Способ получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена Российский патент 2017 года по МПК C12N5/783 C12N5/784 C12N5/786 C12N15/11 C12N15/86 

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена.

В структуре смертности населения России злокачественные новообразования занимают второе место (15,4%) после болезней системы кровообращения. Ведущими локализациями злокачественных опухолей у обоих полов являются кожа (12,3%, с меланомой - 14,0%), молочная железа (11,4%), трахея, бронхи, легкое (10,5%), желудок (7,0%). При этом, ведущей онкологической патологией у женского населения является рак молочной железы (20,9%), уровень смертности от которого занимает первое место (17,0%) [Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Злокачественные новообразования в России в 2013 году (заболеваемость и смертность) М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России. - 2015. илл. 250 с. ISBN 978-5-85502-205-6].

Общепринятыми методами лечения рака на сегодняшний день являются хирургия, лучевая терапия и химиотерапия. Использование данных методов позволяет эффективно снижать опухолевую нагрузку за короткий период времени, но не дает возможности элиминировать все опухолевые клетки, диссеминированные в организме пациента. Минимальная опухолевая нагрузка, сохраняющаяся после удаления основной части новообразования, является причиной возникновения рецидивов опухоли и развития метастазов, что в свою очередь приводит к повышению уровня смертности и инвалидизации пациентов с онкологическими заболеваниями.

Таким образом, традиционные подходы к лечению рака обнаруживают недостатки в вопросе устранения минимальной опухолевой нагрузки, и становится очевидной необходимость появления новых технологий, направленных на улучшение процессов распознавания и уничтожения единичных опухолевых клеток, оставшихся в организме пациента после проведения лучевой терапии, химиотерапии или хирургического удаления основной массы опухоли.

Фундаментальные и клинические исследования последних лет подтверждают, что использование потенциала иммунной системы может быть весьма перспективным для устранения опухолевых клеток [Palucka K., Ueno Н., Banchereau J. Recent developments in cancer vaccines. // J Immunol. - 2011. - Vol. 186. - №3. - P. 1325-31; Qian X., Wang X., Jin H. Cell transfer therapy for cancer: past, present, and future. // J Immunol Res. - 2014. doi: 10.1155/2014/525913]. Иммунотерапевтические подходы позволяют активировать клеточное звено иммунитета, нацеливая специфический иммунный ответ против опухолевых клеток, несущих на своей поверхности опухолевые антигены. Ввиду вышесказанного целесообразна разработка подходов, позволяющих эффективно генерировать специфический противоопухолевый иммунный ответ в организме пациента.

Основную роль в развитии специфического противоопухолевого иммунного ответа играют цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты. Наличие противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), как в отношении их количества, так и нормального функционирования, является необходимым условием для уничтожения опухолевых клеток иммунной системой [Aerts J., Hegmans J. Tumor-specific cytotoxic T cells are crucial for efficacy of immunomodulatory antibodies in patients with lung cancer. // Cancer Res. - 2013. - Vol. 73. - P. 2381-2388]. Иммунотерапевтические подходы, направленные на борьбу с конкретными опухоль-ассоциированными антигенами, также используют активированные антигенспецифические цитотоксические CD8+ Т-клетки в качестве главного противоопухолевого агента.

Известен способ проведения адоптивной иммунотерапии приматам путем введения обогащенных популяций CD8-позитивных цитотоксических Т-лимфоцитов, включающий стадию in vitro получения активированных антигенспецифических Т-лимфоцитов. На стадии in vitro выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК), производят сортировку популяций CD8+CD62L+ CD8+CD62L- Т-лимфоцитов, культивируют отсортированные фракции CD62L+CD8+ и CD8+CD62L- Т-клеток в среде RPMI 1640, дополненной 25 мМ HEPES, 10% человеческой АВ сыворотки, 25 мкМ 2-меркаптоэтанола, и 4 мм L-глутамина, совместно с аутологичными моноцитами в присутствии пептидов антигена, который может быть опухолевым или вирусным антигеном, добавляют интерлейкин-2 (ИЛ-2) на 3-й день культивирования, и затем производят обогащение клонов Т-клеток путем культивирования в 96-луночных круглодонных планшетах на слое фидерных клеток, а именно γ-облученных аутологичных МНК ПК и γ-облученных В-лимфобластоидных клеток, в присутствии ИЛ-2. Способ включает добавление моноклональных антител анти-CD3 и анти-CD28 для обогащения популяций CD8+ ЦТЛ в присутствии фидерного слоя клеток (US 2014356398, A61K 35/17, C12N 15/85, опубл. 04.12.2014).

Недостатком способа является использование аутологичных моноцитов периферической крови в качестве антиген-презентирующих клеток для захвата, обработки и представления антигенного пептида Т-лимфоцитам, без предварительной стимуляции дифференцировки моноцитов в зрелые дендритные клетки (ДК). Моноциты обладают высокой способностью к фагоцитозу, но не способны к эффективному представлению антигенов CD8+ Т-лимфоцитам в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости - major histocompatibility complex (МНС) I класса. Кроме того, недостаточный уровень сигнала от костимуляторных молекул, в норме обеспечиваемый зрелыми ДК в момент презентации антигена Т-лимфоцитам, может привести к нарушению процесса активации Т-лимфоцитов и нарушению их функциональных свойств [Wood K., Bushell A., Hester J. Regulatory immune cells in transplantation. // Nat Rev Immunol. 2012. - Vol. 12. - №6. - Р. 417-30]. Еще одним недостатком способа является тот факт, что сортировка и обогащение CD8+CD62L+ и CD8+CD62L- Т-лимфоцитов с использованием применяемых стимуляторных факторов не обеспечивает получение чистых популяций ЦТЛ, обладающих необходимой антигенной специфичностью. Конечная культура клеток, полученная таким способом, может содержать недостаточное количество эффекторных ЦТЛ, специфичных к антигенам, использовавшимся для активации МНК.

Известен способ получения активированных МНК с противоопухолевой активностью для клеточной иммунотерапии, включающий в себя выделение МНК ПК, культивирование их в среде AIM-V в присутствии пептидной композиции, интерлейкина-2 и антител анти-CD3 (CN 102643783, A61K 35/14, опубл. 22.08.2012).

Недостатком способа является отсутствие этапа генерации антиген-презентирующих клеток из используемых МНК для эффективного представления антигена эффекторным Т-клеткам, а также отсутствие этапа выделения популяций CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов. Эффективность функций ЦТЛ в смешанной культуре может быть снижена в результате супрессивного влияния клеточного окружения, а именно, популяций Т-регуляторных клеток и выделяемых ими факторов [Wood K., Bushell A., Hester J. Regulatory immune cells in transplantation. // Nat Rev Immunol. 2012. - Vol. 12. - №6. - Р. 417-30]. Кроме того, необходимо учитывать низкое содержание клеток-эффекторов, специфичных к выбранному антигенному пептиду, в смешанной культуре МНК, что также может влиять на отсутствие выраженного цитотоксического эффекта.

Известен также способ получения антигенспецифических Т-лимфоцитов, представляющий собой закрытую систему культивирования клеток в стерильных емкостях, включающий выделение МНК из периферической крови, несколько раундов культивирования их в среде, содержащей антигенный пептид, культивирование антигенспецифических Т-лимфоцитов фракции МНК в присутствии антитела anti-CD3 и несколько раундов культивирования активированных МНК в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-15 (US 2014127805, C12N 5/0783, опубл. 08.05.2014).

Недостатком описанного способа также является отсутствие предварительного этапа получения профессиональных антиген-презентирующих клеток перед добавлением антигенного пептида к культуре МНК, что существенно снижает эффективность процессов обработки и презентации антигена цитотоксическим Т-лимфоцитам и активации данных клеток.

Известен способ обогащения опухоль-реактивных CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоцитов для иммунотерапии пациентов с онкологическими заболеваниями. Способ включает в себя стадии стимуляции CD4+ Т-хелперов 1 типа (Th1) и/или CD8+ Т-лимфоцитов с помощью добавления антиген-презентирующих клеток, представляющих собой аутологичные лейкоциты, содержащие В-лимфоциты или моноциты, и антигена опухолевого происхождения, при этом в качестве антигена используется денатурированный гомогенат опухоли или аутологичный опухолевый антиген. Способ включает в себя несколько этапов культивирования клеток в присутствии, по меньшей мере, одного вещества, имеющего агонистическую активность по отношению к рецептору ИЛ-2, несколько раундов подавления экспрессии мембранных молекул CD25 на поверхности CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоцитов с повторным добавлением антигена опухолевого происхождения для активации опухоль-реактивных CD25-негативных Т-лимфоцитов, а также стимуляцию, по меньшей мере, одним веществом, способным усиливать экспрессию рецептора к интерлейкину-12 (ИЛ-12R) на Т-лимфоцитах, одним или более веществами, способными нейтрализовать ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, и/или TGF-β, подавляя развитие Т-лимфоцитов типа Th2. Способ включает также добавление одного или более веществ, способствующих развитию Т-лимфоцитов типа Th1 и/или цитотоксических Т-лимфоцитов, выбирая из следующих цитокинов: ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-15 и ИЛ-21. При этом получаемые Т-лимфоциты являются производными от клеток лимфатических узлов, дренирующих первичную опухоль или метастаз, или от лейкоцитов периферической крови. Особенностью описанного способа является то, что производится обогащение не только эффекторного пула опухоль-реактивных Т-лимфоцитов, но и Т-хелперных клеток 1 типа. В способе отсутствует этап выделения популяций опухоль-реактивных Т-клеток из совместной культуры лейкоцитов. Это существенно снижает относительное содержание эффекторных Т-лимфоцитов, специфичных к опухолевым антигенам, в культуре клеток, предназначенной для адоптивного переноса пациенту (US 2009297489, A61K 35/12, опубл. 03.12.2009).

Недостатком способа является использование аутологичного опухолевого материала для антигенной активации лейкоцитов, поскольку зачастую невозможно получить необходимое количество опухолевой ткани для приготовления гомогената ввиду ее труднодоступности, недостаточности размеров операционного материала или неоперабельности пациента. Кроме того, в опухолевом материале может присутствовать широкий спектр опухолевых белков, способных оказывать супрессивный эффект на иммунные клетки. Указанный недостаток устраняется при использовании ДНК-конструкции в качестве источника опухолевых антигенов для активации ДК, что позволяет оптимизировать технологию антигенной активации антиген-презентирующих клеток с возможностью использования ее для всех пациентов. Также недостатком способа является использование моноцитов и В-лимфоцитов крови для обработки и представления опухолевого антигена Т-лимфоцитам, без использования этапа получения антиген-активированных ДК из моноцитов периферической крови. Моноциты, как известно, не являются профессиональными антиген-представляющими клетками. Показано также, что В-лимфоциты, будучи антиген-презентирующими клетками, тем не менее, выполняют данную функцию менее эффективно по сравнению с ДК, и, кроме того, представляют антигены преимущественно CD4+ Т-хелперным клеткам в комплексе с МНС II класса [Chappell С., Giltiay N., Dresch С., Clark Е. Controlling immune responses by targeting antigens to dendritic cell subsets and В cells. // Int Immunol. - 2014. - Vol. 26(1). P. 3-11]. Наиболее мощными антиген-презентирующими клетками считаются ДК, благодаря своей способности эффективно представлять вирусные и опухолевые антигены цитотоксическим Т-лимфоцитам. Показано, что зрелые ДК приобретают способность более эффективно, чем другие антиген-презентирующие клетки, стимулировать дифференцировку и пролиферацию Т-клеток [Kadowaki N., Но S., Antonenko S. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. // J Exp Med. - 2001. - Vol. 194. - P. 863-869.; Jong, de E., Smits H., Kapsenberg M. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin ImmunopathoL - 2005. - Vol. 26. - №3. - P. 289-307].

Однако в периферической крови человека ДК составляют лишь около 0,2% от общего количества циркулирующих лейкоцитов, в связи с чем в большинстве современных работ для антигенной активации Т-лимфоцитов, как правило, используются ДК, полученные из моноцитов в условиях in vitro [Gelao L., Criscitiello С., Esposito A. et al. Dendritic cell-based vaccines: clinical applications in breast cancer. // Immunotherapy. - 2014. - Vol. 6. - №3. - P. 349-60].

Известен способ получения антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, включающий в себя этапы конструирования рекомбинантного вектора, несущего ген опухолевого антигена, выделения и культивирования ДК, трансфекции полученных незрелых ДК с использованием сконструированного на первом шаге рекомбинантного вектора, стимуляции незрелых ДК цитокинами для получения зрелых ДК и сокультивирования зрелых ДК с Т-лимфоцитами, для получения антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (CN 104004712, C12N 15/867, C12N 5/0783, опубл. 27.08.2014). В описанном способе для трансдукции предпочтительно используется лентивирусный вектор, кодирующий три опухолевых антигена - СЕА, MAGE-А3 и MUC1, для получения активированных и пролиферирующих противоопухолевых Т-клеток, специфичных к данным антигенам. Особенностью данного способа по сравнению с описанными выше способами является наличие этапа получения зрелых антиген-активированных ДК из моноцитов периферической крови и последующего "обучения" Т-лимфоцитов, что существенно увеличивает эффективность процесса активации антигенспецифических CD8+ ЦТЛ. Причем, для антигенной активации незрелые ДК подвергаются трансдукции лентивирусным вектором, кодирующим опухолевый антиген, после чего ДК подвергаются стимулированному созреванию с использованием молекул ФНО-α и ИФН-γ.

Недостатком данного способа является использование вирусной трансфекции и отсутствие этапа выделения популяций антигенспецифических ЦТЛ из совместной культуры МНК и ДК, в результате чего итоговая культура активированных антигенспецифических клеток содержит в себе все разнообразие популяций мононуклеарных клеток периферической крови. Эффективность функций ЦТЛ культуре клеток, получаемой таким способом, может быть снижена в результате влияния клеточного окружения и выделяемых им факторов.

Основной недостаток всех перечисленных способов получения антигенспецифических ЦТЛ заключается в том, что относительное содержание антигенспецифических CD8 + ЦТЛ в смешанной культуре мононуклеарных клеток невелико, что снижает общий уровень цитотоксического эффекта полученной культуры клеток против клеток, несущих опухолевые антигены.

Известен способ получения HLA-А0201-рестриктированных цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к вирусу папилломы человека (human papilloma virus, HPV). Данный способ направлен на получение Т-лимфоцитов, специфичных к вирусному, а не опухолевому антигену. Способ включает в себя следующие этапы: сбор мононуклеарных клеток периферической крови с помощью афереза, выделение и обогащение CD8+ Т-лимфоцитов, стимуляция CD8+ Т-лимфоцитов с помощью зрелых ДК, активированных HLA-А0201-рестриктированным полипептидом антигена ВПЧ, и стимулирование роста Т-клеток с помощью использования комбинаций цитокинов ИЛ-2 и ИЛ-7, выделение целевых ЦТЛ с помощью окрашивания тетрамерами и сортировки методом проточной цитометрии, стимуляция роста целевых ЦТЛ с помощью моноклональных антител к человеческому CD3 и ИЛ-2 сорбированных на пластике, добавление аутологичных гамма-облученных МНК ПК в качестве фидерных клеток для усиления пролиферации ЦТЛ и культивирование в присутствии ИЛ-15, а также сбор и идентификация полученных ЦТЛ (CN 102719402, C12N 5/0783, опубл. 10.10.2012).

К недостаткам способа относится использование антигенного пептида для активации зрелых ДК, поскольку зрелые ДК характеризуются сниженной способностью к захвату, процессингу и представлению антигена [Kadowaki N., Но S., Antonenko S. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different tolllike receptors and respond to different microbial antigens. // J Exp Med. - 2001. - Vol. 194. - P. 863-869.; Jong, de E., Smits H., Kapsenberg M. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin Immunopathol. - 2005. - Vol. 26. - №3. - P. 289-307]. Кроме того ограничение использования пептида для антигенной активации ДК заключается в том, что пептид способен легко отделяться от молекул МНС [Mitchell D., Nair S. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. // J Clin Invest. - 2000. - Vol. 106. - №9. - P. 1065-9], вследствие чего нарушается способность ДК представлять антиген Т-лимфоцитам.

Другим недостатком является необратимость окрашивания Т-лимфоцитов тетрамерами, что приводит к нарушениям в функциональной активности и жизнеспособности выделенных клеток, в связи с длительной активацией Т-клеточных рецепторов (ТКР). [Wang X., Pang Н., Xu X. et al. Streptamer versus tetramer-based selection of functional cytomegalovirus-specific T cells. // J Formos Med Assoc. 2013. - Vol. 112. - №6. P. 338-45]. Кроме того, недостатком является использование тетрамеров для выделения популяций антигенспецифических Т-лимфоцитов, так как сконструированные молекулы тетрамеров содержат в своем составе молекулы стрептавидина, которые не допускаются к использованию в клинической практике для введения пациентам. [Wang X., Pang Н., Xu X. et al. Streptamer versus tetramer-based selection of functional cytomegalovirus-specific T cells. // J Formos Med Assoc. 2013. - Vol. 112. - №6. P. 338-45].

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения in vitro HLA-А0201-рестриктированных цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к раково-эмбриональному антигену (carcinoembryonic antigen, СЕА), включающий получение прилипающей и неприлипающей фракции МНК, выделенных из периферической крови человека, получение ДК путем стимуляции их дифференцировки из прилипающей фракции МНК и антигенную активацию полученных зрелых ДК опухоль-ассоциированным антигеном, совместное культивирование клеток из неприлипающей фракции с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции, последующее выделение фракции антигенспецифических Т-лимфоцитов с помощью окрашивания антигенспецифическими реагентами, стимуляцию роста выделенных ЦТЛ с использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рчИЛ-2), интерлейкина-7 (рчИЛ-7) и интерлейкина-15 (рчИЛ-15).

Зрелые ДК получали из клеток прилипающей фракции МНК периферической крови посредством культивирования их в среде RPMI-1640 с добавлением активированной человеческой сыворотки АВ, в присутствии цитокинов ГМ-КСФ и ИФН-α в течение 3 дней. К полученной культуре зрелых ДК добавляли антигенный полипептид CEA_691-699 и инкубировали во влажной атмосфере при 37°С и содержании CO₂ 5% в течение 2 часов, после чего дважды отмывали в среде RPMI-1640. Из клеток неприлипающей фракции МНК ПК выделяли CD8+ Т-лимфоциты, и стимулировали их активацию и пролиферацию путем совместного культивирования CD8+-T лимфоцитов, выделенных из неприлипающей фракции МНК, со зрелыми аутологичными ДК, активированными HLA-A0201-рестриктированным полипептидом антигена СЕА, в соотношении CD8+ T-лимфоцитов к ДК, составляющем 5:1, соответственно, и при одновременном добавлении в совместную культуру цитокинов ИЛ-2 (до конечной концентрации 500-750 МЕ/мл) и ИЛ-7 (до конечной концентрации 50-75 нг/мл), участвующих в стимуляции Т-клеточного роста, для продлевания времени жизни активированных Т-лимфоцитов и генерации Т-клеток памяти. Культуру ДК и CD8+ Т-лимфоцитов стимулировали указанными цитокинами в течение 14 суток. Затем популяции ЦТЛ, специфичные к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена СЕА, выделяли из совместной культуры с использованием метода необратимого окрашивания антиген-специфичных клеток тетрамерами и сортировки окрашенных клеток методом проточной цитометрии. Затем производили стимуляцию выделенных СЕА-специфичных Т-клеток с помощью твердофазных моноклональных антител к человеческому CD3 и ИЛ-2 в конечной концентрации 500 МЕ/мл, а также добавляют аутологичные гамма-облученные МНК ПК в качестве фидерных клеток для усиления активации деления ЦТЛ. Одновременно с культивированием в присутствии фидерных клеток добавляли ИЛ-15 в конечной концентрации 100-250 нг/мл (CN 102719400, C12N 5/0783, опубл. 10.10.2012).

На основе указанных в патенте данных, полученных в результате анализа СЕА-специфичных Т-лимфоцитов, сделан вывод о высоких показателях чистоты получаемой популяции (более 95% CD8+ СЕА-специфичных Т-лимфоцитов). Анализ цитотоксичности полученных СЕА-специфичных ЦТЛ против клеток-мишеней, проведенный с помощью МТТ-теста, показал уровень цитотоксического эффекта, достигающий значения 20,5% при соотношении полученных ЦТЛ к клеткам-мишеням 10:1.

Описанный способ характеризуется использованием антигенного пептида СЕА для антигенной активации ДК. В научной литературе существует несколько аргументов против использования пептида в качестве способа активации ДК, в числе которых тот факт, что ДК, активированные пептидом, представляют антиген на своей поверхности лишь на короткий период времени [Schuurhuis D., Verdijk P., Schreibelt G. et. al. In situ expression of tumor antigens by messenger RNA-electroporated dendritic cells in lymph nodes of melanoma patients. // Cancer Res. - 2009. - Vol. 69. - №7. - P. 2927-34], поскольку пептид способен легко отделяться от молекул МНС [Mitchell D., Nair S. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. // J Clin Invest. - 2000. - Vol. 106. - №9. - P. 1065-9].

В описанном способе пептид добавляется к культуре зрелых ДК. Известно, что функциональные изменения зрелых ДК по сравнению с незрелыми ДК заключаются в снижении способности к фагоцитозу, обработке и представлению антигенов [Kadowaki N., Но S., Antonenko S. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. // J Exp Med. - 2001. - Vol. 194. - P. 863-869.; Jong, de E., Smits H., Kapsenberg M. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin ImmunopathoL - 2005. - Vol. 26. - №3. - P. 289-307]. Таким образом, способ имеет недостаток, заключающийся в том, что антигенная активация посредством добавления пептида на стадии зрелых ДК приводит к ухудшению эффективности захвата, процессинга и представления антигена дендритными клетками, что может стать причиной нарушения процесса активации цитотоксических Т-лимфоцитов.

Еще одной особенностью данного способа является наличие двух этапов стимуляции целевых клеток, включающих использование комбинаций ИЛ-2 и ИЛ-7 на первом этапе и ИЛ-2 совместно с ИЛ-15, а также антител anti-CD3 и культивирование на фидерном слое гамма-облученных МНК ПК на втором этапе обогащения СЕА-специфичных ЦТЛ. Таким образом, в данном способе существенно усложнена стадия наработки антигенспецифических Т-лифмоцитов, что приводит к значительному удорожанию и большим затратам времени.

Недостатком способа является также использование тетрамеров для окрашивания и выделения популяций СЕА-специфичных Т-лимфоцитов. Тетрамеры, как и другие мультимеры, представляют собой естественный лиганд, связывающийся с ТКР, что приводит к функциональным изменениям очищенных популяций клеток, таких как интернализация, активация и сверхстимуляция ТКР, а также клеточная гибель. Кроме того, препараты, содержащие стрептавидин, входящий в состав молекул тетрамеров, или его производные, являются недопустимыми для введения пациентам в клинической практике. Эта неизбежная проблема технологии окрашивания МНС мультимерами существенно ограничивает применение технологии, как для фундаментальных исследований Т-лимфоцитов, так и для клинических.

Все вышеназванные недостатки снижают эффективность генерации in vitro популяций антигенспецифических цитотоксических Т-клеток с активностью против опухолевых клеток.

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена.

Поставленная задача решается предложенным способом получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена, включающем получение прилипающей и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови человека, получение дендритных клеток (ДК) путем стимуляции их дифференцировки из прилипающей фракции МНК и антигенную активацию полученных зрелых ДК опухоль-ассоциированным антигеном, совместное культивирование клеток из неприлипающей фракции с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции, последующее выделение фракции антигенспецифических Т-лимфоцитов с помощью окрашивания антигенспецифическими реагентами, стимуляцию роста выделенных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) с использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рчИЛ-2), интерлейкина-7 (рчИЛ-7) и интерлейкина-15 (рчИЛ-15), в котором антигенную активацию полученных зрелых ДК осуществляют с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместному культивированию с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции подвергают все клетки неприлипающей фракции МНК, далее из совместной культуры ДК и МНК выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV белка HER2 методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток, а после выделения HER2-специфических ЦТЛ производят стимуляцию их пролиферации посредством культивирования в присутствии внесенных одновременно цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7, рчИЛ-15 в течение 14-20 суток, причем конечная концентрация каждого из цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 составляет 50 нг/мл.

В качестве окрашивающего антигенспецифического реагента используют стрептамеры.

В отличие от использования пептида, антигенная активация полученных зрелых ДК с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного антигена HER2, обеспечивает более прочное и длительное взаимодействие молекул МНС с эксперессируемыми антигенными эпитопами, что позволяет улучшать процесс представления антигена Т-лимфоцитам дендритными клетками, что, в свою очередь, повышает эффективность генерации антигенспецифических Т-лимфоцитов in vitro.

Следует подчеркнуть, что опухоль-ассоциированный антиген HER2 (human epidermal growth factor receptor-2, Her-2/neu, HER2), кодируемый геном ErbB2, относится к семейству эпидермальных факторов роста и его эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV описаны в научной литературе как наиболее иммуногенные эпитопы. Гиперэкспрессией HER2 характеризуются разновидности злокачественных карцином молочной железы, яичника, желудка, поджелудочной железы, колоректального рака и рака эндометрия. Гиперэкспрессия рецептора или амплификация онкогена HER2 ассоциированы с наиболее агрессивным фенотипом опухоли, более коротким периодом до рецидива после первичного лечения [Subbiah, I.M., Gonzalez-Angulo, A.M. Advances and Future Directions in the Targeting of HER2-positive Breast Cancer: Implications for the Future. // Curr Treat Options Oncol. - 2013. - Vol. 2]. Показано, что HER-2 является патологическим биомаркером, отличающим раковые клетки молочной железы от неопухолевых, так как экспрессия белка HER2 на поверхности клеток HER2-гиперэкспрессирующего рака молочной железы может в 50-100 раз превышать экспрессию этого белка в нормальных клетках [Dev K., Ak М., Husain Е. Immunohistochemical expression of Her-2/neu and its correlation with histological grades and age in IDC of breast. // 2013. - Vol. 3. - №3. - P. 230-247]. Данный факт сделал рецептор Her-2/neu идеальной мишенью для терапии против HER2-гиперэкспрессирующих опухолей молочной железы. Показана также перспективность использования данного антигена в качестве мишени для терапии других злокачественных карцином с гиперэкспрессией HER2 [Eroglu Z., Tagawa Т., Somlo G. Human epidermal growth factor receptor family-targeted therapies in the treatment of HER2-overexpressingbreast cancer. // Oncologist. - 2014. - Vol. 19. - №2. - P. 135-50].

Совместное культивирование всех клеток неприлипающей фракции МНК с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции по сравнению с использованием чистой популяции CD8+ Т-лимфоцитов, повышает эффективность предложенного способа за счет того, что в момент представления антигена дендритными клетками для полноценной активации цитотоксических Т-лимфоцитов дополнительный костимуляторный сигнал от клеточного окружения, включающего в себя Т-хелперные клетки и другие иммунокомпетентные клетки, выделяющие ряд стимуляторных цитокинов, усиливает активацию ЦТЛ.

Выделение из совместной культуры ДК и МНК цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV антигена HER2 осуществляют методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток, в частности стрептамеров. При использовании стрептамеров - реагенты окрашивания удаляются с мембран клеток, в связи с чем отсутствует негативное влияние на функциональное состояние клеток, заключающееся в чрезмерном, длительном связывании лиганда с поверхностными рецепторами Т-клеток. В результате длительного взаимодействия ТКР с тетрамерами происходит интернализация Т-клеточных рецепторов, в связи с чем меченные тетрамерами Т-лимфоциты существенно снижают свою способность распознавать клетки-мишени и реализовывать свои эффекторные функции. Кроме того, стрептамеры, в отличие от тетрамеров, не имеют в своем составе стрептавидин, который недопустим для использования в клинической практике. Использование обратимого окрашивания для выделения HER2-специфических ЦТЛ резко повышает эффективность способа в целом.

Проведение стимуляции пролиферации выделенных HER2-специфических ЦТЛ производят в один этап, заключающийся в их культивировании в присутствии внесенных одновременно цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7, рчИЛ-15 в течение 14-20 суток, причем конечная концентрация каждого из цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 составляет 50 нг/мл. Одновременность использования цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 позволяет добиться синергидного стимуляторного действия на Т-клеточный рост. Тем самым, повышается эффективность стимуляции пролиферации ЦТЛ, обеспечивается увеличение времени сохранения жизнеспособности данных клеток.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделенные из периферической крови мононуклеарные клетки прилипающей фракции культивируются в концентрации 1 млн/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10^-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO₂ при 37°C с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через трое суток культивирования для созревания незрелых ДК вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл, а еще через сутки полученные зрелые ДК трансфицируют методом магнитной трансфекции ДНК-конструкцией, кодирующей 2 эпитопа опухоль-ассоциированного антигена Her-2/neu, описанные в научной литературе как наиболее иммуногенные эпитопы данного белка (эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV). На следующие сутки для активации HER2-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов полученные трансфицированные ДК подвергают совместному культивированию с неприлипшей фракцией МНК в соотношении 1:10. Через 4 суток совместного культивирования из совместной культуры мононуклеарных и дендритных клеток выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV белка HER2, с помощью магнитной сепарации по технологии стрептамеров Выделенные HER2-специфичные Т-лимфоциты культивируют в присутствии цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15, в конечной концентрации каждого цитокина, составляющей 50 нг/мл, в течение 14-20 суток, для стимуляции пролиферации ЦТЛ и наработки достаточного количества эффекторных клеток. Смена среды с указанными цитокинами производится через каждые 3-4 дня культивирования. По окончании этапа обогащения популяции HER2-специфичных клеток производится анализ цитотоксической эффективности полученной культуры против клеток, экспрессирующих целевые антигены.

После культивирования выделенной фракции антигенспецифических Т-клеток в присутствии цитокинов обогащенные популяции ЦТЛ оценивали методом проточной цитофлуориметрии на содержание CD8-положительных клеток. Анализ показал, что фракция HER2-специфических Т-лимфоцитов содержит не менее 90% клеток, экспрессирующих маркер CD8+, и не менее 75% клеток, экспрессирующих Т-клеточный рецептор, распознающий эпитопы белка HER2, что свидетельствует о высоком уровне чистоты культуры HER2-специфичных Т-лимфоцитов (рис. 1).

Для стимуляции пролиферации выделенных HER2-специфичных ЦТЛ были подобраны условия культивирования, определяющие оптимальное соотношение иммуномодулирующих цитокинов, которые, согласно сведениям из научной литературы, являются необходимыми молекулами для активации роста и поддержания жизнеспособности цитотоксических Т-лимфоцитов. В результате было показано, что наибольшей эффективностью в стимуляции пролиферативной активности культуры CD8+ лимфоцитов обладает коктейль из трех иммуностимулирующих цитокинов ИЛ-2, ИЛ-7 и ИЛ-15 в дозах по 50 нг/мл каждого.

Анализ цитотоксического потенциала HER2-специфичных Т-клеток проводился следующим образом. Полученные HER2-специфичные Т-лимфоциты подвергали совместному культивированию с клетками опухолевой линии MCF-7, экспрессирующими рецептор HER2, прижизненно помеченными флуорохромом CFSE до процедуры совместного культивирования. Для совместного культивирования использовали соотношение HER2-специфичных ЦТЛ к клеткам линии MCF-7, равное 10:1, соответственно. Спустя 2 суток совместного культивирования клеток-мишеней и клеток-эффекторов проводился анализ цитотоксического эффекта с помощью оценки относительного количества поврежденных опухолевых клеток в совместной культуре методом проточной цитометрии. В качестве контроля цитотоксичности использовалась совместная культура МНК и ДК, трансфицированных плазмидой, кодирующей эпитопы белка HER2 (рис. 2). Кроме того, был поставлен контроль на спонтанную гибель клеток-мишеней (рис. 2).

Анализ данных, полученных в результате экспериментов по оценке цитотоксичности HER2-специфических Т-лимфоцитов от 6 доноров, показал, что относительное количество поврежденных опухолевых клеток в опытных пробах, состоящих из HER2-специфичных Т-лимфоцитов и клеток линии MCF-7, составило в среднем 65,5% от общего числа опухолевых клеток в пробе.

Результаты эксперимента показали также, что популяция антигенспецифических клеток оказывает более выраженный цитотоксический эффект на опухолевые клетки, по сравнению со смешанной культурой мононуклеарных клеток, активированных ДК, трансфицированными ДНК-конструкцией, кодирующей эпитопы белка HER2.

Полученные данные о цитотоксическом потенциале антигенспецифических противоопухолевых ЦТЛ значительно превышают значения уровня цитотоксичности, приводимые в прототипе (20,5% против 65,5%).

В ходе эксперимента показано, что разработанный способ получения популяций HER2-специфических Т-лимфоцитов с использованием дендритных клеток, трансфицированных ДНК-конструкцией, кодирующей эпитопы белка HER2 и наличием этапа выделения и обогащения популяций ЦТЛ, специфичных к данным эпитопам, позволяет получать антигенспецифические клетки, оказывающие на опухолевые клетки значительно более выраженный цитотоксический эффект по сравнению со смешанной культурой активированных МНК, а также по сравнению с показателями цитотоксичности клеток, генерируемых в прототипе. Таким образом, предложенный способ является эффективным и перспективным для создания Т-клеточных вакцин против HER2-экспрессирующих опухолевых клеток.

Предложенное изобретение повышает эффективность получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена.

Техническим результатом изобретения является индукция эффективного антигенспецифического противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа против опухолевых клеток с гиперэкспрессией антигена HER2, характеризующегося увеличением процента гибели HER2-экспрессирующих опухолевых клеток. Изобретение также позволяет получать чистые популяции цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к выбранному опухоль-ассоциированному антигену. Это открывает возможность реализовать адоптивный перенос активированных эффекторных популяций антигенспецифических Т-лимфоцитов пациентам для обнаружения и устранения опухолевых клеток с целью предотвращения рецидивов или развития метастазов, без введения дополнительного клеточного окружения пациенту, т.к. это способно негативно влиять на эффективность цитотоксического эффекта за счет присутствия клеток с толерогенными свойствами.

Дополнительным эффектом является также удешевление и упрощение способа за счет отсутствия этапа выделения CD8+ Т-лимфоцитов и сокращения этапов наработки антигенспецифических ЦТЛ.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано для получения противоопухолевых ЦТЛ. Способ предусматривает антигенную активацию полученных зрелых ДК с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместное культивирование с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции всех клеток неприлипающей фракции МНК, с последующим выделением из совместной культуры ДК и МНК специфичных к указанным эпитопам ЦТЛ методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток. После выделения HER2-специфических ЦТЛ стимулируют их пролиферацию путем культивирования в присутствии внесенных одновременно цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 c конечной концентрацией каждого из них 50 нг/мл в течение 14-20 суток. Изобретение обеспечивает индукцию эффективного антигенспецифического противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа против опухолевых клеток с гиперэкспрессией антигена HER2, характеризующегося увеличением процента гибели HER2-экспрессирующих опухолевых клеток. 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена, включающий получение прилипающей и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови человека, получение дендритных клеток (ДК) путем стимуляции их дифференцировки из прилипающей фракции МНК и антигенную активацию полученных зрелых ДК опухоль-ассоциированным антигеном, совместное культивирование клеток из неприлипающей фракции с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции, последующее выделение фракции антигенспецифических Т-лимфоцитов с помощью окрашивания антигенспецифическими реагентами, стимуляцию роста выделенных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) с использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рчИЛ-2), интерлейкина-7 (рчИЛ-7) и интерлейкина-15 (рчИЛ-15), отличающийся тем, что антигенную активацию полученных зрелых ДК осуществляют с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместному культивированию с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции подвергают все клетки неприлипающей фракции МНК, далее из совместной культуры ДК и МНК выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV белка HER2 методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток, а после выделения HER2-специфических ЦТЛ производят стимуляцию их пролиферации посредством культивирования в присутствии внесенных одновременно цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7, рчИЛ-15 в течение 14-20 суток, причем конечная концентрация каждого из цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 составляет 50 нг/мл.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве окрашивающего антигенспецифического реагента используют стрептамеры.