СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ПРИ АЛКОГОЛЬНОМ ГЕПАТИТЕ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам клинической диагностики, может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения алкогольного поражения печени, основанного на оценке степени активности гамма-глутамилтрансферазы и состояния антиоксидантной системы организма.

В настоящее время в диагностике алкогольных гепатитов и оценке эффективности проводимого лечения широко используется определение активности ферментов: аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, гамма-глутамилтрансфераза, щелочная фосфатаза. Однако активность данных ферментов меняется и при других патологических состояниях и не отражает состояние антиоксидантной системы организма, функционирование которой существенно нарушается при алкогольном поражении печени.

Известно, что для оценки тяжести поражения печени при алкогольном гепатите и эффективности лечения применяется коэффициент Де Ритиса (соотношение аспартатаминотрансфераза /аланинаминотрансфераза). В норме коэффициент де Ритиса близок к 1,0. Развитие патологического процесса в печени ассоциируется со снижением этого показателя до 0,7 и ниже - при хронических активных гепатитах [Хазанов А.И. Функциональная диагностика болезней печени. - М.: Медицина, 1988]. Однако данный коэффициент не отражает степень нарушения функционирования антиоксидантной системы организма.

В последнее время все большее значение в диагностике заболеваний печени и гепато-билиарного тракта приобретает тест по определению активности гамма-глутамилтранспептидазы, который отличается большей чувствительностью, чем применяемые с этой целью тесты на аланинаминотрансферазу и аспартатаминотрансферазу. Определение активности гамма-глутамилтранспептидазы используется в частности для диагностики алкогольного поражения печени, а также для контроля проводимого лечения. Известно, что алкоголь усиливает продукцию гамма-глутамилтранспептидазы, что способствует ее выходу из гепатоцитов и приводит к повышению активности фермента в сыворотке крови даже при отсутствии патологии печени [Голованова Е. В. Диагностика и лечение внутрипеченочного холестаза при хронических заболеваниях печени: дисс. д.м.н., Москва, 2008]. Гамма-глутамилтранспептидаза катализирует перенос гамма-глутамилового остатка с гамма-глутамилового пептида на аминокислоту, другой пептид или иной субстрат. В организме человека фермент участвует в метаболизме глутатиона - пептида, состоящего из остатков глутаминовой кислоты, цистеина, глицина, который играет важную роль в регуляции антиоксидантной системы организма. Восстановленный глутатион относится к ферментативному звену антиоксидантной системы, его основной функцией является защита сульфгидрильных групп белков и мембран клеток от действия активных форм кислорода, генерация которых чрезмерно повышается при алкогольном гепатите. В частности, глутатион является акцептором гидроксильного радикала, а также косубстратом глутатионпероксидазы, инактивирующей гидропероксиды [Биохимия: учеб. для вузов, под ред. Е.С. Северина., 2003, стр.428-432]. Однако детальных сведений об использовании фермента гамма-глутамилтранспептидаза как отдельно взятого показателя или в составе комплекса показателей в качестве инструмента для оценки эффективности лечения алкогольных поражений печени в доступной литературе не обнаружено.

Технический результат - разработка способа прогнозирования эффективности лечения алкогольного гепатита с использованием нового коэффициента, учитывающего активность гамма-глутамилтранспептидазы и уровень восстановленного глутатиона, позволяющего повысить специфичность оценки, более корректно спланировать интенсивность и продолжительность курса лечения. Коэффициент позволяет определить степень поражения гепатобилиарной системы на фоне измененного антиоксидантного статуса организма, что обеспечивает повышение ценности обнаруживаемых изменений в прогнозировании и оценке эффективности проводимой терапии при хроническом алкогольном гепатите.

Технический результат достигнут путем десятидневного наблюдения группы больных с хроническим алкогольным гепатитом в стадии обострения в количестве 28 человек, получавших базисную терапию: полный отказ от приема алкоголя, стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина В1 10 мл внутривенно, раствор рибоксина 10 мл внутривенно, раствор витамина В6 4 мл внутримышечно, раствор реланиума 4 мл внутривенно, эссливер форте (эссенциальные фосфолипиды 300 мг) по 2 таблетки 3 раза в день в течение 10 дней.

Контрольную группу составили 65 практически здоровых доноров.

Для определения активности ферментов у всех обследованных проводили забор сыворотки крови.

Активность гамма-глутамилтранспептидазы оценивали по скорости реакции переноса глутамилового остатка с гамма-L-(+)-глутамил- 4-нитроанилида на глицилглицин (Био-тест, PLIVA - Lachema Diagnostika). Гамма-глутамилтранспептидаза (К.Ф.2.3.2.1., гамма-глутамилтрансфераза) переносит глутамиловый остаток с гамма-L-(+)-глутамил-4-нитроанилида на дипептидный акцептор, которым является глицилглицин, служащий одновременно и буфером. Концентрацию освобожденного 4-нитроанилина измеряют фотометрически после остановки ферментативной реакции подкислением. Получают эталонный раствор: в пробирке в десяти миллилитрах дистиллированной воды измельчают стеклянной палочкой одну таблетку субстрата гамма-L-глутамил-4-нитроанилида и растворяют содержимое при перемешивании и нагревании на кипящей водяной бане. После охлаждения к раствору добавляют 2,50 мл буферного раствора глицилглицина 0,55 моль/л, перемешивают и держат на водяной бане при 37°C [Dimov, D. M., Kulhánek, V.: Clin. Chim. Acta 16, 271 (1967); Kulhánek, V., Dimov, D.M.: Ergb. exp. Med. 12, 161 (1673)]. Перемешивают и измеряют оптическую плотность пробы (А1) и контрольного раствора (А2) против воды и вычисляют разность оптических плотностей (А1-А2).

Проведение анализа. Образцы: негемолизированная сыворотка, ЭДТА плазма; длина волны: (400 - 430) нм; кювета: 1 см; температура: (37±0,1)°C.

Компоненты Проба (мл) Контрольный раствор (мл) Рабочий раствор 0,25 0,25 Предварительно инкубируют 5 мин при 37°С и добавляют Сыворотка крови 0,025 - Инкубируют точно 15 мин при 37°С и добавляют Раствор уксусной кислоты 1,50 1,50 Сыворотки крови - 0,025

Калибровка

Из эталонного раствора 4-нитроанилина 6 ммоль/л приготавливают разбавлением калибровочные растворы согласно таблице:

Калибровачный раствор № Эталонный раствор 4-нитроанилин 6 ммоль/л (мл) Дистиллированная вода (мл) Результирующая каталитическая активность (мккат/л) 1 0,30 3,70 0,50 2 0,60 3,40 1,00 3 1,20 2,80 2,00 4 2,40 1,60 4,00 5 1,80 0,20 6,00

В пробирках отмеряют по 0,025 мл калибровочного раствора, добавляют по 1,75 мл раствора уксусной кислоты, растворы перемешивают и измеряют оптическую плотность против воды при длине волны, при которой измерялась проба. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от каталитической активности. Расчет проводят по разности оптической плотности пробы (А1) и контрольного раствора (А2), на калибровочном графике находят каталитическую активность гамма-глутамилтранспептидазы в испытуемой пробе. Референтные величины активности гамма-глутамилтранспептидазы у мужчин 0,25-1,77 мккат/л.

Концентрацию восстановленного глутатиона (GSH) определят с помощью реакции с 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой, в результате которой образуется тионитрофенильный анион (ТНФА), имеющий максимум поглощения при 412 нм. В пробирку наливают 0,5 мл исследуемой жидкости, затем 3,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) и перемешивают. Затем к 2 мл разведенной в восемь раз дистиллированной водой суспензии приливают 1 мл 20% трихлоруксусной кислоты, перемешивают и оставляют в холодильнике на 15-20 мин. После центрифугирования при 3000g в течение 15 мин 1 мл надосадочной жидкости прибавляют к 0,5 мл фосфатного буфера (рН 7,4). В опытную пробу приливают 0,05 мл реактива Эллмана, а в контрольную пробу - 0,05 мл метанола, после чего измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб против фосфатного буфера (рН 7,4) [Бузлама В.С. Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и систем антиоксидантной защиты организма у животных /В.С. Бузлама. - Воронеж. - 1997].

Расчет концентрации GSH производят по формуле:

Еоп - Ек

С=________×72,6×10³,

13,1×10³

где С - содержание GSH, ммоль/л; Еоп - оптическая плотность опытной пробы; Ек - оптическая плотность контрольной пробы; 13,1×10³ - коэффициент молярной экстинкции ТНФА при 412 нм; 72,6 - фактор разведения.

Глутатион-гамма-глутамилтранспептидазный (GγГ) коэффициент рассчитывают по формуле:

Еггп

GγГ=------

СGSH

где Еггп - активность гамма-глутамилтранспептидазы (мккат/л), а СGSH - концентрация восстановленного глутатиона (ммоль/л).

Проведенные нами исследования показали, что динамика величины предложенного коэффициента GγГ является высокочувствительным показателем, реагирующим на изменение клинически подтвержденного функционального состояния печени (см. табл.).

Таблица

Изменение активности гамма-глутамилтранспептидазы (ГГП) и концентрации глутатиона (GSH) у больных хроническим алкогольным гепатитом в стадии обострения

Показатель контрольная группа хронический алкогольный гепатит до лечения после лечения ГГП 0,882±0,031 3,429±0,147* 1,151±0,081** GSH (ммоль/л) 0,873±0,045 0,418±0,043* 0,719±0,088** Коэффициент GγГ 1,01±0,09 8,20±0,40* 1,60±0,12**

Примечание: * различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой при p<0,05; ** различия статистически значимы по сравнению с состоянием до лечения при p<0,05.

Из данных таблицы следует, что при хроническом алкогольном гепатите происходит повышение активности гамма-глутамилпранспептидазы в силу токсического влияния алкоголя на клетки печени. При этом концентрация глутатиона снижается по сравнению с контрольной группой, что связано со значительным возрастанием расходования данного метаболита при интенсификации свободнорадикальных процессов, так как он играет роль перехватчика свободных радикалов. Динамика предложенного нами коэффициента GγГ в разы отличается от показателя здоровых людей. В процессе проведения курса лечения пациентов с хроническим алкогольным гепатитом уже в первые дни после терапии коэффициент GγГ существенно снижается, через 10 дней от начала лечения, величина коэффициента сопоставима со значениями для практически здоровых и составляет 1,60 (p<0,05).

Таким образом, повышение величины предложенного коэффициента GγГ выше 1,1 свидетельствует о наличии патологического процесса, поражении печени на фоне разрушения гепатоцитов и снижения антиоксидантного потенциала организма. Значение коэффициента 7,80 соответствует обострению течения хронического алкогольного гепатита, требует экстренной госпитализации и назначения комплексной терапии. В процессе адекватного лечения предложенный нами коэффициент снижается до 1,72, что отражает нормализацию функционирования антиоксидантной системы и уменьшение гибели клеток печени. При таком значении коэффициента можно дать рекомендации к продолжению лечения и наблюдения пациента в условиях поликлиники.

Клинические примеры:

Больной А., 1980 года рождения. Диагноз: Синдром алкогольной зависимости, средней степени тяжести. Хронический алкогольный гепатит, стадия обострения.

Поступил в отделение №5 Воронежского областного клинического психоневрологического диспансера 17.09.2010 года с жалобами на выраженную общую слабость, боли в правом подреберье, тревогу, плохой аппетит и сон. Пациент на протяжении 5 лет злоупотреблял алкоголем. Печеночные пробы: общий билирубин - 33,4 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 256,9 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза- 147,2 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 4,3 ед., гамма-глутамилтрансфераза - 3,51 мккат/л. Концентрация восстановленного глутатиона - 0,399 ммоль/л. Коэффициент GγГ 8,80 - обострение течения хронического алкогольного гепатита.

Назначено лечение: полный отказ от приема алкоголя, стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина В1 10 мл внутривенно, раствор рибоксина 10 мл внутривенно, раствор витамина В6 4 мл внутримышечно, раствор реланиума 4 мл внутривенно, эссливер форте (эссенциальные фосфолипиды 300 мг) по 2 таблетке 3 раза в день в течение 10 дней.

Через 10 дней от начала лечения отмечено улучшение состояния (аппетита, сна, работоспособности), спокоен, во времени и месте ориентирован верно, наблюдается значительное уменьшение болей в правом подреберье при пальпации, тремора пальцев рук и языка. Печеночные пробы: общий билирубин - 27,6 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 154,3 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 99,5 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 3,8 ед., гамма-глутамилтрансфераза - 1,15 мккат/л. Концентрация восстановленного глутатиона - 0,729 ммоль/л. Коэффициент GγГ - 1,58.

Рекомендации: продолжить лечение в условиях поликлиники, под контролем клинических и лабораторных показателей.

Больной Б., 1977 года рождения. Диагноз: Синдром алкогольной зависимости, средней степени тяжести. Хронический алкогольный гепатит, стадия обострения.

Поступил в отделение №5 Воронежского областного клинического психоневрологического диспансера 10.06.2010 года с жалобами на выраженную общую слабость, боли в правом подреберье, тревогу, плохой аппетит и сон. Пациент на протяжении 4 лет злоупотреблял алкоголем.

Биохимический анализ крови: Печеночные пробы: билирубин - 36,6 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 267 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 138,0 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 4,8 ед., гамма-глутамилтрансфераза - 3,46 мккат/л. Концентрация восстановленного глутатиона - 0,402 ммоль/л. Коэффициент GγГ 8,61 - обострение течения хронического алкогольного гепатита.

Назначено лечение: полный отказ от приема алкоголя, стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина В1 10 мл внутривенно, раствор рибоксина 10 мл внутривенно, раствор витамина В6 4 мл внутримышечно, раствор реланиума 4 мл внутривенно, эссливер форте (эссенциальные фосфолипиды 300 мг) по 2 таблетке 3 раза в день в течение 10 дней.

Через 10 дней от начала лечения отмечено улучшение состояния (аппетита, сна, работоспособности), спокоен, во времени и месте ориентирован верно, наблюдается уменьшение болей в правом подреберье при пальпации, тремора пальцев рук и языка. Печеночные пробы: билирубин - 27,9 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 163,7 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 119,5 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 3,7 ед., гамма-глутамилтрансфераза - 1,25 мккат/л. Концентрация восстановленного глутатиона - 0,623 ммоль/л. Коэффициент GγГ - 2,01. Рекомендации: продолжить лечение в условиях стационарна, под строгим контролем клинических и лабораторных показателей.

Таким образом, предлагаемый способ отражает новый подход при прогнозировании и оценке эффективности проводимой терапии у пациентов с алкогольным поражением печени. Метод надежен, обладает высокой информативностью, позволяет более точно оценить длительность и необходимость лечения пациента с хроническим алкогольным гепатитом в условиях стационара. Предлагаемый способ может быть применен в любой клинической лаборатории, оснащенной спектрофотометром, отличается простотой, не требует существенных затрат времени и реактивов.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам клинической диагностики, и описывает способ прогнозирования эффективности лечения при алкогольном гепатите в стадии обострения, где до начала лечения у пациента в сыворотке крови определяют активность гамма-глутамилтранспептидазы (ГГП) и концентрацию восстановленного глутатиона (GSH), рассчитывают глутатион-гамма-глутамилтранспептидазный (GγГ) коэффициент по формуле:

$$G\gamma Г=\frac{Еггп}{CGSH}$$

где Еггп - активность гамма-глутамилтранспептидазы (мккат/л), a CGSH - концентрация восстановленного глутатиона (ммоль/л); и при значении коэффициента более 7,80 устанавливают обострение течения хронического алкогольного гепатита, экстренно госпитализируют и назначают комплексную терапию; через 10 дней от начала лечения повторно определяют коэффициент GγГ, и в случае его снижения до 1,72 делают вывод о нормализации функционирования антиоксидантной системы и уменьшении гибели клеток печени, что позволяет продолжить лечение в условиях поликлиники, в случае значения коэффициента GγГ выше 1,72 следует продолжить лечение в условиях стационара, под строгим контролем клинических и лабораторных показателей. Изобретение обеспечивает повышение специфичности оценки, планирование интенсивности и продолжительности курса лечения. 3 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования эффективности лечения при алкогольном гепатите в стадии обострения, характеризующийся тем, что до начала лечения у пациента в сыворотке крови определяют активность гамма-глутамилтранспептидазы (ГГП) и концентрацию восстановленного глутатиона (GSH), рассчитывают глутатион-гамма-глутамилтранспептидазный (GγГ) коэффициент по формуле:
$$G\gamma Г=\frac{Еггп}{CGSH}$$
где Еггп - активность гамма-глутамилтранспептидазы (мккат/л), a CGSH - концентрация восстановленного глутатиона (ммоль/л); и при значении коэффициента более 7,80 устанавливают обострение течения хронического алкогольного гепатита, экстренно госпитализируют и назначают комплексную терапию; через 10 дней от начала лечения повторно определяют коэффициент GγГ, и в случае его снижения до 1,72 делают вывод о нормализации функционирования антиоксидантной системы и уменьшении гибели клеток печени, что позволяет продолжить лечение в условиях поликлиники, в случае значения коэффициента GγГ выше 1,72 следует продолжить лечение в условиях стационара, под строгим контролем клинических и лабораторных показателей.