Устройство для отбора биологических клеток Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к Оборудованию и способам разделения биологических клеток.

Цель изобретения - повышение точности отбора клеток заданных размеров

На фиг. 1 изображена решетка для отбора клеток, общий вид; на фиг. 2 - сечение отверстий решетки; на фиг. 3 - то же; на фиг. 4 - npoiочная камера, общий вид; на фиг, 5 - базис для решетки; на фиг. 6 - устройство для отбора клеток в сечении, вид сбоку; на фиг. 7 - устройство с направителем потока; на фиг 8 - вариант проточной камеры с оптическим анализатором; на фиг. 9 - вариант базиса для решетки с проточной камерой, общий вид, на фиг. 10 - вид А на фиг, 11; на фиг 11 - устройство с приспособлением для получения разности давлений; на фиг. 12 - то же в сечении; на фиг. 13 - вариант проточной камеры с базисом: на фиг. 14 - вариант решетки для клеток; на фиг 15 - элемент решетки для клеток: на Фиг 16 - устройство для отделения клеток, сканирования и анализа на фиг 17 - вариант решетки для клеток с электромагнитным приспособлением.

Решетка 1 клеток может иметь различные конфигурации апертур или отверстий 2, равно как и способов, по которым они размещаются. Размеры отверстий выбраны таким образом, чтобы они могли принимать лимфоциты, среди которых имеются клетки двух основных размеров, составляющих около 7 мкм и около 10-15 мкм. На верхней поверхности стороны решетки 1 апертур имеют размер поперечного сечения, составляющий приблизительно 10 мкм. Апертуры на нижней поверхности решетки имеют поперечное сечение, равное приблизительно 6 мкм. Боковые стенки апертур могут сходиться непрерывно или ступенчато.

В общем случае апертура должна иметь такую форму, чтобы либо на ее нижней стороне или в поперечном сечении, расположенном между сторонами решетки, размер этого сечения оказывался бы меньшим, чем на верхней стороне, так чтобы искомая клетка, входящая в апертуру, не могла бы пройти насквозь через отверстие а вместо этого

s

Ј

VI VI Os

со

(Я

ю

СлЭ

задерживалась бы внутри Кроме этого, очень важно ограничить толщину решетки между ее сторонами для предотвращения возможности смывания клетки при осуществлении операции промывания.

Отверстия 2 в решетке 1 расположены, например, рядами и колоннами для того, чтобы обеспечить возможность четкой идентификации положения каждого отверстия 2, например, по их координатам по осям X и Y в плоскости решетки. Количество отверстий выбирается в зависимости от числа клеток, которое будет переноситься. Решетка 1 может иметь круговую периферическую поверхность (фиг. 12). Решетка имеет множество ушек 3, предназначенных для установки в фиксирующие элементы 4.

Решетка 1 может быть выполнена из любого материала, например, их металлов, таких как медь, золото, никель, серебро и других, или из пластических материалов, которые могут быть снабжены участками, обладающими электропроводностью. Таким образом, можно воздействовать электрическим потенциалом на любое из отверстий, содержащее клетку, для того, чтобы обеспечить взаимодействие с электрическим зарядом самой клетки. Посредством регулирования потенциала в различных отверстиях можно обеспечить электрическое связывание находящихся в них клеток, равно как и высвободить их.

На решетку клеток наносят несколько капель раствора, содержащего лимфоциты, например, крови. Жидкость проходит через отверстия в решетке. Однако клетки остаются на решетке, поскольку размеры отверстий 2 выбраны таким образом, чтобы принимать в себя только лимфоциты, которые и входят в эти отверстия. В каждое отверстие входит только одна клетка. Избыточное количество клеток данной группы и клетки других групп смываются с поверхности решетки. После этого, для того, чтобы предотвратить возможность ухода клеток из решетки, они могут быть закреплены на ней с помощью различных средств, например, путем покрывания решетки прилипающим коллоидным веществом, и обеспечением электрического заряжения ее, равно как посредством электрического или магнитного полей. При этом за счет того, что клетки обладают электрическими поверхностными зарядами, устройство может быть использовано для селективного высвобождения и удерживания нужных клеток, где решетка снабжена электрическими проводниками 38, проходящими между отверстиями 2, электрически изолированными друг от друга На периферийной

поверхности решетки 1 проводники присоединены известным способом (по методике интегральной схемы) к переключающему устройству, регулируемому ЭВМ, для обеспечения селективного наведения электрического потенциала на каждый из проводников. Для прикрепления клеток к решетке все проводники могут поддерживаться под одним и тем же потенциалом, знак которого противополо0 жен потенциалу заряда клетки, в результате чего обеспечивается электрическое притяжение клеток (фиг. 17).

В первом варианте (фиг. 4, 5. 6, 7) множество клеток помещены на базисе 5, кото5 рый расположен наверху проточной камеры 6, устанавливается с возможностью снятия на центральной части 7 проточной камеры 6. Центральная часть 7 определяет множество каналов 8, каждый из которых присое0 диняется обоими концами к одной из множества трубок для подачи и выведения требуемого раствора. Центральная часть 7 прирепляется к проточной камере 6 посредством прозрачной стенки 10, которая необ5 ходима при использовании методики анализа клеток, находящихся на решетках, связанных с применением отраженного и поглощаемого излучения. Устройство для направления потока 11 .гарантирует, что

0 раствор входит в контакт с решеткой 1, которая может быть покрыта стеклянной-пластиной 12. На фиг. 11, 12 представлен модифицированный базис 5, который имеет волнообразную форму, чтобы обеспечить

5 возможность погружения составляющих его лотков 13 в растворы, протекающие через каналы 8 на более высоком уровне. Решетка клеток установлена на дне лотков 13 и может смачиваться для того, чтобы пропола0 скивать или стимулировать каким-либо другим способом клетки как с верхней, так и с нижней стороны решетки. Поэтому в этом варианте нет необходимости в применении устройств для направления потока.

5 На фиг. 10 проиллюстрирован вариант проведения оптического анализа. В первом варианте, предназначенном для использования септическим анализатором на основе микроскопа, нижняя часть 14 проточной ка0 меры 6 содержит водонепроницаемые эластичные (выполненные из резины) держатели 15 стекла 16 и обеспечивает возможность для объектива 17 микроскопа приближаться достаточно близко к решетке 1

5 клеток для сканирования имеющихся на ней отдельных мест или отверстий снизу. Если объектив микроскопа находится в самом нижнем своем положении, канал проточной камеры в этом случае раскрывается на всю свою исходную ширину. В модификации

этого варианта нижняя и боковая стенки проточной камеры выполнены как единичное целое из резины.

Во втором варианте (фиг. 15) оптический анализ осуществляется с верхней сто- роны, Однако базис 5 для решетки 1 клеток помещается идущим сверху вниз на нижней части 14 проточной камеры 6 после того, как клетки помещаются в специальный блок, т.е. такой, где имеющие коническую форму отверстия в решетках 1 расширяются книзу. Для того, чтобы удерживать клетки в нужном месте и для того, чтобы эффективным образом связывать их с решеткой, обеспечивается разница давлений между нижней частью 14 и верхней частью 18 проточной камеры, причем жидкость в нижней части 14 имеет слегка более высокое давление, чем в верхней части 18. Уплотняющие выступы 19 . предотвращают возможность утечки жидко- сти из обеих частей проточной камеры.

Базис 5 (фиг. 13) размещен на конструкции из трубок 20, каждая из которых разделяется по длине на верхнюю часть 21 и нижнюю часть 22. Нижняя часть 22 образует трубопровод для жидкости (воздуха) более низкого давления для того, чтобы отнести жидкости и ненужные кровяные клетки от верхней части 21. Верхняя часть содержит мостики 23, под которыми сделаны дренаж- ные отверстия 24 и между которыми имеются всасывающие отверстия 25, установленные на одно линии. На фиг. 13 показаны держатели для размещения клеток только от одного пациента. По верхней и нижней частям 21 и 22 подается жидкость, например, раствор РВ, который проходит под мостиками 23. Жидкость в нижней части 22 с помощью выступов 26 принуждается к перемещению с большей скоростью в обла- сти, где расположены дренажные отверстия 24 и всасывающие отверстия 25, в результате чего создается местное понижение давления в этих отверстиях. Поэтому жидкость, первоначально протекавшая через верх- нюю часть 21, частично втягивается в нижнюю часть через упомянутые давления.

Элемент 27 подачи крови, установленный с возможностью снятия с базиса 5, предусмотрен для1 подачи, крови на решетку 1. Ножки 28 элемента 27 подачи крови предотвращают возможность прохождения жидкости от одного ряда щелей 29 к другому.

Решетка 1 клеток имеет каналы 30, 31, проходящие поперечно относительно друг друга, и внутренние трубопроводы 32, 33, также проходящие в поперечном направлении друг относительно друга. На каждом пересечении каналов размещаются отверстия 2 решетки на вращаемом держателе

34,который образован зубчатым колесом

35,которое взаимодействует с соответствующей зубчатой рейкой 36. Одна зубчатая рейка приводит в движение все держатели 34 соответствующей колонны. Направление подачи крови для грубого разделения, т.е. для отделения группы лимфоцитов от другой группы кровяных клеток, перпендикулярно плоскости, в которой осуществляется сканирование решетки клеток под микроскопом. Таким образом, после отделения лимфоцитов от других кровяных телец, держатели 34 поворачиваются на 90° для проведения операции сканирования.

Часть канала, которая пересекает держатель 34, выполнена в форме стеклянной трубки 37, которая разделена по длине. Таким образом становится возможным обеспечить горизонтальный поток жидкости через держатель, в то время как одновременно с этим обеспечивается пропускание излучения в вертикальном направлении, Понижение давления в этой системе вызывается наличием внутренних трубопроводов 32, 33, которые сделаны закрытыми и более тонкими, в то-время, как верхние каналы 30, 31 сделаны более широкими и открытыми. Тот же самый эффект может быть достигнут с помощью других способов, таких, например, как увеличение скорости потока во внутренних трубопроводах по сравнению со скоростью потока в верхних каналах.

На фиг. 16 показана система отделения клеток, сканирования и анализа (диагностики).

При осуществлении методики отбора большое количество клеток, например, лимфоцитов, .оторое можно рассматривать в качестве представителей группы или популяции клеток, вначале отделяется от всех других клеток, т.е. от различных групп популяций клеток. В ходе осуществления способа отделения отделенные лимфоциты, в дополнение к тому, что они отделяются от других клеток, отделяются также друг от друга, причем каждый из них находится в известном месте, которое впоследствии называется адресом клетки. Все отделенные лимфоциты затем подвергаются одновременно определенным испытаниям, после чего каждая из клеток исследуется по отдельности для того, чтобы определить, проявляет она или нег в результате испытания или стимулирования конкретные свойства. При этом регистрируется адрес каждой из клеток, проявившей упомянутое свойство. Таким образом, после того, как были исследованы все отделенные клетки, становятся известиыми адреса всех клеток, которые проявили некоторое конкретное свойство.

Эти клетки представляют собой конкретную подгруппу лимфоцитов внутри большей полной группы лимфоцитов. Как только произошла идентификация клеток в подгруппе, они вместе с остальными лимфоцитами мо- гут быть подвергнуты одному или нескольким испытаниям. Однако, что касается исследования свойств клеток в результате этих дополнительных испытаний, они могут быть ограничены только клетками, входящи- ми в подгруппу. Каждая клетка в подгруппе исследуется по отдельности посредством направления обеспечивающих это исследование приборов известное место нахождения или адрес каждой отдельной клетки. Таким образом, как только происходит идентификация клеток в подгруппе, они подвергаются последующему исследованию, в то время как все остальные клетки, хотя они принадлежат к той же самой труп- пе, но не являются членами подгруппы, игнорируются в том смысле, что они не подвергаются исследованию. Следовательно, как только произведена идентификация конкретной подгруппы, производится исс- ледование тех клеток, которые в нее входят, в результате чего время исследования ограничивается исследованием только клеток подгруппы, которая представляет интерес. Кроме того, поскольку исследование дела-

етсч в режиме клетка за клеткой, получаются более точные данные, что обеспечивает повышение точности всего анализа. Формула изобретения

1.Устройство для отбора биологических клеток, содержащее решетку с калиброванными отверстиями, отличающееся тем, что, с целью повышения точности отбора клеток заданных размеров, оно снабжено базисом для решетки и размещенной под ним проточной камерой, имеющими возможность свободного перемещения относительно друг друга, а также средствами выделения и удержания отобранных клеток, удаления некалиброванных клеток и напра- вителем потока отбираемых клеток, при этом отверстия решетки выполнены ступенчатыми и/или коническими.

2.Устройство поп. 1,отличающее- с я тем, что проточная камера имеет каналы, расположенные под рядами отверстий решетки, и трубопроводы для введения и выведет ия раствора.

3.Устройство поп. 1,отличающее- с я тем, что оно содержит электромагнитное приспособление для привлечения и отталкивания клеток.

4.Устройство поп. 1,отличающее- с я тем, что оно содержит приспособление для получения разности давлений.

Изобретение предназначено для отбора биологических клеток. С целью повышения точности отбора клеток заданных размеров имеется базис с проточной камерой и различные средства для выделения и удержания отобранных клеток с направителем потока. 3 з. п. ф-лы, 17 ил.

фие.2

фигЗ

РигА

фае. 5

12

фиг. 7

фиг, 8

74

13

фиг. 9

Фиг. fO

фигЛ

фиг. 13

//

Л

36

Фиг п

Фиг. f5

38

Vy2 (риг. 17 Krj

/А /

fa