СПОСОБ И ПРИБОР ДЛЯ СОРТИРОВКИ КЛЕТОК Российский патент 2014 года по МПК C12M1/34 C12M1/42 G01N15/10 G01N15/14 G01N33/483 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США №61/077083, поданной 30 июня 2008 г.; все содержание которой включено в настоящее описание путем отсылки. Настоящая заявка связана с одновременно поданной заявкой на патент США №___(реестр адвокатов №30752/44821), все содержание которой также включено в данную заявку путем отсылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение, в целом, связано со способами и приборами, предназначенными для сортировки клеток, и, в частности, со способами и приборами, предназначенными для использования контролируемого источника энергии с целью преобразования популяции целевых клеток путем выборочного удаления, увеличения числа или изменения клеток, вирусов или частиц в популяции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Проточная цитометрическая сортировка позволяет отбирать, увеличивать число, пропорционально распределять или делить популяции целевых клеток, вирусов, организмов или частиц (далее - клетки). Критерии отбора включают измеряемые свойства отдельных клеток, которые можно выявить снаружи клетки как с помощью, так без помощи химических реагентов, комплексов, или организмов, которые присоединяются или могут присоединяться к клетке. Например, свойства клеток можно измерить или приблизительно установить посредством обнаружения и/или определения связи клеток с одной или несколькими метками, такими как флуоресцирующие молекулы, комплексы или организмы, или молекулы, комплексы или организмы, измененные с целью обеспечения флуоресценции. Такие флуоресцирующие молекулы, комплексы и/или организмы могут избирательно присоединяться к клеткам исходя из качественных или количественных свойств клеток, включая их состав в плане содержания белков, липидов, фосфопротеинов, гликопротеинов, фосфолипидов, нуклеиновых кислот (включая количество, последовательность или структуру нуклеиновых кислот), углеводов, солей/ионов и других молекул, находящихся в клетках или присоединенных к ним. Кроме того, такие флуоресцирующие молекулы, комплексы и/или организмы могут избирательно присоединяться к клеткам исходя из физических или физиологических характеристик клеток, таких как проницаемость мембран, состав мембран, текучесть мембран, химический или мембранный потенциал, жизнеспособность, химические градиенты, подвижность, восстановительный или окислительный потенциал или состояние восстановления или окисления, а также другие параметры и свойства.

Другие измеряемые свойства помеченных или непомеченных, измененных или неизмененных клеток, которые могут служить основанием для отбора клеток, включая, без ограничения:

свойства взаимодействия света с клетками, например флуоресценция, спектральная поглощательная способность, отражательная способность, рассеяние, поляризация или другие свойства;

электрические свойства клеток или воздействие клеток на свою среду, включая проводимость, индуктивность, сопротивление, мембранный потенциал или напряжение, а также другие свойства;

магнитные или электромагнитные свойства клеток, включая магнетизм, парамагнетизм, магнитный резонанс и/или взаимодействие клеток с электромагнитной энергией;

внешние признаки, вид или морфологические свойства клеток; и

состав клеток по отношению к какому-либо веществу или параметру, измеренному прямо или косвенно, каким бы то ни было способом.

Кроме того, прямое или косвенное измерение таких параметров как по отдельности, так и в комбинации может отражать простые или сложные свойства целевых клеток.

Примером такого свойства является половая хромосома, входящая в диплоид, гаплоид или геном гаметы, она может быть Х-хромосомой или Y-хромосомой или их сочетанием в зависимости от типа клетки и организма. Определить содержания половой хромосомы можно при помощи одного или нескольких месяцев на основании прямых или косвенных измерений или определений. Такие способы включают в себя измерение содержания в клетках относительно или абсолютно определенной ДНК; наличие или отсутствие определенных последовательностей ДНК или маркеров наличия или отсутствия определенных последовательностей ДНК; размер клеток или частей, или органелл клеток; наличие, местонахождение или отсутствие белков или другой характеристики маркеров, их комбинаций или моделей представления таких маркеров содержания половой хромосомы в клетках; или любое другое измерение, отражающее состав половой хромосомы клетки. Для выявления клеток, представляющих интерес в определенном случае, ситуации, системе, болезни, состоянии, процессе или обстоятельствах может потребоваться целый ряд подобных изменений или манипуляций, направленных на определение свойств.

Такие цитометрические измерения обеспечивают возможность определять количественные и/или качественные свойства клеток, популяций клеток, органов, тканей или организмов. Такие определения могут использоваться различным образом, включая, в том числе, диагностику, биомедицинское исследование, проектирование, эпидемиологию, медицину, сельское хозяйство, животноводство, содержание скота, зоологию, биофармацевтическую промышленность и другие сферы. Помимо возможности проводить такие измерения существующие способы и аппаратура позволяют разделять клетки на основании характеристик или параметров, измеренных с помощью описанной выше цитометрии. Отбор клеток может быть позитивно-негативным и производиться путем концентрирования, сбора или разделения целевых клеток или путем удаления ненужных или нецелевых клеток в составе. Контроль за таким отбором может вестись на основании любого параметра, характеристики или комбинации параметров или характеристик, которые можно определить так, как указано выше.

Клетки, выявленные с помощью способов, включающих описанные выше способы или связанные с ними, можно разделить, отделить, увеличить или уменьшить степень их концентрации или объединить их в любое произвольное число групп. В одном распространенном способе разделения (представленном на фиг.1А) используются электростатические силы для отвода электрического или электростатического потока, капли или капель, содержащих клетку или клетки с нужными или ненужными свойствами. Отклоненные клетки соответствующим образом собираются или исключаются в зависимости от области применения, как показано на фиг.1А. Другие способы разделения включают использование струйных элементов, в том числе клапаны для отвода клеток в потоке жидкости в альтернативные пути, каналы, трубки или элементы для последующего сбора или удаления, как показано на фиг.1В.

Существует ряд методов и систем для проточной цитометрический сортировки клеток, в том числе методы и системы, разработанные специально для проточной цитометрический сортировки сперматозоидов млекопитающего и, в частности, для сортировки сперматозоидов в популяциях сперматозоидов, несущих Х-хромосомы, и/или популяциях сперматозоидов, несущих Y-хромосомы, с целью повышения вероятности того, что оплодотворение яйцеклетки отсортированной спермой приведет к рождению потомства необходимого пола. Например, владельцу молочной фермы может потребоваться отсортировать сперму быка с целью создания коровьего эмбриона путем искусственного осеменения, экстракорпорального оплодотворения или иным образом, используя сперму с Х-хромосомой, для получения дополнительного потомства женского рода у коров.

Методы проточной цитометрической сортировки сопряжены с некоторыми трудностями, в частности, это относится к сортировке сперматозоидов млекопитающего для дальнейшего использования при создании потомства. Важно отметить, что методы, используемые для метки и/или разграничения клеток, и/или методы, используемые для сортировки клеток, не должны негативно влиять на жизнеспособность клеток. Часто одна или несколько целей использования методов и/или систем (например, ускоренная сортировка, более высокая точность и т.д.) противоречат другим целям использования методов и/или систем. Необходимо сбалансировать и учесть различные факторы, включая температуру, изменения температуры, давление и/или изменения давления, которые влияют на клетки, жидкостную среду, воздействующую на клетки, силы, действующие на клетки, и продолжительность жизни клетки. Например, скорость, с которой флуоресцирующая молекула (например, флуорохром) входит в клетку для связи с ДНК в ядре клетки (т.е. скорость окрашивания клеток), может увеличиваться по мере роста температуры. Следовательно, производительность системы (по меньшей мере, производительность процесса окрашивания) может увеличиваться по мере роста температуры среды, в которой находится клетка. Тем не менее, повышенная температура может негативно сказаться на жизнеспособности клеток и/или продолжительности времени, в течение которого клетки остаются жизнеспособными. Напротив, поддержание клеток на оптимальном температурном уровне с целью обеспечения жизнеспособности может увеличить время, необходимое для окрашивания (и для измерения и сортировки) клеток, таким образом, для реализации процесса потребуется больше времени, чем это целесообразно с практической точки зрения, или, в результате, по истечении времени, необходимого для завершения процесса, клетки станут нежизнеспособными.

Другая трудность, сопряженная с сортировкой клеток, связана с физическими и оптическими свойствами клеток. В частности, сплющенные или другие ассиметричные клетки такие, как эритроциты или сперматозоиды млекопитающих, обеспечивают анизотропное излучение энергии (например, свет). Сложная геометрическая форма внутренней части клетки и/или сложная геометрическая форма границ клетки способствует преломлению и/или отражению света такими путями, которые в значительной мере зависят от ориентации клетки по отношению к любым источникам света и/или детекторам, используемым для различения клеток. К примеру, проточная цитометрическая сортировка сперматозоидов млекопитающего в популяциях с Х- или Y-хромосомами обычно включает окрашивание клеток с флуоресцирующей молекулой, которая связывается с ДНК внутри клеток. Варьирование содержания ДНК между Х- и Y-хромосомами большинства видов млекопитающих (Y-хромосомы, как правило, содержат меньше ДНК, чем Х-хромосомы) приводит к относительно большей флуоресценции со стороны клеток с Х-хромосомами. Однако разница в содержании ДНК Х- и Y-хромосом обычно составляет порядка нескольких процентов и часто геометрическая форма и/или ориентация клетки может повлиять на обнаруженную флуоресценцию в процентном соотношении, которое существенно превышает процентную разницу в содержании ДНК в Х- и Y-хромосомах. Кроме того, такой анализ требует, чтобы клетки проходили через область обнаружения по отдельности таким образом, чтобы детектор не истолковывал флуоресценцию со стороны двух клеток, как флуоресценцию со стороны одной клетки.

В системах проточной цитометрической сортировки часто используется струйный механизм «ядро в оболочке» для переноса клеток через область обнаружения. Как показано на фиг.1C, относительно медленно движущийся поток 50 водной суспензии клеток 52 вливается в относительно быстро движущуюся струю проточной жидкости 54. Такая схема позволяет собрать клетки 52 в поток 56, который называется «ядерным» потоком. При соответствующем выборе давления и образующейся в результате скорости ядерной суспензии и проточной жидкости «ядерный» поток сужается под действием гидродинамических сил, вызванных проточной струей, и клетки в «ядерном» потоке распределяются в продольном направлении таким образом, чтобы обеспечить их перенос в струе по очереди. Силы, которые удлиняют и сужают «ядерный» поток, позволяют ориентировать клетки 52 таким образом, чтобы продольная ось 58 клетки 52 была параллельна направлению струи 56, в которой клетки движутся по одной. Однако ориентация клеток по отношению к продольной оси 58 остается более или менее произвольной. Таким образом, при прохождении каждой клеткой зоны обнаружения свет, падающий на клетку, свет, излучаемый от клетки (например, флуоресцентное излучение), и свет, отражаемый от клетки, по-прежнему зависит от ориентации клетки 52. Это особенно справедливо для многих типов сперматозоидов млекопитающих.

Существует несколько решений проблемы ориентации сперматозоида, связанной с освещением и обнаружением клеток в проточных цитометрических системах. Например, на фиг.1D представлено одно решение, в котором используется срезанный, скошенный наконечник 60 на трубке 62 для вливания пробного потока 64 в проточную струю 66. Срезанный, скошенный наконечник 60 помогает направлять клетки по отношению к их продольным осям 58 внутри проточной струи 66, выравнивая лицевые поверхности клеток в одном направлении. Другое решение (которое можно объединить с решением, предполагающим использование скошенного наконечника) предусматривает применение двух детекторов 68 и 70, перпендикулярных друг другу (детектор 68, расположенный под углом 0 градусов, и детектор 70, расположенный под углом 90 градусов), которые используются совместно для определения ориентации каждой клетки 52 при прохождении ею зоны обнаружения 72, а также для измерения уровня флуоресценции соответствующим образом ориентированных клеток таким образом, чтобы обеспечить квантование флуоресцирующего сигнала. Решения, использующие гидродинамическую ориентацию клеток вокруг продольной оси, как правило, дают результат в популяциях, в которых необходимое выравнивание с целью измерения флуоресценции обеспечивается примерно для 70% или менее клеток в пробной струе, что снижает производительность аппаратуры и приводит к исключению неправильно направленных клеток.

Еще одно решение проблемы, связанной с геометрической формой и ориентацией клеток, подразумевает использование оптического обнаружения вдоль оси, вдоль которой струя «ядро в оболочке» переносит клетки. В одном таком решении используется оптика для эпи-освещения с целью освещения клетки и обнаружения света, излучаемого клеткой. Как показано на фиг.1Е, пробный поток 74, переносимый проточной струей 76, движется непосредственно к объективу микроскопа 78, исключая зависимость от ориентации клетки (например, сперматозоида 80) по отношению к продольной оси 82 клетки 80. Однако траектория движения клетки 80 к объективу 78 требует, чтобы клетка 80 немедленно изменила траекторию после прохождения через зону обнаружения 82 (т.е. фокальную точку 84 объектива 78). Система изменяет траекторию за счет поперечной струи 86 жидкости. После проведения анализа за счет схождения 88 поперечной струи жидкости 86, проточной струи 76 и потока жидкости 74 может возникнуть неопределенность в отношении расположения отдельных клеток. Такая неопределенность относительно расположения может привести к тому, что система не сможет выполнить сортировку клеток, поскольку местонахождение клетки 80 внутри сведенной в одну точку струи может стать непредсказуемым сразу после прохождения клетки через зону обнаружения 82.

Еще одно решение, представленное на фиг.1F, подразумевает использование одного или нескольких параболических отражателей 102 для равномерного освещения клеток и/или для радиального сбора света из клеток. В системе применяется сопло 104 для выпуска потока/струи 106 жидкости с отдельными клетками 92. Поток 106 движется через область обнаружения 94 и через отверстие 96 в параболическом отражателе 102. После прохождения области обнаружения в какой-то точке поток 106 разделяется на капли 90, которые могут быть электрически заряжены. После этого каждая капля 90 может быть отсортирована, например, путем изменения направления заряженной капли 90 и электрически заряженных пластин дефлектора 98 для смещения капель в одно или несколько приемных устройств 100. Проблема в том, что такая конфигурация «струя в воздухе» приводит к тому, что при выходе потока 106 из сопла 104 поток 106 (и клетки 92, находящиеся в потоке 106) подвергается падению давления. Внезапное изменение давления (и увеличенное давление внутри самого сопла) может негативно повлиять на жизнеспособность клетки 92 аналогично последующему влиянию на клетку 92 внутри приемного устройства 100. Следовательно, давление и скорость потока 106, выходящего из сопла 104, должны оставаться ниже любого порогового значения, при котором клетки 92 могут быть разрушены, что снижает производительность системы. Кроме того, движение капель 90 в атмосфере может потребовать установления ограничений по отношению к среде, включая чистоту воздуха в помещении (например, «чистое помещение») и контроль температуры.

Таким образом, даже при относительно улучшенном состоянии проточной цитометрии существует потребность в более эффективных, более чувствительных и более точных методах и средствах разделения и/или идентификации клеток.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описывается способ и прибор для обнаружения, выборочного изменения за счет функционального и/или физического изменения, и сбора нужных или ненужных клеток в популяции с помощью проточной цитометрии. Данный способ не основывается на использовании параболических отражателей или перпендикулярно расположенных детекторов для обнаружения и категоризации клеток, как в случае с распространенными методами и приборами цитометрической сортировки. Напротив, данный способ основан на использовании объектива, оптическая ось которого расположена соосно прохождению образца через зону обнаружения. Этот способ необязательно основывается на отклонении или разделении струйного потока клеток или на распределении клеток по разным принимающим сосудам или каналам, как и в случае с распространенными методами и приборами цитометрической сортировки.

Данный способ предполагает использование контролируемого источника энергии, такого как источник электромагнитного излучения, например лазер, для облучения нужных или ненужных клеток в популяции, которые были выявлены с помощью цитометрических методик обнаружения. Контролируемый источник энергии выборочно направляется на целевые клетки исходя из их измеренных свойств или характеристик, после их анализа в цитометре, в некоторых вариантах в течение одной секунды проведения анализа, тогда как клетки остаются в жидкостной струе устройства. Такие клетки можно функционально или физически изменить за счет переданной энергии. В зависимости от конкретного использования и конкретного варианта исполнения способов и приборов образующаяся популяция клеток может быть функционально или физически очищена от ненужных клеток или может быть преобразована таким образом, чтобы обеспечить последующее увеличение числа нужных клеток или удаление ненужных клеток. Описанные способы и приборы полезны в тех случаях, когда требуется увеличить или уменьшить количество клеток. В некоторых вариантах исполнения данный способ и/или прибор изменяет жидкость, содержащую нужные или ненужные клетки в популяции, которые были выявлены с помощью цитометрических методик обнаружения, и не может непосредственно изменять клетки. В таких вариантах исполнения способ действия данного метода и/или прибора может основываться на отклонении или разделении струйного потока клеток или на распределении клеток по разным принимающим сосудам или каналам.

Один аспект, связанный с описываемыми способами и приборами, включает их использование для увеличения числа, отбора, функционального изменения и уменьшения числа сперматозоидов в популяции на основе Х или Y половой хромосомы, содержащейся в клетках. Данные способы и приборы предполагают использование альтернативных проектов для струйной техники и оптических систем цитометра, включая, с одной стороны, прибор, в котором оптические измерительные элементы и/или изменяющий клетки источник энергии ориентированы/ориентирован перпендикулярно жидкостному потоку, а с другой стороны, прибор, в котором некоторые такие элементы могут также или в качестве альтернативы быть ориентированы по той же оси, что и жидкостный поток и/или под косыми углами по отношению к нему.

Данные способы и приборы проточной цитометрии предлагают новый способ и прибор для позитивно-негативного отбора клеток путем наблюдения за клетками и точной классификации каждой клетки независимо от ориентации клетки по отношению к ее самой длинной оси, а также посредством последующего использования классификации для того, чтобы определить, изменить, дериватизировать, разрушить, уничтожить или фрагментировать клетку в ходе цитометрии. Описываемые способы и приборы включают применение сил, энергии или облучения по отношению к нужным или ненужным клеткам одновременно или в течение одной секунды после цитометрического измерения с целью внесения изменений в те клетки, которые изменяют их в физическом или функциональном плане. Такие измененные клетки или их остатки или производные, с одной стороны, сохраняются в образующемся составе или, с другой стороны, добавляются или удаляются в зависимости от требований при определенном использовании или применении.

Здесь дано описание варианта исполнения, позволяющего на функциональном и/или физическом уровне отделять спермии с Х-хромосомами от спермиев с Y-хромосомами и/или спермии с Y-хромосомами от спермиев с Х-хромосомами. В данном исполнении относительное содержание ДНК в отдельных спермиях в популяции спермиев косвенно измеряется с помощью хорошо известного свойства химических веществ, связывающихся с ДНК, таких как бисбензимид, красители SYBR, например SYBR-14, Хехст 33342, Хехст 33258, бромид этидия, акридиновый оранжевый, DAPI, хромомицин, митрамицин, оливомицин, и других химических веществ, известных в данной отрасли, которые при присоединении к ДНК обеспечивают повышенный уровень флуоресценции. Измерение производится путем наблюдения за клеткой по мере ее перемещения внутри потока, движущегося к точке наблюдения, желательно с помощью объектива, оптическая ось которого расположена соосно движению потока. Предполагается, что клетки с относительно большим количеством ДНК (т.е. более высокое содержание ДНК) содержат большую Х-хромосому, а клетки с относительно меньшим количеством ДНК (т.е. более низкое содержание ДНК) содержат меньшую Y-хромосому. В некоторых вариантах исполнения способа, когда в конечном составе должны быть клетки только с одной из половых хромосом, данный способ предполагает направление лазерного источника энергии на клетки одновременно или в течение одной секунды, или менее, проведения анализа, когда лазерный источник энергии можно быстро смоделировать для облучения клеток, содержащих ненужную половую хромосому, и/или клеток, половая хромосома которых не определена. Один вариант исполнения предполагает использование в данном способе лазерного источника энергии, выделяющего энергию достаточного качества и/или в достаточном объеме для изменения, дериватизации, разрушения, деактивации и/или уничтожения ненужных клеток. Такие изменения в отобранных клетках, с одной стороны, включают фрагментирование клеток или, с другой стороны, являются менее разрушительными в зависимости от применения. Например, в тех вариантах исполнения способа, когда для оплодотворения и/или размножения используется идентифицированная и/или выявленная сперма, для того чтобы получить нужный состав, достаточно лишить ненужные клетки возможности воспроизводить жизнеспособное потомство, например, в результате разрушения последовательности или структуры молекул ДНК в клетках или в результате уменьшения их подвижности таким образом, чтобы при искусственном осеменении они в большинстве своем были бесплодны. В других вариантах ненужные клетки становятся неподвижными, уничтожаются, изменяются или инактивируются каким-либо другим способом с целью воздействия на репродуктивную способность ненужных клеток. В альтернативном варианте ненужные клетки изменяются или дериватизируются таким образом, чтобы в последующем их можно было удалить или частично удалить из состава, включающего нужные клетки.

В другом варианте исполнения в конфигурации цитометра применяется один или несколько оптических элементов, с одной стороны, для измерения клеточных свойств и/или, с другой стороны, для использования с целью подачи энергии в клетки, когда хотя бы один оптический элемент, желательно оптическая ось объектива, ориентирован по отношению к той же оси, что и струя с анализируемыми клетками. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения представлен способ и прибор, которые для освещения, измерения или подачи энергии в клетки используют оптический элемент и, в частности, объектив, расположенный соосно струе жидкости. В другом исполнении представлен способ и прибор, которые для измерения или подачи энергии в клетки по отдельности или совместно используют один или несколько дополнительных оптических элементов, расположенных под углом 90 градусов по отношению к потоку жидкости. В еще одном исполнении представлен способ и прибор, которые для измерения или подачи энергии в клетки по отдельности или совместно используют один или несколько дополнительных оптических элементов, расположенных несоосно потоку жидкости. И еще в одном исполнении представлен способ и прибор, которые для измерения или подачи энергии в клетки по отдельности или совместно используют один или несколько дополнительных оптических элементов, расположенных под косым углом по отношению к потоку жидкости. В настоящем документе «косой угол» означает острый или тупой угол, не являющийся прямым углом или кратным прямому углу.

Некоторые варианты исполнения предлагают способ для изменения целевой клетки в популяции клеток, включая направление на целевую клетку контролируемого источника энергии, который изменяет целевую клетку после идентификации клетки как целевой клетки в популяции клеток, не отделяя целевую клетку от популяции клеток после изменения с помощью источника энергии.

Некоторые варианты исполнения предлагают способ для выявления субпопуляции целевых клеток в популяции клеток, включая направление на популяцию клеток контролируемого источника энергии, который изменяет клетки субпопуляции целевых клеток, при этом источник энергии направляется после первого анализа клеток в пробной жидкостной струе проточного цитометра, и не более чем через примерно одну секунду после первого анализа, при этом клетки остаются в пробной жидкостной струе проточного цитометра, и в ходе первого анализа клетки субпопуляции клеток идентифицируются как целевые клетки, по мере того, как такие целевые клетки движутся к зоне опроса, и при этом контролируемый источник энергии изменяет целевые клетки пробной струи посредством проточного цитометра.

В некоторых вариантах исполнения первый анализ включает обнаружение целевых клеток с нужным свойством, выбранным из группы со следующими необходимыми характеристиками: белковый состав, состав ДНК, маркер на поверхности клетки, размер молекулы, поглощение света, отражение света, флуоресценция, рассеяние света, поляризация, электрическое свойство, магнитное свойство, морфологическое свойство, проницаемость мембран, текучесть мембран и окислительно-восстановительное состояние.

В некоторых вариантах исполнения источник энергии направляется на популяцию клеток в момент прохождения популяции клеток через струйный поток в проточном цитометре. В соответствующем исполнении источник энергии направляется на целевую клетку после, и в течение одной секунды, идентификации клетки как целевой клетки в струйном потоке.

В некоторых вариантах исполнения предполагается, что источник энергии располагается соосно струйному потоку. Также предполагается, что источник энергии располагается под углом 90° по отношению к струйному потоку или под косым углом по отношению к струйному потоку. В другом исполнении источник энергии подается в целевые клетки с помощью оптики для освещения по Келеру и/или эпи-освещения. Еще в одном исполнении источник энергии направляется на точку в струе клеток, расположенную ниже места, в котором измеряются клеточные свойства. И еще в одном исполнении источник энергии направляется на точку в струе клеток, расположенную ниже места, где измеряются клеточные свойства, и которая расположена после отклонения или поворота струйного потока по отношению к исходному направлению струи.

В некоторых вариантах исполнения один или несколько анализов проводятся путем наблюдения за клеткой по мере ее перемещения внутри потока, движущегося к точке наблюдения, желательно с помощью объектива, оптическая ось которого расположена соосно движению потока. После прохождения через точку наблюдения в некоторых вариантах исполнения поток изменяет направление, тогда как порядок и/или месторасположения клеток в потоке по-прежнему поддаются определению. В некоторых вариантах исполнения контролируемый источник энергии может выборочно изменить одну или несколько клеток в соответствии с данными одного или нескольких анализов. В некоторых вариантах исполнения контролируемый источник энергии располагается соосно заново направленному потоку, тогда как в других вариантах исполнения контролируемый источник энергии располагается перпендикулярно или под косым углом по отношению к заново направленному потоку. В некоторых вариантах исполнения, которые необязательно включают контролируемый источник энергии, сопло может выталкивать поток, образующий капли, которые могут сортироваться с помощью общеизвестных средств (например, за счет контролируемого источника энергии для подачи электростатического заряда, за счет контроля давления в различных каналах потока жидкости и т.д.).

В некоторых соответствующих вариантах исполнения контролируемый источник энергии направляется на место расположения клетки в струйном потоке одним из способов, включающих непрерывный поток, импульсный поток, прерывистые циклы включения-выключения, периодическую фокусировку и расфокусировку источника энергии и прерывистое быстрое отклонение источника энергии к потоку.

В некоторых вариантах исполнения контролируемый источник энергии представляет собой электромагнитный источник. В некоторых вариантах исполнения источником энергии является лазер.

В некоторых вариантах исполнения способ изменения клеток выбирается из группы, включающей дериватизацию, уничтожение, разрушение, нарушение и фрагментирование целевых клеток.

Кроме того, целевая клетка идентифицируются как целевая клетка с помощью метки, которая обнаруживается с помощью электрических, магнитных, спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, флуоресцентных или других химических средств. В некоторых вариантах исполнения метка представляет собой добавление фотоактивируемого химического соединения или метки.

В соответствующем исполнении целевая клетка идентифицируется как клетка с нужным свойством, выбранным из группы со следующими необходимыми характеристиками: белковый состав, содержание белка, состав ДНК, содержание ДНК, маркер на поверхности клетки, размер молекулы, поглощение света, отражение света, флуоресценция, рассеяние света, поляризация, электрическое свойство, магнитное свойство, морфологическое свойство, проницаемость мембран, текучесть мембран и окислительно-восстановительное состояние.

Описываемые способы и приборы предполагают, что любой источник энергии, детектор или фокусирующий элемент, используемый при выявлении свойств клеток в струе, может располагаться соосно струйному потоку. Например, в проточном цитометре, состоящем из детекторов или контролируемого источника энергии, либо детекторы, либо контролируемый источник энергии, либо и то и другое, располагаются соосно струйному потоку. В соответствующем исполнении любое устройство обнаружения и/или оптические элементы, используемые при выявлении свойств клеток в струе, располагаются соосно струйному потоку.

В другом исполнении для подачи света или энергии, необходимой для выявления нужных свойств, используется оптика для освещения по Келеру и/или эпи-освещения. В соответствующем исполнении, когда способ предполагает использование проточного цитометра, проточный цитометр представляет собой цитометр для эпи-освещения. Также предполагается, что цитометр для эпи-освещения, используемый в описываемом способе, включает прибор для изменения целевых клеток, о чем будет сказано ниже.

При использовании в описываемом способе проточного цитометра проточный цитометр представляет собой цитометр с одним или несколькими пробными потоками, который включает оптику с объективом, расположенным соосно течению одного или нескольких пробных потоков для подачи света или энергии, необходимой для выявления нужных свойств, с целью выявления нужных свойств клеток и/или для подачи света или энергии, необходимой для изменения нужных или ненужных клеток.

В другом исполнении источник энергии изменяет целевую клетку с нужным свойством. В соответствующем исполнении источник энергии изменяет целевую клетку, не обладающую нужным свойством.

Еще в одном варианте исполнения целевой клеткой является сперматозоид, отобранный из группы сперматозоидов, несущих Х-хромосому, и сперматозоидов, несущих Y-хромосому. В некоторых вариантах исполнения предполагается, что сперматозоид идентифицируется как целевая клетка на основании нужного различия в содержании ДНК между сперматозоидами, несущими Х-хромосому, и сперматозоидами, несущими Y-хромосому.

Описываемые способы и приборы также обеспечивают сбор популяции клеток в сборную камеру для дальнейшего использования. В некоторых исполнениях сборная камера содержит целевые клетки, измененные контролируемым источником энергии, и клетки, не измененные контролируемым источником энергии. В соответствующем исполнении после сбора целевые клетки могут использоваться при реализации последующих процессов и процедур. В еще одном исполнении предполагается, что после сбора целевые клетки исключаются, и оставшиеся в популяции клетки используются при реализации последующих процессов или процедур.

Описываемые способы и приборы также предполагают использование прибора для изменения целевой клетки в популяции клеток, включающего контролируемый источник энергии, изменяющий целевую клетку после идентификации клетки как целевой клетки в популяции клеток, не отделяя целевую клетку от популяции клеток после изменения с помощью источника энергии.

В соответствующем варианте исполнения описываемые способы и приборы предполагают выявление субпопуляции целевых клеток в популяции клеток с помощью проточного цитометра, включающего контролируемый источник энергии, который изменяет субпопуляцию целевых клеток, при этом источник энергии направляется после первого анализа клеток во время прохождения пробы через типовую трубку проточного цитометра, и, как правило, в течение одной секунды анализа клетки, тогда как клетки остаются в пробной жидкостной струе прибора, при этом в ходе первого анализа клетка идентифицируется как целевая клетка, и при этом контролируемый источник энергии изменяет целевую клетку при прохождении пробы через проточный цитометр.

В некоторых вариантах исполнения один или несколько предусмотренных данным способом этапов хранятся в виде машиночитаемых инструкций на материальных носителях в контроллере. Процессор контроллера выполняет инструкции с целью мониторинга и/или контроля различных аспектов сортировочного проточного цитометра. Данные инструкции могут включать одну или несколько операций, адаптированных для выполнения разных задач в цитометре.

В некоторых дополнительных вариантах исполнения оптическая ячейка, кювета, окно, расходомерная трубка, стенка, край или другая часть сортировочного проточного цитометра изготовлены из материала с коэффициентом преломления от 1,30 до 1,40 включительно. В этих и других вариантах исполнения решение, включающее определяемое при анализе вещество, может быть скорректировано таким образом, чтобы коэффициент преломления в данном решении был близок к коэффициенту преломления оптической ячейки, кюветы, окна, расходомерной трубки, стенки, края или другой части сортировочного проточного цитометра и, в частности, чтобы коэффициенты преломления различались на 0,02 или менее.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1А показан способ сортировки капель, используемый в сортировочных проточных цитометрах;

на фиг.1В показан способ дифференциального давления в струе, используемый в сортировочных проточных цитометрах;

на фиг.1C изображен механизм «оболочка/поток», используемый в проточных цитометрических системах;

на фиг.1D изображен механизм «оболочка/поток», в котором для ориентирования в потоке используется скошенный наконечник;

на фиг.1Е изображен проточный цитометр, обнаруживающий клетку с помощью объектива, направленного соосно струйному потоку;

на фиг.1F показана система, использующая параболический отражатель для равномерного освещения клеток и радиального сбора света из клеток;

на фиг.2 изображен предполагаемый вариант исполнения пути движения струи сортировочного проточного цитометра;

на фиг.3 изображен предполагаемый вариант исполнения сортировочного проточного цитометра;

на фиг.4 изображен предполагаемый альтернативный вариант исполнения сортировочного проточного цитометра;

на фиг.5 изображен другой предполагаемый альтернативный вариант исполнения сортировочного проточного цитометра;

на фиг.6А изображен предполагаемый альтернативный вариант исполнения части сортировочного проточного цитометра;

на фиг.6В изображен другой предполагаемый альтернативный вариант исполнения части сортировочного проточного цитометра;

на фиг.7 показан способ, который может использоваться с одним или несколькими вариантами исполнения предполагаемого сортировочного проточного цитометра для создания двух разных фокальных точек для подачи энергии внутри системы;

на фиг.8А изображен объектив и соответствующая фокальная точка внутри пути струи предполагаемого варианта исполнения описываемых способов и приборов;

на фиг.8В показан вариант исполнения, как правило, конической зоны, образованной между номинальной фокальной точкой и объективом;

на фиг.9 изображен водно-иммерсионный объектив и соответствующая фокальная точка внутри пути струи варианта исполнения описываемых способов и приборов;

на фиг.10 изображен объект, в котором может быть сформирована часть пути струи сортировочного проточного цитометра в соответствии с вариантом исполнения описываемых способов и приборов;

на фиг.11 изображен альтернативный вариант исполнения объекта, изображенного на фиг.9;

на фиг.12 изображен другой альтернативный вариант исполнения объекта, изображенного на фиг.9;

на фиг.13 изображен еще один альтернативный вариант исполнения объекта, изображенного на фиг.9;

на фиг.14 изображен еще один альтернативный вариант исполнения объекта, изображенного на фиг.9; и

на фиг.15 изображена блок-схема, в которой указаны все этапы выполнения способа в соответствии с описываемыми способами и приборами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной патентной заявке описываются способы, системы и приборы для разделения клеток на основании метода проточной цитометрии. Если не оговорено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют общепринятое значение, понятное среднему специалисту, на которого ориентировано данное изобретение.

При использовании в настоящей спецификации и прилагаемых заявках единственное число включает использование множественного числа, если контекстом прямо не предусмотрено иное.

Если не указано, что для понимания описываемых способов и приборов большое значение имеет что-либо иное, специалистам в данной области будет ясно, что приведенные здесь чертежи начерчены не в масштабе.

Если не оговорено иное, в данном документе следующие термины имеют установленное для них значение.

Термин «клетки» относится к веществу, определяемому при анализе с помощью описываемых способов и приборов, включая, в том числе, клетки, вирусы, организмы или частицы. Термин «целевые клетки» или «целевая клетка» относится к клетке с нужным свойством, которое можно выявить при прохождении клеток через проточный цитометрический прибор. «Нужное свойство» относится к определенной характеристике, которая позволяет отделить клетку с нужным свойством от клетки, не имеющей указанных характеристик. Клетки с нужным свойством находятся внутри «нужной субпопуляции» клеток. Типичные измеряемые или выявляемые клеточные характеристики целевой клетки включают, в том числе, белковый состав, содержание белка, состав ДНК, содержание ДНК, маркеры на поверхности клетки, размер молекулы, поглощение света, отражение света, флуоресценцию, рассеяние света, поляризацию, электрические свойства клеток, магнитные свойства, морфологические свойства, проницаемость мембран, текучесть мембран и окислительно-восстановительное состояние. Специалисту в данной области будет ясно, что цитометр может измерить или выявить любые альтернативные характеристики в целевой клетке, а также что такие альтернативные характеристики могут легко использоваться во время применения описываемых способов и приборов. Данные способы или приборы используют «нужное свойство» целевой клетки для идентификации клеток с таким свойством.

Термин «первый анализ» относится к исходному анализу клеток, проводимому при прохождении клеток через проточный цитометрический прибор, который может представлять собой трубку, кювету, зону, ячейку, камеру и т.д., с целью определения, являются ли клетки целевыми. В некоторых исполнениях первый анализ выполняется с помощью детекторов проточного цитометра.

В настоящем документе «дополнительный анализ» относится к определению характеристик целевой клетки после первого анализа с помощью расходомерной трубки с целью принятия решения о необходимости или отсутствии необходимости изменить целевую клетку, используя источник энергии. В некоторых вариантах исполнения дополнительный анализ проводится после, как правило, менее чем через одну секунду, первого анализа.

В данном документе термины «преобразовать», «преобразование», «изменить» и «изменение» относятся к использованию источника энергии для внесения изменений в клетку. Преобразования включают, в том числе, различное воздействие на клети, в частности преобразование клеточных компонентов или химических веществ, включая белки, ДНК и вещества, участвующие в клеточном метаболизме; разрушение, нагревание, кавитацию или взрывы, происходящие в клетках или рядом с ними; пермеабилизацию или перфорацию клеток; и разрушение, фрагментирование или морфологическое изменение клеток. В других отношениях преобразования также или в качестве альтернативы включают косвенное воздействие источника энергии, оказываемое с помощью источника энергии или других факторов, включая химическую активацию и/или деактивацию, химическое сшивание или химическую дериватизацию клеток или одного или нескольких клеточных компонентов, активацию и/или деактивацию одного или нескольких химических веществ внутри клеток или рядом с ними, что приводит к связыванию или присоединению таких веществ или их производных к клетке или ее компонентам или к изменению функционирования клеток. В определенных отношениях химические вещества, обычно присутствующие внутри клеток или иным образом связанные с клетками, взаимодействуют с клетками при их облучении.

Описываемые способы и приборы позволяют идентифицировать целевые клетки путем обнаружения наличия или отсутствия каких-либо характеристик (например, нужного свойства) или параметров, которые можно определить, оценить или отразить в измерениях, совместимых с проточными цитометрическими методиками. Цитометрические измерения, используемые для определения целевых клеток или клеточных популяций, включают те из них, которые описаны в настоящем документе или иным образом известные в данной отрасли, а также новые методы измерений, механизмы и/или приборы, которые могут быть включены в проточный цитометрический анализ или приспособлены для него. Клетки, подвергающиеся цитометрическому анализу, который проводится с помощью описываемых здесь способов и приборов, могут быть помечены или не помечены или иным образом преобразованы или не преобразованы посредством известных в данной отрасли методик и реагентов.

В настоящем документе термин «метка» относится к составу, который можно обнаружить с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических или других химических средств. Например, полезные метки включают флуоресцентные красители, электроноплотные реагенты, энзимы, биотин-стрептавидин, диоксигенин, гаптены, белки, для которых имеются антисыворотки или моноклональные антитела, или красители нуклеиновых кислот. Таким образом, в описываемых способах и приборах, состав, свойства и/или характеристики клеток в отношении какого-либо непосредственно или косвенно измеренного вещества или параметра являются основанием для идентификации клеток и популяций клеток с целью отбора или исключения.

Примеры выявляемого состава, свойств и/или характеристик клеток включают, в том числе, измерения свойств света, взаимодействующего с клетками или излучаемого клетками, например поглощение, рассеяние света, люминесценция, флуоресценция, фосфоресценция, поляризация или деполяризация света или другие свойства; свойств электричества, включая, в том числе, индуктивность, электрическую емкость, потенциал, ток или сопротивление клеток или окружающей среды; свойств электромагнетизма, включая магнетизм, парамагнетизм, магнитный резонанс и/или взаимодействие клетки с или излучение электромагнитных сил и/или волн; отображение, вид, морфологические свойства или соответствующие свойства, полученные в результате сбора и/или анализа внешнего вида или связанных с внешним видом свойств клеток. В некоторых отношениях результат измерения представляет собой такую присущую клетке характеристику, как количество или качество, в других же отношениях результат измерения представляет собой значение, которое косвенно отражает, представляет или приближенно выражает количество или качество клетки. И в ином отношении результат измерения представляет собой и такую присущую клетке характеристику, как количество или качество, и является косвенным отражением, представлением или приближенным выражением количества или качества клетки. Например, показатель флуоресценции клетки может отражать свойственную клетке флуоресценцию, или же показатель флуоресценции клетки может отражать наличие и/или количество флюорохрома или флуоресцентных частиц, которые связываются с или присоединяются к клетке и прямо или косвенно отражают какое-либо свойство клетки, или и то и другое.

В некоторых случаях применения описываемых способов и приборов в сортировочном цитометре используется технология для физического или пространственного разделения клеток и популяций клеток. В других случаях применения описываемых способов и приборов в сортировочном цитометре используется технология для физического и/или функционального преобразования отобранных клеток в популяции с целью их функционального и/или физического разделения и/или различения, по желанию, для дальнейшего использования. В некоторых случаях применения описываемых способов и приборов в основе работы сортировочного цитометра лежит не непосредственное разделение клеток с учетом расположения, местонахождения, сосуда или времени, а, напротив, используются клетки, инактивированные, ограниченные, разрушенные, разъединенные, разделенные на фрагменты или ином образом измененные (т.е. «преобразованные») в отношении какого-либо нужного свойства, что при желании позволяет разделить или различить субпопуляции в составе. Характер преобразования полностью или частично зависит от предполагаемого применения или использования для идентифицированных клеток и, следовательно, характеристик идентифицированных клеток, соответствующих области применения. К примеру, и только в целях пояснения или уточнения, злокачественная или в противном случае бессмертная клетка или быстрорастущая клетка может считаться функционально инактивированной применительно к составу из нормальных соматических клеток в случае негативного воздействия на способность клетки к воспроизводству или в случае уничтожения клетки. В другом примере и опять же только в целях объяснения или уточнения, если для применения необходимо удалить из популяции субпопуляцию клеток, производящих ненужный белок или другое вещество, сортировочный цитометр обеспечит такое удаление посредством отмены производства вещества в клетках, уничтожения клеток и/или преобразования клеток с целью их физического удаления из популяции.

В некоторых вариантах исполнения описываемые способы и приборы для преобразования клеток или для ввода или запуска таких процессов, как химическая активация, которые могут преобразовать клетки, используют источник энергии. Преобразования, произведенные с помощью источника энергии, включают непосредственное воздействие на клетки, в том числе преобразование клеточных компонентов или химических веществ, включая белки, ДНК и вещества, участвующие в клеточном метаболизме; пермеабилизацию или перфорацию клеток; и разрушение, фрагментирование или морфологическое изменение клеток, в том числе клеток, вирусов, организмов или частиц. В других вариантах исполнения преобразования также или в качестве альтернативы включают косвенное воздействие источника энергии, оказываемое с помощью источника энергии или других факторов, включая химическую активацию и/или деактивацию, химическое сшивание или химическую дериватизацию клеток или одного или нескольких клеточных компонентов, активацию и/или деактивацию одного или нескольких химических веществ внутри клеток или рядом с ними, что приводит к связыванию или присоединению таких веществ или их производных к клетке или ее компонентам или к изменению функционирования клеток. В определенных вариантах исполнения химические вещества, вступающие в реакцию с клетками при освещении, обычно присутствуют в клетках или предполагаются областью применения, или же добавляются в рамках способа.

В некоторых вариантах исполнения описываемые способы и приборы предполагают использование фотоактивируемых соединений, вводимых для связывания с или присоединения к клеткам или клеточным компонентам при освещении светом соответствующей интенсивности и энергии. В некоторых контекстах такие соединения приводят к соответствующему сшиванию или денатурации одного или нескольких клеточных компонентов, влияющих на клеточные процессы или метаболизм целевых клеток. Или же в определенных контекстах такие соединения приводят к соответствующему сшиванию или денатурации одного или нескольких клеточных компонентов, которые уничтожают целевые клетки. В другом альтернативном варианте фотоактивируемые соединения, используемые в описываемых способах и приборах, связываются с отобранными клетками и изменяют одно или несколько свойств целевых клеток таким образом, чтобы целевые клетки можно было идентифицировать, и/или увеличить, и/или уменьшить в количестве при выполнении последующих процессов. Целевые клетки, измененные путем химической дериватизации, например посредством добавления химического вещества, в определенных отношениях удаляются, концентрируются или очищаются на последующем этапе с помощью способов, предполагающих использование свойств или взаимосвязей такого вещества. К примеру, и только в целях объяснения или уточнения, целевые клетки, в определенном отношении, дериватизируются путем добавления вещества, которое впоследствии ограничивается антителом, благодаря чему с помощью различных средств можно захватить или удержать целевую дериватизированную клетку. Предусмотрено множество таких веществ, и такие вещества включают класс соединений, содержащих или относящихся к 2,4-динитрофенильной группе (ДНФ), которая опознается и специально ограничивается антителами, которые могут распознавать ДНФ. Соответственно фотоактивируемые производные ДНФ или соответствующие соединения используются для дериватизации целевых клеток при подобном применении. Или же дериватизированые целевые клетки захватываются или удаляются с помощью методик, за счет которых дериватизированные целевые клетки связываются преимущественно с определенными основами. К примеру, и только в целях объяснения и уточнения, целевые клетки, дериватизированные с помощью соединений, содержащих и относящихся к биотину, захватываются или удерживаются на основах, поверхностях, среде, соединениях или частицах, которые связываются, или которые были изменены с целью связывания с биотином, например за счет наличия авидина, стрептавидина, связывающих биотин антител или других связывающих биотин молекул. В другом альтернативном варианте, связанном с данным аспектом, для дериватизации целевых клеток при подобном применении используются фотоактивируемые производные биотина или соответствующие соединения. Или же в других отношениях целевые клетки изменяются за счет добавления или присоединения химических веществ или соединений до отбора и преобразования. Следовательно, в таком случае вариант исполнения описываемых способов и приборов предполагает изменение добавленного вещества для отобранных клеток с целью разграничения таких клеток и других клеток в популяции. К примеру, и только в целях объяснения и уточнения, с одной стороны, все клетки в популяции дериватизируются путем добавления, перед проведением анализа, фотолабильного химического соединения, а с другой стороны, определенные клетки выявляются для преобразования с помощью источника энергии прибора с целью преобразования на этих клетках фотолабильного химического соединения.

В некоторых вариантах исполнения цитометра (см. фиг.1) клетки поступают в опросную или аналитическую камеру, кювету, поток или другое место или область для проведения анализа обычным способом, известным специалистам в данной области, для проведения проточного цитометрического анализа и/или сортировки. Цитометр идентифицирует клетки по их измеряемым свойствам, как было описано выше, включая, в том числе, такие свойства, как флуоресценция и/или рассеяние света, как обладающие или не обладающие нужным свойством в конечном составе. Струя жидкости проносит клетки через область расположения цитометра и мимо одного или нескольких лазерных лучей, детекторов и/или других приборов, определяющих количество и качество клеток. В одном таком случае струя жидкости перемещает клетки в направлении оптического элемента, ось которого в основном расположена соосно струе жидкости. Например, оптический элемент может, в том числе, включать линзу, например линзу объектива, и/или может включать один или несколько детекторов, лазерных лучей и/или других источников энергии. Свет и/или энергия, проходящая между клетками и детекторами, лазерными лучами и/или другими источниками энергии, может проходить через оптический элемент (например, объектив), который в основном расположен соосно движению клеток через соответствующую часть цитометра. Расположение каждой клетки в цитометре в любой момент времени прямо или косвенно определяется и/или оценивается исходя из скорости клетки или жидкости, проходящей через соответствующую часть аппаратуры. Клетка, прошедшая некоторые или все точки анализа в данной аналитической области, идентифицируется как обладающая или не обладающая нужным свойством в конечном составе. Такое определение осуществляется с помощью компьютера и/или аналогового и/или цифрового электрического или электронного и/или программного и/или компьютерного устройства или устройств для анализа данных. Такое устройство сравнивает отдельное или разные свойства, результаты измерений и/или характеристики каждой клетки с одним или набором или группой свойств, результатов измерений и/или характеристик, определенных оператором прибора. Или же свойства, с которыми должны сравниваться измеренные свойства, определяются автоматически с помощью алгоритмов или программ, включенных в цитометр или поставляемых с ним.

Набор свойств, с которыми сравниваются измеренные в цитометре клетки, определяет одну или несколько субпопуляций целевых клеток, обладающих или не обладающих нужным свойством в конечном составе. Можно быстро определить, входит ли клетка, проходящая через область анализа аппаратуры, в определенную субпопуляцию целевых клеток, при этом статус клетки, как обладающей или не обладающей нужным свойством в составе с клетками, определяется в момент определения положения клетки в проточной системе аппаратуры, как правило, менее чем через одну секунду после входа в область анализа аппаратуры. После завершения определения на клетки воздействует энергия или сила, которая выборочно подается в клетки, удовлетворяющие или не удовлетворяющие критериям отбора. Сила или энергия инактивирует, ограничивает, разрушает, разъединяет, разделяет на фрагменты или иным образом изменяет целевые клетки в отношении нужного свойства, подходящего для последующего применения. Или же сила или энергия преобразует и/или дериватизирует или приводит к дериватизации целевых клеток таким способом, который позволяет в дальнейшем отделять или различать одну или несколько субпопуляций целевых клеток в составе.

Такая сила или энергия подается одним или несколькими лазерами или другими источниками света и/или электромагнитными источниками, направленными на место нахождения клеток в текущем потоке таким образом, чтобы источник энергии можно было с легкостью отвести в сторону, расфокусировать или выключить, чтобы обеспечить проход клеток, которые не отобраны для преобразования. К примеру, и только в целях уточнения и объяснения, лазер высокой мощности и/или с высокой интенсивностью излучения, который можно быстро переключить в импульсный режим или включить или выключить, подвергает отобранные клетки разрушающему излучению, в результате чего они не функционируют в условиях необходимого использования. В некоторых случаях сила или энергия проходит через оптический элемент, расположенный в основном соосно течению клеток, при движении клеток через соответствующую зону цитометра. В любом случае все клетки, как отобранные и подвергнутые воздействию преобразующей силы или энергии, так и те, которые не были отобраны и подвергнуты воздействию силы или энергии, продолжают мигрировать с клеточной струей и покидают область аппаратуры, в которой производится измерение клеточных свойств и преобразование отобранных клеток. Вытекающий поток собирается; в нем содержатся преобразованные и непреобразованные клетки, а также в определенных случаях фрагменты или остатки клеток, а также жидкость, растворы и/или буферные смеси, использовавшиеся при выполнении процесса. В разных случаях вытекающий поток и дальше используется в такой же форме, в других случаях он концентрируется, разделяется на фракции или иным образом обрабатывается для получения нужных свойств и/или состава.

На фиг.2-5 представлены различные варианты исполнения сортировочного проточного цитометра в соответствии с описываемыми способами и приборами. На фиг.2 в частности изображен вариант базового пути движения струи 110 такого цитометра. Трубка для ввода проточной жидкости 112 позволяет проточной жидкости, находящейся под давлением, войти в путь движения струи 110 в точке входа проточной жидкости 14, образуя струю 116 проточной жидкости, проходящую через путь движения струи 110. После точки входа проточной жидкости 114 и предпочтительно в области плавной ламинарной струи проточной жидкости трубка для ввода определяемой при анализе жидкости 118 впускает поток определяемой при анализе жидкости 120 (т.е. жидкость, в которой удерживается, переносится и т.д. определяемое при анализе вещество) для входа в путь движения струи 110 через точку ввода определяемого при анализе вещества 122. В некоторых вариантах исполнения точка ввода определяемого при анализе вещества 122 располагается в центре струи 116 проточной жидкости и/или в центре пути движения струи 110 и ориентирована таким образом, чтобы поток 120 определяемой при анализе жидкости был параллелен струе 116 проточной жидкости при входе определяемой при анализе жидкости в путь движения струи 110. Конечно, точка ввода определяемого при анализе вещества 122 необязательно должна располагаться центрально по отношению к струе 116 проточной жидкости или пути движения струи 110, и специалист в данной области может представить варианты исполнения, в которых поток 120 определяемой при анализе жидкости не параллелен струе 116 проточной жидкости при входе потока 120 определяемой при анализе жидкости в путь движения струи 110. Скорость и давление струи 116 проточной жидкости относительно потока 120 определяемой при анализе жидкости сокращают и сжимают поток 120 определяемой при анализе жидкости с целью сужения относительно струи 116 проточной жидкости. Струя 116 проточной жидкости и поток 120 определяемой при анализе жидкости объединяются и образуют пробную струю 123.

Путь движения струи 110 может изменить направление в области 124. Однако после нее расположена область 126, в которой отсутствуют и препятствия, и внезапные изменения в направлении струи, и которая предназначена для стабилизации пробной струи 123 до того, как она достигнет зоны опроса 128 (т.е. зоны наблюдения, зоны анализа, номинальной фокальной точки и т.д.). Путь пробной струи 123 через путь движения струи 110 определяет ось струи 130. В некоторых вариантах исполнения поток 120 определяемой при анализе жидкости и, в частности, определяемых при анализе веществах (т.е. клеток) внутри потока 120 определяемой при анализе жидкости в основном перемещается через путь движения струи 110 вдоль оси струи 130.

После достижения и/или прохождения через зону опроса 128 пробная струя 123 отклоняется от направления. В некоторых вариантах исполнения путь движения струи 110 меняет направление в углу 132 (обозначен на фиг.2 пунктирной линией). В других вариантах исполнения пробная струя 123 сталкивается с поперечной струей 134 при достижении конца 136 области 126. Поперечная струя 134 изменяет направление пробной струи 123. В некоторых вариантах исполнения угол 132 или поперечная струя 134 изменяет направление пробной струи 123 на 90 градусов. Однако в альтернативных вариантах исполнения пробная струя 123 может изменяться больше или меньше чем на 90 градусов. В любом случае после изменения направления пробная струя 123 может двигаться к сосуду для сбора 138 и может пройти через один или несколько элементов пути движения струи 140 (например, регуляторы струи, фильтры и т.д.).

С помощью объектива 142, в основном расположенного в углу 132 или рядом с ним, либо рядом с пересечением пробной струи 123 с поперечной струей 134, можно создать фокальную точку (не показана) внутри зоны опроса 128. Оптическая ось 144 объектива 142 в целом расположена соосно оси струи 130 пути движения струи 110 при прохождении пути движения струи 110 через зону опроса 128. Конечно, оптическая ось 144 и ось струи 130 необязательно должны быть полностью соосны и могут изменяться таким образом, чтобы оптическая ось 144 была параллельна и смещена относительно оси струи 130 так, чтобы оптическая ось 144 располагалась под косым углом относительно оси струи 130 и т.д.

На фиг.3 показан образец сортировочного проточного цитометра 151, включая различные характеристики описываемых способов и приборов. Аналогично варианту исполнения пути движения струи 110, изображенному на фиг.2, на фиг.3 показана трубка для ввода проточной струи 112 и типовая трубка для ввода жидкости 118, используемая соответственно для ввода струи 116 проточной жидкости и потока 120 определяемой при анализе жидкости через точку ввода проточной жидкости 114 и через точку ввода определяемой при анализе жидкости 122. В частности определяемая при анализе жидкость, изображенная на фиг.3, включает сперматозоиды млекопитающего 150 и буферную смесь 152, переносящую сперматозоиды млекопитающего 150. При слиянии струи 116 проточной жидкости и струи 120 определяемой при анализе жидкости с целью формирования пробной струи 123 соответствующие скорости движения струи приводят к тому, что клетки 150 образуют поток, в котором клетки в основном движутся по одной, и выравнивают свою продольную ось (т.е. по длине «хвоста» клеток) в соответствии с направлением пробной струи 123.

На фиг.3 представлен вариант исполнения сортировочного проточного цитометра с возможностью проведения первого и дополнительного анализов. При прохождении клеток 150 через путь движения струи 110 вместе с пробной струей 123 при первом анализе можно определить, являются ли клетки целевыми, можно определить скорость, с которой клетки движутся через путь движения струи 110, можно определить, в конкретной точке пробной струи 123, не находятся ли клетки 150 слишком близко друг к другу для проведения одного или нескольких последующих анализов, направлены ли клетки 150 вперед хвостиком или головкой. В варианте исполнения, представленном на фиг.3, первый анализ производится при достижении клетками 150 точки 154 в пути движения струи 110. Источник освещения для первого анализа 156 направляет энергию 158 к точке 154. Энергия 158 может взаимодействовать с каждой клеткой 150 с целью рассеяния энергии 158 или иного взаимодействия с клеткой 150, антителом, связанным с клеткой 150, флуорохромом (например, флуоресцеином), связанным с клеткой 150, и т.д. Детектор 160 может определить образующуюся в результате энергию 162 (например, рассеянную энергию, образующийся флуоресцирующий сигнал и т.д.) и отправить соответствующий сигнал через соединение 164 на контроллер 166. Детектор 160 может располагаться в любом месте, подходящем для обнаружения энергии 162, в том числе под косым углом относительно точки 154 (по отношению к источнику энергии для освещения 156) или на одной линии с точкой 154. В качестве источника освещения для первого анализа 156 предпочтительно использовать 488 нм лазер, однако это может быть любой источник энергии, подходящий для проведения измерений, предусмотренных первым анализом. Источник освещения для первого анализа 156 может быть ориентирован таким образом, чтобы энергия 158 перемещалась перпендикулярно пробной струе 123, или же может быть ориентирован так, чтобы энергия 158 падала на клетки 150 под косым углом относительно направления пробной струи 123. Кроме того, энергия 158 и/или энергия 162 может проходить через один или несколько оптических элементов (не показаны) таких, как фильтры, линзы и т.д., которые могут обеспечить иное расположение источника энергии для освещения 156 и/или детектора 160, чем показано на чертежах, за счет создания другого оптического пути, о чем хорошо известно специалистам в данной области.

В некоторых вариантах исполнения первый анализ может не проводиться. Например, информации, полученной в ходе дополнительного анализа (подробно описывается ниже), может оказаться достаточно и для определения того, какие клетки являются целевыми, и для различения клеток в нужной и ненужной субпопуляциях. Поэтому в некоторых вариантах исполнения элементы 154-164 могут быть опущены. Или же некоторые варианты исполнения могут включать проведение двух или более первых анализов и соответственно два или более наборов элементов 154-164. Например, пробная струя 123 может включать один или несколько маркеров (например, включенных в проточную струю 116, присоединенных или иным образом связанных с некоторыми клетками 150 в пробном потоке 120 и т.д.). Во время исходного первого анализа можно выявить один из маркеров в первой точке, а во время дополнительного первого анализа можно выявить маркер во второй точке, чтобы определить скорость течения клеток в пробной струе 123.

В любом случае после первого анализа пробная струя 123 продолжает перемещаться с целью переноса клеток 150 вдоль пути движения струи 110. При прохождении клеток 150 через точку 170 дополнительный анализ позволяет выявить характеристики клеток 150, как описано ниже, с целью определения необходимости или отсутствия необходимости в преобразовании каждой клетки 150. При достижении каждой клеткой 150 точки 170 источник освещения для дополнительного анализа 172 направляет энергию 174 к точке 170. Энергия 174 может взаимодействовать с клеткой 150, антителом, присоединенным к клетке 150, флюорохромом (например, краситель Хехст), присоединенным к клетке 150, или с ДНК в клетке 150 и т.д. В некоторых вариантах исполнения источник освещения для дополнительного анализа 172 представляет собой ультрафиолетовый лазер, испускающий энергию 174 в виде ультрафиолетового излучения, которое взаимодействует с частицами красителя Хехст, прикрепленными к ДНК внутри клетки 150, с целью обеспечения флуоресценции пропорционально содержанию ДНК в клетке 150, как общеизвестно в данной области. Источник энергии для дополнительного анализа 172 может быть направлен таким образом, чтобы луч 174 был перпендикулярен пробной струе 123, как показано на фиг.3. Однако источник освещения для дополнительного анализа 172 также может быть расположен под косым углом относительно пробной струи 123. Кроме того, энергия 174 может проходить через один или несколько оптических элементов (не показаны) таких, как фильтры, линзы и т.д., которые могут обеспечить иное расположение источника освещения для дополнительного анализа 172, чем показано на чертежах, за счет создания непрямого оптического пути.

Взаимодействие энергии 174 с клеткой 150 или с элементами внутри клетки 150 приводит к излучению клеткой 150 образующейся в результате энергии 176. Объектив 142, расположенный так, чтобы оптическая ось 144 объектива 142 была в целом соосна пробной струе 123, предназначен для фокусировки энергии 176. Фокальная точка 178 объектива 142 расположена, как правило, в точке 170, однако может располагаться таким образом, чтобы можно было определить образующуюся энергию 176, исходящую из клетки 150, через какое-то время после того, как энергия 174 осветит клетку 150 (т.е. фокальная точка 178 может быть немного ближе к объективу 142, чем точка 170). Детектор 180, установленный для получения энергии 182, сфокусированной объективом 142, обнаруживает сфокусированную энергию 182, исходящую из клетки 150, и отправляет соответствующий сигнал на контроллер 166 через соединение 184. Несомненно, один или несколько оптических элементов, например фильтр 186, могут использоваться для изменения или перенаправления энергии 182 между объективом 142 и детектором 180. В некоторых вариантах исполнения объектив 142 создает фокальную точку 178 перед углом 132 или местом схождения поперечной струи 134 и пробной струи 123. В других вариантах исполнения объектив 142 создает фокальную точку (не показана) в или рядом с углом 132 или местом схождения поперечной струи 134 и пробной струи 123.

Контроллер 166, который может состоять из одного или нескольких микропроцессоров 188, одного или нескольких кварцевых генераторов 190, одного или нескольких блоков памяти 192, в которых хранится одна или несколько программ 194, и т.д., расшифровывает сигналы, поступившие с детектора 160 и/или детектора 180, чтобы определить для каждой клетки 150, является ли клетка 150 частью нужной субпопуляции клеток. Например, в некоторых вариантах исполнения клетки 150 представляют собой сперматозоиды млекопитающих, и контроллер 166 расшифровывает сигналы, полученные от детектора 180, чтобы определить, какую хромосому несет каждая клетка 150 - Х- или Y-хромосому. Специалистам в данной области хорошо известно, что в сперматозоидах млекопитающих Y-хромосомы, как правило, содержат меньше ДНК, чем Х-хромосомы. Соответственно, путем анализа флуоресценции (т.е. образующейся энергии 176), излучаемой красителем в клетке 150 после освещения с помощью источника освещения для дополнительного анализа 172, контроллер 166 в целом может определить, несет клетка 150 Х- или Y-хромосому. В некоторых вариантах исполнения одна из программ 194 позволяет постоянно следить за статистическим распределением обнаруженных флуоресцирующих сигналов с целью повышению точности определения с течением времени.

Возвращаясь к фиг.3, следует отметить, что в некоторых вариантах исполнения контроллер 166, в зависимости от того, является ли клетка 150 частью нужной субпопуляции, отправляет сигнал на контролируемый источник энергии 196 через соединение 198. Контролируемый источник энергии 196 может излучать энергию 197, направленную на точку 199 в пробной струе 123. В некоторых вариантах исполнения контроллер 166 используется для согласования сигнала с контролируемым источником энергии 196, и/или же выбирается точка 199 (например, путем наведения одной или нескольких линз, зеркал и т.д.), в зависимости от скорости, с которой клетка 150 перемещается через путь движения струи 110. В некоторых вариантах исполнения точка 199 может располагаться перед углом 132 или местом схождения поперечной струи 134 и пробной струи 123 для упрощения определения расположения клетки 150, перемещающейся вдоль пути движения струи 110. В других вариантах исполнения точка 199 может располагаться после угла 132 или же располагаться в или после места схождения поперечной струи 134 и пробной струи 123. В примере выше контроллер 166 может отправить сигнал, чтобы контролируемый источник энергии 196 начал излучать энергию 197 в ответ на полученное определение: содержит ли клетка 150 Х-хромосому или Y-хромосому. Или же контроллер 166 может отправить сигнал, чтобы контролируемый источник энергии 196 перестал излучать энергию 197 в ответ на полученное определение: содержит ли клетка 150 Х-хромосому или Y-хромосому. Энергия 197, излучаемая контролируемым источником энергии 196, может использоваться для деактивации клетки 150 или лишения клетки 150 жизнеспособности (например, путем преобразования клеточных компонентов или химических веществ, включая белки, ДНК и вещества, участвующие в клеточном метаболизме; путем нарушения, нагревания, кавитации или взрыва в или рядом с клеткой 150; путем пермеабилизации или перфорации клетки 150; путем разрушения, фрагментирования или морфологического изменения клетки 150), может использоваться для изменения (например, путем взаимодействия с химическим веществом, находящимся внутри или присоединенным к клеточному компоненту) клетки с тем, чтобы впоследствии ее можно было идентифицировать и/или удалить из нужной субпопуляции клеток 150, или же может использоваться для оказания положительного воздействия на клетку. В некоторых вариантах исполнения контролируемый источник энергии 196 представляет собой лазер и, в частности, может представлять собой лазер, излучающий энергию в видимой или инфракрасной части спектра. В некоторых вариантах исполнения лазер выпускает энергию с длиной волны 690 нм. В других вариантах исполнения контролируемый источник энергии 196 может выделять другие типы излучения или излучение с другими длинами волн, например рентгеновское излучение, микроволновое излучение, видимый свет, ИК-излучение, УФ-излучение или любой другой вид энергии, оказывающий необходимое воздействие на клетку 150. Несомненно, в ответ на определение, является ли клетка частью нужной субпопуляции, контроллер 166 может: (1) излучать энергию 197 для негативного воздействия на клетки 150, не являющиеся частью нужной субпопуляции (не затрагивая клетки 150, являющиеся частью нужной субпопуляции); (2) может излучать энергию 197 для положительного воздействия на клетки 150, являющиеся частью нужной субпопуляции (не затрагивая клетки 150, не являющиеся частью нужной субпопуляции);

(3) может перестать излучать энергию 197 во избежание положительного воздействия на клетки 150, не являющиеся нужной субпопуляции (продолжая при этом излучать энергию 197 для положительного воздействия на клетки 150, являющиеся частью нужной субпопуляции); или (4) может перестать излучать энергию 197 во избежание негативного воздействия на клетки 150, являющиеся частью нужной субпопуляции (продолжая при этом излучать энергию 197 для негативного воздействия на клетки 150, не являющиеся частью нужной субпопуляции). Кроме того, в некоторых вариантах исполнения контроллер 166 может рассматривать неопределенные клетки 150 (например, клетки 150, которые контроллер 166 не может определить, клетки 150, находящиеся слишком близко друг к другу и т.д.) также, как и клетки, не являющиеся частью нужной популяции.

На фиг.4 показан образец сортировочного проточного цитометра 200, включая различные характеристики описываемых способов и приборов. В частности в сортировочном проточном цитометре 200, изображенном на фиг.4, не проводится первый анализ и, соответственно, отсутствуют элементы 154-164. Тем не менее, хотя это и не показано, специалисты в данной области поймут, что при желании в представленный на фиг.4 вариант исполнения можно включить первый анализ. В варианте исполнения, описанном на фиг.3, пробная струя 123 переносит клетки 150 вдоль пути движения струи 110. При прохождении клеток 150 через точку 170 во время дополнительного анализа (которому, как показано на фиг.4, не предшествует никакой первый анализ) определяются характеристики клеток 150, как описано выше, с целью установления, нужно ли преобразовывать каждую клетку 150 или нет. То есть когда каждая клетка 150 достигает точки 170, источник освещения для дополнительного анализа 172 направляет энергию 174 к точке 170, и энергия 174 взаимодействует с клеткой 150, как описано выше. Несомненно, источник освещения для дополнительного анализа 172 может представлять собой ультрафиолетовый лазер, и энергия 174 может взаимодействовать с молекулами красителя Хехст 33342, присоединенного к ДНК внутри клетки 150. Источник энергии для дополнительного анализа 172 может быть направлен таким образом, чтобы луч 174 был перпендикулярен пробной струе 123, как показано на фиг.4. Однако источник освещения для дополнительного анализа 172 также может быть расположен под косым углом относительно пробной струи 123. Кроме того, энергия 174 может проходить через один или несколько оптических элементов (не показаны) таких, как фильтры, линзы и т.д., которые могут обеспечить иное расположение источника освещения для дополнительного анализа 172, чем показано на чертежах, за счет создания непрямого оптического пути.

Образующаяся энергия 176, исходящая от клетки 150, распространяется по направлению к объективу 142, который расположен таким образом, чтобы оптическая ось 144 (см. фиг.3) объектива 142 была в целом соосна пробной струе 123, и который используется для фокусирования энергии 176. Фокальная точка 178 объектива 142 расположена, как правило, в точке 170, однако может располагаться таким образом, чтобы можно было определить образующуюся энергию 176, исходящую из клетки 150, через какое-то время после того, как энергия 174 осветит клетку 150. Один или несколько оптических элементов могут направлять сфокусированную энергию 182 от объектива 142 к детектору 180. Например, в представленном на фиг.4 варианте исполнения сфокусированная энергия 182 прежде, чем достигнуть детектора 180, проходит через светоделитель 202 и фильтр 186. Другие оптические элементы (например, линзы, зеркала, фильтры и т.д.) также могут повлиять на путь движения сфокусированной энергии 182 между объективом 142 и детектором 180. Как и в представленном на Фиг3. варианте исполнения, в некоторых вариантах исполнения объектив 142 создает фокальную точку 178 перед углом 132 или местом схождения поперечной струи 134 и пробной струи 123. В других вариантах исполнения объектив 142 создает фокальную точку (не показана) в или рядом с углом 132 или местом схождения поперечной струи 134 и пробной струи 123.

Контроллер 166, как уже выше говорилось применительно к фиг.3, используется для расшифровки сигналов, поступающих (через соединение 184) с детектора 180 (и детектора 160, если цитометр 200 предусматривает проведение первого анализа), чтобы в отношении каждой клетки 150 определить, является ли клетка 150 частью нужной субпопуляции клеток (например, сперматозоиды с Х-хромосомой). Контроллер 166 отправляет сигнал на контролируемый источник энергии 204 по соединению 206. Контролируемый источник энергии 204 работает так же, как и контролируемый источник энергии 196 (фиг.3). Однако в представленном на фиг.4 варианте исполнения энергия 208, излучаемая контролируемым источником энергии 204, проходит через объектив 142 после прохождения, в некоторых вариантах исполнения, через один или несколько оптических элементов таких, как фильтр 216. Объектив 142 используется для фокусирования энергии 208 в фокальной точке 210. В некоторых вариантах исполнения объектив 142 может фокусировать энергию 208, поступающую от контролируемого источника энергии 204, таким образом, чтобы сфокусированная энергия 212 была в целом направлена соосно пробной струе 123, и таким образом, чтобы точка 210 располагалась ближе к объективу 142, чем точка 170.

Специалистам в данной области известно, что существует множество способов создания как фокальной точки 210, так и фокальной точки 178, с помощью одной и той же линзы. На фиг.7 изображен один способ, который может использоваться в цитометре 200 с целью создания фокальной точки 178 для энергии 176 и фокальной точки 210 для энергии 212. На фиг.7 показано, что при прохождении энергии 176 (отмечена на фиг.7 сплошными линиями) через линзу 214 объектива 142 (не показан на фиг.7) от фокальной точки 178 (т.е. от клетки 150 в точке 170) линза 214 воздействует на энергию 176 таким образом, чтобы лучи, образующиеся при излучении энергии 176, были параллельны при выходе из линзы 214. Напротив, лучи, образующиеся при излучении энергии 208, слегка сходятся при падении на линзу 214 и, соответственно, сходятся в фокальной точке 210 после прохождения через линзу 214. Несомненно, существуют другие способы для создания как фокальной точки 178, так и фокальной точки 210, включая преимущества того, что разные длины волн энергии могут по-разному преломляться через один и тот же материал или при использовании мультифокальных линз, например таких, которые описаны в заявке на патент в США №6,010,647.

В качестве иллюстрации на фиг.5 приведен другой примерный вариант исполнения сортировочного проточного цитометра 220. Данный сортировочный проточный цитометр включает путь движения струи 110, описанный для фиг.3 и 4. Аналогично сортировочному проточному цитометру 200, изображенному на фиг.4, сортировочный проточный цитометр 220 не предусматривает проведение первого анализа (так же, как и оборудование, связанное с первым анализом). Пробная струя 123 и, в частности, клетки 150 движутся к объективу 142. Как и в вышеописанных вариантах исполнения, объектив 142 создает фокальную точку 178 в точке 170 внутри пути движения струи 110. При достижении клеткой 150 точки 170 энергия 176 от клетки 150 проходит через объектив 142, который расположен так, чтобы оптическая ось 144 объектива 142 была в целом соосна пробной струе 123, и который используется для фокусировки энергии 176. Фокальная точка 178 объектива 142 расположена, как правило, в точке 170, однако может располагаться таким образом, чтобы можно было определить образующуюся энергию 176, исходящую из клетки 150, через какое-то время после того, как энергия 174 осветит клетку 150. Один или несколько оптических элементов (таких, как светоделитель 202, фильтр 186 и т.д.) могут направлять сфокусированную энергию 182 от объектива 142 к детектору 180.

Изображенный на фиг.5 сортировочный проточный цитометр 220 включает источник освещения для дополнительного анализа 222. Источник освещения для дополнительного анализа 222 излучает энергию 224, которая может представлять собой ультрафиолетовую энергию 174. Энергия 224, излучаемая источником освещения для дополнительного анализа 222, по оптическому пути движется к объективу 142. Объектив 142 может фокусировать энергию 224 в фокальной точке 178 и, таким образом, оптические пути энергии 176 и энергии 224 могут в некоторой степени накладываться друг на друга. Различные схемы расположения других оптических элементов таких, как светоделитель 202 и фильтр 226, могут использоваться для направления энергии 224 от источника освещения для дополнительного анализа 222 к объективу, а также для направления энергии 176 (от клетки 150) от объектива 142 к детектору 180.

Контроллер 166, как уже было описано применительно к фиг.3 и 4, расшифровывает сигналы, поступившие (через соединение 184) с детектора 180 (и детектора 160, если цитометр 200 предусматривает проведение первого анализа), чтобы в отношении каждой клетки 150 определить, является ли клетка 150 частью нужной субпопуляции клеток. Контроллер 166 отправляет сигнал на контролируемый источник энергии 228 через соединение 230. Контролируемый источник энергии 228 работает так же, как и контролируемый источник энергии 196 (фиг.3), испуская энергию 232, направленную на точку 234.

На фиг.6А и 6В изображены части 235А и 235В, соответственно, других вариантов исполнения проточного цитометра в соответствии с предполагаемыми способами и приборами. На каждой из фиг.6А и 6В клетки 236 движутся в потоке 237 через путь движения струи 238, который изменяет траекторию в или около точки 239, как было описано применительно к фиг.2. Струйное моделирование и/или точное формирование пути движения струи 238 и/или потока 237 клеток 236 через путь движения струи 238 и/или включение дополнительных элементов (не показаны) для мониторинга положения клеток 236 может снизить неопределенность, в противном случае вызванную изменением траектории в или около точки 239. В таком случае сохраняется возможность определения положения и особенностей отдельных клеток после изменения траектории. На фиг.6А представлен вариант исполнения, в котором контролируемый источник энергии 240, работающий так же, как было выше описано применительно в фиг.3, 4 и 5 (196, 204 и 228 соответственно), расположен таким образом, чтобы излучаемая энергия 241 падала на клетки 236 после прохождения клетками 236 точки 239 в пути движения струи 238. На фиг.6А показано движение энергии 241 перпендикулярно направлению течения клеток 236 через путь движения струи 238. Несомненно, можно понять, что контролируемый источник 240 может в качестве варианта располагаться таким образом, чтобы излучаемая энергия 241 перемещалась в целом соосно направлению течения клеток 236 через путь движения струи 238 (например, путем изменения направления струи и расположения контролируемого источника энергии 240 таким образом, чтобы клетки 236, находящиеся внутри пути движения струи 238, двигались к контролируемому источнику энергии 240).

Следует учесть, что сортировочный проточный цитометр, созданный в соответствии с предполагаемыми способами и приборами, может в качестве альтернативы использовать конфигурацию «струя в воздухе», как показано на фиг.6В. На фиг.6В изображено сопло 242, выпускающее поток 243 капель 244. Контролируемый источник энергии (не показан) выборочно изменяет капли за счет подачи заряда на одну или несколько капель 244. После этого, например, пара электрически заряженных пластин 245 может распределить поток 243 капель 244 по приемным устройствам 246 в зависимости от произведенного детектором (не показан) определения, как было описано выше.

На фиг.8А изображен объектив 142 и часть пути движения струи 110, куда входит область опроса 128. Как известно специалистам в данной области, для создания номинальной фокальной точки 252 используются один или несколько элементов линзы 250 (например, полукруглая передняя линза, менисковая линза и т.д.). В вариантах исполнения, описанных применительно к фиг.3-5, номинальная фокальная точка 252 находится внутри пробной струи 123 и, в частности, внутри пути перемещения клеток 150 через путь движения струи 110. Номинальная фокальная точка 252 позволяет определить вершину, как правило, конической зоны 254 между номинальной фокальной точкой 252 и внешним элементом 256 объектива 142, образующими основу 253 конической зоны 254. Коническая зона 254 может представлять собой правильную круговую коническую зону, но также может представлять собой косую коническую зону. В тех вариантах исполнения, в которых коническая зона 254 представляет собой правильную круговую коническую зону, ось 258 конуса в целом соосна оси 260 объектива 142. В таких вариантах исполнения оси 258 и 260 соосны оси струи 262 внутри пути движения струи 110, при этом ось струи 262 в целом определяет путь, по которому клетки 150 движутся внутри пути движения струи 110.

В некоторых вариантах исполнения фокальная точка 252 объектива 142 образована таким образом, чтобы свести к минимуму количество стыков, через которые проходит боковая поверхность 264 конической зоны 254. К примеру, и применительно к фиг.8А, стенка пути движения струи 268А образует, как правило, цилиндрический поперечный путь движения струи 270А, а стенка пути движения струи 268В образует, как правило, цилиндрический путь движения струи 270В, расположенный в основном соосно оси конической зоны 254. На фиг.8А коническая зона 254 проходит только через два стыка при входе и выходе из материала, образующего стенку 268А. Коническая зона 254 проходит через стык 272 между воздухом 276 и материалом, образующим стенку 268А, а также через стык 274 между материалом, образующим стенку 268А, и жидкостью 278 в пути движения струи 110. Кроме того, в некоторых вариантах исполнения стенка 268А пути движения струи 110, через который проходит боковая поверхность, может быть в целом параллельна основе 253 конической зоны 254. Это позволяет упростить стыки, через которые должна проходить энергия, сфокусированная объективом 142 (т.е. энергия не проходит через какие-либо криволинейные поверхности), при этом каждый из этих стыков может, путем преломления, оказывать воздействие на фокальную точку 252 объектива 142. Кроме того, коническая зона 254 может быть образована из частей 255А, 255В и 255С нескольких конусов 257, 259 и 261, соединенных вместе, как показано на фиг.8В, так же как и в случае, когда один или несколько стыков (таких, как стыки 272 и 274) созданы из материалов с различающимися коэффициентами преломления.

Как правило, коническая зона 254 должна проходить как минимум через два стыка 272 и 274. В некоторых вариантах исполнения описываемых способов и приборов объектив 142 может учитывать один или несколько стыков, например, учитывая толщину и коэффициент преломления материала, из которого состоит стык (например, стенка 268А). Более того, в некоторых вариантах исполнения объектив 142 может представлять собой линзу для погружения в воду, водно-иммерсионную линзу или масляно-иммерсионную линзу, использующую иммерсионную среду (например, воду или масло), коэффициент преломления которой аналогичен коэффициенту преломления материала, из которого состоит стык (например, стенка 268А). Таким образом, как показано на фиг.9, в некоторых вариантах исполнения обеспечивается дальнейшее уменьшение искажения фокальной точки 252 путем минимизации различий между соответствующими коэффициентами преломления материалов, через которые проходит коническая зона 254. Например, на фиг.9 коническая зона 254 может проходить через воду 280, стенку 268А и жидкость 278 в пути движения струи 110. Объектив 142 может представлять собой водно-иммерсионный объектив, в котором, например, стенка 268А сделана из стекла. Или же объектив 142 может представлять собой объектив для погружения в воду в тех случаях, когда не требуется корректировать преломление, вызванное стенкой 268А, как, например, при изготовлении стенки 268А из материала с коэффициентом преломления, аналогичным или схожим с коэффициентом преломления жидкости 278.

В других же вариантах исполнения, и как в полной мере описано в одновременно поданной заявке (реестр адвокатов №30752/44821), стенки 268А и 268В пути движения струи 110 могут быть выполнены из материала с коэффициентом преломления, близким к коэффициенту преломления жидкости 278 (т.е. материал, позволяющий минимизировать различие между коэффициентами преломления материалов, через которые проходит коническая зона 254). Например, материалы с коэффициентом преломления, близким к коэффициенту преломления воды, включают материалы с коэффициентом преломления в диапазоне 1,30-1,40 включительно. Этому диапазону удовлетворяют коэффициенты преломления некоторых твердых материалов семейства аморфных перфторполимеров, аморфных фторполимеров и перфторалкокси-полимеров. Например, такими материалами являются Cytop™, произведенный Asahi Glass Co., Ltd., и Teflon® AF и Teflon® PFA, произведенные DuPont™.

В некоторых вариантах исполнения данные способы и приборы могут также корректировать коэффициент преломления жидкости 278 таким образом, чтобы коэффициент преломления жидкости 278 был ближе к коэффициенту преломления материала, образующего стенки 268А и/или 268В пути движения струи 110. В частности данные способы и приборы позволяют скорректировать коэффициент преломления жидкости 278 таким образом, чтобы он находился в переделах 0,02 от коэффициента преломления материала, образующего стенки 268А и/или 268В пути движения струи 110.

В некоторых цитометрах часть пути движения струи 110, включая область опроса 128, образуется внутри объекта 280, такого как, например, на фиг.10. На фиг.10 изображен объект 280 в виде прямоугольного параллелепипеда, в котором высверлена или иным образом выполнена часть 281 пути движения струи 110. Часть 281 включает первую часть пути движения струи 282, в целом перпендикулярную поверхности 284, через которую с помощью объектива 142 можно вести наблюдения, и вторую часть пути движения струи 286, которая в целом параллельна поверхности 284 и пересекает конец 288 первой части пути движения струи 282 вблизи поверхности 284. Объект 280, который, например, может представлять собой кювету, может быть изготовлен из полированного кварца, стекла, пластика или другого материала, широко известного в данной области. В некоторых вариантах исполнения объект 280 может быть полностью или частично изготовлен из материала с коэффициентом преломления в диапазоне 1,30-1,40 включительно, например, Cytop™ или Teflon® AF.

В другом варианте исполнения, представленном на фиг.11, объект 280 включает часть 281 пути движения струи. Часть 281 включает первую часть пути движения струи 282, которая в целом перпендикулярна поверхности 284, через которую можно вести наблюдения с помощью объектива 142. Тем не менее, в варианте исполнения, изображенном на фиг.11, вторая часть пути движения струи 286 образует канал, верхняя граница которого 290 в целом лежит в одной плоскости с поверхностью 284. Покровное стекло 292, расположенное в верхней части поверхности 284, в некоторых вариантах исполнения позволяет использовать объектив, отрегулированный с целью использования с таким покровным стеклом 292, для устранения или минимизации преломляющего эффекта стыков между материалами с различающимися коэффициентами преломления.

В других же вариантах исполнения, например представленных на фиг.12, объект 280 включает емкость 294, образованную при пересечении первой части пути движения струи 282 и второй части пути движения струи 286. Например, первая часть пути движения струи 282 может пересекать емкость 294 в месте расположения в целом плоской нижней поверхности, которая, как правило, параллельна поверхности 284. Части 286А и 286В части пути движения струи 286 могут быть соединены с емкостью 294 на противоположных поверхностях емкости 294, которая может в целом иметь форму сплющенного цилиндра. Такая схема расположения может повысить гибкость при настройке фокальной точки 252 (фиг.8 и 9), например, за счет предотвращения прохождения конической зоны 254 через стенку 268А, как правило, цилиндрического поперечного пути движения струи 270А (см. фиг.8 и 9).

На фиг.13 представлен аналогичный вариант исполнения, в котором верхняя граница 298 емкости 294 лежит в одной плоскости с поверхностью 284 объекта 280. Действие объектива для погружения в воду (не показан) может распространяться и на емкость 294, и при этом он может соприкасаться с жидкостью, движущейся через путь движения струи 110, за счет чего можно исключить какие-либо стыки между материалами с различающимися коэффициентами преломления.

На фиг.14 представлен еще один вариант исполнения, в котором покровное стекло 299 расположено поверх открытой емкости, изображенной в варианте исполнения на фиг.13.

На фиг.15 изображен способ 300 отбора нужной субпопуляции клеток из образца клеток. В некоторых вариантах исполнения способ 300 или его части хранятся в блоке памяти в виде набора машиночитаемых инструкций, образующих программу управления для одного или нескольких соответствующих приборов. Процессор может считывать инструкции из блока памяти и выполнять их с целью обеспечения работы способа 300. В другом варианте исполнения способ 300 включает несколько программ, которые могут по отдельности контролировать один или несколько приборов, могут анализировать данные, собранные одним или несколькими приборами и могут осуществлять выбор одного или нескольких параметров на основании проанализированных данных и т.д. Как известно, специалист или прибор могут помечать (например, путем добавления красителя Хехст) образцы с целью анализа (например, сбора сперматозоидов) (блок 305). Метки могут наноситься на клетки внутри сортировочного проточного цитометра или в рамках отдельного процесса или процедуры вне сортировочного проточного цитометра. Кроме того, определенная метка, наносимая на клетки, может зависеть от области цитометрического применения.

В любом случае после нанесения меток на клетки сортировочный проточный цитометр может создавать струю проточной жидкости в пути движения струи (блок 310). Через отдельный вход сортировочный проточный цитометр может вводить образец (т.е. помеченные клетки) в путь движения струи (блок 315), желательно в или рядом с центром струи проточной жидкости. Также предпочтительно, чтобы образец входил в струю проточной жидкости с небольшой скоростью относительно струи проточной жидкости таким образом, чтобы клетки образца (например, сперматозоиды) были выровнены по длинной оси, параллельной струе проточной жидкости, и таким образом, чтобы клетки в основном перемещались по одной.

При прохождении клеток через путь движения струи источник энергии возбуждения, например УФ-лазер, освещает образец (блок 320). Источник энергии возбуждения может непрерывно освещать путь движения струи; или же с помощью выполнения программы в процессоре можно контролировать источник энергии возбуждения с целью выборочного освещения пути движения струи (например, только когда образец находится в пути движения струи).

Объектив или иные фокусирующие устройства используются для фокусировки энергии, излучаемой, передаваемой или отражаемой от каждой клетки (например, флуоресцентное излучение, исходящее от метки), в направлении, соосном струе (блок 325). То есть объединенная проточная струя и образец внутри пути движения струи, как правило, движутся к объективу, оптическая ось которого расположена в целом соосно струе, и номинально каждая клетка образца проходит через фокальную точку объектива. С объектива сфокусированная энергия поступает на детектор (блок 330), который отправляет образец обнаруженной энергии на контроллер в виде сигнала. В некоторых вариантах исполнения детектор может отдельно обнаруживать сфокусированную энергию, исходящую от более чем 40000 клеток в секунду, может отдельно обнаруживать сфокусированную энергию, исходящую от более чем 75000 клеток в секунду, или может отдельно обнаруживать сфокусированную энергию, исходящую от более чем 100000 клеток в секунду.

Контроллер получает образец обнаруженной энергии в виде сигнала и анализирует данные (блок 335) с целью определения (в блоке 340) того, описывают ли полученные данные клетку нужной субпопуляции, клетку, не являющуюся частью нужной субпопуляции, или неопределенную клетку, которая не может быть определена ни как являющаяся частью нужной субпопуляции, ни как не являющаяся частью нужной субпопуляции. В последнем случае контроллер может рассматривать клетку так, как будто бы детектор определил, что эта клетка не находилась в нужной субпопуляции. Если контроллер определяет, что клетка не находится в нужной субпопуляции или является неопределенной, он может отправить на контролируемый источник энергии, например, инфракрасный лазер, сигнал о необходимости облучения клетки (например, изменить клетку, разрушить клетку, лишить клетку жизнеспособности и т.д.) (блок 345). Или же если контроллер определяет, что клетка находится в нужной субпопуляции, он может отправить на контролируемый источник энергии сигнал (или не отправлять сигнал) об отсутствии необходимости облучения клетки контролируемым источником энергии (блок 350).

Данный прибор может собирать клетки для использования и/или дальнейшей обработки (например, разделения клеток) в конце процесса. В некоторых вариантах исполнения, которые могут включать вариант исполнения, представленный на фиг.15, контроллер отправляет на контролируемый источник энергии сигнал не изменять (т.е. не облучать) клетки, определенные как находящиеся в нужной субпопуляции, при этом в образующемся в результате наборе обработанных клеток процент клеток в нужной субпопуляции клеток по отношению к общему числу неизмененных клеток превышает или равняется 60%. Также в некоторых вариантах исполнения, которые могут включать вариант исполнения, представленный на фиг.15, контроллер отправляет на контролируемый источник энергии сигнал не изменять (т.е. не облучать) клетки, определенные как находящиеся в нужной субпопуляции; при этом в образующемся в результате наборе обработанных клеток процент измененных клеток в нужной субпопуляции клеток по отношению к общему числу клеток в нужной субпопуляции меньше или равняется 50%.

Несомненно, представленный выше способ отражает один или несколько вариантов исполнения описываемых здесь способов, но также может включать один или несколько этапов или программ, о которых говорится в настоящей спецификации применительно к различным вариантам исполнения. Кроме того, в некоторых вариантах исполнения могут быть опущены один или несколько этапов или программ, описанных применительно к способу 300. Например, в некоторых вариантах исполнения метка может сама флуоресцировать, при этом исключается необходимость в освещении образца с помощью источника энергии для освещения. Также в некоторых вариантах исполнения (как было описано выше) в рамках данного способа блоки 345 и 350 могут меняться местами, за счет чего клетки, определенные как не являющиеся частью нужной субпопуляции, могут двигаться без облучения с помощью контролируемого источника энергии, при этом контролируемый источник энергии облучает клетки, определенные как находящееся в нужной субпопуляции.

Данные способы и приборы обладают рядом важных преимуществ по сравнению с применяемыми в настоящее время сортировочными проточными цитометрами. Одним из преимуществ является то, что в описываемых способах и приборах определяемые при анализе клетки, которые в некоторых вариантах исполнения являются сперматозоидами млекопитающего, не подвергаются воздействию конфигурации «капля в воздухе», которая широко используется в сортировочных проточных цитометрах. В результате цитометр в рамках описываемых вариантов исполнения не подвергает определяемые при анализе клетки воздействию среды за пределами цитометра или происходящего в результате столкновения отсортированной капли с приемным устройством. Также не оказывается воздействие в результате давления или изменения давления, вызванного соплом в конфигурации «капля в воздухе». Это позволяет использовать цитометр за пределами среды, которая предполагает строгие условия в отношении качества воздуха и контроля температуры (например, за пределами среды «чистой комнаты»). В действительности цитометр сам может контролировать температуру с целью увеличения жизнеспособности определяемых при анализе клеток. Кроме того, описываемые способы и приборы могут обнаруживать или изменять определяемые при анализе клетки быстрее и/или точнее отчасти потому, что в целом соосное выравнивание объектива по отношению к движению определяемых при анализе веществ через зону опроса позволяет уменьшить и/или исключить проблемы, связанные с анизотропным излучением энергии от определяемых при анализе веществ, в частности в вариантах исполнения, используемых для сортировки многих видов сперматозоидов млекопитающих. После прочтения настоящего описания раскрытых здесь способов и приборов специалистам в данной области будут очевидны и другие преимущества описываемых способов и приборов.

Хотя выше приведено подробное описание многих различных вариантов исполнения, следует понимать, что объем правовой охраны определяется приведенной ниже патентной формулой. Приведенное подробное описание следует рассматривать только в качестве примера. Оно не включает описание всех возможных вариантов исполнения, поскольку описывать каждый возможный вариант исполнения было бы нецелесообразно, если не невозможно. Множество альтернативных вариантов исполнения можно внедрить с помощью либо существующей технологии, либо существующего объема притязаний.

Следовательно, можно преобразовывать и изменять описанные и представленные здесь методики и структуры, не отклоняясь от характера и объема настоящей формулы изобретения. Соответственно следует понимать, что описываемые здесь способы и приборы приведены только для наглядности и не ограничивают объем изобретения. В приведенной выше спецификации описываются по меньшей мере следующие аспекты:

1. Способ отбора первого набора клеток из популяции клеток, в том числе первый набор клеток и второй набор клеток, который включает:

нанесение меток на популяцию клеток с тем, чтобы можно было отличить первый набор клеток от второго набора клеток;

обеспечение первого пути движения струи, состоящего из дальнего конца, ближнего конца, зоны опроса, расположенной между ближним концом и дальним концом, и оси струи;

образование проточной струи проточной жидкости, которая проходит через путь движения струи, при этом проточная струя движется к ближнему концу со скоростью первой струи;

вливание в проточную струю в точке, расположенной перед ближним концом, струи с образцами, включающей популяцию клеток, при этом струя с образцами первоначально имеет скорость второй струи, которая ниже скорости первой струи;

обеспечение источника энергии возбуждения, при этом энергия, излучаемая источником энергии возбуждения, воздействует на отдельные клетки при прохождении клеток через зону опроса и приводит к выпуску или передаче вторичного излучения от клеток;

использование объектива, оптическая ось которого в целом соосна оси струи, для фокусировки вторичного излучения от отдельных клеток при прохождении клеток через зону опроса;

обнаружение сфокусированного вторичного излучения от отдельных клеток;

определение на основании обнаруженного вторичного излучения того, находятся ли отдельные клетки в первом наборе или втором наборе; и

отбор клеток, которые определены как находящиеся в первом наборе.

2. Способ в рамках аспекта 1, в котором отбор клеток, определенных как часть первого набора, включает, например, дериватизацию, уничтожение, разрушение, преобразование, нарушение или фрагментирование клеток, не являющихся частью первого набора.

3. Способ в рамках аспекта 1, в котором отбор клеток, определенных как часть первого набора, включает выброс клеток из сопла в поток, создание множества капель из потока, выборочную подачу заряда на капли и сортировку капель в соответствии с зарядом каждой капли.

4. Способ в рамках любого из аспектов 1-3, в котором нанесение меток на популяцию клеток включает окрашивание клеток.

5. Способ в рамках любого из аспектов 1-4, в котором обеспечение вторичного излучения включает обеспечение флуоресцентного излучения.

6. Способ в рамках любого из аспектов 1-5, в котором энергия, излучаемая источником энергии возбуждения, проходит через объектив.

7. Способ в рамках любого из аспектов 1-6, в котором клетки представлены сперматозоидами, и в котором первый набор клеток содержит либо клетки с X-хромосомой, либо клетки с Y-хромосомой.

8. Способ в рамках любого из аспектов 1-7, в котором отбор клеток, определенных как часть первого набора, включает использование источника энергии для различения с целью облучения клеток, не определенных как часть первого набора.

9. Способ в рамках аспекта 8, в котором источником энергии для различения является лазер ближнего инфракрасного диапазона.

10. Способ в рамках аспекта 8 или 9, в котором энергия, излучаемая источником энергии для различения, проходит через объектив.

11. Способ в рамках любого из аспектов 1-10, в котором обеспечение источника энергии возбуждения включает предоставление ультрафиолетового лазера.

12. Способ в рамках аспекта 10, также включающий:

выбор комбинации длины волны источника энергии для различения скорости первой струи, скорости второй струи и объектива таким образом, чтобы номинальная фокальная точка объектива и номинальная фокальная точка источника энергии для различения были разделены расстоянием, которое должны пройти отдельные клетки через путь движения струи, между обнаружением сфокусированного вторичного излучения и использованием источника энергии для различения с целью облучения клеток, которые не определены как не являющиеся частью первого набора.

13. Способ в рамках аспекта 8 или аспекта 10, в котором обеспечение источника энергии возбуждения включает обеспечение уменьшенного выхода со стороны источника энергии для различения.

14. Способ в рамках любого из аспектов 1-13, также включающий обеспечение второго пути движения струи поперек оси струи, который расположен на ближнем конце первого пути движения струи таким образом, что после прохождения через зону опроса и достижения ближнего конца первого пути движения струи клетки перемещаются во второй путь движения струи и отдаляются от зоны опроса.

15. Способ в рамках любого из аспектов 1-14, в котором обеспечение пути движения струи также включает обеспечение пути движения струи, образованного из материала с коэффициентом преломления в диапазоне 1,30-1,40 включительно.

16. Способ в рамках любого из аспектов 1-15, который также включает корректировку коэффициента преломления раствора, содержащего популяцию клеток, таким образом, чтобы коэффициент преломления раствора находился в переделах 0,02 по отношению к коэффициенту преломления материала, образующего путь движения струи.

17. Прибор для обнаружения и выборочного изменения нужной субпопуляции клеток в популяции с образцами клеток, включающий:

путь движения жидкости, состоящий из:

первого участка струи с осью струи, и

второго участка струи,

первого и второго участков струи, пересекающихся на стороне измерения первого участка струи;

зону опроса, расположенную на или около стороны измерения первого участка струи;

точку ввода проточной жидкости в месте соединения струи жидкости с путем движения жидкости;

точку ввода образца в месте соединения струи жидкости с путем движения жидкости;

объектив с номинальной фокальной точкой и оптической осью, который расположен на стороне измерения первого участка струи. При этом объектив выровнен по первому участку струи таким образом, чтобы номинальная фокальная точка располагалась вдоль оси струи и в зоне опроса, и таким образом, чтобы оптическая ось была в целом соосна оси струи;

детектор для обнаружения света, сфокусированного объективом;

логическую программу, сопряженную с детектором, которая используется, чтобы определить, является ли клетка в популяции с клеточными образцами частью нужной субпопуляции клеток, а также, чтобы выводить сигналы исходя из определения о том, является ли клетка частью нужной субпопуляции клеток; и

контролируемый источник энергии, сопряженный с логической программой, который используется для выборочного изменения либо клеток в нужной субпопуляции клеток, либо клеток, не входящих в нужную субпопуляцию клеток, в соответствии с сигналом (по меньшей мере), отправленным логической программой.

18. Прибор в рамках аспекта 17, в котором контролируемый источник энергии выборочно изменяет клетки путем дериватизации, уничтожения, разрушения, преобразования, нарушения или фрагментирования одной или нескольких клеток, не определенных как часть нужной субпопуляции.

19. Прибор в рамках аспекта 17 или аспекта 18 также включает источник энергии возбуждения.

20. Прибор в рамках аспекта 19, в котором энергия, излучаемая источником энергии возбуждения, проходит через объектив.

21. Прибор в рамках аспекта 19 или аспекта 20, в котором источник энергии возбуждения включает аттенюатор, оснащенный контролируемым источником энергии в качестве точки ввода.

22. Прибор в рамках любого из аспектов 17-21, в котором энергия, излучаемая контролируемым источником энергии, проходит через объектив.

23. Прибор в рамках любого из аспектов 17-22, в котором контролируемый источником энергии включает лазер.

24. Прибор в рамках любого из аспектов 17-23, в котором контролируемый источником энергии включает лазер ближнего инфракрасного диапазона.

25. Прибор в рамках любого из аспектов 17-24, который также включает объект, в котором формируется путь движения струи.

26. Прибор в рамках аспекта 25, который также включает желобок, образующий второй участок струи на первой поверхности объекта, при этом сторона измерения первого участка струи пересекает желобок на первой поверхности.

27. Прибор в рамках аспекта 25, также включающий:

первый внутренний канал, проходящий через объект от первой поверхности объекта до точки в объекте и образующий первый участок струи; и

второй внутренний канал, проходящий через объект от точки в объекте до второй поверхности объекта.

28. Прибор в рамках любого из аспектов 25-27, в котором объект изготовлен из материала с коэффициентом преломления между 1,30 и 1,40 включительно.

29. Прибор в рамках аспекта 28, в котором материал включает аморфный перфторполимер и аморфный фторполимер или перфторалкокси-полимер.

30. Прибор в рамках любого из аспектов 17-29, в котором объектив представляет собой либо водно-иммерсионную линзу, либо линзу для погружения в воду.

31. Прибор в рамках любого из аспектов 17-30, в котором популяция с клеточными образцами включает сперматозоиды.

32. Прибор в рамках аспекта 31, в котором нужная популяция клеток включает либо клетки с Х-хромосомой, либо клетки c Y-хромосомой.

33. Система для обнаружения и выборочного изменения нужной субпопуляции клеток в популяции с клеточными образцами, которая включает:

путь движения жидкости с осью струи;

зону опроса, расположенную внутри пути движения жидкости;

точку ввода проточной жидкости в месте соединения струи жидкости с путем движения жидкости;

первый насос в месте соединения струи жидкости с точкой ввода проточной жидкости;

точку ввода жидкости с образцами в месте соединения струи жидкости с путем движения жидкости;

второй насос в месте соединения струи жидкости с точкой ввода жидкости с образцами;

объектив с номинальной фокальной точкой и оптической осью, который расположен таким образом, чтобы номинальная фокальная точка располагалась вдоль оси струи и в зоне опроса, и таким образом, чтобы оптическая ось была в целом соосна оси струи в зоне опроса;

детектор для обнаружения света, сфокусированного объективом;

контролируемый источник энергии;

процессор, сопряженный с машиночитаемым носителем информации, детектором и контролируемым источником энергии; и

процессор и контролируемый источник энергии, которые совместно используются для выборочного изменения либо клеток в нужной субпопуляции клеток, либо клеток, не находящихся в нужной субпопуляции клеток, в соответствии с выходными данными процессора.

34. Система в рамках аспекта 33, в которой процессор и контролируемый источник энергии также совместно используются для выборочного изменения клеток в нужной субпопуляции клеток путем дериватизации, уничтожения, разрушения, преобразования, нарушения или фрагментирования одной или нескольких клеток, не определенных как часть нужной субпопуляции клеток.

35. Система в рамках аспекта 33 или 34, в которой энергия, излучаемая источником энергии для различения, проходит через объектив.

36. Система в рамках любого из аспектов 33-35, в которой контролируемый источник энергии включает лазер ближнего инфракрасного диапазона.

37. Система в рамках любого из аспектов 33-35, которая также включает объект, изготовленный из материала с коэффициентом преломления между 1,30 и 1,40 включительно.

38. Система в рамках любого из аспектов 33-37, в которой популяция с клеточными образцами включает сперматозоиды.

39. Система в рамках аспекта 38, в которой нужная субпопуляция клеток включает либо клетки с Х-хромосомой, либо клетки с Y-хромосомой.

40. Способ обнаружения и выборочного изменения нужной субпопуляции клеток в популяции с клеточными образцами, который входит в набор машиночитаемых инструкций, выполняемых на процессоре и хранящихся на материальном носителе. Данный способ включает:

контроль движения популяции с клеточными образцами через путь движения струи с осью струи;

контроль источника освещения с целью освещения зоны опроса, через которую проходят клетки в популяции с клеточными образцами;

прием данных от детектора в оптическом пути, оснащенном объективом, при этом объектив имеет оптическую ось и номинальную фокальную точку. Оптическая ось в целом соосна оси струи, а номинальная фокальная точка находится внутри зоны опроса;

определение на основании полученных данных наличия в зоне опроса одной из клеток популяции с клеточными образцами.

определение на основании полученных данных того, является ли одна из клеток из числа клеточных образцов частью нужной субпопуляции клеток; и

контроль источника энергии для отбора клеток по меньшей мере на основании определения того, является ли одна из клеток из числа клеточных образцов частью нужной субпопуляции клеток.

41. Способ в рамках аспекта 40, в котором контроль источника энергии для отбора клеток включает:

определение скорости течения одного из клеточных образцов через зону опроса; и

выборочное облучение одной из клеток за счет контроля источника энергии для отбора клеток в соответствии с определенной скоростью течения одного из клеточных образцов через путь движения струи.

42. Способ в рамках аспекта 40, в котором контроль источника энергии для отбора клеток включает выборочную подачу заряда на каплю, в которой содержится одна из клеток.

43. Система для обнаружения и выборочного изменения нужной субпопуляции клеток в популяции с клеточными образцами, которая включает:

путь движения струи, состоящий из зоны опроса и оси струи в зоне опроса;

средства контроля для контроля за течением популяции с клеточными образцами через путь движения струи;

средства освещения для освещения клеточных образцов при их прохождении через зону опроса;

объектив с оптической осью и номинальной фокальной точкой, при этом оптическая ось в целом соосна оси струи, а номинальная фокальная точка находится в зоне опроса;

средства обнаружения для обнаружения энергии, сфокусированной объективом, и для предоставления данных об обнаруженной энергии;

средства обработки для получения данных об обнаруженной энергии, а также для определения того, являются ли отдельные клеточные образцы, проходящие через зону опроса, частью нужной субпопуляции;

средства отбора клеток с целью выборочного облучения клеточных образцов; и

средства контроля отбора клеток для контроля средств отбора клеток, как минимум, в зависимости от определения того, являются ли отдельные клеточные образцы частью нужной субпопуляции.

44. Система в рамках аспекта 43, в которой популяция с клеточными образцами включает популяцию сперматозоидов, при этом нужная субпопуляция клеток включает сперматозоиды с Х-хромосомой.

45. Система в рамках аспекта 43, в которой популяция с клеточными образцами включает популяцию сперматозоидов, при этом нужная субпопуляция клеток включает сперматозоиды с Y-хромосомой.

46. Система в рамках любого из аспектов 43-45, в которой энергия, излучаемая средствами отбора клеток, прежде чем достигнуть клеточных образцов, проходит через объектив.

47. Система в рамках любого из аспектов 43-46, в котором как минимум часть пути движения струи образована из материала с коэффициентом преломления между 1,30 и 1,40 включительно.

48. Процесс обнаружения и выборочного изменения нужной субпопуляции клеток в популяции с клеточными образцами, который включает:

создание струи, которая переносит движущиеся один за другим клеточные образцы через путь движения струи;

освещение клеточных образцов при прохождении клеточных образцов через зону опроса в пути движения струи;

расположение объектива таким образом, чтобы:

оптическая ось объектива была в целом соосна пути движения струи,

струя перемещалась через путь движения струи по направлению к объективу, и

фокальная точка объектива располагалась в зоне опроса;

выявление параметров отдельных клеточных образцов при прохождении клеточных образцов через зону опроса;

расшифровку выявленных параметров отдельных клеточных образцов с целью определения того, являются ли отдельные клеточные образцы частью нужной субпопуляции.

выборочную дериватизацию, уничтожение, разрушение, преобразование, нарушение или фрагментирование одной или нескольких популяций с клеточными образцами в зависимости от определения того, являются ли отдельные клеточные образцы частью нужной субпопуляции клеток; и

сбор образующейся в результате популяции обработанных клеток.

49. Процесс в рамках аспекта 48:

в котором популяция с клеточными образцами включает сперматозоиды;

в котором нужная субпопуляция клеток включает либо клетки с Х-хромосомой, либо клетки с Y-хромосомой; и

в котором выявление параметров отдельных клеточных образцов при прохождении клеточных образцов через зону опроса включает выявление параметров более чем 40000 клеточных образцов в секунду при прохождении клеток через зону опроса.

50. Процесс в рамках аспекта 48, в котором выявление параметров отдельных клеточных образцов при прохождении клеточных образцов через зону опроса включает выявление параметров более чем 75000 клеточных образцов в секунду при прохождении клеток через зону опроса.

51. Процесс в рамках аспекта 48, в котором выявление параметров отдельных клеточных образцов при прохождении клеточных образцов через зону опроса включает выявление параметров более чем 100000 клеточных образцов в секунду при прохождении клеток через зону опроса.

52. Процесс в рамках любого из аспектов 48-51, в котором клетки, определенные как часть нужной субпопуляции, не изменяются путем выборочной дериватизации, уничтожения, разрушения, преобразования, нарушения или фрагментирования клеток, и в котором образующаяся в результате популяция обработанных клеток включает такой процент клеток в нужной субпопуляции клеток, который по отношению к общему числу неизменных клеток больше или равен 60%.

53. Процесс в рамках любого из аспектов 48-51, в котором клетки, определенные как часть нужной субпопуляции, изменяются путем выборочной дериватизации, уничтожения, разрушения, преобразования, нарушения или фрагментирования клеток, и в котором образующаяся в результате популяция обработанных клеток включает такой процент клеток в нужной субпопуляции клеток, который по отношению к общему числу измененных клеток больше или равен 60%.

54. Процесс в рамках любого из аспектов 48-53, в котором клетки, определенные как часть нужной субпопуляции, не изменяются путем выборочной дериватизации, уничтожения, разрушения, преобразования, нарушения или фрагментирования клеток, и в котором образующаяся в результате популяция обработанных клеток включает такой процент измененных клеток в нужной субпопуляции клеток, который по отношению к общему числу клеток в нужной субпопуляции меньше или равен 50%.

55. Процесс в рамках любого из аспектов 48-53, в котором клетки, определенные как часть нужной субпопуляции, изменяются путем выборочной дериватизации, уничтожения, разрушения, преобразования, нарушения или фрагментирования клеток, и в котором образующаяся в результате популяция обработанных клеток включает такой процент неизмененных клеток в нужной субпопуляции клеток, который по отношению к общему числу клеток в нужной субпопуляции меньше или равен 50%.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой прибор и систему для обнаружения и выборочного изменения нужной субпопуляции клеток в популяции с клеточными образцами. Прибор и система включают путь движения жидкости. Прибор и система предполагают использование объектива, оптическая ось которого расположена соосно пути движения струи в фокальной точке. Прибор и система включают детектор для обнаружения света, сфокусированного объективом, логическую программу, сопряженную с детектором, которая используется, чтобы определить, является ли клетка в популяции с клеточными образцами частью нужной субпопуляции клеток, а также чтобы выводить сигналы исходя из определения о том, является ли клетка частью нужной субпопуляции клеток, и контролируемый источник энергии, сопряженный с логической программой, который используется для выборочного изменения либо клеток в нужной субпопуляции клеток, либо клеток, не входящих в нужную субпопуляцию клеток, в соответствии с сигналом, отправленным логической программой. Предложенное изобретение позволяет осуществлять сортировку клеток с большей эффективностью и точностью. 2 н. и 15 з.п.ф-лы, 22 ил.

1. Прибор для обнаружения и выборочного изменения нужной субпопуляции клеток в популяции с клеточными образцами, который включает:
путь движения жидкости (110), состоящий из:
первого участка струи с осью струи (130), и
второго участка струи,
первого и второго участков струи, пересекающихся на стороне измерения (136) первого участка струи;
зону опроса (128), расположенную на или около стороны измерения первого участка струи, где наблюдается энергия (176), излучаемая клетками в популяции с клеточными образцами;
точку ввода проточной жидкости (114) в месте соединения струи жидкости с путем движения жидкости (110);
точку ввода образца (122) в месте соединения струи жидкости с путем движения жидкости;
объектив (142) с номинальной фокальной точкой (170) и оптической осью (144), который расположен на стороне измерения первого участка струи, при этом объектив выровнен по первому участку струи таким образом, чтобы номинальная фокальная точка располагалась вдоль оси струи и в зоне опроса и таким образом, чтобы оптическая ось была в целом соосна оси струи;
детектор (180) для обнаружения света (182), сфокусированного объективом;
логическую программу (194), сопряженную с детектором, которая используется, чтобы определить, является ли клетка (150) в популяции с клеточными образцами частью нужной субпопуляции клеток, а также чтобы выводить сигналы (198) исходя из определения о том, является ли клетка частью нужной субпопуляции клеток; и
контролируемый источник энергии (196, 204, 228), сопряженный с логической программой, который используется для выборочного изменения либо клеток в нужной субпопуляции клеток, либо клеток, не входящих в нужную субпопуляцию клеток, в соответствии с сигналом, по меньшей мере, отправленным логической программой.

2. Прибор по п.1, отличающийся тем, что контролируемый источник энергии выборочно изменяет клетки путем дериватизации, уничтожения, разрушения, преобразования, нарушения или фрагментирования одной или нескольких клеток, не определенных как часть нужной субпопуляции.

3. Прибор по п.1, который также включает источник энергии возбуждения (222) и в котором энергия (224), излучаемая источником возбуждения, проходит через объектив.

4. Прибор по п.3, отличающийся тем, что источник энергии возбуждения включает аттенюатор, оснащенный контролируемым источником энергии в качестве точки ввода.

5. Прибор по п.1, отличающийся тем, что энергия, излучаемая контролируемым источником энергии (204), проходит через объектив.

6. Прибор по п.1, который также включает объект (280), в котором формируется путь движения струи.

7. Прибор по п.6, который также включает желобок (281), образующий второй участок струи на первой поверхности (284) объекта, при этом сторона измерения первого участка струи пересекает желобок на данной первой поверхности.

8. Прибор по п.6, также включающий:
первый внутренний канал (282), проходящий через объект от первой поверхности (284) объекта до точки (288) в объекте и образующий первый участок струи; и
второй внутренний канал (286), проходящий через объект от точки в объекте до второй поверхности объекта.

9. Прибор по п.6, отличающийся тем, что объект изготовлен из материала с коэффициентом преломления между 1,30 и 1,40 включительно.

10. Прибор по п.9, отличающийся тем, что материал включает аморфный перфторполимер, аморфный фторполимер или перфторалкокси-полимер.

11. Прибор по п.1, отличающийся тем, что объектив представляет собой либо водно-иммерсионную линзу, либо линзу для погружения в воду.

12. Прибор по п.1, отличающийся тем, что популяция с клеточными образцами включает сперматозоиды, и в котором нужная популяция клеток содержит либо клетки с X-хромосомой, либо клетки с Y-хромосомой.

13. Система (200, 220) для обнаружения и выборочного изменения нужной субпопуляции клеток в популяции с клеточными образцами, которая включает:
путь движения жидкости (110) с осью струи (130);
зону опроса (128), расположенную внутри пути движения жидкости, где наблюдается энергия (176), излучаемая клетками в популяции с клеточными образцами;
точку ввода проточной жидкости (114) в месте соединения струи жидкости с путем движения жидкости;
первый насос в месте соединения струи жидкости с точкой ввода проточной жидкости;
точку ввода жидкости с образцами (122) в месте соединения струи жидкости с путем движения жидкости;
второй насос в месте соединения струи жидкости с точкой ввода жидкости с образцами;
объектив (142) с номинальной фокальной точкой (170) и оптической осью (144), который расположен таким образом, чтобы номинальная фокальная точка располагалась вдоль оси струи и в зоне опроса, и таким образом, чтобы оптическая ось была в целом соосна оси струи в зоне опроса;
детектор (180) для обнаружения света (182), сфокусированного объективом;
контролируемый источник энергии (196, 204, 228);
процессор (188), сопряженный с машиночитаемым носителем информации (192), детектором и контролируемым источником энергии; и
отличающаяся тем, что процессор и контролируемый источник энергии совместно используются для выборочного изменения либо клеток в нужной субпопуляции клеток, либо клеток, не находящихся в нужной субпопуляции клеток, в соответствии с выходными данными процессора.

14. Система по п.13, в которой процессор и контролируемый источник энергии также совместно используются для выборочного изменения клеток в нужной субпопуляции клеток путем дериватизации, уничтожения, разрушения, преобразования, нарушения или фрагментирования одной или нескольких клеток, не определенных как часть нужной субпопуляции клеток.

15. Система по п.13, отличающаяся тем, что энергия, излучаемая контролируемым источником энергии (204), проходит через объектив.

16. Система по п.13, отличающаяся тем, что объект (280) изготовлен из материала с коэффициентом преломления между 1,30 и 1,40 включительно.

17. Система по п.13, отличающаяся тем, что популяция с клеточными образцами включает сперматозоиды, и нужная субпопуляция клеток содержит либо клетки с X-хромосомой, либо клетки с Y-хромосомой.