингибиторы трансляции (трихозантин) и прочие.

Предпочтительно в качестве активированной - потенцированной формы антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ, используют активированную - потенцированную форму антител к антигену, преимущественно связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы и/или активированную - потенцированную форму антител к растворенным антигенам (антигенам, не связанным с наружной мембраной иммунокомпетентных клеток).

При этом в качестве антигена, преимущественно связанного с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют рецепторы иммунокомпетентных клеток (включая кластеры дифференцировки).

При этом в качестве растворенного антигена используют, преимущественно, цитокины.

При этом активированную - потенцированную форму антител к антигену, преимущественно связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы и/или активированную - потенцированную форму антител к растворенным антигенам (антигенам, не связанным с наружной мембраной клеток иммунной системы) используют в виде активированного - потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

Предпочтительно активированную - потенцированную форму антител к растворенным антигенам или антигену, преимущественно связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, получают путем многократного последовательного разведения матричного - исходного - раствора антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или антител к растворенным антигенам в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

Композиция может содержать антиретровирусный препарат на основе действующего вещества Зидовудина в эффективной дозе в сочетании с активированной - потенцированной формой антител к интерферону - гамма человека.

Композиция может содержать антиретровирусный препарат на основе действующего вещества Зидовудина в эффективной дозе в сочетании с активированной - потенцированной формой антител к интерферону - гамма человека и активированной - потенцированной формой антител к CD4.

Полученная в соответствии с изобретением антиретровирусная композиция представляет собой новый фармакологический препарат, который характеризуется наличием высокой экспериментально подтвержденной терапевтической активности, выраженность которой обусловлена противовирусным и, возможно, иммуномодулирующим действием активированной - потенцированной формы антител к белку или пептиду иммунной системы (белковой молекуле или ее фрагменту), что позволяет существенно снизить терапевтическую дозу действующего вещества антиретровирусного препарата при сохранении исходного антиретровирусного эффекта и уменьшить побочные эффекты и повысить качество жизни пациентов.

При этом снижение терапевтической дозы антиретровирусного препарата позволяет избежать быстрого развития резистентности, что обуславливает возможность использования заявленной композиции для длительной безопасной и эффективной профилактики и лечения ВИЧ-инфекции. Кроме того, заявленная фармацевтическая композиция расширяет арсенал лекарственных средств для лечения ВИЧ-инфекции.

Заявленную композицию готовят следующим образом.

Для приготовления активированной - потенцированной формы антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ, используют моноклональные или, преимущественно, поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г.Фримеля, М., «Медицина», 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридомных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.

Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемым в соответствии с изобретением веществом - антигеном или конъюгированным антигеном (например, гамма-интерфероном человека). В результате проведения такой процедуры получают моноспецифическую антисыворотку с высоким содержанием антител, которую и используют для получения активированной - потенцированной формы. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Например, для получения поликлональных антител к

гамма-интерферону человека в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов используют адъювант и, например, цельную молекулу гамма-интерферона человека следующей последовательности:

1 MKYTSYILAF QLCIVLGSLG CYCQDPYVKE AENLKKYFNA

GHSDVADNGT LFLGILKNWK

61 EESDRKIMQS QIVSFYFKLF KNFKDDQSIQ KSVETIKEDM

NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN

121 YSVTDLNVQR KAIHELIQVM AELSPAAKTG KRKRSQMLFR GRRASQ

Возможно для получения поликлональных антител к

гамма-интерферону человека в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов использование адъюванта и, например, одного полипептидного фрагмента гамма-интерферона человека, выбранного из следующих последовательностей:

7-55:

ILAF QLCIVLGSLG CYCQDPYVKE AENLKKYFNA GHSDV

24-166:

QDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKA IHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFRGRRASQ

24-166:

QDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKA IHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFQGRRASQ

69-123:

QS QIVSFYFKLF KNFKDDQSIQ KSVETIKEDM NVKFFNSNKK KRDDFEKLTNYSV

100-145:

M NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN YSVTDLNVQR KAIHELIQVM AELSP

92-130:

SVETIKEDM NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN YSVTDLNVQR

123- 147:

VTDLNVQR KAIHELIQVM AELSPAA

24-166:

MQDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKA IHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFQGRRASQ

5-45:

SYILAF QLCIVLGSLG CYCQDPYVKE AENLK

94-114:

ETIKEDM NVKFFNSNKK KRDD,

24-166:

MQDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKA IHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFRGRRASQ

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°С) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Можно добавлять к антисыворотке 20% NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранить до использования в замороженном состоянии при температуре -20°С (или без добавления NaN₃ - при температуре -70°). Ввыделение из антисыворотки антител к гамма-интерферону возможно следующим образом:

1. 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М Nad добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°С;

2. выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

3. после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

4. фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Очистку антител производят методом аффинной хроматографии на колонке с антигеном, путем связывания антител к гамма-интерферону с антигеном (гамма-интерферон), прикрепленным к нерастворимому матриксу колонки, с последующим элюированием антител концентрированными растворами соли.

Полученный таким образом буферный раствор поликлональных кроличьих антител к гамма-интерферону человека, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (исходного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы.

Активированную - потенцированную форму каждого компонента готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части каждого подвергаемого разведению раствора, начиная с упомянутого матричного раствора, в 9 частях (для десятичного разведения D) или в 99 частях (для сотенного разведения С) или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя в сочетании с многократным вертикальным встряхиванием (потенцированием, или "динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции - кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В.Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29).

Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С 12 одну часть матричного (исходного) раствора антител, например к гамма-интерферону человека с концентрацией 2,5 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают - потенцируют, получая 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С1 разведения приготовляют 2-ое сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С 12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С 12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно 12 раз в разных емкостях 1-ой части исходного матричного раствора антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 2,5 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, т.е. раствор, полученный разведением матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведении С30 и С50.

При использовании, например, активированной - потенцированной формы антител к гамма-интерферону человека в виде смеси различных, преимущественно сотенных, разведений каждое разведение (например, С12, С30, С50) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до разведения на 3 разведения меньше, чем конечное (соответственно, до получения С9, С27, С47), и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения). Далее полученную смесь последовательно дважды разводят в соотношении 1 к 100, потенцируя полученный раствор после каждого разведения. При этом получают активированную - потенцированную форму антител, например, к гамма-интерферону человека в сверхмалой дозе, полученной разведением матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных разведении С12, С30, С50.

Для приготовления в жидкой лекарственной форме активированную -потенцированную форму антител, например, к гамма-интерферону человека в сверхмалой дозе в виде раствора вводят в раствор антиретровирусного препарата в терапевтически эффективной дозе, например, на основе действующего вещества Зидовудина. Для получения заявленной фармацевтическая композиции в твердой лекарственной форме ингредиенты твердой формы антиретровирусного препарата (включая нейтральный носитель) на этапе ее приготовления насыщают раствором активированной - потенцированной формы антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ (например, насыщают гранулы нейтрального вещества, например, лактозу, раствором активированной - потенцированной формы антител, которые прессуют совместно с действующим веществом и вспомогательными веществами при формировании твердой формы).

Кроме того, возможно совместное использование путем одновременного введения в организм компонентов заявленной композиции в виде двух отдельно приготовленных препаратов (одного или нескольких антиретровирусных препаратов или действующих веществ в терапевтически эффективной дозе и активированной - потенцированной формы антител к белку или пептиду иммунной системы) с применением различных лекарственных форм указанных препаратов.

Пример 1

Для проведения экспериментальных исследований были использованы аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела к гамма-интерферону человека, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой, на основе которых была приготовлена активированная - потенцированная форма антител к гамма-интерферону в сверхмалой дозе в виде смеси разведений С12+С30+С50, полученных по гомеопатической технологии (далее СМД AT к ИФН-гамма).

Антиретровирусная активность заявленной фармацевтической композиции СМД AT к ИФН-гамма и азидотимидина (препарата на основе действующего вещества зидовудина) изучалась в культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI. Эффективность ингибирования репликации ВИЧ оценивали по содержанию основного нуклеокапидного белка р24 ВИЧ в супернатантах мононуклеарных клеток периферической крови человека.

Мононуклеары периферической крови человека были выделены из крови здоровых серонегативных доноров при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака. Клетки активировали в течение 3 дней с использованием 1 мкг/мл фитогеммаглютина Р и 5 МЕ/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека.

Для оценки антиретровирусной активности в лунки, содержащие 100 мкл активированных мононуклеаров периферической крови человека, за 24 часа или через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI в дозе 100 TCID50 (50 мкл инокулята штамма ВИЧ-1-LAI), вносили комбинацию СМД AT к ИФН гамма с азидотимидином (доза азидотимидина в комбинации 10 нМ) (12,5 мкл) или азидотимидин в дозе 1000 нМ (препарат сравнения), которые смешивали со средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения конечного объема в 50 мкл.

Супернатанты культуры клеток были собраны на 7 день после заражения. Эффективность препаратов определяли по ингибированию репликации ВИЧ, которая оценивалась по содержанию основного нуклеокапидного белка р24 ВИЧ в супернатантах клеток методом ИФА (Retrotek Elisa kit).

Выявлено, что азидотимидин в дозе 1000 нМ ингибировал репликацию ВИЧ на 99±0 и 99±1% при внесении в лунку за 24 часа до и через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI, соответственно. Комбинация СМД AT к ИФН гамма с азидотимидином в дозе 10 нМ, что в 100 раз меньше дозы азидотимидина при монотерапии, ингибировала репликацию ВИЧ на 98±0% при внесении в лунку за 24 часа до, и на 80 d=9% при внесении в лунку через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI, соответственно.

Таким образом, в in vitro исследовании показано, что комбинированное применение азидотимидина с СМД AT к ИФН гамма позволяет в 100 раз снизить дозу азидотимидина при сохранении его исходной высокой антиретровирусной активности. Примечание: TCID50 - доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани.

Пример 2

Для исследования свойств заявленной композиции были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных-потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма-интерферону человека (анти-IFN-γ) и CD4 рецептора (анти-CD4) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C200 (СМД анти-IFN-γ+анти-CD4); для лечения пациентов группы активного препарата №2 были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных-потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (анти-IFN-γ), к CD4 рецептору (анти-CD4) и гистамину (анти-H) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C200 (СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H). Для лечения пациентов группы сравнения были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные водно-спиртовым раствором (3 мг/табл.) активированной-потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к

гамма-интерферону человека, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 (СМД анти-IFN-γ).

Антиретровирусную активность композиций СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H оценивали в ходе открытого сравнительного клинического исследования с участием пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), которые наблюдались в Территориальном центре по профилактике и борьбе со СПИД'ом и инфекционными заболеваниями. В исследование были включены 65 мужчин и 32 женщины (всего 97 пациентов) в возрасте от 18 до 48 лет с вирусной нагрузкой ≥150 копий РНК ВИЧ-1 в 1 мл плазмы и уровнем CD4-лимфоцитов не ниже 250 клеток/мкл (или ≥0,25×10⁹/л). 34 из 97 участников исследования наблюдались по поводу бессимптомного инфекционного статуса и ранее не получали лечения по поводу ВИЧ-инфекции (наивные пациенты). 63 из 97 пациентов находились на антиретровирусной терапии (АРТ) в течение 1-2 лет. В исследование не включались пациенты с циррозом печени, вирусным гепатитом C, тяжелыми сопутствующими заболеваниями в стадии обострения, беременные женщины, а также лица, принимающие внутривенно наркотические средства. Исследование проводили в осеннее-зимний период, когда отмечался сезонный подъем заболеваемости гриппом и острыми респираторными инфекциями (ОРВИ).

75 пациента были рандомизированы в три группы, им была назначена терапия препаратами группы 1 и 2 или препаратом сравнения группы 3 в профилактической (в отношении гриппа/ОРВИ) дозировке - по 1 таблетке 1 раз в день в течение 6 недель, в том числе: пациентам группы 1 (n=25) была назначена композиция СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 в виде монотерапии (подгруппа 1А: наивные пациенты, n=12) или в сочетании с АРТ (подгруппа 1Б, n=13); пациентам группы 2 (n=23) была назначена композициям СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H, в том числе, в виде монотерапии (подгруппа 2А: наивные пациенты, n=11) или в сочетании с АРТ (подгруппа 2Б, n=12); пациентам группы 3 (n=27) был назначен препарат СМД анти-IFN-γ, в том числе, в виде монотерапии (подгруппа 3А: наивные пациенты, n=11) или в сочетании с АРТ (подгруппа 3Б, n=16). Контрольную (четвертую) группу (n=22) составили пациенты, которые продолжали получать АРТ по прежней схеме без добавления какого-либо изучаемого препарата (группа АРТ). Антиретровирусная терапия (АРТ) включала прием препаратов Combivir® (Zidovudine 150 мг + Lamivudine 300 мг) 2 раза в сутки и Stocrin (Efavirenz) 600 мг 1 раз в сутки.

Исходно и через 6 недель у всех пациентов оценивали вирусную нагрузку, уровень CD4 и CD8 лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4/CD8. Для определения копий РНК ВИЧ-1 в плазме крови использовали наборы COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Kit, version 1,5 для автоматического ПЦР-анализатора COBAS AMPLICOR (Roche, Швейцария). Фенотипирование циркулирующих лимфоцитов периферической крови выполняли на проточном цитофлюориметре FACSCount (Becton Dickinson, США) с использованием стандартных тест-систем FACSCount Reagent Kit, содержащих антитела к CD3, CD4, CD8, меченные флюорохромами FITC, PE.

В таблице 10 представлены данные по вирусной нагрузке (числу копий РНК ВИЧ) в виде значений медианы (Me), первого и третьего квартилей (Q1, Q3) у пациентов исследуемых групп в динамике наблюдения. В результате исследования установлено, что 6-недельный прием композиции СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 приводил к снижению количества копий РНК ВИЧ-1 у 58% наивных пациентов (у 7 из 12 человек подгруппы 1A), при этом среднее снижение вирусной нагрузки составило 16,9%. Сочетанное применение композиции СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и АРТ было не менее эффективным, поскольку уменьшение количества копий РНК ВИЧ-1 отмечено у 62% участников исследования (у 8 из 13 человек подгруппы 1Б), а снижение вирусной нагрузки в среднем было 18,2% от исходного уровня. Примерно сходные показатели получены при использовании композиции СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H: противовирусная активность регистрировалась у 55% ВИЧ-инфицированных наивных пациентов (у 6 из 11 человек подгруппы 2А) и у 67% лиц, получавших комбинацию СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H и АРТ (у 8 из 12 человек подгруппы 2Б); среднее снижение вирусной нагрузки составило 17,3% и 18,9% соответственно. Антиретровирусная активность, отмеченная в первых двух группах, была несколько выше результатов лечения, полученных у пациентов группы сравнения. Монотерапия СМД анти-IFN-γ через 6 недель снижала количество копий РНК ВИЧ-1 у 36% наивных пациентов (у 4 из 11 человек подгруппы 3А), при этом уменьшение вирусной нагрузки в среднем составило 9,5%. Сочетанное применение монокомпонентного препарата СМД анти-IFN-γ и АРТ повышало эффективность терапии, способствуя снижению вирусной нагрузки у 50% участников исследования (у 8 из 16 человек подгруппы 3Б) в среднем на 14,2%. Аналогичные показатели лечения у лиц, получавших только АРТ (контрольная группа 4), составили 32% (у 7 из 22 человек группы 4) и 13,3% соответственно.

Анализ показателей субпопуляций циркулирующих лимфоцитов в динамике наблюдения (Таблица 11) показал более выраженное, чем в контрольной группе, увеличение числа CD4 лимфоцитов через 6 недель терапии при использовании СМД анти-IFN-γ+анти-CD4, СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H и СМД анти-IFN-γ в виде монотерапии у наивных пациентов (подгруппы 1А, 2А и 3А) или при сочетании с АРТ (подгруппы 1Б, 2Б и 3Б). При этом число CD8 через 6 недель приема препаратов (моно- либо сочетанная терапия) не менялось ни в одной из изучаемых групп. Позитивная динамика со стороны CD4-лимфоцитов в ходе лечения приводила к повышению иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, наиболее значимому в подгруппах пациентов, принимавших композиции СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H (моно- или сочетанная терапия - группы 1 и 2) и СМД анти-IFN-γ в сочетании с АРТ (подгруппа 3Б).

Таблица 10 Динамика вирусной нагрузки в зависимости от схемы терапии Вирусная нагрузка, копий/мл Среднее снижение вирусной нагрузки, % СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 (Me [Q1-Q3]) Исходно 5769 [368-62584] 16,9 Через 6 недель лечения 4575 [337-58526] АРТ и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 (Me [Q1-Q3])

Исходно 5238 [385-59695] 18,2 Через 6 недель лечения 4408 [320-50197] СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H (Me [Q1-Q3]) Исходно 5638 [385-61742] 17,3 Через 6 недель лечения 4754 [278-57426] АРТ и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H (Me [Q1-Q3]) Исходно 5189 [350-59798] 18,9 Через 6 недель лечения 46108 [269-47987] СМД анти-IFN-γ (Me [Q1-Q3]) Исходно 5813 [150-33356] 9,5 Через 6 недель лечения 5786 [150-38359] АРТ и СМД анти-IFN-γ (Me [Q1-Q3]) Исходно 4680 [274-9838] 14,2 Через 6 недель лечения 4652 [272-8874] АРТ (Me [Q1-Q3]) Исходно 5547 [385-58996] 13,3 Через 6 недель лечения 5308 [338-57709]

Таблица 11 Показатели субпопуляций циркулирующих лимфоцитов у пациентов исследуемых групп в динамике наблюдения Период наблюдения CD4, кл/мкл (M±SE) CD4/CD8 (M±SE) СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 (n=12) Исходно 516±33 0,46±0,09 Через 6 недель лечения 712±24 0,58±0,07* АРТ и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 (n=13) Исходно 499±41 0,50±0,08 Через 6 недель лечения 728±29 0,60±0,06* СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H (n=11) Исходно 509±45 0,49±0,06 Через 6 недель лечения 706±27 0,58±0,08* АРТ и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H (n=12)

Исходно 521±37 0,48±0,09 Через 6 недель лечения 734±22 0,62±0,10* СМД анти-IFN-γ (n=11) Исходно 513±98 0,38±0,19 Через 6 недель лечения 563±26 0,44±0,12 АРТ и СМД анти-IFN-γ (n=16) Исходно 491±49 0,55±0,06 Через 6 недель лечения 623±45 0,67±0,05* АРТ (n=22) Исходно 510±29 0,44±0,06 Через 6 недель лечения 595±35 0,50±0,12 * значимые отличия по сравнению с исходным уровнем, p<0,05

Отсутствие у пациентов в ходе лечения нежелательных явлений, связанных с приемом исследуемых лекарственных средств, свидетельствовало о хорошей переносимости препаратов. Повторный контроль лабораторных показателей, в том числе анализов крови и мочи, биохимических маркеров, подтверждало безопасность лечения.

Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало антиретровирусную эффективность препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H, обусловленную, очевидно, изменением функциональной активности CD4 рецепторов, что препятствует проникновению ВИЧ в клетки, а также подавлением репликации ВИЧ внутри клетки за счет активации процессов транскрипции мРНК противовирусных белков. Установлено, что снижение вирусной нагрузки, отмеченное в результате 6-недельного приема препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H в дозе 1 таблетка в день, превышает противовирусный эффект, который регистрируется через 6 недель приема монокомпонентного препарата СМД анти-IFN-γ в той же дозе либо продолжающейся по прежней схеме АРТ. Сочетание какого-либо препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4, СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H или СМД анти-IFN с АРТ несколько усиливает противовирусную активность последней, что проявляется в уменьшении среднего значения вирусной нагрузки через 6 недель у большего процента участников исследования.

Показано влияние препаратов СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H на соотношение CD4/CD8 лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов (за счет некоторого увеличения абсолютного количества CD4-клеток), наиболее выраженное при совместном использовании с АРТ. Учитывая одновременное снижение вирусной нагрузки у пациентов, принимающих препараты СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H, можно полагать, что увеличение количества CD4-клеток связано с пополнением популяции этих клеток за счет здоровых (неинфицированных) клеток. Сочетание АРТ с препаратами СМД анти-IFN-γ+анти-CD4, СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H или СМД анти-IFN более эффективно в отношении восстановления иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, чем продолжающаяся АРТ по прежней схеме.

Антиретровирусная активность препаратов СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H позволяет использовать их с профилактической и лечебной целью как у «наивных» ВИЧ-инфицированных пациентов, так и у лиц, получающих АРТ.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к вирусологии, и касается профилактики инфицирования ВИЧ, комплексной профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа. Для этого вводят композицию, содержащую один или несколько антиретровирусных препаратов в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ. Это обеспечивает эффективное ингибирование репликации ВИЧ при уменьшении концентрации антиретровирусных препаратов и повышение концентрации лимфоцитов у данной группы больных. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ профилактики инфицирования ВИЧ, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа, включающий введение одного или нескольких антиретровирусных препаратов, отличающийся тем, что одновременно и сочетано вводят активированную-потенцированную формы антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что активированную-потенцированную форму антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ, используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе матричного-исходного раствора антител в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антиретровирусного препарата используют препарат, выбранный из группы: нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеазы, ингибиторы слияния.

4. Способ по п.1 или 3, отличающийся тем, что в качестве активированной-потенцированной формы антител к белку или пептиду иммунной системы, используют активированную-потенцированную форму антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или активированную-потенцированную форму антител к растворенным антигенам.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве антигена, связанного с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют рецепторы иммунокомпетентных клеток.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве антигена, связанного с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют кластеры дифференцировки.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что в качестве растворенного антигена используют цитокины.

8. Способ по п.4, отличающийся тем, что активированную-потенцированную форму антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ, получают путем многократного последовательного разведения матричного-исходного раствора антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или антител к растворенным антигенам в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

9. Композиция для профилактики инфицирования ВИЧ, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа, включающая один или несколько антиретровирусных препаратов, отличающаяся тем, что дополнительно содержит активированную-потенцированную форму антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ.

10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что в качестве антиретровирусного препарата используют препарат, выбранный из группы: нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеазы, ингибиторы слияния, ингибиторы созревания, ингибиторы раздевания вируса, ингибиторы транскрипции, ингибиторы трансляции.

11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что в качестве активированной-потенцированной формы аффинно очищенных антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ, содержит активированную-потенцированную форму антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или активированную-потенцированную форму антител к растворенным антигенам.

12. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что в качестве антигена, связанного с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют рецепторы иммунокомпетентных клеток.

13. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что в качестве антигена, связанного с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют кластеры дифференцировки.

14. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что в качестве растворенного антигена используют цитокины.

15. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что активированную-потенцированную форму антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или активированную-потенцированную форму антител к растворенным антигенам используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного-исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

16. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что активированную-потенцированную форму антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или активированную-потенцированную форму антител к растворенным антигенам получают путем многократного последовательного разведения матричного-исходного - раствора антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или антител к растворенным антигенам в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

17. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что содержит антиретровирусный препарат на основе действующего вещества Зидовудина в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к интерферону - гамма человека.