СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАДИИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ НА ОСНОВЕ ОЦЕНКИ ПАРАМЕТРОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ГОМЕОСТАЗА Российский патент 2014 года по МПК G01N33/48 G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической диагностике, и может использоваться для определения стадии патологического состояния печени на основе оценки состояния свободнорадикального гомеостаза в организме человека.

В настоящее время для определения интенсивности свободнорадикального окисления (CpO) измеряют уровень малонового диальдегида в крови [Carole В. Rudra A prospective study of early-pregnancy plasma malondialdehyde concentration and risk of preeclampsia / Carole B. Rudra, Chunfang Qiu, Robert M. David at al. // Clinical Biochemistry, 2006. - Vol.39. - P.722-726]. Недостатком метода является, то, что малоновый диальдегид относится к вторичным продуктам пероксидного окисления липидов, которые обычно находятся в организме в достаточно высоких стационарных концентрациях и принимают участие в различных биохимических процессах.

Известен способ определения диеновых конъюгатов в диагностике патологического течения процесса [Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биомембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - M.: Наука, 2003. - С.230-272].

Недостатки способа: диеновые конъюгаты являются первичными продуктами пероксидного окисления липидов, их концентрация не может в полной мере отражать реальную активность свободнорадикального окисления, так как этому процессу могут подвергаться кроме липидов белки и нуклеиновые кислоты. Следует отметить, что определение содержания диеновых конъюгатов связано с определенными трудностями, так как они быстро разрушаются и их концентрация в крови крайне нестабильна.

Технический результат - разработать способ определения стадии процесса патологического состояния состояни печени на основе оценки параметров свободнорадикального гомеостаза.

Технический результат достигают путем определения уровня ферментативной активности аконитатгидратазы (КФ 4.2.1.3; фермент, катализирующий в цикле трикарбоновых кислот вторую реакцию) и концентрации цитрата в сыворотке крови больных с патологическим состоянием печени. Как известно, антиоксидантная система включает в себя ферментативное и неферментативное звенья. К неферментативному звену относится цитрат, который может играть роль хелатора ионов металлов с переменной валентностью. Данный метаболит способен элиминировать ионы $$F{e}_2^{+}$$ , участвующие в образовании гидроксильного радикала из пероксида водорода в реакции Фентона [Осипов А.Н., Якутова Э.Ш., Владимиров Ю.А. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа // Биофизика, Т. 38, №3, 1993. - С.390-396]. Реакцию превращения цитрата в изоцитрат катализирует фермент - аконитатгидратаза, молекула которой легко разрушается активными формами кислорода, что позволяет рассматривать данный фермент как чувствительную мишень действия свободных радикалов [Skulachev V.P. Role of uncoupled and non-coupled oxidants in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants // Quart. Rev. Biophys., V.29, P.169-203, 1996].

Это позволяет ввести коэффициент для повышения специфичности диагностики, который зависит как от уровня цитрата, так и от активности аконитатгидратазы. Предлагаемый способ позволяет предложить метод для определения интенсивности свободнорадикального окисления на фоне измененного антиоксидантного статуса организма, что обеспечивает повышение ценности обнаруживаемых изменений в диагностике патологических состояний.

Обоснованием для предлагаемого способа явились результаты, полученные при 10-дневном наблюдении двух групп больных с патологическим состоянием печени (всего 63 человека), находящихся на базисном лечении:

1-я группа, включившая 35 пациентов с лекарственным гепатитом, развивающимся на фоне приема противотуберкулезных препаратов. Лечение: стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина B₁ 10 мл внутривенно, эссливер форте (эссенциальные фосфолипиды 300 мг) по 2 таблетке 3 раза в день в течение 10 дней.

2-я группа, включившая 28 пациентов хроническим алкогольным гепатитом в стадии обострения. Лечение: полный отказ от приема алкоголя, стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина B₁ 10 мл внутривенно, раствор рибоксина 10 мл внутривенно, раствор витамина B₆ 4 мл внутримышечно, раствор реланиума 4 мл внутривенно, эссливер форте (эссенциальные фосфолипиды 300 мг) по 2 таблетке 3 раза в день в течение 10 дней.

Контрольную группу составили 65 практически здоровых доноров.

С целью диагностики исследовали концентрацию цитрата и активность аконитатгидратазы в крови пациентов, взятой утром натощак из локтевой вены. Активность аконитатгидратазы оценивают спектрофотометрически при 235 нм в среде, содержащей 0,05 мМ трис-HCl-буфер (pH 7,8), 4 мМ цитрат. За ферментативную единицу (Е) принимали количество фермента, необходимого для превращения 1 мкмоль субстрата в 1 мин при 25°С. Расчет активности фермента производили по формуле:

$$E=\frac{D\times \mathrm{2,0}\times V}{\Delta V\times \tau \times \mathrm{3,08}}$$ ,

где D - прирост оптической плотности при 235 нм за определенное время; 1,0 - объем раствора в кювете, мл; V - общий объем ферментного раствора, мл; ∆V - объем внесенной для измерения пробы, мл; τ - время измерения, мин; 3,08 - коэффициент экстинкции, соответствующий величине поглощения, которую дает 1 мкмоль кофермента, находящийся в 2 мл исследуемой смеси при измерении на спектрофотометре, когда толщина слоя измеряемого раствора 1 см [Бузлама B.C. Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у животных / В.С.Бузлама и др. - Воронеж, 1997. - 67 с.].

Количество цитрата определяют по методу Нательсона [Natelson S., Pincus J.В., Lugovoy J.К. Response of citric acid levels to oral administration of glucose J. Clin. Invest., V.27, №4, P.446-449, 1948]. Метод заключается в образовании из цитрата при помощи бромного реактива и перманганата калия пентабромацетона, его экстракции петролейным эфиром и определении поглощения окрашенного комплекса с тиомочевиной при длине волны 430 нм.

Расчет производят по калибровочной кривой. К миллилитру исследуемой жидкости прибавляют 0,8 мл 17% раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугируют при 4000g в течение 5 мин. В пробирку с притертой пробкой к 0,5 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,25 мл 50% раствора серной кислоты, 0,1 мл 1 бромистого калия и 0,5 мл насыщенного раствора перманганата калия. Затем охлаждают в течение 20 мин. Избыток перманганата калия устраняли прибавлением по каплям 3% H₂O₂. Для экстрагирования образовавшегося пентобромацетата прибавляют гексан по частям; сначала 0,5 мл, затем еще раз 0,5 мл и в заключительный раз 0,3 мл гексана. После каждой порции гексана экстракт встряхивают в течение 5 мин на шюттель-аппарате. Для проведения цветной реакции 1 мл гексанового экстракта переносят в пробирку с притертой пробкой, куда предварительно вносят 2,5 мл 2% раствора тиомочевины в боратном буфере. Пробирку встряхивали в течение 5 минут, после расслоения фаз окрашенный в светло-желтый цвет нижний слой осторожно отсасывают с помощью пипетки Пастера с оттянутым концом. Фотометрирование проводят против контроля, для получения которого на выпаривание берут 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты и обрабатывают по описанной выше технологии.

Коэффициент состояния свободнорадикального гомеостаза (СГ) рассчитывают по формуле:

$$СГ=\frac{{С}_{Ц}}{{Е}_{АГ}}$$ ,

где С_Ц - концентрация цитрата (ммоль/мл), а Е_АГ - активность аконитатгидратазы (Е на мл сыворотки крови).

У пациентов происходило повышение концентрации цитрата как при лекарственном гепатите, так и при хроническом алкогольном гепатите (p<0,05) по сравнению с контрольной группой, что является адаптивной реакцией организма при интенсификации свободнорадикального окисления, направленной на нейтрализацию повышенного количества активных форм кислорода (табл.1). При этом активность аконитатгидратазы в обеих группах снижается (p<0,05), что свидетельствует о разрушении ее молекулы под действием свободных радикалов. Полученные данные отражаются на коэффициенте СГ.

Таблица 1 Изменение концентрации цитрата, активности аконитатгидратазы (АГ) и коэффициента свободнорадикального гомеостаза (СГ) у больных лекарственным и хроническим алкогольным гепатитами Показатель контрольная группа лекарственный гепатит хронический алкогольный гепатит до лечения после лечения до лечения после лечения Цитрат
(ммоль/мл) 0,777±0,031 1,405±0,052* 0,949±0,043** 1,653±0,061* 1,421±0,052** АГ (Е/мл) 0,942±0,045 0,534±0,022* 0,587±0,023** 0,610±0,018* 0,832±0,02б** Коэффициент СГ 0,83±0,09 2,63±0,13* 1,61±0,11** 2,71±0,15* 1,71±0,12** Примечание: * - по сравнению с контрольной группой p<0,05; ** - по сравнению с результатами, полученными до назначения лечения p<0,05.

Коэффициент СГ достоверно различается, его средние значения составляют: в контрольной группе 0,83 (границы доверительного интервала от 0,76 до 0,99), у больных с лекарственным гепатитом 2,63 (границы доверительного интервала от 2,49 до 2,76); у пациентов с хроническим алкогольным гепатитом в стадии обострения патологического процесса 2,71 (границы доверительного интервала от 2,49 до 2,88). При оценке коэффициента СГ через 10 дней от начала лечения наблюдается его снижение: у больных с лекарственным гепатитом в среднем до 1,61 (границы доверительного интервала от 1,49 до 1,85); у пациентов с хроническим алкогольным гепатитом в стадии ремиссии патологического процесса до 1,71 (границы доверительного интервала от 1,59 до 1,81).

Таким образом, увеличение значения коэффициента СГ выше 0,99 - величина указана исходя из верхней границы доверительного интервала группы контроля, отражает повышенную активность свободнорадикального окисления и снижение антиоксидантного потенциала организма при токсическом поражении печени; значения в диапазоне от 0,99 до 1,83 - соответствуют стадии ремиссии заболевания, значения коэффициента выше 1,83 - соответствуют стадия обострения патологического процесса.

Клинические примеры:

Больной Д., 1975 года рождения. Диагноз: Инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого, МБТ (+).

Поступил в отделение №3 Воронежского областного клинического противотуберкулезного диспансера им.Н.С.Похвисневой 11.02.2009. Была назначена полихимиотерапия (изониазид 600 мг в таблетках, стрептомицин 1 мл в растворе, пиразинамид 1,75 мг в таблетках, рифампицин 600 мг в таблетках). Через 21 день от начала лечения у больного появились жалобы на выраженную общую слабость, тянущие боли в правом подреберье, плохой аппетит и сон. Были проведены печеночные пробы: общий билирубин - 28,1 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 231,7 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 134,5 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 4,1 ед. Показатели состояния свободнорадикального гомеостаза: цитрат - 1,446 ммоль/мл, аконитатгидратаза - 0,511 Е на мл сыворотки крови. Коэффициент СГ - 2,83.

Было назначено лечение стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина В1 10 мл внутривенно, эссливер форте (эссенциальные фосфолипиды 300 мг) по 2 таблетке 3 раза в день в течение 10 дней.

Через 10 дней от начала лечения отмечено улучшение общего состояния, аппетита, сна. Печеночные пробы: общий билирубин - 23,2 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 136,7 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 92,8 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 3,4 ед. Показатели состояния свободнорадикального гомеостаза: цитрат - 0,936 ммоль/мл, аконитатгидратаза - 0,529 Е на мл сыворотки крови. Коэффициент СГ - 1,77.

Больной А., 1980 года рождения. Диагноз: Хронический алкоголизм, II ст., средней степени тяжести. Абстинентный синдром. Хронический алкогольный гепатит, стадия обострения.

Поступил в отделение №5 Воронежского областного клинического психоневрологического диспансера 17.09.2010 года с жалобами на выраженную общую слабость, боли в правом подреберье, тревогу, плохой аппетит и сон. Пациент на протяжении 5 лет злоупотреблял алкоголем. Печеночные пробы: общий билирубин - 33,4 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 256,9 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 147,2 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 4,3 ед. Показатели свободнорадикального гомеостаза: цитрат - 1,592 ммоль/мл, аконитатгидратаза - 0,622 Е на мл сыворотки крови. Коэффициент СГ - 2,56.

Назначено лечение: полный отказ от приема алкоголя, стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина B1 10 мл внутривенно, раствор рибоксина 10 мл внутривенно, раствор витамина B6 4 мл внутримышечно, раствор реланиума 4 мл внутривенно, карсил (силимарин 35 мг) по 2 таблетке 3 раза в день во время еды в течение 10 дней.

Через 10 дней от начала лечения отмечено улучшение общего состояния, аппетита, сна, работоспособности, спокоен, во времени и месте ориентирован верно, наблюдается уменьшение болей в правом подреберье при пальпации. Печеночные пробы: общий билирубин - 27,6 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 154,3 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 99,5 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 3,8 ед. Показатели свободнорадикального гомеостаза: цитрат - 1,377 ммоль/мл, аконитатгидратаза - 0,801 Е на мл сыворотки крови. Коэффициент СГ - 1,72.

Пациент К., 1974 года рождения. Практически здоров. Проходил в МБУЗ ГО г.Воронеж «Городская поликлиника №10» профилактический осмотр 11.10.2009 года. Жалоб не предъявлял. Общий и биохимический анализы крови в пределах нормы. Показатели состояния свободнорадикального гомеостаза: цитрат - 0,756 ммоль/мл, аконитатгидратаза - 0,951 Е на мл сыворотки крови. Коэффициент СГ - 0,79.

Таким образом, предлагаемый способ отражает новый подход по определению стадии патологического состояния печени на основе оценки параметров свободнорадикального гомеостаза. Он является надежным методом, обладающим высокой информативностью, который позволяет оценивать степень тяжести патологического процесса и прогнозировать эффективность проводимого лечения. Предлагаемый способ может быть применен в любой клинической лаборатории, оснащенной спектрофотометром, отличается простотой, не требует существенных затрат времени и реактивов.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения стадии патологического состояния печени на основе оценки параметров свободнорадикального гомеостаза. Сущность способа состоит в том, что проводят определение уровня ферментативной активности аконитатгидратазы и концентрации цитрата в сыворотке крови, рассчитывают коэффициент состояния свободнорадикального гомеостаза (СГ) по формуле. При значении СГ 0,99 и менее, судят об отсутствии патологического состояния печени. При значении СГ выше 0,99, но менее 1,83, судят о наличии процессов патологического состояния печения в стадии ремиссии. При значении СГ выше 1,83 определяют стадию обострения патологического процесса. Использование заявленного способа позволяет более эффективно определить стадии патологического состояния печени. 1 табл., 3 пр.

Способ определения стадии патологического состояния печени на основе оценки параметров свободнорадикального гомеостаза, включающий определение уровня ферментативной активности аконитатгидратазы и концентрации цитрата в сыворотке крови, отличающийся тем, что рассчитывают коэффициент состояния свободнорадикального гомеостаза (СГ) по формуле:
,
где C_Ц - концентрация цитрата (ммоль/мл), а E_АГ - активность аконитатгидратазы (E на мл сыворотки крови); если значение коэффициента СГ 0,99 и менее, судят об отсутствии патологического состояния печени; если значение коэффициента СГ выше 0,99, но менее 1,83, судят о наличии процессов патологического состояния печени в стадии ремиссии; значения коэффициента СГ выше 1,83 соответствуют стадии обострения патологического процесса.