КОМПЛЕКСНОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2014 года по МПК A61K39/00 A61P31/12 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для эффективной профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний, включая, например, острые и хронические вирусные инфекции, острый вирусный гепатит А, В, С и другие вирусные гепатиты, герпесвирусные инфекции, грипп различных типов, в том числе, грипп А и Б.

Из уровня техники известно лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний, в том числе вирусной этиологии, на основе активированной формы сверхмалых доз антител к интерферону (RU 2192888 C1, A61K 39/395, 20.11.2002). Однако данное лекарственное средство может быть недостаточно эффективно для лечения широкого спектра острых и хронических инфекционных вирусных заболеваний, включая, например, острый вирусный гепатит А, В, С и другие вирусные гепатиты, герпесвирусные инфекции.

Изобретение направлено на создание комплексного лекарственного средства без выраженных побочных эффектов, обеспечивающего как эффективную первичную профилактику инфекционных вирусных заболеваний, так и лечение широкого спектра инфекционных вирусных заболеваний.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что комплексное лекарственное средство для профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний, согласно изобретению, содержит смесь нескольких компонентов, каждый из которых представлен в виде активированной-потенцированной формы антител к антигену-белку или пептиду иммунной системы, участвующему в патогенезе инфекционного вирусного заболевания.

При этом по меньшей мере один из компонентов заявленного лекарственного средства может представлять собой активированную-потенцированную форму антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы.

Кроме того, по меньшей мере один из компонентов заявленного лекарственного средства может представлять собой активированную-потенцированную форму антител к растворенному антигену (или растворимому антигену, т.е. антигену, не связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы).

При этом в качестве растворенного антигена возможно использовать цитокины.

В качестве антигена, связанного с наружной мембраной клеток иммунной системы, можно использовать рецепторы иммунокомпетентных клеток.

При этом в качестве рецепторов иммунокомпетентных клеток можно использовать кластеры дифференцировки.

Кроме того, активированную-потенцированную форму антител к растворенным антигенам и активированную-потенцированную форму антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, при этом конечные разведения содержат сверхмалые дозы (СМД) антител.

Комплексное лекарственное средство может быть выполнена в виде фармацевтической композиции в твердой лекарственной форме и содержать технологически необходимое (эффективное) количество нейтрального носителя, насыщенного смесью водных или водно-спиртовых растворов активированной-потенцированной формы антител к растворенным антигенам и активированной-потенцированной формы антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и фармацевтически приемлемые добавки, которые включают, например, лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Предпочтительно водные или водно-спиртовые растворы активированных-потенцированных форм антител к растворенным антигенам и к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, могут быть получены путем многократного последовательного разведения матричного - исходного - раствора антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или антител к растворенному антигену в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

Каждый из компонентов на основе сверхмалых доз антител могут использовать в виде смеси различных, преимущественно сотенных, разведении, приготовленных по гомеопатической технологии.

Кроме того, решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний, согласно изобретению, используют смесь (комплекс) нескольких компонентов в виде активированных-потенцированных форм антител к различным белкам или пептидам иммунной системы, участвующим в патогенезе инфекционного вирусного заболевания.

При этом в заявленном способе одновременно и сочетано используют активированную-потенцированную форму антител к растворенному антигену и активированную-потенцированную форму антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы.

В качестве антигена, связанного с наружной мембраной клеток иммунной системы, можно использовать рецепторы иммунокомпетентных клеток.

В качестве рецепторов иммунокомпетентных клеток можно использовать кластеры дифференцировки.

В качестве растворенных антигенов можно использовать цитокины.

При этом смесь активированных-потенцированных форм антител используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора каждого компонента, активность которого обусловлена процессом многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

Предпочтительно используют приготовленные в виде единого лекарственного препарата - одной лекарственной формы смесь различных разведении антител к растворенному антигену в сочетании со смесью различных разведении антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, приготовленных по гомеопатической технологии.

Водные или водно-спиртовые растворы активированных-потенцированных форм антител к растворенным антигенам и к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, могут быть получены путем многократного последовательного разведения матричного - исходного - раствора антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или антител к растворенным антигенам в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

Согласно изобретению, активированной-потенцированной формой является форма антител к антигену, приготовленная по гомеопатической технологии потенцирования путем многократного последовательного разведения матричного - исходного - раствора антител в сочетании с внешним воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения, которая обладает активностью в фармакологических моделях и/или клинических методах профилактики инфицирования ВИЧ, профилактики и эффективного лечения инфекционных вирусных заболеваний.

Предложенное сочетание активированных-потенцированных форм антител к растворенным антигенам (например, к гамма-интерферону человека) и антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы (например, к CD4 рецептору) в заявленном лекарственном средстве обеспечивает получение неожиданного синергетического терапевтического эффекта, экспериментально подтвержденного на адекватной модели, который заключается в высокой эффективности препарата как при профилактике, так и при лечении широкого спектра инфекционных заболеваний, что обусловлено повышенным иммунотропным действием компонентов, например, усилением интерферон-зависимой активации CD4 лимфоцитов и увеличением числа рецепторов на поверхности CD4 клеток, рецепторов к гамма-интерферону, усилением противовирусной активности.

Лекарственное средство готовят, преимущественно, следующим образом.

Для приготовления активированной-потенцированной формы действующих компонентов используют моноклональные или, преимущественно, поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям-методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г. Фримеля, М., «Медицина», 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридомных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.

Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемым в соответствии с изобретением веществом - антигеном или конъюгированным антигеном (например, гамма-интерфероном человека или CD4 рецептором). В результате проведения такой процедуры получают моноспецифическую антисыворотку с высоким содержанием антител, которую и используют для получения активированной-потенцированной формы. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Предпочтительным для приготовления заявленного комплексного лекарственного средства является использование поликлональных антител - например, к гамма-интерферону человека, и, например к CD4 рецептору, которые в качестве матричного (исходного) раствора с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, используют для последующего приготовления активированной-потенцированной формы.

Предпочтительной для приготовления каждого компонента является использование смеси трех водно-спиртовых разведении первичного матричного раствора антител, разведенных, соответственно, в 100¹², 100³⁰, и 100⁵⁰ раз, что эквивалентно сотенным разведениям С12, С30 и С50, приготовленным по гомеопатической технологии. При выполнении заявленного лекарственного средства в твердой лекарственной форме на лактозу наносится смесь указанных компонентов.

Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного средства является использование поликлональных антител, например к гамма-интерферону человека, и, например, к CD4 рецептору, которые могут быть получены иммунизацией кроликов следующим образом.

Для получения поликлональных антител к гамма-интерферону человека в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов используют адъювант и, например, цельную молекулу гамма-интерферона человека следующей последовательности:

1 MKYTSYILAF QLCIVLGSLG CYCQDPYVKE AENLKKYFNA GHSDVADNGT LFLGILKNWK

61 EESDRKIMQS QIVSFYFKLF KNFKDDQSIQ KSVETIKEDM NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN

121 YSVTDLNVQR KAIHELIQVM AELSPAAKTG KRKRSQMLFR GRRASQ

Возможно для получения поликлональных антител к гамма-интерферону человека в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов использование адъюванта и, например, одного полипептидного фрагмента гамма-интерферона человека, выбранного из следующих последовательностей:

7-55:

ILAF QLCIVLGSLG CYCQDPYVKE AENLKKYFNA GHSDV

24-166:

QDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKA IHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFRGR RASQ

24-166:

QDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKA IHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFQGR RASQ

69-123:

QS QIVSFYFKLF KNFKDDQSIQ KSVETIKEDM NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN YSV

100-145:

M NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN YSVTDLNVQR KAIHELIQVM AELSP

92-130:

SVETIKEDM NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN YSVTDLNVQR

123-147:

VTDLNVQR KAIHELIQVM AELSPAA

24-166:

MQDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKA IHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFQGR RASQ

5-45:

SYILAF QLCIVLGSLG CYCQDPYVKE AENLK

94-114:

ETIKEDM NVKFFNSNKK KRDD,

24-166:

MQDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKA IHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFRGR RASQ

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°С) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Можно добавлять к антисыворотке 20% NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранить до использования в замороженном состоянии при температуре -20°С (или без добавления NaN₃ - при температуре -70°). Ввыделение из антисыворотки антител к гамма-интерферону возможно следующим образом:

1. 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°С;

2. выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

3. после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

4. фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Очистку антител производят методом аффинной хроматографии на колонке с антигеном, путем связывания антител к гамма-интерферону с антигеном (гамма-интерферон), прикрепленным к нерастворимому матриксу колонки, с последующим элюированием антител концентрированными растворами соли.

Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных кроличьих антитела к гамма-интерферону человека, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (исходного) раствора для последующего приготовления активированной-потенцированной формы.

Поликлональные антитела к CD4 рецептору получают по вышеуказанному способу, используя в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов адъювант и цельную молекулу или один полипептидный фрагмент CD4 рецептора, выбранный, например, из следующих аминокислотных последовательностей:

412-458:

IGLGIFFCV RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR FQKTCSPI

26-60:

MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGD

105-119:

A DSRRSLWDQG NFPL

115-139:

G NFPLIIKNLK IEDSDTYICE VEDQ

26-458:

MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ FHWKNSNQIK ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK IEDSDTYICE VEDQKEEVQL LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV VLAFQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE KLTGSGELWW QAERASSSKS WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA LEAKTGKLHQ EVNLVVMRAT QLQKNLTCEV WGPTSPKLML SLKLENKEAK VSKREKAVWV LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKVLPTW STPVQPMALI VLGGVAGLLL FIGLGIFFCV RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR FQKTCSPI

Полученные таким образом буферные растворы каждого компонента поликлональных антител к гамма-интерферону человека и к CD4 рецептору с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл используют в качестве матричных (исходных) растворов для последующего приготовления активированных-потенцированных форм лекарственного средства.

Активированную-потенцированную форму каждого компонента готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части каждого подвергаемого разведению раствора, начиная с упомянутого матричного раствора, в 9 частях (для десятичного разведения D) или в 99 частях (для сотенного разведения С) или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя в сочетании с многократным вертикальным встряхиванием (потенцированием, или "динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции-кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В. Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29).

Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С12 одну часть матричного (исходного) раствора антител, например к гамма-интерферону человека (или, например антител к CD4 рецептору) с концентрацией 2,5 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают - потенцируют, получая 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С1 разведения приготовляют 2-ое сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно 12 раз в разных емкостях 1-ой части исходного матричного раствора антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 2,5 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, т.е. раствор, полученный разведением матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведении С 30 и С 50.

При использовании, например, активированной-потенцированной формы антител к гамма-интерферону человека (или, например антител к CD4 рецептору) в виде смеси различных, преимущественно сотенных, разведении каждое разведение (например, С12, С30, С50) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до разведения на 3 разведения меньше, чем конечное (соответственно, до получения С9, С27, С47), и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения). Далее полученную смесь последовательно дважды разводят в соотношении 1 к 100, потенцируя полученный раствор после каждого разведения. При этом получают активированную-потенцированную форму антител, например, к гамма-интерферону человека (или, например антител к CD4 рецептору) в сверхмалой дозе, полученной разведением матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных разведении С12, С30, С50.

Возможно использование каждого компонента в виде смеси других различных, разведении, например, десятичных и или сотенных, (D20, С30, С100 или С12, С30, С50 и т.д.), приготовленных по гомеопатической технологии, эффективность которых определяют экспериментально.

Для получения лекарственного средства водные или водно-спиртовые растворы действующих веществ компонентов смешивают, преимущественно, в объемном соотношении 1:1 и используют в жидкой лекарственной форме.

Заявленное лекарственное средство может быть использовано и в твердой лекарственной форме в виде фармацевтической композиции, которая содержит технологически необходимое (эффективное) количество нейтрального носителя - например, лактозы - насыщенного путем пропитывания до насыщения смесью, приготовленных по вышеуказанной технологии, водных или водно-спиртовых растворов активированных-потенцированных форм антител, например к гамма-интерферону человека, и, например к CD4 рецептору и фармацевтически приемлемые добавки, включающие, преимущественно, лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Для получения твердой оральной формы заявленного лекарственного средства производят в установке кипящего слоя (например, типа «Hüttlin Pilotlab» производства компании Hüttlin GmbH) орошение до насыщения вводимых в псевдоожиженный - кипящий слой гранул нейтрального вещества - лактозы (молочного сахара) с размером частиц 50÷500 мкм, предварительно полученным водным или водно-спиртовым раствором активированной-потенцированной формы антител к CD4 рецептору, преимущественно, в соотношении 1 кг раствора антител на 5 или 10 кг лактозы (1:5-1:10) с одновременной сушкой в потоке подаваемого под решетку нагретого воздуха при температуре не выше 40°С. Расчетное количество лактозы (10÷91% от таблеточной массы), насыщенной активированной-потенцированной формой антител по вышеуказанной методике, загружают в смеситель и смешивают с лактозой, увлажненной активированной-потенцированной формой антител, в количестве 3÷10% таблеточной массы и с чистой лактозой в количестве не более 84% от таблеточной массы (для снижения стоимости и некоторого упрощения и ускорения технологического процесса без снижения эффективности лечебного воздействия). Затем в эту смесь добавляют микрокристаллическую целлюлозу в количестве 5÷10% от таблеточной массы и стеарат магния в количестве 1% от таблеточной массы. Полученную таблеточную массу равномерно перемешивают и таблетируют прямым сухим прессованием (например, в таблет-прессе Korsch-XL 400). После таблетирования получают таблетки массой 300 мг, пропитанные водно-спиртовым раствором активированной-потенцированной формой антител к гамма-интерферону человека и к CD4 рецептору в сверхмалой дозе, каждого компонента, приготовленной из матричного раствора, разведенного в 100¹², в 100³⁰ в 100⁵⁰, что эквивалентно смеси сотенных разведении С12, С30 и С50, приготовленных по гомеопатической технологии.

Предпочтительно заявленное лекарственное средство рекомендуется принимать по 1-2 таблетке 2-4 раза в день.

Для проведения экспериментальных исследований были использованы антитела, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой.

Пример 1.

Противовирусное действие заявленного лекарственного препарата изучали на модели ВИЧ, ингибируя репликацию ВИЧ в культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI. Эффективность ингибирования репликации ВИЧ оценивали по содержанию основного нуклеокапидного белка р24 ВИЧ в супернатантах.

Для проведения экспериментальных исследований были использованы аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела к фактору некроза опухоли альфа и аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела к гамма-интерферону, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой, на основе которых были приготовлены активированные-потенцированные формы антител к гамма-интерферону и антител к фактору некроза опухоли альфа в сверхмалой дозе в виде смеси разведении С12+С30+С200, полученных по гомеопатической технологии (далее комплексный препарат).

Оценка противовирусной активности комплексного препарата проводилась с использованием мононуклеарных клеток периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAL

Мононуклеары периферической крови человека были выделены из крови здоровых серонегативных доноров при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака. Клетки активировали в течение 3 дней с использованием 1 мкг/мл фитогеммаглютина Р и 5 МЕ/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека.

Для оценки антиретровирусной активности препараты вносили в лунку, содержащую 100 мкл активированных мононуклеаров периферической крови человека, за 24 часа или через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI в дозе 100 TCID50 (50 мкл инокулята штамма ВИЧ-1-LAI). Перед внесением в лунку, комплексный препарат (12,5 мкл) или азидотимидин (действующее вещество - зидовудин) в дозе 1000 нМ (препарат сравнения) смешивали со средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения конечного объема в 50 мкл.

Супернатанты культуры клеток были собраны на 7 день после заражения. Эффективность препаратов определяли по ингибированию репликации ВИЧ, которая оценивалась по содержанию основного нуклеосапидного белка ВИЧ р24 в супернатантах клеток методом ИФА (Retrotek Elisa kit).

Показано, что комплексный препарат ингибируют репликацию ВИЧ на 91±3% при внесении в лунку за 24 часа до, и на 34±30% при внесении в лунку через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI, соответственно. Азидотимидин в дозе 1000 нМ ингибировал репликацию ВИЧ на 99±0 и 99±1% при внесении в лунку за 24 часа до и через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI, соответственно.

Таким образом, в in vitro исследовании показана высокая противовирусная активность комбинации сверхмалых доз кроличьих поликлональных антител к фактору некроза опухоли-альфа и кроличьих поликлональных антител к интерферону-гамма (смесь гомеопатических разведении С12+С30+С200).

Примечание:

- TCID50-доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани.

Пример 2.

Противовирусное действие заявленного лекарственного препарата изучали на модели ВИЧ, ингибируя репликацию ВИЧ в культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI. Эффективность ингибирования репликации ВИЧ оценивали по содержанию основного нуклеокапидного белка р24 ВИЧ в супернатантах.

Для проведения экспериментальных исследований были использованы аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела к интерферону-альфа, аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела к гамма-интерферону, аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела к CD4 рецептору Т-лимфоцитов и аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела к CD8 рецептору Т-лимфоцитов, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой, на основе которых были приготовлены активированные-потенцированные формы антител к гамма-интерферону, антител к интерферону-альфа, антител к CD4 рецептору Т-лимфоцитов и антител к CD8 рецептору Т-лимфоцитов в сверхмалой дозе в виде смеси разведении С12+С30+С50, полученных по гомеопатической технологии (далее комплексный препарат).

Оценка противовирусной активности комплексного препарата проводилась с использованием мононуклеарных клеток периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI.

Мононуклеары периферической крови человека были выделены из крови здоровых серонегативных доноров при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака. Клетки активировали в течение 3 дней с использованием 1 мкг/мл фитогеммаглютина Р и 5 МЕ/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека.

Для оценки антиретровирусной активности препараты вносили в лунку, содержащую 100 мкл активированных мононуклеаров периферической крови человека, за 24 часа или через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI в дозе 100 TCID50 (50 мкл инокулята штамма ВИЧ-1-LAI). Перед внесением в лунку, комплексный препарат (12,5 мкл) или азидотимидин (действующее вещество - зидовудин) в дозе 1000 нМ (препарат сравнения) смешивали со средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения конечного объема в 50 мкл.

Супернатанты культуры клеток были собраны на 7 день после заражения. Эффективность препаратов определяли по ингибированию репликации ВИЧ, которая оценивалась по содержанию основного нуклеосапидного белка ВИЧ р24 в супернатантах клеток методом ИФА (Retrotek Elisa kit).

Показано, что комплексный препарат ингибирует репликацию ВИЧ на 94±6% при внесении в лунку за 24 часа до, и на 46±13% при внесении в лунку через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI, соответственно. Азидотимидин в дозе 1000 нМ ингибировал репликацию ВИЧ на 99±0 и 99±1% при внесении в лунку за 24 часа до и через 15 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI, соответственно.

Таким образом, в in vitro исследовании показана высокая противовирусная активность комбинации сверхмалых доз кроличьих поликлональных антител к интерферону-альфа, кроличьих поликлональных антител к интерферону-гамма, кроличьих поликлональных антител к CD4, кроличьих поликлональных антител к CD8 (смесь гомеопатических разведении С12+С30+С50).

Примечание:

- TCID50-доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани.

Пример 1

Исследование эффективности применения заявленного комплексного лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к альфа-интерферону человека в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50, и активированные-потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к ИФН-α + СМД AT к CD4) в соотношении компонентов 1:1, а также лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к интерферону альфа в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к ИФН-α) и лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к CD4) в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c проводилось на базе ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России в два этапа. В первом этапе была исследована эффективность препарата СМД AT к ИФН-α и препарата СМД AT к CD4, во втором этапе была исследована эффективность применения препарата СМД AT к ИФН-α + СМД AT к CD4. Как при тестировании препарата СМД AT к ИФН-α + СМД AT к CD4, так и при тестировании препарата СМД AT к ИФН-α и препарата СМД AT к CD4, в качестве препарата сравнения использовали препарат озельтамивир, в качестве контроля мышам (n=20) вводили дистиллированную воду (контрольная группа).

Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50 (доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани).

Препарат СМД AT к ИФН-α, препарат СМД AT к CD4 и препарат СМД AT к ИФН-α + СМД AT к CD4 вводили мышам (n=20 в каждой группе) интрагастрально по 0,2 мл/мышь два раза в сутки (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 суток до инфицирования и в течение 10 суток после инфицирования вирусом гриппа A/California/07/2009swl (H1N1). Дополнительно препарат СМД AT к ИФН-α, препарат СМД AT к CD4 и препарат СМД AT к ИФН-α + СМД AT к CD4 были добавлены в поилки к животным соответствующих экспериментальных групп. Поилки находились в свободном доступе.

Препарат сравнения озельтамивир вводили мышам (n=20) интрагастрально два раза в сутки в дозе 10 мг/кг (суточная доза 20 мг/кг), начиная за 1 час до инфицирования вирусом гриппа A/California/07/2009swl (H1N1). Препарат озельтамивир вводили в течение 5 суток после инфицирования. В течение 4 суток до инфицирования и начиная с 6 суток после инфицирования мышам данной экспериментальной группы вместо озельтамивира интрагастрально вводили дистиллированную воду по 0,2 мл/мышь два раза в сутки (суточная доза 0,4 мл/мышь).

В контрольной группе мышам (n=20) интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь). На протяжении всего исследования в поилках животных данных двух экспериментальных групп была дистиллированная вода. Поилки находились в свободном доступе.

Эффективность препаратов оценивали по выживаемости животных. Результаты исследования противовирусной активности препарата СМД AT к ИФН-α и препарата СМД AT к CD4 (этап 1) отражены в таблице 1, результаты исследования противовирусной активности препарата СМД AT к ИФН-α + СМД AT к CD4 (этап 2) отражены в таблице 2. Статистическую значимость различий между экспериментальными группами и контролем (дистиллированная вода) рассчитывали с использованием непараметрического критерия хи-квадрат.

Таблица 1. Результаты исследования противовирусной активности препарата СМД AT к ИФН-α и препарата СМД AT к CD4 на модели гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c, инфицированных интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl CH1N1) в дозе 10ЛД50 (10 сутки после инфицирования). № п/п Экспериментальная группа Выживаемость, % 10ЛД50 Разность между % выживаемости в группе, получавшей препарат, и % выживаемости в группе, получавшей дистиллированную воду 1. СМД AT к ИФН-α 25 +5% 2. СМД AT к CD4 30 +10% 3. Озельтамивир (препарат сравнения) 80* +60% 4. Дистиллированная вода (контроль) 20 - * - р<0,05 (достоверность отличия от контроля).

Таблица 2. Результаты исследования противовирусной активности препарата СМД AT к ИФН-α + СМД AT к CD4 на модели гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c, инфицированных интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50 (10 сутки после инфицирования). № п/п Экспериментальная группа Выживаемость, %
10ЛД50 Разность между % выживаемости в группе, получавшей препарат, и % выживаемости в группе, получавшей дистиллированную воду 1. Препарат СМД AT к ИФН-α+ СМД AT к CD4, соотношение 1:1 30* +25% 2. Озельтамивир (препарат сравнения) 70* +65% 3. Дистиллированная вода (контроль) 5 - * - р<0,05 (достоверность отличия от контроля).

Показано, что выживаемость мышей, инфицированных гриппом A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50, на этапе 1 исследования была выше, чем на этапе 2: выживаемость в группе, получавших дистиллированную воду, составила 20% и 5%, соответственно; выживаемость в группе препарата сравнения озельтамивира составила 80% и 70%, соответственно. Это свидетельствует о более выраженном летальном эффекте, индуцированном интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50, на этапе 2 исследования.

При этом, препарат СМД AT к ИФН-α + СМД AT к CD4 на 25% по сравнению с контролем повышал выживаемость экспериментальных животных, инфицированных вирусом гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50, в то время как выживаемость в группе, получавшей препарат СМД AT к ИФН-α была всего на 5% выше выживаемости в группе контроля, а выживаемость в группе, получавшей препарат СМД AT к CD4 была всего на 10% выше выживаемости в группе контроля.

Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что применение препарата СМД AT к ИФН-α + СМД AT к CD4 оказывает более выраженный противовирусный эффект, чем применение препарата СМД AT к ИФН-α или препарата СМД AT к CD4, не смотря на то, что доза каждого компонента в составе препарата СМД AT к ИФН альфа + СМД AT к CD4 в два раза ниже, чем доза компонентов в составе препарата СМД AT к ИФН альфа и доза компонентов в составе препарата СМД AT к CD4, протестированных в качестве отдельных препаратов.

Пример 2.

Исследование эффективности применения заявленного комплексного лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к фактору некроза опухоли альфа в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³, 100 раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 и активированные-потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к ФНО-α + СМД AT к CD4) в соотношении 1:1, а также лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к фактору некроза опухоли альфа в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹, 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к ФНО-α) и лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к CD4) в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c проводилось на базе ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России в два этапа. В первом этапе была исследована эффективность препарата СМД AT к ФИО-α и препарата СМД AT к CD4, во втором этапе была исследована эффективность применения СМД AT к ФИО-α + СМД AT к CD4. В качестве препарата сравнения использовали озельтамивир, контрольной группе давали дистиллированную вода (контроль).

Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50 (доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани).

Препарат СМД AT к ФНО-α, препарат СМД AT к CD4, а также препарат СМД AT к ФНО-α + СМД AT к CD4 вводили мышам (n=20 в каждой группе) интрагастрально по 0,2 мл/мышь два раза в сутки (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 суток до инфицирования и в течение 10 суток после инфицирования. Дополнительно препарат СМД AT к ФНО-α, препарат СМД AT к CD4, а также препарат СМД AT к ФНО-α + СМД AT к CD4 были добавлены в поилки к животным соответствующих экспериментальных групп. Поилки находились в свободном доступе.

Препарат сравнения озельтамивир вводили мышам (n=20) интрагастрально два раза в сутки в дозе 10 мг/кг (суточная доза 20 мг/кг), начиная за 1 час до инфицирования. Препарат вводили в течение 5 суток после инфицирования вирусом гриппа A/California/07/2009swl (H1N1). В течение 4 суток до инфицирования и начиная с 6 суток после инфицирования мышам данной экспериментальной группы вместо озельтамивира интрагастрально вводили дистиллированную воду по 0,2 мл/мышь два раза в сутки (суточная доза 0,4 мл/мышь).

В контрольной группе мышам (n=20) интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь). На протяжении всего исследования в поилках животных данных двух экспериментальных групп была дистиллированная вода. Поилки находились в свободном доступе.

Эффективность препаратов оценивали по выживаемости животных. Результаты исследования противовирусной активности препарата СМД AT к ФИО-α и препарата СМД AT к CD4 (этап 1) приведены в таблице 3, результаты исследования противовирусной активности препарата СМД AT к ФНО-α + СМД AT к CD4 (этап 2) приведены в таблице 4. Статистическую значимость различий между экспериментальными группами и контролем (дистиллированная вода) рассчитывали с использованием непараметрического критерия хи-квадрат.

Таблица 3. Результаты исследования противовирусной активности препарата СМД AT к ФНО-α и препарата СМД AT к CD4 на модели гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c, инфицированных интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50 (10 сутки после инфицирования). № п/п Экспериментальная группа Выживаемость, % 10ЛД50 Разность между % выживаемости в группе, получавшей препарат, и % выживаемости в группе, получавшей дистиллированную воду 1. СМД AT к ФНО-α 25 +5% 2. СМД AT к CD4 30 +10% 3. Озельтамивир (препарат сравнения) 80* +60% 4. Дистиллированная вода (контроль) 20 - * - р<0,05 (достоверность отличия от контроля).

Таблица 4. Результаты исследования противовирусной активности препарата СМД AT к ФНО-α + СМД AT к CD4 на модели гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c, инфицированных интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50 (10 сутки после инфицирования). № п/п Экспериментальная группа Выживаемость, % 10ЛД50 Разность между % выживаемости в группе, получавшей препарат, и % выживаемости в группе, получавшей дистиллированную воду 1. СМД AT к ФНО-α + СМД AT к CD4, в соотношении 1:1 30* +25% 2. Озельтамивир (препарат сравнения) 70* +65% 3. Дистиллированная вода (контроль) 5 - * - р<0,05 (достоверность отличия от контроля).

Показано, что выживаемость мышей, инфицированных гриппом A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50, на этапе 1 исследования была выше, чем на этапе 2: выживаемость в группе, получавших дистиллированную воду, составила 20% и 5%, соответственно; выживаемость в группе препарата сравнения озельтамивира составила 80% и 70%, соответственно. Это свидетельствует о более выраженном летальном эффекте, индуцированном интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50, на этапе 2 исследования.

При этом, препарат СМД AT к ФИО-α + СМД AT к CD4 на 25% по сравнению с контролем повышал выживаемость экспериментальных животных, инфицированных вирусом гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50, в то время как выживаемость в группе, получавшей препарат СМД AT к ФНО-α была всего на 5% выше выживаемости в группе контроля, а выживаемость в группе, получавшей препарат СМД AT к CD4 была всего на 10% выше выживаемости в группе контроля.

Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что применение препарата СМД AT к ФНО-α + СМД AT к CD4 оказывает более выраженный противовирусный эффект, чем применение препарата СМД AT к ФНО-α или препарата СМД AT к CD4, не смотря на то, что доза каждого компонента в составе препарата СМД AT к ФНО-α + СМД AT в два раза ниже, чем доза компонентов в препарате СМД AT к ФНО-α и в препарате СМД AT к CD4, протестированных в качестве отдельных препаратов.

Пример 3.

Оценка антиретровирусной активности заявленного комплексного лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к интерферону альфа в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50, активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к интерферону гамма в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50, активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 и активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD8 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 в соотношении 1:1:1:1 (СМД AT к ИФН-α + ИФН-γ + CD4 + CD8), проводилась с использованием мононуклеарных клеток периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI. В качестве препарата сравнения использовали азидотимидин (Sigma-AZ169-100 mg, лот 107 K1578).

Мононуклеары периферической крови человека были выделены из крови здорового серонегативного донора при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака. Клетки активировали в течение 3 дней с использованием 1 мкг/мл фитогемагглютина Р и 5 МЕ/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека в среде RPMI1640 (DIFCO) с 10% фетальной телячьей сывороткой (комплемент был удален нагреванием в течение 45 минут при температуре 56°С), 1% раствором антибиотиков (PSN Gibco, содержащего 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл неомицина).

Клетки заражали штаммом ВИЧ-1-LAI, внося 50 мкл инокулята штамма ВИЧ-1-LAI, что соответствует дозе 100 TCID50 (доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани).

Для оценки антиретровирусной активности препарат СМД AT к ИФН-α + ИФН-γ + CD4 + CD8 и препарат сравнения азидотимидин вносили в лунки через 15-30 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI. На 7 сутки после инфицирования клеток был собран супернатант, использованный для оценки влияния препаратов на ингибирование репликации ВИЧ.

Перед внесением в лунки, содержащие 150 мкл клеточной культуры, препарат СМД AT к ИФН-α + ИФН-γ + CD4 + CD8 разводили средой RPMI1640 (DIFCO) в 4 раза (степень разведения 1/4) до достижения конечного объема в 50 мкл, препарат азидотимидин разводили средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения концентрации 8 нМ.

Эффективность препаратов определяли по ингибированию репликации ВИЧ, которую оценивали по ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ в супернатантах мононуклеаров периферической крови человека с использованием HIV RT RetroSys набора производства INNOVAGEN (лот 10-059С). Для вычисления % ингибирования репликации ВИЧ в качестве контроля использовали супернатант клеток, к которым не вносили препарат СМД AT к ИФН-α + ИФН-γ + CD4 + CD8 и препарат азидотимидин (Таблица 5).

Таблица 5. Антиретровирусная активность препарата СМД AT к ИФН-α + ИФН-γ + CD4 + CD8 с использованием мононуклеарных клетках периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI Препарат Степень разведения препарата в среде RPMI1640 (DIFCO) Ингибирование ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ (% от контроля) 7 сутки СМД AT к ИФН-α + ИФН-γ + CD4 + CD8, в соотношении 1:1:1:1 1/4 81±11 Азидотимидин (8 нМ) - 58±7

Таким образом, в условиях данной экспериментальной модели показано, что препарат СМД AT к ИФН-α + ИФН-γ + CD4 + CD8B соотношении 1:1:1:1 обладает антиретровирусной активностью.

Пример.4

Оценка антиретровирусной активности заявленного комплексного лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 и активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител интерферону гамма в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 в соотношении 1:1 (СМД AT к CD4+ ИФН-γ), а также лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к CD4) и лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к интерферону гамма в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к ИФН-γ), проводилась с использованием мононуклеарных клеток периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI. В качестве препарата сравнения использовали азидотимидин (Sigma-AZ169-100 mg, лот 107 K1578).

Мононуклеары периферической крови человека были выделены из крови здорового серонегативного донора при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака. Клетки активировали в течение 3 дней с использованием 1 мкг/мл фитогемагглютина Р и 5 МЕ/мл рекомбинантного интерлейкина-2 человека в среде RPMI1640 (DIFCO) с 10% фетальной телячьей сывороткой (комплемент был удален нагреванием в течение 45 минут при температуре 56°С), 1% раствором антибиотиков (PSN Gibco, содержащего 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл неомицина).

Клетки заражали штаммом ВИЧ-1-LAI, внося 50 мкл инокулята штамма ВИЧ-1-LAI, что соответствует дозе 100 TCID50 (доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани).

Для оценки антиретровирусной активности препараты вносили в лунки через 15-30 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI. На 7 сутки после инфицирования клеток был собран супернатант, использованный для оценки влияния препаратов на ингибирование репликации ВИЧ.

Перед внесением в лунки, содержащие 150 мкл клеточной культуры, препараты разводили средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения конечного объема в 50 мкл. Препарат СМД AT к CD4 и препарат СМД AT к ИФН-γ разводили в среде RPMI1640 (DIFCO) в 8 раз (степень разведения 1/8), а препарат СМД AT к CD4+ ИФН-γ разводили в среде RPMI1640 (DIFCO) в 4 раза (степень разведения 1/4). Таким образом, количество компонентов препарата СМД AT к CD4+ ИФН-γ, вносимых в экспериментальную лунку при тестировании, идентично количеству компонентов препарата СМД AT к CD4 и компонентов препарата СМД AT к ИФН-γ а тестируемых в качестве монопрепаратов, что позволяет провести сравнение эффективности препарата СМД AT к CD4+ ИФН-γ с его отдельными компонентами, входящими в его состав. Препарат сравнения азидотимидин развели средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения концентрации 8 нМ.

Эффективность препаратов определяли по ингибированию репликации ВИЧ, которую оценивали по ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ в супернатантах мононуклеаров периферической крови человека с использованием HIV RT RetroSys набора производства INNOVAGEN (лот 10-059С). Для вычисления % ингибирования репликации ВИЧ в качестве контроля использовали супернатант клеток, к которым не вносили тестируемые препараты или азидотимидин (Таблица 6).

Таблица 6. Антиретровирусная активность препаратов с использованием мононуклеарных клетках периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI Препарат Степень разведения препарата в среде RPMI1640 (DIFCO) Ингибирование ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ (% от контроля) 7 сутки СМД AT к CD4+ ИФН-γ 1/8 0±5 СМД AT к CD4 1/8 67±22 СМД AT к CD4+ ИФН-γ, в соотношении 1:1 1/4 85±1 Азидотимидин (8 нМ) - 58±7

Таким образом, в условиях данной экспериментальной модели показано, что антиретровирусная активность препарата СМД AT к CD4+ ИФН-γ превосходит антиретровирусную активность препарата СМД AT к CD4 и препарата ИФН-γ.

Пример 5.

Оценка антиретровирусной активности заявленного комплексного лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 и активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител интерферону гамма в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 в соотношении 1:1 (СМД AT к CD4+ ИФН-γ), а также лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к CD4) и лекарственного средства, содержащего активированные-потенцированные формы водных разведении поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к интерферону гамма в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к ИФН-γ), проводилась с использованием макрофагов, полученных из мононуклеаров периферической крови человека, и зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-Ba-L. В качестве препарата сравнения использовали азидотимидин (Sigma-AZ169-100 mg, лот 107 K1578).

Макрофаги периферической крови человека были получены из мононуклеарных клеток периферической крови человека, которые были выделены из крови двух здоровых серонегативных доноров при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака. Мононуклеарные клетки периферической крови человека выращивали 3 суток в среде RPMI1640 (DIFCO), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (комплемент был удален нагреванием в течение 45 минут при температуре 56°С), 1% раствором антибиотиков (PSN Gibco, содержащего 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл неомицина), 15 нг/мл ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор). Затем клетки помещали культуральные планшеты (150000 клеток/лунка в 48-луночном планшете), выращивали в течение 7 суток совместно с 1 нг/мл ГМ-КСФ и 10 нг/мл М-КСФ (макрофагальный колониестимулирующий фактор) для того, чтобы клетки смоги полностью дифференцироваться в макрофаги.

Клетки заражали штаммом ВИЧ-1-Ba-L, внося 100 мкл инокулята штамма ВИЧ-1-Ba-L, что соответствует дозе 1000 TCID50 (доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани).

Для оценки антиретровирусной активности препараты вносили в лунки за 24 ч до заражения клеток штаммом ВИЧ-1-Ba-L, а также на 3, 7, 10, 14, 17 день после заражения. На 3, 7, 10, 14, 17 сутки после инфицирования клеток был собран супернатант, использованный для оценки влияния препаратов на ингибирование репликации ВИЧ.

Перед внесением в лунки, содержащие 750 мкл клеточной культуры, препараты разводили средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения конечного объема в 250 мкл. Препарат СМД AT к CD4 и препарат СМД AT к ИФН-γ разводили в среде RPMI1640 (DIFCO) в 8 раз (степень разведения 1/8), а препарат СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ разводили в среде RPMI1640 (DIFCO) в 4 раза (степень разведения 1/4). Таким образом, количество компонентов каждого компонента в составе препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ, вносимого в экспериментальную лунку при тестировании, идентично количеству компонентов в составе препарата СМД AT к CD4 и компонентов в составе препарата СМД AT к ИФН-γ, тестируемых в качестве монопрепаратов, что позволяет провести сравнение эффективности препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ с его отдельными компонентами, входящими в его состав. Препарат сравнения азидотимидин разводили средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения концентрации 8 нМ.

Эффективность препаратов определяли по ингибированию репликации ВИЧ, которую оценивали по ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ в супернатантах макрофагов периферической крови человека с использованием HIV RT RetroSys набора производства INNOVAGEN (лот 10-059С). Для вычисления % ингибирования репликации ВИЧ в качестве контроля использовали супернатант клеток, к которым не вносили тестируемые препарат СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ, препарат СМД AT к CD4, препарат СМД AT к ИФН-γ и препарат сравнения азидотимидин (Таблицы 7 и 8).

Таблица 7. Антиретровирусная активность препаратов с использованием макрофагов периферической крови человека (донор №1), зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-Ba-L Препарат Степень разведения препарата в среде RPMI1640 (DIFCO) Ингибирование ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ (% от контроля) 14 сутки 17 сутки 21 сутки СМД AT к ИФН-γ 1/8 24±4 24±4 0±0 СМД AT к CD4 СМД AT к CD4 + 1/8 53±13 37±7 0±0 СМД AT к ИФН-γ, в соотношении 1:1 1/4 69±1 74±9 37±3 Азидотимидин (8 нМ) - 97±1 97±0 98±2

Таблица 8. Антиретровирусная активность препаратов с использованием макрофагов периферической крови человека (донор №2), зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-Ba-L Препарат Степень разведения препарата в среде RPMI1640 (DIFCO) Ингибирование ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ (% от контроля) 14 сутки 17 сутки 21 сутки СМД AT к ИФН-γ 1/8 39±20 0±0 0±0 СМД AT к CD4 1/8 0±0 0±0 0±0 СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ, в соотношении 1:1 1/4 50±5 42±4 30±6 Азидотимидин (8 нМ) - 82±2 54±1 41±1

Таким образом, в условиях данной экспериментальной модели показано, что антиретровирусная активность препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ превосходит антиретровирусную активность препарата СМД AT к ИФН-γ и препарата СМД AT к CD4; антиретровирусная активность препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ сохраняется на протяжении всего эксперимента, в отличие от антиретровирусной активности препарата СМД AT к ИФН-γ и препарата СМД AT к CD4; препарат СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ оказывает антиретровирусную активность на модели in vitro зараженных макрофагов периферической крови человека, полученных от разных серонегативных доноров, что свидетельствует о более выраженном антиретровирусном эффекте препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ, в отличие от препарата СМД AT к ИФН-γ и препарата СМД AT к CD4, антиретровирусная активность которых была выявлена на модели in vitro зараженных макрофагов периферической крови человека, полученных только от одного серонегативного донора.

Пример 6.

Для исследования свойств заявленных лекарственных средств для лечения пациентов группы активного препарата №1 были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных-потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT к ИФН-γ) и CD4 рецептору (AT к CD4) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (СМД AT к ИФН-γ + AT к CD4); для лечения пациентов группы активного препарата №2 были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных-потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT к ИФН-γ), CD4 рецептору (AT к CD4) и гистамину (AT к Н) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (СМД AT к ИФН-γ + AT к CD4+ AT к Н); для лечения пациентов группы активного препарата №3 были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные водно-спиртовым раствором (3 мг/табл.) активированной-потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к гамма интерферону человека, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД AT к ИФН-γ).

Оценку эффективности трех препаратов, содержащих СМД AT к ИФН-γ + AT к CD4, СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4+AT к Н и СМД AT к ИФН-γ, в лечении хронического вирусного гепатита С (ХГС) проводили в ходе сравнительного исследования в параллельных группах с участием 18 больных (14 мужчин и 4 женщины) в возрасте от 27 до 52 лет. Диагноз ХГС подтверждали на основании профиля сывороточных маркеров-AT к HCV и HCV RNA. Все пациенты, включенные в исследование, имели 2 или 3 генотип HCV, малосимптомное медленно прогрессирующее течение ХГС с низкой активностью (менее 3-кратного повышения уровня сывороточных аминотрансфераз, или <100 ЕД/л), ни один из пациентов ранее не получал противовирусной терапии. В исследование не включались пациенты с положительным результатом серологического анализа на HIV, RW, анти-НСА, HBsAg или HBcor Ab, с циррозом печени, тяжелыми сопутствующими заболеваниями в стадии обострения, талассемией или другой гемоглобинопатией, алкогольной и/или лекарственной/наркотической зависимостью, после трансплантации органов, постоянно принимающие иммуносупрессивные препараты, беременные и кормящие ребенка грудью женщины. Пациентам первых трех групп была назначена терапия каким-либо исследуемым препаратом в дозе 1 таблетка 3 раза в день в течение 24 недель: пациентам 1 группы (n=5) - композиция СМД AT к ИФН-γ +АТ к CD4; 2 группы (n=4) - композиция СМД AT к ИФН-γ +АТ к CD4+AT к Н; 3 группы (n=4) - СМД AT к ИФН-γ Контрольную группу (№4) составили 5 пациентов с персистирующей виремией и стойко нормальными уровнями аминотрансфераз (<20 ЕД/л), которым не назначалась какая-либо терапия. В ходе исследования проводились врачебные осмотры, контроль вирусной нагрузки и лабораторных показателей, регистрировалась сопутствующая терапия, возможные нежелательные явления. В качестве критериев эффективности лечения на 24-й неделе оценивались вирусная нагрузка HCV RNA и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ).

Данные по вирусной нагрузке (числу копий HCV RNA), представленные таблице 9 в виде значений медианы (Me), первого и третьего квартилей (Q1, Q3), свидетельствуют о положительной ее динамике, полученной у пациентов 1-3 групп к концу 24-недельной терапии. Прием препарата СМД AT к ИФН-γ + AT к CD4 приводил к уменьшению числа копий HCV RNA у 4 из 5 человек 1 группы, при этом среднее снижение вирусной нагрузки составило 75%. Сходные показатели были получены у пациентов, которые принимали препарат СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4+AT к Н в течение 24 недель: противовирусная активность регистрировалась у всех пациентов (у 4 из 4 человек группы 2), среднее снижение вирусной нагрузки составило 70%. При этом у 2 пациентов (по одному из группы 1 и группы 2) был получен полный вирусологический ответ по окончании терапии. Противовирусная активность монокомпонентного препарата СМД AT к ИФН-γ была несколько ниже, поскольку снижение числа копий HCV RNA отмечено у 3 из 4 пациентов 3 группы, среднее снижение вирусной нагрузки составило 55%. Среди участников исследования контрольной группы положительной динамики вирусной нагрузки не выявлено.

Таблица 9. Динамика вирусной нагрузки в исследуемых группах HCV RNA, копий/мл Среднее снижение вирусной нагрузки, % СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4 (Me [Q1-Q3]) Исходно 66200 [450-181400] 75 Через 24 недели лечения 12500 [50-30560] СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4+AT к Н (Me [Q1-Q3]) Исходно 58900 [600-124500] 70 Через 24 недели лечения 15600 [50-45700] СМД AT к ИФН-γ (Me [Q1-Q3]) Исходно 84700 [350-172800] 55 Через 24 недели лечения 22400 [150-58500] Контрольная группа (Me [Q1-Q3]) Исходно 79500 [300-155600] - Через 24 недели лечения 87900 [450-164300]

Противовирусная активность исследуемых препаратов сочеталась с положительной динамикой уровня АЛТ, которую зарегистрировали у пациентов 1-3 групп к концу 24 недель лечения. Нормализация уровня АЛТ была отмечена у 2 пациентов группы СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4, у 1 пациента группы СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4+AT к Н и также у 1 пациента группы СМД AT к ИФН-γ. У 1 пациента контрольной группы на фоне увеличения вирусной нагрузки через 24 недели наблюдения показатель АЛТ превысил верхнюю границу нормы (>20 ЕД/л).

В ходе наблюдения не было выявлено каких-либо нежелательных явлений, связанных с приемом исследуемых препаратов, что свидетельствовало о хорошей их переносимости. Отсутствие патологических отклонений со стороны анализов крови и мочи, а также биохимических показателей, включая почечные и печеночные маркеры, подтверждало безопасность лечения.

Таким образом, в результате исследования были получены данные об эффективности и безопасности препаратов СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4, СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4+AT к Н и СМД AT к ИФН-γ, в лечении больных с ХГС. Наиболее отчетливый противовирусный эффект отмечен у препарата СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4 и СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4+AT к Н, что подтверждалось положительной динамикой вирусной нагрузки, а также зарегистрированным у 2 пациентов полным вирусологическим ответом к концу 24 недель терапии. Противовирусная эффективность препаратов, содержащих СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4, СМД AT к ИФН-γ+АТ к CD4+AT к Н и СМД AT к ИФН-γ, сочеталась со снижением активности ХГС, что выражалось в снижении и даже нормализации уровня АЛТ у части пациентов к окончанию 24-недельного курса терапии.

Пример 7.

Для исследования свойств заявленных лекарственных средств для лечения пациентов группы активного препарата №1 были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных-потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (анти-IFN-γ) и CD4 рецептора (анти-CD4) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (СМД анти-IFN-γ+анти-CD4); для лечения пациентов группы активного препарата №2 были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных-потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (анти-IFN-γ), к CD4 рецептору (анти-С04) и гистамину (анти-Н) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н). Для лечения пациентов группы сравнения были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные водно-спиртовым раствором (3 мг/табл.) активированной-потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к гамма интерферону человека, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С50 (СМД анти-IFN-γ).

Антиретровирусную активность композиций СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н оценивали в ходе открытого сравнительного клинического исследования с участием пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), которые наблюдались в Территориальном центре по профилактике и борьбе со СПИД′ом и инфекционными заболеваниями. В исследование были включены 65 мужчин и 32 женщины (всего 97 пациентов) в возрасте от 18 до 48 лет с вирусной нагрузкой ≥150 копий РНК ВИЧ-1 в 1 мл плазмы и уровнем CD4-лимфоцитов не ниже 250 клеток/мкл (или ≥0,25×10⁹/л). 34 из 97 участников исследования наблюдались по поводу бессимптомного инфекционного статуса и ранее не получали лечения по поводу ВИЧ-инфекции (наивные пациенты). 63 из 97 пациентов находились на антиретровирусной терапии (APT) в течение 1-2 лет. В исследование не включались пациенты с циррозом печени, вирусным гепатитом С, тяжелыми сопутствующими заболеваниями в стадии обострения, беременные женщины, а также лица, принимающие внутривенно наркотические средства. Исследование проводили в осеннее-зимний период, когда отмечался сезонный подъем заболеваемости гриппом и острыми респираторными инфекциями (ОРВИ).

75 пациента были рандомизированы в три группы, им была назначена терапия препаратами группы 1 и 2 или препаратом сравнения группы 3 в профилактической (в отношении гриппа/ОРВИ) дозировке - по 1 таблетке 1 раз в день в течение 6 недель, в том числе: пациентам группы 1 (n=25) была назначена композиция СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 в виде монотерапии (подгруппа 1А: наивные пациенты, n=12) или в сочетании с APT (подгруппа 1Б, n=13); пациентам группы 2 (n=23) была назначена композициям СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H, в том числе, в виде монотерапии (подгруппа 2А: наивные пациенты, n=11) или в сочетании с APT (подгруппа 2Б, n=12); пациентам группы 3 (n=27) был назначен препарат СМД анти-IFN-γ, в том числе, в виде монотерапии (подгруппа 3А: наивные пациенты, n=11) или в сочетании с APT (подгруппа 3Б, n=16). Контрольную (четвертую) группу (n=22) составили пациенты, которые продолжали получать APT по прежней схеме без добавления какого-либо изучаемого препарата (группа APT).

Исходно и через 6 недель у всех пациентов оценивали вирусную нагрузку, уровень CD4 и CD8 лимфоцитов, иммунорегуляторный индекс CD4/CD8. Для определения копий РНК ВИЧ-1 в плазме крови использовали наборы COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Kit, version 1,5 для автоматического ПЦР-анализатора COBAS AMPLICOR (Roche, Швейцария). Фенотипирование циркулирующих лимфоцитов периферической крови выполняли на проточном цитофлюориметре FACSCount (Becton Dickinson, США) с использованием стандартных тест-систем FACSCount Reagent Kit, содержащих антитела к CD3, CD4, CD8, меченные флюорохромами FITC, РЕ.

В таблице 10 представлены данные по вирусной нагрузке (числу копий РНК ВИЧ) в виде значений медианы (Me), первого и третьего квартилей (Q1, Q3) у пациентов исследуемых групп в динамике наблюдения. В результате исследования установлено, что 6-недельный прием композиции СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 приводил к снижению количества копий РНК ВИЧ-1 у 58% наивных пациентов (у 7 из 12 человек подгруппы 1А), при этом среднее снижение вирусной нагрузки составило 16,9%. Сочетанное применение композиции СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и APT было не менее эффективным, поскольку уменьшение количества копий РНК ВИЧ-1 отмечено у 62% участников исследования (у 8 из 13 человек подгруппы 1Б), а снижение вирусной нагрузки в среднем было 18,2% от исходного уровня. Примерно сходные показатели получены при использовании композиции СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н: противовирусная активность регистрировалась у 55% ВИЧ-инфицированных наивных пациентов (у 6 из 11 человек подгруппы 2А) и у 67% лиц, получавших комбинацию СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н и APT (у 8 из 12 человек подгруппы 2Б); среднее снижение вирусной нагрузки составило 17,3% и 18,9% соответственно. Антиретровирусная активность, отмеченная в первых двух группах, была несколько выше результатов лечения, полученных у пациентов группы сравнения. Монотерапия СМД анти-IFN-γ через 6 недель снижала количество копий РНК ВИЧ-1 у 36% наивных пациентов (у 4 из 11 человек подгруппы 3А), при этом уменьшение вирусной нагрузки в среднем составило 9,5%. Сочетанное применение монокомпонентного препарата СМД анти-IFN-γ и APT повышало эффективность терапии, способствуя снижению вирусной нагрузки у 50% участников исследования (у 8 из 16 человек подгруппы 3Б) в среднем на 14,2%. Аналогичные показатели лечения у лиц, получавших только APT (контрольная группа 4), составили 32% (у 7 из 22 человек группы 4) и 13,3% соответственно.

Анализ показателей субпопуляций циркулирующих лимфоцитов в динамике наблюдения (Таблица 11) показал более выраженное, чем в контрольной группе, увеличение числа CD4 лимфоцитов через 6 недель терапии при использовании СМД анти-IFN-γ+анти-CD4, СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н и СМД анти-IFN-γ в виде монотерапии у наивных пациентов (подгруппы 1А, 2А и 3А) или при сочетании с APT (подгруппы 1Б, 2Б и 3Б). При этом число CD8 через 6 недель приема препаратов (моно- либо сочетанная терапия) не менялось ни в одной из изучаемых групп. Позитивная динамика со стороны CD4-лимфоцитов в ходе лечения приводила к повышению иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, наиболее значимому в подгруппах пациентов, принимавших композиции СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н (моно- или сочетанная терапия - группы 1 и 2) и СМД анти-IFN-γ в сочетании с APT (подгруппа 3Б).

Таблица 10 Динамика вирусной нагрузки в зависимости от схемы терапии Вирусная нагрузка, копий/мл Среднее снижение вирусной нагрузки, % СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 (Me [Q1-Q3]) Исходно 5769 [368-62584] 16,9 Через 6 недель лечения 4575 [337-58526] APT и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 (Me [Q1-Q3]) Исходно 5238 [385-59695] 18,2 Через 6 недель лечения 4408 [320-50197] СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H (Me [Q1-Q3]) Исходно 5638 [385-61742] 17,3 Через 6 недель лечения 4754 [278-57426] APT и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н (Me [Q1-Q3]) Исходно 5189 [350-59798] 18,9 Через 6 недель лечения 46108 [269-47987] СМД анти-IFN-γ (Me [Q1-Q3]) Исходно 5813 [150-33356] 9,5 Через 6 недель лечения 5786 [150-38359] APT и СМД анти-IFN-γ (Me [Q1-Q3]) Исходно 4680 [274-9838] 14,2 Через 6 недель лечения 4652 [272-8874] APT (Me [Q1-Q3]) Исходно 5547 [385-58996] 13,3 Через 6 недель лечения 5308 [338-57709]

Таблица 11 Показатели субпопуляций циркулирующих лимфоцитов у пациентов исследуемых групп в динамике наблюдения Период наблюдения CD4, кл/мкл (М±SE) CD4/CD8 (М±SE) СМД АНТИ-IFN-γ+АНТИ-CD4 (n=12) Исходно 516±33 0,46±0,09 Через 6 недель лечения 712±24 0,58±0,07* APT и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 (n=13) Исходно 499±41 0,50±0,08 Через 6 недель лечения 728±29 0,60±0,06* СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н (n=11) Исходно 509±45 0,49±0,06 Через 6 недель лечения 706±27 0,58±0,08* APT и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H (n=12) Исходно 521±37 0,48±0,09 Через 6 недель лечения 734±22 0,62±0,10* СМД анти-IFN-γ(n=11) Исходно 513±98 0,38±0,19 Через 6 недель лечения 563±26 0,44±0,12 APT и СМД анти-IFN-γ (n=16) Исходно 491±49 0,55±0,06 Через 6 недель лечения 623±45 0,67±0,05* APT (n=22) Исходно 510±29 0,44±0,06 Через 6 недель лечения 595±35 0,50±0,12 * значимые отличия по сравнению с исходным уровнем, р<0,05

Отсутствие у пациентов в ходе лечения нежелательных явлений, связанных с приемом исследуемых лекарственных средств, свидетельствовало о хорошей переносимости препаратов. Повторный контроль лабораторных показателей, в том числе, анализов крови и мочи, биохимических маркеров, подтверждало безопасность лечения.

Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало антиретровирусную эффективность препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н, обусловленную, очевидно, изменением функциональной активности CD4 рецепторов, что препятствует проникновению ВИЧ в клетки, а также подавлением репликации ВИЧ внутри клетки за счет активации процессов транскрипции мРНК противовирусных белков. Установлено, что снижение вирусной нагрузки, отмеченное в результате 6-недельного приема препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-H в дозе 1 таблетка в день, превышает противовирусный эффект, который регистрируется через 6 недель приема монокомпонентного препарата СМД анти-IFN-γ в той же дозе либо продолжающейся по прежней схеме APT. Сочетание какого-либо препарата СМД анти-IFN-γ+анти-CD4, СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н или СМД анти-IFN с APT несколько усиливает противовирусную активность последней, что проявляется в уменьшении среднего значения вирусной нагрузки через 6 недель у большего процента участников исследования.

Показано влияние препаратов СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н на соотношение CD4/CD8 лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов (за счет некоторого увеличения абсолютного количества CD4-клеток), наиболее выраженное при совместном использовании с APT. Учитывая одновременное снижение вирусной нагрузки у пациентов, принимающих препараты СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н, можно полагать, что увеличение количества CD4-клеток связано с пополнением популяции этих клеток за счет здоровых (неинфицированных) клеток. Сочетание APT с препаратами СМД анти-IFN-γ+анти-CD4, СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н или СМД анти-IFN более эффективно в отношении восстановления иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, чем продолжающаяся APT по прежней схеме.

Антиретровирусная активность препаратов СМД анти-IFN-γ+анти-CD4 и СМД анти-IFN-γ+анти-CD4+анти-Н позволяет использовать их с профилактической и лечебной целью как у наивных ВИЧ-инфицированных пациентов, так и у лиц, получающих APT.

Пример 8.

Для экспериментального изучения заявленного технического решения были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных-потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT ГИ), к CD4 рецептору (AT CD4), к гистамину (AT Г), в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз каждого компонента, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200, нанесенные на лактозу в виде водно-спиртовой смеси гомеопатических разведении С12, С30, С200 каждого (AT ГИ + AT CD4 + AT Г). Группа плацебо получала таблетки массой 300 мг, содержащие лактозу моногидрат, целлюлозу микрокристаллическую, магния стеарат.

В продолжающееся двойное слепое плацебоконтролируемое исследование включаются пациенты в возрасте 18-60 лет обоего пола, с ОРВИ с признаками интоксикации и катаральным синдромом. В исследование включаются пациенты с температурой тела 37,8°C и более (при условии регистрации такой температуры с момента начала заболевания), длительностью заболевания не более 48 часов до начала лечения, без тяжелых сопутствующих заболеваний. Пациентам проводится экспресс-тест на наличие антигенов вируса гриппа. Пациенты с положительными результатами теста не включаются в исследование. Все пациенты дают письменное добровольное согласие на участие в исследовании перед началом всех процедур исследования. Пациенты заполняют дневники, в которых регистрируют температуру тела дважды в день, сопутствующую терапию и пр. Пациенты получают препарат AT ГИ + AT CD4 + AT Г или плацебо, в зависимости от той или иной группы лечения, по 8 таблеток в первый день и по три таблетки в день со второго по пятый дни. Пациенты могут принимать жаропонижающие препараты при необходимости. Не допускается применение противовирусных, иммуномодулирующих, антигистаминных препаратов и антибиотиков. Перед первым приемом препарата и на последнем визите пациенты сдают образцы крови и мочи для проведения лабораторных исследований с целью мониторинга безопасности проводимой терапии. Лечение продолжается 5 суток, последующее наблюдение - 2 суток. Таким образом, в среднем, каждый пациент принимает участие в исследовании в течение 7 дней.

Эффективность терапии оценивалась по срокам достижения температуры тела 37,0°C и менее, также сравнивалось число приемов антипиретиков.

На момент проведения анализа, терапию завершили 78 пациентов (40 пациентов получали AT ГИ + AT CD4 + AT Г, 38 - плацебо). Доли пациентов с достижением температуры тела 37,0°C и менее представлены на Фиг.1. Как видно из Фиг.1, терапия AT ГИ + AT CD4 + AT Г к исходу вторых суток от начала терапии позволила достичь снижения тела у пациентов в 17,4% случаев чаще, чем в группе приема плацебо (р<0,05). При этом, число приемов жаропонижающих средств в группах к этому же моменту было статистически значимо меньше в группе приема препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г (3,5±0,25 приема жаропонижающих с момента начала терапии AT ГИ + AT CD4 + AT Г к исходу вторых суток лечения, против 3,9±0,32 в группе приема плацебо, р<0,005). Превосходство AT ГИ + AT CD4 + AT Г над плацебо, начавшееся уже на утро вторых суток лечения, сохранялось на протяжении всего периода терапии.

В анализ безопасности были включены данные всех 78 пациентов, участвовавших в исследовании и завершивших лечение в установленные протоколом сроки, досрочно выбывших пациентов не было. В течение всего периода наблюдения отмечалась хорошая переносимость препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г. Нежелательные явления, связанные с приемом препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г, не отмечались. Исследование анализа крови в начале и конце периода лечения не выявило патологических отклонений. Общий анализ мочи в первый и заключительный день исследования также не выявил патологии ни у одного пациента.

При сравнении полученных данных с результатами проведенного в 2005 году двойного слепого плацебоконтролируемого рандомизированного исследования клинической эффективности и безопасности лечебного применения препарата, содержащего активированные-потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT ГИ) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (СМД AT к ГИ) при гриппе и других острых респираторных вирусных инфекциях (ГУ НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург, 2005) было выявлено, что препарат AT ГИ + AT CD4 + AT Г более эффективно по сравнению с СМД AT к ГИ снижает температуру (Таблица 12, Таблица 13 и Фиг.1).

Таблица 12. Доли пациентов с достижением температуры тела 37,0°C и менее на фоне приема препарата АТ ГИ+AT CD+АТ Г/плацебо   1 сутки, утро 1 сутки, вечер 2 сутки, утро 2 сутки, вечер 3 сутки, утро 3 сутки, вечер 4 сутки, утро 4 сутки, вечер 5 сутки, утро 5 сутки, вечер 6 сутки, утро 6 сутки, вечер 7 сутки, утро АТ ГИ+АТ CD4+АТ Г, т=40 Общее число пациентов 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 Число с нормальной температурой 19 20 24 28 27 30 31 33 36 38 40 40 40 Доля с нормальной температурой, % 47.5 50.0 60.0 70.0 67.5 75.0 77.5 82.5 90.0 95.0 100.0 100.0 100.0 Плацебо, т=38 Общее число пациентов 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 38 Число с нормальной температурой 18 17 19 20 23 24 27 24 29 30 33 37 38 Доля с нормальной температурой, % 47.4 44.7 50.0 52.6 60.5 63.2 71.1 63.2 76.3 78.9 86.8 97.4 100.0 АТ ГИ*, n=30 Общее число пациентов 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 Число с нормальной температурой 0 3 14 12 18 19 25 29 29 30 29 30 29 Доля с нормальной температурой, % 0 10.0 46.7 40.0 60.0 63.3 83.3 96.7 96.7 100 96.7 100 96.7 Плацебо*, n=30 Общее число пациентов 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 Число с нормальной температурой 0 0 10 7 16 15 28 28 28 30 30 30 30 Доля с нормальной температурой, % 0 0 33.3 23.3 53.3 50.0 93.3 93.3 93.3 100 100 100 100 * По данным двойного слепого плацебоконтролируемого рандомизированного исследования клинической эффективности и безопасности лечебного применения препарата СМД AT к ГИ при гриппе и других острых респираторных вирусных инфекциях (ГУ НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург, 2005).

Таблица 13. Средние значения температуры тела у пациентов в зависимости от группы лечения, °C, M±SD   1 сутки, утро 1 сутки, вечер 2 сутки, утро 2 сутки, вечер 3 сутки, утро 3 сутки, вечер 4 сутки, утро 4 сутки, вечер 5 сутки, утро 5 сутки, вечер 6 сутки, утро 6 сутки, вечер 7 сутки, утро CD4+AT Г, n=40 37.5±0.54 37.7±0.56 37.2±0.67 37.1±0.53 36.8±0.43 36.8±0.49 36.7±0.31 36.6±0.33 36.6±0.25 36.6±0.23 36.6±0.22 36.6±0.15 36.6±0.18 Плацебо, n=38 37.6±0.71 37.6±0.63 37.2±0.48 37.1±0.49 36.9±0.41 36.9±0.36 36.8±0.49 36.7±0.37 36.6±0.32 36.6±0.21 36.6±0.28 36.5±0.18 36.5±0.18 АТ ГИ*, n=30 38.1±0.62 38.0±0.58 37.4±0.80 37.3±0.61 37.1±0.50 37.0±0.47 36.8±0.35 36.6±0.32 36.6±0.21 36.5±0.26 36.6±0.21 36.6±0.26 36.6±0.26 Плацебо,* n=30 38.0±0.48 38.0±0.50 37.4±0.60 37.4±0.47 37.0±0.37 37.0±0.42 36.8±0.23 36.6±0.34 36.6±0.28 36.6±5.42 36.6±0.21 36.5±0.24 36.6±0.18 * По данным двойного слепого плацебоконтролируемого рандомизированного исследования клинической эффективности и безопасности лечебного применения препарата СМД AT к ГИ при гриппе и других острых респираторных вирусных инфекциях (ГУ НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург, 2005).

Пример 9.

Для экспериментального изучения заявленного технического решения были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных-потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT ГИ), к CD4 рецептору молекуле Т-лимфоцитов (AT CD4), к гистамину (AT Г), в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз каждого компонента, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (AT ГИ + AT CD4 + AT Г). В качестве препарата сравнения использовали препарат Тамифлю® (действующее вещество-озельтамивир, Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд.-Швейцария) (Осельтамивир).

В продолжающееся открытое сравнительное контролируемое клиническое исследование препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г и препарата Тамифлю® включаются пациенты в возрасте 18-60 лет обоего пола, с гриппом А или В с признаками интоксикации и катаральным синдромом. В исследование включаются пациенты с температурой тела 37,8°C и более (при условии регистрации такой температуры с момента начала заболевания), длительностью заболевания не более 48 часов до начала лечения, без тяжелых сопутствующих заболеваний. Пациентам проводится экспресс-тест на наличие антигенов вируса гриппа. Пациенты с отрицательными результатами теста не включаются в исследование. Все пациенты дают письменное добровольное согласие на участие в исследовании перед началом всех процедур исследования. Пациенты заполняют дневники, в которых регистрируют температуру тела дважды в день, сопутствующую терапию и пр. Пациенты получают препарат AT ГИ + AT CD4 + AT Г по 8 таблеток в первый день и по три таблетки в день со второго по пятый дни, или Тамифлю® по 75 мг дважды в день, согласно инструкции производителя. Пациенты могут принимать жаропонижающие препараты при необходимости. Не допускается применение противовирусных, иммуномодулирующих, антигистаминных препаратов и антибиотиков. Перед первым приемом препарата и на последнем визите пациенты сдают образцы крови и мочи для проведения лабораторных исследований с целью мониторинга безопасности проводимой терапии. Лечение продолжается 5 суток, последующее наблюдение - 2 суток. Таким образом, в среднем, каждый пациент принимает участие в исследовании в течение 7 дней.

Эффективность терапии оценивалась по срокам достижения температуры тела 37,0°C и менее, также сравнивалось число приемов антипиретиков.

На момент проведения анализа исследование завершило 17 пациентов (6 пациентов группы препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г и 11 пациентов группы приема Тамифлю®).

Доли пациентов с достижением температуры тела 37,0°C и менее в группах статистически не различались между собой на протяжении всего периода лечения. Уже к началу 4-х суток лечения в обеих группах было достигнуто почти полное выздоровление пациентов (Фиг.2). Уже к началу вторых суток лечения в обеих группах у трети пациентов была зарегистрирована нормализация температуры тела. Среднее число приемов жаропонижающих в группах также не имело статистически значимых различий и на начало 4-х суток терапии составило 7,6±0,84 в группе приема препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г и 7,4±0,90 в группе приема препарата Тамифлю® соответственно.

В анализ безопасности были включены данные всех 17 пациентов, участвовавших в исследовании и завершивших лечение в установленные протоколом сроки, досрочно выбывших пациентов не было. В течение всего периода наблюдения отмечалась хорошая переносимость препарата, нежелательные явления не отмечались. Исследование анализа крови в начале и конце периода лечения не выявило патологических отклонений. Общий анализ мочи в первый и заключительный день исследования также не выявил патологии ни у одного пациента.

При сравнении полученных данных с результатами проведенного в 2005 году двойного слепого плацебоконтролируемого рандомизированного исследования клинической эффективности и безопасности лечебного применения препарата, содержащего активированные-потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT ГИ) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (СМД AT ГИ) при гриппе и других острых респираторных вирусных инфекциях (ГУ НИИ гриппа РАМП, Санкт-Петербург, 2005) было выявлено, что препарат AT ГИ + AT CD4 + AT Г более эффективно по сравнению с СМД AT ГИ снижает температуру (см. Таблица 14, Таблица 15 и Фиг.2).

Таблица 14. Доли пациентов с достижением температуры тела 37,0°C и менее на фоне приема препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г / Тамифлю®   утро, день 1 вечер, день 1 утро, день 2 вечер, день 2 утро, день 3 вечер, день 3 утро, день 4 вечер, день 4 утро, день 5 вечер, день 5 утро, день 6 вечер, день 6 утро, день 7 вечер, день 7 утро, день 8 АТ ГИ+АТ CD4+ АТ Г, n=60 АТ ГИ+АТ CD4+АТ Г, n=6 Общее число пациентов 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 4 4 н/д Число с нормальной температурой 0 0 2 3 4 4 6 5 6 6 5 5 4 4 н/д Доля с нормальной температурой, % 0 0 33.3 50.0 66.7 66.7 100.0 83.3 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 н/д АТ ГИ*, Осельтамивир, n=11 Общее число пациентов 11 11 11 11 11 11 11 10 10 10 9 7 5 4 3 Число с нормальной температурой 0 1 4 5 5 6 10 8 9 9 9 7 5 4 3 Доля с нормальной температурой, % 0 9.1 36.4 45.5 45.5 54.5 90.9 80.0 90.0 90.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 Общее число пациентов 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 Число с нормальной температурой 0 3 14 12 18 19 25 29 29 30 29 30 29 30 30 Доля с нормальной температурой, % 0 10.0 46.7 40.0 60.0 63.3 83.3 96.7 96.7 100 96.7 100 96.7 100 100 Плацебо*, n=30 Общее число пациентов 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 Число с нормальной температурой 0 0 10 7 16 15 28 28 28 30 30 30 30 30 30 Доля с нормальной температурой, % 0 0 33.3 23.3 53.3 50.0 93.3 93.3 93.3 100 100 100 100 100 100 * По данным двойного слепого плацебоконтролируемого рандомизированного исследования клинической эффективности и безопасности лечебного применения препарата СМД AT ГИ при гриппе и других острых респираторных вирусных инфекциях (ГУ НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург, 2005).

Таблица 15. Средние значения температуры тела у пациентов в зависимости от группы лечения, °C, M±SD   утро, день 1 вечер, день 1 утро, день 2 вечер, день 2 утро, день 3 вечер, день 3 утро, день 4 вечер, день 4 утро, день 5 вечер, день 5 утро, день 6 вечер, день 6 утро, день 7 вечер, день 7 утро, день 8 АТ ГИ+АТ CD4+АТ Г, n=6 38.5±0.49 38.1±0.62 37.2±1.01 37.2±0.67 36.5±0.61 36.8±0.47 36.5±0.37 36.6±0.46 36.5±0.26 36.6±0.28 36.4±0.35 36.5±0.20 36.4±0.26 36.5±0.22 н/д Осельтамивир, n=11 38.±0.82 37.3±0.71 37.3±0.72 36.9±0.53 36.9±0.47 36.7±0. 46 36.8±0.37 36.5±0.38 36.7±0.25 36.5±0.21 36.6±0.21 36.3±0.19 36.5±0. 10 36.6±0.12 36.5±0.14 АТ ГИ*, n=30 38.1±0.62 38.0±0.58 37.4±0.80 37.3±0.61 37.1±0.50 37.0±0.47 36.8±0.35 36.6±0.32 36.6±0.21 36.5±0.26 36.6±0.21 36.6±0.26 36.63±0.26 36.5±0.27 36.5±0.23 Плацебо,* n=30 38.0±0.48 38.0±0.50 37.4±0.60 37.4±0.47 37.0±0.37 37.0±0.42 36.8±0.23 36.6±0.34 36.6±0.28 36.6±5.42 36.6±0.21 36.5±0.24 36.6±0. 18 36.5±0.19 36.4±0.21 * По данным двойного слепого плацебоконтролируемого рандомизированного исследования клинической эффективности и безопасности лечебного применения препарата СМД AT ГИ при гриппе и других острых респираторных вирусных инфекциях (ГУ НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург, 2005).

Пример 10.

Для экспериментального изучения заявленного технического решения были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных-потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT ГИ), к CD4 рецептору молекуле Т-лимфоцитов (AT CD4), к гистамину (AT Г), в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз каждого компонента, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (AT ГИ + AT CD4 + AT Г). В качестве препарата сравнения используют препарат, содержащий активированные-потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT ГИ) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30, С200 (СМД AT ГИ). Группа плацебо получала таблетки массой 300 мг, содержащие лактозу моногидрат, целлюлозу микрокристаллическую, магния стеарат.

В продолжающемся двойном слепом плацебоконтролируемое исследовании эффективности и безопасности препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г при ОРВИ (см. пример 8) и в продолжающемся открытом сравнительном контролируемом исследовании эффективности и безопасности препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г при гриппе (см. пример 9) дополнительно оценивали число развившихся на фоне острого инфекционного процесса осложнений, в том числе бактериальных (бактериальная пневмония, трахеит, отит, гломерулонефрит и др.).

В тех случаях, когда система защиты совершенна, - инфекционный процесс может прерваться или, оставаясь локализованным, не сопровождаться развитием выраженных клинических симптомов, т.е. адекватность защитных реакций приводит к быстрой инактивации возбудителя, восстановлению нарушенных функций организма и выздоровлению. Иная картина возникает в организме, высоковосприимчивом к инфекционному возбудителю и не располагающим совершенным механизмом специфической и неспецифической защиты (иммунокомпрометированные пациенты). В таких случаях репродуцировавшиеся во все возрастающем количестве возбудители и продукты их взаимодействия с эпителиальными и иммунными клетками, а также сами разрушенные клетки попадают в кровь, обусловливая развитие тяжелых форм течения болезни, формирование осложнений и возможный неблагоприятный исход.

Применение препарата AT ГИ + AT CD4 + AT Г как при гриппе, так и при ОРВИ способствует значительному снижению частоты бактериальных осложнений по сравнению с плацебо (Таблица 16), и, как следствие, снижению потребности в антибактериальной терапии. Препарат AT ГИ + AT CD4 + AT Г препятствует развитию вторичного иммунодефицита на этапе реконвалесценции, оказывая иммуномодулирующий эффект и повышая естественные защитные силы организма. Способность AT ГИ + AT CD4 + AT Г снижать частоту развития бактериальных осложнений превышала по сравнению с препаратом СМД AT ГИ.

Таблица 16. Частота развития бактериальных осложнений Препарат Кол-во пациент. Бактериальные осложнения Отит кол-во/% Трахеит кол-во/% Пневмония кол-во/% Всего кол-во/% AT ГИ+АТ CD4+AT Г (ОРВИ) 40 0/0 1/2.5 0/0 1/2.5 Плацебо (ОРВИ) 38 3/7.9 7/18.4 0/0 10/26.3 AT ГИ+АТ CD4+AT Г (Грипп) 6 0/0 0/0 0/0 0/0 Тамифлю® (Грипп) 11 0/0 2/18.2 1/9.1 3/27.2 СМД AT ГИ (Грипп и ОРВИ) * 30 1/3.3 2/6.7 0/0 3/10.0 Плацебо (Грипп и ОРВИ)* 30 4/13.3 5/16.7 0/0 9/30 * - По данным двойного слепого плацебоконтролируемого рандомизированного исследования клинической эффективности и безопасности лечебного применения препарата СМД AT ГИ при гриппе и других острых респираторных вирусных инфекциях (ГУ НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург, 2005).

Пример 11.

Исследование влияния комплексного лекарственного средства, в состав которого входят активированные-потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител антител к CD4 (смесь сверхмалых доз водных гомеопатических разведении С12+С30+С50) и активированные-потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител антител к интерферону гамма (смесь сверхмалых доз водных гомеопатических разведении С12+С30+С50) в соотношении 1:1 (далее комплексный препарат), а также компонентов, входящий в его состав (активированные-потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител антител к CD4 (смесь сверхмалых доз водных гомеопатических разведении С12+С30+С50) (далее СМД AT к CD4) и активированные-потенцированные формы поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител антител к интерферону гамма (смесь сверхмалых дозводных гомеопатических разведении С12+С30+С50) (далее СМД AT к ИФН гамма)) in vitro на связывание стандартного лиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека оценивали радиолигандным методом. В качестве контроля тестируемых препаратов была протестирована потенцированная-активированная форма дистиллированной воды (смесь гомеопатических разведении С12+С30+С50) (далее потенцированная вода).

Сигма-1 рецептор - внутриклеточный рецептор, локализованный в клетках центральной нервной системе, клетках большинства периферических тканей и иммунокомпетентных клетках. Этот рецептор посредством контроля гомеостаза внутриклеточного кальция, регулирует внутриклеточные сигнальные каскады, приводящие к активации соответствующих транскрипционных факторов и транскрипции целого семейства генов, кодирующих, в частности, факторы резистентности к инфекционным агентам и цитокины. В связи с этим способность лекарственных средств оказывать влияние на эффективность взаимодействия лигандов с сигма-1 рецептором указывает на наличие противовирусного и иммуномодулирующего компонентов в спектре их фармакологической активности, что позволяет рассматривать данные препараты в качестве эффективных лекарственных средств для лечения и профилактики различных инфекционных заболеваний.

В опыте (для измерения общего связывания) в инкубационную среду вносили 20 мкл комплексного препарата или по 10 мкл СМД AT к CD4 или СМД AT к ИФН гамма. Таким образом, количество СМД AT к CD4 и СМД AT к ИФН гамма, вносимых в экспериментальную лунку при тестировании комплексного препарата, было идентично количеству СМД AT к CD4 и СМД AT к ИФН гамма тестируемых в качестве монопрепаратов, что позволяет провести сравнение эффективности комплексного препарата с его отдельными компонентами, входящими в его состав. Потенцированную воду вносили в инкубационную среду в объеме 20 мкл и 10 мкл.

Затем вносили 160 мкл (~200µg белка) гомогената мембран клеток линии Jurkat (линия лейкемических Т-лимфоцитов человека), и в последнюю очередь 20 мкл радиолиганда меченого тритием [³H]пентазоцин (15 нМ).

Для измерения неспецифического связывания вместо препаратов или потенцированной воды в инкубационную среду вносили 20 мкл немеченого лиганда - галоперидол (10 мкМ).

Радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике (Topcount, Packard) с использованием сцинтилляционной смеси (Microscint 0, Packard) после инкубации в течение 120 минут при температуре 22°С в 50 мМ Tris-HCl буфере (рН=7,4) и фильтрации на стекловолоконных фильтрах (GF/B, Packard). Специфическое связывание (в опыте или контроле) рассчитывали как разницу между общим (в опыте или контроле) и неспецифическим связыванием.

Результаты представлены в виде процента ингибирования специфического связывания в контроле (в качестве контроля использовали дистиллированную воду) (см. Таблицу 17).

Таблица 17. Влияние препаратов и потенцированной воды на связывание стандартного радиолиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека Экспериментальная группа Количество, вносимое в экспериментальную лунку % от специфического связывания радиолиганда в контроле % ингибирования связывания радиолиганда в контроле 1-е измерение 2-е измерение Среднее значение Комплексный препарат 20 мкл 50,8 49,1 49,9 50,1 СМД AT к CD4 10 мкл 74,0 76,2 75,1 24,9 СМД AT к ИФН гамма 10 мкл 158,9 149,8 154,3 -54,3 Потенцированная вода 20 мкл 98,1 75,8 86,9 13,1 Потенцированная вода 10 мкл 140,1 106,2 123,2 -23,2 Примечание: % специфического связывания в контроле = (специфическое связывание в опыте / специфическое связывание в контроле)*100%; % ингибирования специфического связывания в контроле = 100% - (специфическое связывание в опыте / специфическое связывание в контроле)*100%).

- Результаты, отражающие ингибирование выше 50%, представляют собой значительные эффекты исследуемых соединений.

- Результаты, отражающие ингибирование от 25% до 50%, свидетельствуют об эффектах от слабого до умеренного.

- Результаты, отражающие ингибирование менее 25% считаются незначительными эффектами исследуемого соединения и находятся в пределах уровня фона.

Таким образом, в условиях данной экспериментальной модели показано, что:

1. Комплексный препарат более эффективно, чем отдельные его компоненты (СМД AT к CD4 и СМД AT к ИФН гамма) ингибирует связывание стандартного радиолиганда [³Н]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека.

2. СМД AT к CD4, внесенные в экспериментальную лунку в объеме 10 мкл, ингибируют связывание стандартного радиолиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека, но выраженность эффекта уступает выраженности эффекта комплексного препарата.

3. СМД AT к ИФН гамма, внесенные в экспериментальную лунку в объеме 10 мкл, не оказывали влияния на связывание стандартного радиолиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека.

4. Потенцированная вода, внесенная в экспериментальную лунку в объеме 10 мкл или 20 мкл, не оказывала влияния на связывание стандартного радиолиганда [³H]пентазоцина с рекомбинантным сигма 1 рецептором человека.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний. Для этого вводят комплексное лекарственное средство, содержащее смесь нескольких компонентов в виде активированных-потенцированных форм антител к растворенному антигену и антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы. Это обеспечивает эффективное лечение вирусных заболеваний различной этиологии за счет синергетического антивирусного действия активных компонентов лекарственного средства. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 17 табл., 2 ил., 11 пр.

1. Комплексное лекарственное средство для профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний, характеризующееся тем, что содержит смесь нескольких компонентов в виде активированных-потенцированных форм антител к растворенному антигену и антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы.

2. Комплексное лекарственное средство по п.1, характеризующееся тем, что активированная-потенцированная форма антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, представляет собой активированную-потенцированную форму антител к рецепторам иммунокомпетентных клеток.

3. Комплексное лекарственное средство по п.1, характеризующееся тем, что активированная-потенцированная форма антител к растворенному антигену представляет собой активированную-потенцированную форму антител к цитокинам.

4. Комплексное лекарственное средство по п.2, характеризующееся тем, что используют активированную-потенцированную форму антител к кластерам дифференцировки.

5. Комплексное лекарственное средство по п.1, характеризующееся тем, что активированную-потенцированную форму антител к растворенному антигену и активированную-потенцированную форму антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - встряхиванием каждого разведения.

6. Комплексное лекарственное средство по п.1, характеризующееся тем, что выполнено в твердой лекарственной форме и содержит технологически необходимое количество нейтрального носителя, насыщенного смесью водных или водно-спиртовых растворов активированной - потенцированной формы антител к растворенному антигену и активированной-потенцированной формы антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и фармацевтически приемлемые добавки.

7. Комплексное лекарственное средство по п.1, характеризующееся тем, что водные или водно-спиртовые растворы активированных-потенцированных форм антител к растворенному антигену и к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, получены путем многократного последовательного разведения матричного - исходного - раствора антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или антител к растворенному антигену в сочетании с внешним механическим воздействием - встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

8. Комплексное лекарственное средство по п.1, характеризующееся тем, что каждый из компонентов на основе сверхмалых доз антител используют в виде смеси различных, преимущественно сотенных, разведений, приготовленных по гомеопатической технологии.

9. Комплексное лекарственное средство по п.6, характеризующееся тем, что фармацевтически приемлемые добавки включают лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

10. Способ профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний, характеризующийся тем, что используют смесь нескольких компонентов в виде активированных-потенцированных форм антител к растворенному антигену и антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы.

11. Способ по п.10, характеризующееся тем, что в качестве антигена, связанного с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют рецепторы иммунокомпетентных клеток.

12. Способ по п.11, характеризующееся тем, что в качестве рецепторов иммунокомпетентных клеток используют кластеры дифференцировки.

13. Способ по п.10, характеризующееся тем, что в качестве растворенных антигенов используют цитокины.

14. Способ по п.10, характеризующийся тем, что смесь активированных-потенцированных форм антител используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора каждого компонента, активность которого обусловлена процессом многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - встряхиванием каждого разведения.

15. Способ лечения по п.14, характеризующийся тем, что используют приготовленные в виде единого лекарственного препарата - одной лекарственной формы смесь различных разведений антител к растворенному антигену в сочетании со смесью различных разведений антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, приготовленных по гомеопатической технологии.

16. Способ по п.14, характеризующееся тем, что водные или водно-спиртовые растворы активированных-потенцированных форм антител к растворенному антигену и к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, получены путем многократного последовательного разведения матричного - исходного - раствора антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или антител к растворенным антигенам в сочетании с внешним механическим воздействием - встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

17. Способ по п.10, характеризующийся тем, что инфекционным вирусным заболеванием является грипп.

18. Способ по п.10, характеризующийся тем, что инфекционным вирусным заболеванием является заболевание, вызванное вирусом иммунодефицита человека.

19. Способ по п.10, характеризующийся тем, что инфекционным вирусным заболеванием является хронический гепатит С.

20. Способ по п.10, характеризующийся тем, что инфекционным вирусным заболеванием является острая респираторная вирусная инфекция.

21. Фармацевтическая композиция, обладающая антиретровирусной активностью, характеризующаяся тем, что содержит смесь нескольких компонентов в виде активированных-потенцированных форм антител к растворенному антигену и антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы.

22. Фармацевтическая композиция по п.21, характеризующаяся тем, что активированная-потенцированная форма антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, представляет собой активированную-потенцированную форму антител к рецепторам иммунокомпетентных клеток.

23. Фармацевтическая композиция по п.21, характеризующееся тем, что активированная-потенцированная форма антител к растворенному антигену, представляет собой активированную-потенцированную форму антител к цитокинам.

24. Фармацевтическая композиция по п.22, характеризующаяся тем, что используют активированную-потенцированную форму антител к кластерам дифференцировки.

25. Фармацевтическая композиция по п.21, характеризующаяся тем, что активированную-потенцированную форму антител к растворенному антигену и активированную-потенцированную форму антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, используют в виде активированного-потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом последовательного многократного разведения матричного - исходного - раствора антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - встряхиванием каждого разведения.

26. Фармацевтическая композиция по п.21, характеризующаяся тем, что выполнено в твердой лекарственной форме и содержит технологически необходимое количество нейтрального носителя, насыщенного смесью водных или водно-спиртовых растворов активированной-потенцированной формы антител к растворенному антигену и активированной-потенцированной формы антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и фармацевтически приемлемые добавки.

27. Фармацевтическая композиция по п.21, характеризующаяся тем, что водные или водно-спиртовые растворы активированных-потенцированных форм антител к растворенному антигену и к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, получены путем многократного последовательного разведения матричного - исходного - раствора антител к антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы, и/или антител к растворенному антигену в сочетании с внешним механическим воздействием - встряхиванием каждого разведения, при этом концентрация матричного раствора составляет 0,5÷5,0 мг/мл.

28. Фармацевтическая композиция по п.21, характеризующаяся тем, что каждый из компонентов на основе сверхмалых доз антител используют в виде смеси различных, преимущественно сотенных, разведений, приготовленных по гомеопатической технологии.

29. Фармацевтическая композиция по п.26, характеризующаяся тем, что фармацевтически приемлемые добавки включают лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.