СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2014 года по МПК C12N5/783 C12N5/784 A61K48/00 A61P35/00 

Описание патента на изобретение RU2521506C1

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы.

Несмотря на успехи диагностики и лечения в последние два десятилетия рак молочной железы (РМЖ) до сих пор является наиболее распространенным онкологическим заболеванием среди женщин. По сравнению с 1999 годом, в 2009 в России наблюдался рост заболеваемости раком молочной железы на 15,91% [Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность). Под ред. В.И. Чиссова, 2011]. Общая выживаемость больных раком молочной железы в 5- и 10-летний срок составляет 68% и 50%, соответственно [La Vecchia, С., et al.//Ann. Oncol. - 2009. - №19].

На данный момент, перспективным направлением в лечении онкологических заболеваний являются различные методы иммунотерапии, направленные на непосредственное воздействие на опухоль и гибель раковых клеток в первичном очаге, или способствующие снижению риска раннего метастазирования и рецидивов опухолевого роста, за счет индукции апоптоза диссеминированных опухолевых клеток. Иммунотерапия непосредственно стимулирует внутренние системы организма на борьбу с патологическим процессом, а также способствует профилактике токсического действия как самой опухоли, так и химио- и лучевой терапии на организм в целом [Попович A.M. Иммунотерапия в онкологии. // Справочник по иммунотерапии для практического врача. СПб: изд-во "Диалог", 2002. С.335-352].

При любом онкологическом процессе, и при РМЖ, в частности, начиная с ранних предраковых состояний, начинается подавление нормального функционирования иммунной системы, приводящее к развитию иммунодепрессии, которая на сегодняшний день рассматривается как один из основных факторов агрессивного роста опухоли. [А. Mantovani et al. Tumour immunity: effector response to tumor and role of the microenvironment. // Lancet. - 2008. - N371. - p.771-83]. Это может быть связано с преобладанием CD4+ Т хелперов над CD8+ цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) [Kohrt HE, et al. Profile of immune cells in axillary lymph nodes predicts disease-free survival in breast cancer. // PLoS Med. - 2005. - N2(e284). - p.904-919; D.G. DeNardo and L. M. Coussens. Balancing immune response: crosstalk between adaptive and innate immune cells during breast cancer progression. - Breast Cancer Research. - 2007. - №9(212)]. Основной задачей иммунотерапии является активация процесса, способствующего разрушению опухоли с помощью усиления функциональных свойств антиген-презентирующих клеток (дендритных клеток), цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллерных клеток.

Дендритные клетки являются профессиональными антиген-презентирующими клетками, способными захватывать АГ и представлять его на своей поверхности в комплексе, как с классическими МНС I и II классов [R.M. Steinman The dendritic cells system and its role in immunogenicity. // Annu. Rev. bnmunol. - 1991. - №9. - p.271-279], так и с неклассическими молекулами (семейство CD1). [А.К. Palucka et al. Dendritic cells: a critical player in cancer therapy? // J Immunother. - 2008. - N31(9). - p.793-805]. Активация дендритных клеток(ДК) происходит в периферических тканях, где клетки узнают антигены и захватывают их с помощью различных механизмов (макропиноцитоза, рецептор-опосредованного эндоцитоза, фагоцитоза и др.). После захвата антигена ДК изменяют свою морфологию и фенотип, теряют способность к эндоцитозу, и мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где происходит межклеточное взаимодействие зрелых ДК и наивных или покоящихся Т-клеток. За счет взаимодействия рецепторов этих клеток, а также различных цитокинов происходит передача активационного сигнала Т-клеткам и запуск иммунного ответа [Н. Saito et al. Dendritic Cell-Based Vaccination Against Cancer. // Hematol Oncol Clin. - 2006. - N20. - p.689-710]. Активация Т-лимфоцитов зависит как от наличия костимуляторных молекул на поверхности клеток (CD40L, CD80/CD86, CD83 и др.), так и от микроокружения взаимодействующих клеток (ФНО-alpha, ИФН-gamma, ИЛ-12 и т.д.) [Н. Ueno et al. Dendritic cell subsets in health and disease. // Immunological Reviews. - 2007. - №219. - p.118-142].

Цитокины, продукция которых осуществляется активированными ДК, оказывают влияние на развитие иммунного ответа. Так, считается, что IL-18 воздействует на другие цитокины (например, ИФHg) и формирует цитотоксический тип иммунного ответа, за счет дифференцировки Т клеток в Th1 лимфоциты [De Jong Е.С., Smits Н.Н., Kapsenberg M.L. Dendritic cell-mediated Т cell polarization. // Springer Semin Immun. - 2004. - №26. - P.289-307]. Аналогичным действием обладает ИЛ-12. При этом ИЛ-18 сильнее, чем ИЛ-12 усиливает продукцию IFNγ Т- и цитотоксическими НК-клетками, а также пролиферацию Т-клеток [Barbulescu К, Becker С, Schlaak JF, et al. IL-12 and IL-18 differentially regulate the transcriptional activity of the human IFN-gamma promoter in primary CD4+T lymphocytes. // J Immunol. - 1998. - №160. - P.3642-3647].

На сегодняшний день наибольшее распространение получили ДК вакцины на основе миелоидных клеток. Незрелые ДК получают из прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), при добавлении в среду рчГМ-КСФ и рчИЛ-4. Для созревания ДК применяют определенный набор цитокинов, таких как ФНО-alpha, ИФН-alpha, ИЛ-15, ИФН-gamma, ПГЕ2, и т.д. Для нагрузки ДК опухолевыми АГ могут использоваться РНК, ДНК, рекомбинантные белки, лизат опухолевых клеток [K.Palucka et al. Recent developments in cancer vaccines. // J Immunol. - 2011. - №186(3). - p.1325-1331].

Использование лизата аутологичных опухолевых клеток позволяет презентировать весь возможный набор иммунных молекул, тем самым вызывая поликлональную реакцию Т-лимфоцитов против опухолевых клеток. Кроме того, так как материал забирается непосредственно от больного, отсутствует ограничение по HLA типу.

Наиболее близким к предполагаемому является способ получения ДК и нагрузки их аутологичными апоптотическими опухолевыми клетками [N. Delirezh et al. Autologous dendritic cells loaded with apoptotic tumor cells induce Т cell-mediated immune responses against breast cancer in vitro. // Cellular Immunology - 2009 - №257 - p.23-31]. ДК получали из прилипшей фракции мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных с использованием lymphoprep (1.077 g/ml). Для получения незрелых ДК, прилипшая фракция МНК культивировалась в культуральной среде в присутствии гранулоцитарно -макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина 4 (ИЛ-4) в финальной концентрации 1000 ME/ml и 800 ME/ml соответственно. Среда менялась через день при повторном добавлении цитокинов. На 4 день в культуру незрелых ДК добавляли апоптотические опухолевые клетки в соотношении 1:1 и инкубировались в течение ночи. Апоптотические опухолевые клетки (ОК) получали из операционного материала опухоли, путем механического разделения на кусочки и ферментативного выделения клеток в течение ночи (37°С и 5% СO2) с последующим гамма-облучением суспензии клеток. Облученные ОК инкубировались в течение 48 часов в полной среде с добавлением 10% человеческой сыворотки и замораживались до дальнейшего использования. Для получения зрелых ДК, на 5 день в культуру незрелых ДК и апоптотических ОК добавляли 25% (по объему) кондиционной среды моноцитов и 10 нг/мл ФНО-alhpa. Антиген-активированные зрелые ДК получались на 7 день культивирования. Далее, для оценки способности антиген-активированных ДК стимулировать цитотоксический Т-клеточный ответ in vitro, проводилось сокультивирование аутологичных Т-клеток, выделенных с помощью магнитной сепарации, и антиген-нагруженных ДК в течение 19 дней. Повторная стимуляция Т-клеток осуществлялась каждые 2 недели. Среда заменялась каждые 3 дня с добавлением ИЛ-2 (20 IU/ml). Первая оценка цитотоксичности проводилась как минимум на 19 день после стимуляции Т-клеток антиген-активированными ДК. Уровень цитотоксичности против аутологичных опухолевых клеток варьировал от 21% до 65% (медиана 28±9.5%). Также, наблюдался лизис клеток опухолевой линии К562 от 5,2 до18% (медиана 7.1±2.6%). Однако он был значительно ниже, чем лизис аутологичных опухолевых клеток (р<0,05). Через 24 часа после последней (третьей) стимуляции собиралась кондиционная среда совместной культуры активированных ДК и Т-клеток для измерения уровня продукции ИЛ-4 и ИФН-gamma с помощью коммерческого набора ELISA. У всех 5 пациентов наблюдался разный уровень продукции данных цитокинов: двое из исследуемых пациентов секретировали высокий уровень ИФН-gamma по сравнению с ИЛ-4 (335±38 pg/ml против 29±8 pg/ml), а у троих был выше уровень ИЛ-4, чем ИФН-gamma (1393±1218 pg/ml против 90±81 pg/ml).

Описанный способ получения антиген-активированных дендритных клеток достаточно длителен (7 суток), требует использования большого количества рекомбинантных цитокинов (рчГМ-КСФ, рчИЛ-4, рчФНО-alpha, и рчИЛ-2), что ведет к значительному удорожанию технологии, так и обладает недостаточной цитотоксической и интерферон-продуцирующей активностью.

Новая техническая задача - повышение цитотоксической и интерферон продуцирующей активности антиген-активированных дендритных клеток, обладающих более высоким потенциалом цитотоксической активности для формирования эффективного противоопухолевого ответа против опухолевых клеток молочной железы при сокращении сроков культивирования.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем:

Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови больных раком молочной железы культивируют с антиген-активированными дендритными клетками, полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК. Антигенную активацию ДК проводят с помощью лизата аутологичных опухолевых клеток, а для созревания ДК используют рекомбинантный человеческий провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли (рчФНО-α). Для эффективной модуляции противоопухолевой защиты совместное культивировании зрелых антиген-активированных ДК и неприлипающей фракции МНК проводят в присутствии рекомбинантных человеческих интерлейкинов (рчИЛ-12 и рчИЛ-18), что позволяет повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток.

Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является:

- использование рчИЛ-12 и рчИЛ-18 при сокультивировании ДК и МНК, что повышает эффективность стимуляции и направленную дифференцировку наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа,

- применение протоколов активации и созревания ДК, включающих использование аутологичных опухолевых антигенов, что активирует ДК против собственных опухолевых антигенов, тем самым увеличивая цитотоксический ответ, а также сокращает стадию получения зрелых антиген-активированных ДК до 5 суток.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Выделенные из периферической крови больных раком молочной железы клетки прилипающей фракции мононуклеарных клеток культивируют в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×105 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СО2 при 37°С с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 48 часов культивирования к полученным незрелым ДК добавляют опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток) в дозе 100 мкг/мл, а еще через 48 часов для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносят рчФНО-α в дозе 25 нг/мл. Полученные дендритные клетки культивируют с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл.

Способность полученных антиген-активированных ДК стимулировать прямую цитотоксичность МНК оценивали по уровню гибели аутологичных опухолевых клеток, а также гибели клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы MCF-7. Для этого, полученные ДК совместно культивировали с неприлипшей фракцией МНК для праймирования опухолевых антигенов. Во все группы вносили аутологичные опухолевые клетки или клетки аденокарциномы молочной железы MCF-7 и оценивали их гибель по высвобождению внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы. Показано достоверное повышение значения цитотоксичности, что служит показателем активации противоопухолевых цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения опухолевых клеток (табл.1 и 2).

В Табл.1 приведены данные по цитотоксичности совместной культуры МНК больных раком молочной железы и аутологичных ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток, по отношению к аутологичным опухолевым клеткам (n=22). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

* Примечание:

МНК - контрольная культура МНК;

МНК+ДК 0 - совместная культура МНК и зрелых ДК, созревание которых происходило в отсутствие опухолевого антигена

МНК + ДК Lys - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клеток

+рчИЛ-12+рчИЛ18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18

* - статистически достоверные различия с группой МНК в соответствующей стимуляции

# - статистически достоверные различия с группой МНК+ДК 0 в соответствующей стимуляции

В Табл.2 приведены данные по цитотоксичности совместной культуры МНК больных раком молочной железы и аутологичных ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток, по отношению к опухолевой линии рака молочной железы MCF-7 (n=22). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

* Примечание:

МНК - контрольная культура МНК;

МНК+ДК 0 - совместная культура МНК и зрелых ДК, созревание которых происходило в отсутствие опухолевого антигена

МНК + ДК Lys - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клеток

+рчИЛ-12+рчИЛ18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18

* - статистически достоверные различия с группой МНК в соответствующей стимуляции

# - статистически достоверные различия с группой МНК+ДК 0 в соответствующей стимуляции

& - статистически достоверные различия с группой МНК+ДК Lys

При оценке цитотоксической активности совместной культуры МНК и антиген - активированных зрелых ДК были получены результаты, подтверждающие эффективность применения данного протокола для получения зрелых дендритных клеток, способных стимулировать цитотоксический потенциал МНК. Добавление в совместную культуру МНК и ДК стимулирующих цитокинов рчИЛ-12 и рчИЛ-18 является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их цитотоксического противоопухолевого ответа. Аналогичные результаты были получены при исследовании цитотоксического потенциала против клеточной линии рака молочной железы MCF-7, а именно добавление рекомбинантных цитокинов в совместную культуру антиген-нагруженных ДК и МНК статистически достоверно увеличивают цитотоксический ответ.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что использование рекомбинантных человеческих цитокинов (ИЛ-12 и ИЛ-18) статистически повышает цитотоксическую активность мононуклеарных клеток, как против аутологичных опухолевых клеток, так и против специфической клеточной линии аденокарциномы молочной железы, что свидетельствует об усилении индукции ответа Т хелперов 1 типа. При сравнении цитотоксического ответа против аутологичных ОК и клеток линии MCF-7 получены статистически достоверные различия в способности антиген-активированных ДК стимулироваться МНК как в спонтанных культурах (33,21±3,55% против 24,93±3,95%, соответственно, р<0,05), так и при стимуляции культуры клеток цитокинами (44,56±5,24% против 30,92±4,55, соответственно, р<0,05).

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-12, и рчИЛ-18 in vitro.

Для анализа антиген-специфической стимуляции иммунного ответа по Th1 типу, определяли содержание ИНФ-γ в кондиционной среде культуры МНК, сокультивированных с антиген - активированными дендритными клетками без добавления или с добавлением цитокинов, до и после дополнительной стимуляции опухолевыми антигенами. В табл.3 представлены результаты по продукции ИНФ-γ МНК пациентов с раком молочной железы, культивированных в разных условиях.

В Табл.3 приведены данные по продукции ИФН-гамма в совместной культуре МНК больных раком молочной железы и ДК, активированных лизатом аутологичных опухолевых клеток ДК (n=26). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

* Примечание:

МНК - контрольная культура МНК;

МНК+ДК(0) -совместная культура МНК и ДК без трансфекции;

МНК+ДК(Lys) - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клеток

+рчИЛ-12, +рчИЛ-18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18

+лизат - повторное добавление лизата в культуру МНК и ДК на 2 стуки после сокультивирования

* - статистически значимые различия

Под действием аутологичных антиген-активированных ДК больных раком молочной железы статистически достоверно повышается уровень продукции цитокина мононуклеарными клетками как в спонтанных культурах, так и при стимуляции ИЛ-12 и ИЛ-18 по сравнению с контрольными группами (МНК и МНК+ДК(0)). Добавление лизата в совместную культуру МНК и ДК не оказывает статистически значимого воздействия на продукцию ИФН-g.

Полученные данные по продукции иммунорегуляторного цитокина ИФН-g подтверждают результаты цитотоксического теста о возможности модуляции иммунного ответа с помощью разработанного протокола в сторону Th1-го типа.

Помимо Т-хелперов 1 типа, в развитие специфического противоопухолевого иммунного ответа принимают участие CD8+ цитотоксические лимфоциты. Доминирующим механизмом запуска цитотоксического ответа против поврежденных или измененных клеток является гранзим-опосредованный путь запуска апоптоза, который осуществляется двумя основными белками: порообразующим белком - перфорином, и основным цитотоксическим белком - гранзимом В [Rousalova I., Krepela E. Granzyme B-induced apoptosis in cancer cells and its regulation (Review). // International journal of oncology. - 2010. - №37. - P.1361-1378]. В исследованиях на мышах было показано, что отсутствие белка перфорина делает невозможным проникновение гранзима В в клетку и, соответственно, удаление поврежденных или измененных клеток. [Cullen SP, Brunet M, Martin SJ Granzymes in cancer and immunity. // Cell Death and Differentiation. - 2010. - №17. - P.616-623].

Для оценки потенциальной цитотоксической активности мононуклеарных клеток больных раком молочной железы, культивированных с антиген-стимулированными дендритными клетками определяли содержание внутриклеточного мономерного белка перфорина. (Табл.4).

На Фиг.4 приведены данные по содержанию перфорин-позитивных клеток в совместной культуре МНК и ДК, активированных лизатом аутологичных опухолевых клеток (n=26). Нагрузка осуществлялась на стадии незрелых ДК, совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

Примечание:

МНК - контрольная культура МНК;

МНК+ДК(0) - совместная культура МНК и ДК без трансфекции;

МНК+ДК(Lys) - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клеток

+рчИЛ-12, +рчИЛ-18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18

+лизат - повторное добавление лизата в культуру МНК и ДК на 2 стуки после сокультивирования

* - статистически значимые различия

Было показано, что добавление в совместную культуру МНК и антиген - активированных ДК рчИЛ-12 и рчИЛ-18 статистически достоверно увеличивает уровень продукции порообразующего белка перфорина при сравнении со всеми группами контроля (интактная группа МНК и группа МНК, культивированная совместно с ДК, созревание которых происходило в отсутствие антигена). При сокультивировании неприлипшей фракции МНК и антиген-нагруженных ДК в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18, повторное добавление лизата приводит к статистически достоверному увеличению внутриклеточной продукции перфорина по сравнению как с другими группами контроля (МНК и МНК+ДК(0) в аналогичной стимуляции), так и по сравнению с другими видами стимуляции совместной культуры МНК и антиген - активированных ДК.

Таким образом, совместное культивирование зрелых аутологичных антиген-активированных денритных клеток и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток совместно с рчИЛ-12 и рчИЛ-18, при повторном добавлении лизата или без него приводит к достоверному повышению содержания перфорин-позитивных клеток с более высокой потенциальной цитотоксической активностью.

В результате проведенных исследований была показана эффективность разработанного протокола генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных ДК и рчИЛ-12 и рчИЛ-18.

Приложение Таблица 1 Группы Уровень цитотоксичности, % МНК 23,08±3,75 МНК+рчИЛ-12+рчИЛ18 19,42±4,40 МНК+ДК0 27,75±3,41* МНК+ДК 0+рчИЛ-12+рчИЛ 18 24,98±4,41 МНК+ДК Lys 33,21±3,55* МНК + ДК Lys+рчИЛ-12+рчИЛ 18 44,56±5,24*#

Таблица 2 Группы Уровень цитотоксичности, % МНК 21,25±3,89 МНК+рчИЛ-12+рчИЛ 18 21,95±4,03 МНК+ДК0 16,70±3,11 МНК+ДК 0+рчИЛ-12+рчИЛ 18 17,55±2,62 MHK+AKLys 24,93±3,95# МНК + ДК Lys+рчИЛ-12+рчИЛ18 30,92±±4,55*#&

Таблица 3 Содержание ИФН-гамма, пг/мл МНК- МНК+ИЛ12, ИЛ18 МНК+лизат МНК+лизат, ИЛ12, ИЛ18 МНК+ДК(0) МНК+ДК(0)+ИЛ12, ИЛ18 МНК+ДК(0)+лизат МНК+ДК(0)-+лизат ИЛ12, ИЛ18 МНК+ДК(Lys) МНК+ДК(Lys)-+ИЛ12, ИЛ18 МНК+ДК(Lys МНК+ДК(Lys)+лизат, ИЛ12, ИЛ18 МНК 1,41±0,2 2 * * * * МНК+ ИЛ 12, ИЛ18 114,82±4 6,54 * * * МНК+ лизат 2,47±0,3 1 * * * МНК + лизат, ИЛ 12, ИЛ18 104,12±4 4,42 * * МНК+ДК(0) 10,23±5, 16 * * МНК+Д К(0)+ ИЛ 12, ИЛ18 175,39±6 0,48 * * МНК+ДК(0)+лизат 7,73±2,8 9 * * МНК+ДК(0) +
лизат, ИЛ12, ИЛ18
166,55±5 1,55 *
МНК+XK(Lys) 12,38±3, 96 * * МНК+ ДК(Lys)+И Л12,ИЛ18 262,89±7 6,25 МНК+ДК(Lys)+ лизат 16,35±5, 83 * МНК+ДК(Lys)+л изат,ИЛ12, ИЛ18 252,49±6 8,93

Таблица 4 Количест во перфорин-позитивных клеток, % МНК- МНК+ИЛ12, ИЛ18 МНК+лизат МНК+лизат, ИЛ12, ИЛ18 МНК+ДК(0) МНК+ДК(0)+ИЛ12, ИЛ18 МНК+ДК(0)+лизат МНК+ДК(0)-+лизат ИЛ12, ИЛ18 МНК+ДК(Lys) МНК+ДК(Lys)-+ИЛ12, ИЛ18 МНК+ДК(Lys)+лизат МНК+ДК(Lys)+лизат, ИЛ12, ИЛ18 МНК 2,53±0,70 МНК+ ИЛ12, ИЛ18 2,83±0,53 * МНК+, лизат 2,71±0,92 * МНК + лизат, ИЛ 12, ИЛ18 3,06±0,85 * МНК+ДК(0) 2,08±0,56 * * * МНК+ДК(0)+ ИЛ 12, ИЛ18 3,12±0,70 * МНК+ДК(0)+ лизат 2,19±0,39 * МНК+ ДК(0) + лизат, ИЛ 12, ИЛ18 3,82±1,02 * МНК+ДК(Lys) 3,24±0,56 * * МНК+ДК(Lys)+ИЛ12, ИЛ18 4,76±1,21 * * МНК+ДК(Lys)+ лизат 3,52±0,61 * МНК+ ДК(Lys)+ лизат ,И Л12, ИЛ18 5,46±0,86

Похожие патенты RU2521506C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК, ОБЛАДАЮЩИХ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 2013
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Шевченко Юлия Александровна
  • Хантакова Юлия Николаевна
  • Курилин Василий Васильевич
  • Лопатникова Юлия Анатольевна
  • Сидоров Сергей Васильевич
  • Зайцев Сергей Алексеевич
  • Максютов Амир Закиевич
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Максютов Ринат Амирович
RU2596920C2
СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2011
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Курилин Василий Васильевич
  • Облеухова Ирина Александровна
  • Лопатникова Юлия Анатольевна
  • Якушенко Елена Владимировна
  • Якушенко Владимир Константинович
RU2458985C1
СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК С АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ КЛЕТОК РАКА ЯИЧНИКА 2012
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Облеухова Ирина Александровна
  • Курилин Василий Васильевич
  • Красильников Сергей Эдуардович
  • Тархов Александр Валерьевич
  • Гончаров Максим Александрович
RU2508298C2
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ КЛЕТОК ОПУХОЛЕВОЙ ЛИНИИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИГЕНЫ, С ПОМОЩЬЮ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, ТРАНСФЕЦИРОВАННЫХ ПОЛИЭПИТОПНОЙ ДНК-КОНСТРУКЦИЕЙ 2012
  • Максютов Амир Закиевич
  • Максютов Ринат Амирович
  • Гаврилова Елена Васильевна
  • Зайцев Сергей Алексеевич
  • Лопатникова Юлия Анатольевна
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Курилин Василий Васильевич
RU2520091C2
СПОСОБ ИНДУКЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ИММУННОГО ОТВЕТА in vitro С ПОМОЩЬЮ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ РНК ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, ПРОТИВ КЛЕТОК НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО 2015
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Облеухова Ирина Александровна
  • Лопатникова Юлия Анатольевна
  • Вицин Александр Евгеньевич
  • Козлов Вадим Викторович
  • Кирюшина Наталья Анатольевна
RU2578008C1
Способ получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена 2016
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Лопатникова Юлия Анатольевна
  • Кузнецова Мария Сергеевна
  • Максютов Амир Закиевич
  • Хантакова Юлия Николаевна
  • Куликова Екатерина Владимировна
RU2619186C1
СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК С АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ КЛЕТОК НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО 2014
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Облеухова Ирина Александровна
  • Лопатникова Юлия Анатольевна
  • Вицин Александр Евгеньевич
  • Козлов Вадим Викторович
RU2577992C2
Способ иммунотерапии рака молочной железы с помощью антиген-активированных дендритных клеток 2016
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Шевченко Юлия Александровна
  • Курилин Василий Васильевич
  • Христин Александр Александрович
  • Блинова Дарья Дмитриевна
  • Старостина Наталья Михайловна
  • Сидоров Сергей Васильевич
RU2645464C1
Способ получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток с трансфекцией РНК опухолевых клеток рака молочной железы 2016
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Курилин Василий Васильевич
  • Шевченко Юлия Александровна
  • Христин Александр Александрович
  • Сидоров Сергей Васильевич
RU2631792C2
Способ получения антиген-специфических цитотоксических клеток, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого 2016
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Лопатникова Юлия Анатольевна
  • Облеухова Ирина Александровна
  • Кирюшина Наталья Анатольевна
  • Козлов Вадим Викторович
RU2639514C1

Реферат патента 2014 года СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы, и может быть использовано в медицине. Способ включает выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови пациента, разделение клеток на прилипающую и неприлипающую фракции, добавление к прилипающей фракции МНК ростовых факторов, нагрузку дендритных клеток антигенами опухолевого лизата in vitro, стимуляцию созревания дендритных клеток в течение последующих суток. При этом к полученным незрелым ДК добавляют лизат аутологичных опухолевых клеток в дозе 100 мкг/мл, а еще через 48 часов в течение последующих 24 часов вносят рчФНО-альфа в дозе 25 нг/мл. Затем проводят совместное культивирование зрелых активированных лизатом дендритных клеток и неприлипающей фракции МНК в соотношении 1:10 в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 в дозе 10 нг/мл и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 в дозе 100 нг/мл. Изобретение позволяет повысить уровень цитотоксической и интерферон-продуцирующей активности антиген-активированных дендритных клеток при сокращении сроков их культивирования. 4 табл.

Формула изобретения RU 2 521 506 C1

Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы, включающий выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови пациента, разделение клеток на прилипающую и неприлипающую фракции, добавление к прилипающей фракции МНК ростовых факторов, нагрузку дендритных клеток антигенами опухолевого лизата in vitro, стимуляцию созревания дендритных клеток в течение последующих суток, отличающийся тем, что проводят совместное культивирование зрелых дендритных клеток, активированных с помощью лизата аутологичных опухолевых клеток рака молочной железы, и неприлипающей фракции МНК в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18, при этом к полученным незрелым ДК добавляют лизат аутологичных опухолевых клеток в дозе 100 мкг/мл, а еще через 48 часов в течение последующих 24 часов вносят рчФНО-α в дозе 25 нг/мл, после этого полученные дендритные клетки культивируют с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2014 года RU2521506C1

СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2011
  • Сенников Сергей Витальевич
  • Курилин Василий Васильевич
  • Облеухова Ирина Александровна
  • Лопатникова Юлия Анатольевна
  • Якушенко Елена Владимировна
  • Якушенко Владимир Константинович
RU2458985C1
BAI L
et al., Dendritic Cells pulsed with viral oncolysates potently stimulate autologous T cells from cancer patients, Intern
Journ
Of Oncology, 2002, v.21, n.4, p
Катодный усилитель с питанием усилительной лампы переменным током 1923
  • Минц А.Л.
SU685A1
WO 2011110953 A2, 15.09.2011
КУРИЛИН В.В
и др., Модуляция цитотоксического противоопухолевого ответа в культуре мононуклеарных клеток с помощью

RU 2 521 506 C1

Авторы

Сенников Сергей Витальевич

Шевченко Юлия Александровна

Хантакова Юлия Николаевна

Курилин Василий Васильевич

Лопатникова Юлия Анатольевна

Сидоров Сергей Васильевич

Волгушев Сергей Анатольевич

Оглоблин Владимир Петрович

Ефимова Лина Викторовна

Теплова Надежда Вениаминовна

Даты

2014-06-27Публикация

2013-04-01Подача