НОВЫЕ ЛИГАНДЫ G-КВАДРУПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ ГЕТЕРОАРЕНАНТРАЦЕНДИОНОВ, ИНГИБИРУЮЩИЕ РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2014 года по МПК C07D307/77 C07D333/50 A61K31/381 A61K31/343 A61P35/00 

Область техники

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается лигандов G-квадруплексных структур нуклеиновых кислот на основе линейных тетрациклических гетероциклических производных антрацендиона (гетероаренантрацендионов), содержащих в положениях 2, 4, 11 цепи с терминальными гуанидиногруппами, а также их структуры, методов получения и медицинского использования в качестве агентов, ингибирующих рост опухолевых клеток.

Уровень техники

Гуанин-богатые последовательности нуклеиновых кислот могут образовывать плоские G-квартеты, которые за счет стекинг-взаимодействий друг с другом способны формировать четырехцепочечные структуры - G-квадруплексы [Ambrus A., et. al. Nucleic Acids Res., 2006, 34, 2723; Luu K.N., et. al. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 9963]. В последнее десятилетие было доказано, что такие неканонические G-квадруплексные структуры играют важную роль в функционировании генома эукариотических клеток. Прежде всего, было обнаружено, что G-квадруплексы, формируемые теломерными участками ДНК, играют важную роль в регуляции активности фермента теломеразы, контролирующего длину теломерной ДНК и участвующего в регуляции клеточного цикла, числа клеточных делений и процессах старения как нормальных, так и опухолевых клеток [Sedivy J.M. Cancer Cell, 2007, 11, 389]. Кроме того, G-квадруплексные структуры обнаружены в промоторных областях многочисленных онкогенов таких, как с-myc, c-kit, bcl-2, k-ras, h-ras, VEGF, HIF-1 [Le T.V.T., et. al. Current Pharmaceutical Design, 2012, 18, 1948]. Установлено, что стабилизация G-квадруплексов, расположенных в промоторных областях этих генов, приводит к супрессии их транскрипции. Также G-квадруплексы недавно были найдены в 5'-нетранслируемых участках и РНК (5'-UTR) и показано, что их стабилизация вызывает селективное блокирование трансляции [Kumari S., et al. Nat. Chem. Biol., 2007, 3, 218].

Таким образом, G-квадруплексные структуры теломерной ДНК, промоторов онкогенов и 5'-UTR участков РНК являются перспективными мишенями для противоопухолевой терапии [Patel D.J., et. al. Nucleic Acids Res. 2007, 35, 7429], а лиганды, стабилизирующие G-квадруплексы, рассматриваются как перспективные кандидаты для поиска новых лекарственных средств [Gu L.Q., et. al. ChemMedChem, 2008, 3, 690].

Ранее было показано, что введение в положения 4 и 11 гетероаренантрацендионов заместителей, содержащих терминальные группы с делокализованными основными центрами, повышает сродство лигандов к теломерным G-квадруплексным структурам ДНК. Так, производные с двумя боковыми цепями, содержащие терминальные гуанидино-(соединения 1а, b) или амидино-группы (соединение 2) и обладающие высокой аффинностью к G-квадруплексам, способны их стабилизировать и блокировать синтез теломер и транскрипцию ряда онкогенов [Kaluzhny D., et. al. PLoS ONE, 2011, 6 (11), e27151; Shchekotikhin A.E. et. al. Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861; Cogoi S., et. al. J. Med. Chem., 2013, DOI: 10.1021/jm3019063].

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение призвано получить новые линейные тетрациклические гетероаренантрацендионы, имеющие большую аффинность к четырехцепочечным G-квадруплексным структурам нуклеиновых кислот, способные стабилизировать G-квадруплексы и ингибировать пролиферацию опухолевых клеток. Настоящее изобретение включает соединения, соответствующие формуле 3, их фармакологически приемлемые соли 3 и их использование в медицине для терапии опухолевых заболеваний.

Х означает независимо гетероатом, выбранный из О, S, или NH-группы, формирующий пятичленный гетероарен, конденсированный с антрацендионовым ядром по связи 2-3;

m - означает независимо число от 2 до 4, равное количеству спейсерных СН₂-групп, соединяющих атом азота карбоксамидной группы, расположенной в положении 2 гетероциклического ядра гетероаренантрацендиона, с атомом азота остатка гуанидиногруппы, расположенной в боковой цепи;

n - означает независимо число от 2 до 4, равное количеству спейсерных СН₂-групп, соединяющих аминогруппы в пери-положениях гетероаренантрацендиона с атомами азота остатков гуанидиногрупп, расположенных в боковых цепях.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного соединения формулы 3 или его фармацевтически приемлемых солей или сольватов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению соединений в качестве терапевтически активных для лечения заболеваний человека, связанных с повышенной скоростью роста клеток (т.е. гиперпролиферацией), прежде всего онкологических заболеваний различного генеза, включая без ограничения перечисленным, карциномы, лейкемии, лимфомы, меланомы, саркомы и т.п. В дополнение к настоящему изобретению относится способ лечения, заключающийся во введении указанной выше фармацевтической композиции субъекту с заболеванием.

Биологическое действие соединений, являющихся предметом настоящего изобретения, отличается от описанных ранее лигандов на основе гетероаренантрацендионов большей аффинностью к G-квадруплексным структурам нуклеиновых кислот. Введение в гетероциклический фрагмент гетероаренантрацендинов дополнительной боковой цепи, содержащей гуанидиногруппу, приводит к значительному увеличению аффинности лигандов формулы 3 к G-квадруплексам, по сравнению с ранее известными лигандами формул 1 и 2 [Kaluzhny D., et. al. PLoS ONE, 2011, 6 (11), e27151; Shchekotikhin A.E., et. al. Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861].

Соединения по настоящему изобретению могут быть получены различными способами, один из них, описанный ниже, лишь иллюстрирует методы их синтеза и модификации функциональных групп. Исходные материалы и реагенты, которые используются при получении соединений формулы 3, являются коммерческими химическими веществами, поставляемыми такими фирмами, как Aldrich Chemical Co., Acros, или их можно получить методами, известными специалисту в данной области, по методикам, описанным в литературе, при необходимости используя защитные группы.

Если не указано иное, реакции, приведенные в описании заявки, предпочтительно проводят при атмосферном давлении от приблизительно -78°С до 180°С, более предпочтительно от 0°С до 120°С в инертном растворителе или без него.

Одна из общих схем получения соединений формулы 3 по настоящему изобретению включает стадии замещения уходящих групп, одна из которых расположена в остатке карбоксигруппы в положении 2 гетероцикла, а две другие находятся в положениях 4 и 11 ядра гетероаренантрацендиона А, на остатки аминоалкиламинов (схема 1). На заключительной стадии проводится модификация терминальных аминогрупп боковых цепей производного С в гуандиногруппы обработкой гуанидирующими агентами.

При этом подразумевается, что LG₁-LG₄ - означают уходящие группы. При необходимости синтеза соединений формулы 3 с n=m стадии замещения LG₁, LG₁, LG₃ можно совместить в одну стадию и получить продукт С из исходного А действием избытка аминоалкиламина без выделения промежуточного карбоксамида В. Для повышения выхода и/или селективности реакций, а также для удобств выделения и очистки продуктов синтез целевых соединений можно проводить с использованием защитных групп.

Если не указано иное, термины, используемые в описании заявки и пунктах формулы изобретения, имеют значения, указанные ниже. Следует отметить, что, если не указано иное, используемые в описании и пунктах формулы формы единственного числа включают также формы множественного числа.

"Алкил" означает, если не указано иное, одновалентный насыщенный углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью или циклический радикал, включающий только атомы углерода и водорода и содержащий от 1 до включительно 6 атомов углерода. Примеры алкильных радикалов включают, без ограничения перечисленным, метил, этил, пропил, изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, н-гексил и т.п.

"Алкилтио" означает радикал -SR, где R - указанный выше алкил. Примеры алкилтиорадикала включают, без ограничения перечисленным, метилтио, этилтио и т.п.

"Алкилен" означает насыщенный двухвалентный углеводородный радикал с прямой цепью, содержащий от одного до четырех атомов углерода, или насыщенный двухвалентный углеводородный радикал с разветвленной цепью, содержащий от трех до шести атомов углерода. Например, С2-С3 алкилен включает метилен, этилен, 2,2-диметилэтилен, пропилен, 2-метилпропилен и т.п.

"Алкокси" означает радикал -OR, где R - указанный выше алкильный радикал. Примеры алкоксирадикалов включают, без ограничения перечисленным, метокси, этокси, изопропокси, изобутокси и т.п.

"Амино" означает группы -NH2, -NHR¹, -NR¹R², где R¹ и R² каждый независимо-алкильные радикалы, указанные выше. Примеры аминогрупп включают, без ограничения перечисленным, метиламино, этиламино, диметиламино, метилэтиламино и т.п.

"Аминоалкил" означает алкильный радикал, указанный выше, замещенный одной или более, предпочтительно одной аминогруппой, указанной выше, при условии, что к одному углеродному атому присоединено не более одной аминогруппы. Примеры аминоалкильных радикалов включают, без ограничения перечисленным, аминометил, метиламинометил, диметиламинометил.

"Аминоалкиламино" означает насыщенный углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью, содержащий от одного до четырех атомов углерода, связанный с двумя аминогруппами, указанными выше, при условии, что к одному углеродному атому присоединено не более одной аминогруппы. Примеры аминоалкиламинорадикалов включают, без ограничения перечисленным, 2-аминоэтиламино, 2-(метиламино)этиламино, 2-(этиламино)этиламино, 2-[(2-гидроксиэтил)амино]этиламино, 2-аминопропиламино, 3-аминопропиламино и т.п.

"Антрацендион" означает остаток необязательно замещенного 9, 10-антрацендиона (антрахинона).

"Арил" означает, если не указано иное, одновалентный циклический ароматический углеводородный радикал, содержащий один или более конденсированных циклов, из которых по меньшей мере один цикл является ароматическим, который необязательно замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, включающей циано, алкил, алкокси, алкилтио, галоген, нитро, алкоксикарбонил, аминосульфонил, сульфониламино, нитро и/или алкилсульфонил. Примеры арильных радикалов включают, без ограничения перечисленным, фенил, нафтил, бифенил, инданил, антрахинонил и т.п.

"Арилокси" означает радикал -OAr, где Ar - указанный выше арильный радикал. Примеры арилоксирадикалов включают, без ограничения перечисленным, фенокси 4-нитрофенокси, пентафторфенокси и т.п.

"Ацил" означает группу, соответствующую формуле: -COR, -CSR, где R означает, без ограничения перечисленным, водород или алкил, алкенил, арил, гетероарил, гетероциклил.

"Ацилокси" означает группу, соответствующую формуле: -OCOR, -OCSR, где R означает, без ограничения перечисленным, водород или алкил, алкенил, арил, гетероарил.

"Галоген" означает радикал фтора, брома, хлора, иода.

"Галогеналкил" означает алкильный радикал, имеющий значения, указанные выше, замещенный в любом положении одним или более атомами галогена. Примеры галогеналкильного радикала включают, без ограничения перечисленным, 1-фторметил, 1,2-дифторметил, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, хлорметил и т.п.

"Гетероарил" означает, если не указано иное, одновалентный ароматический карбоциклический радикал, содержащий один или более циклов, включающих в цикле один, два или три гетероатома (выбранных из N, О или S), и необязательно замещенный заместителем, выбранным из группы, включающей гидрокси, циано, алкил, алкокси, тиоалкил, галоген, галогеналкил, гидроксиалкил, нитро, алкоксикарбонил, амино, алкиламино, диалкиламино, аминокарбонил, карбониламино, аминосульфонил, сульфониламино и/или алкилсульфонил. Примеры гетероарильных радикалов включают, без ограничения перечисленным, пирролил, тиофенил, фуранил, имидазолил, оксазолил, тиазолил, пиразолил, оксадиазолил, пиранил, пиридинил, хинолинил, изохинолинил, бензофуранил, бензотиофенил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензотиазолил, бензопиранил, индазолил, индолил, изоиндолил и т.п.

"Гетероарен" означает, если не указано иное, пятичленный ароматический гетероцикл, содержащий один или два гетероатома (выбранных из N, О или S), и необязательно замещенный заместителем, выбранным из группы, включающей гидрокси, циано, алкил, алкокси, тиоалкил, галоген, галогеналкил, гидроксиалкил, нитро, алкоксикарбонил, амино, алкиламино, диалкиламино, аминокарбонил, карбониламино, аминосульфонил, сульфониламино и/или алкилсульфонил. Примеры гетероаренов, пригодных для построения гетероаренантрацендионов, включают содержащие не менее трех атомов углерода (два из которых общие с антрацендионовым фрагментом) гетероциклы: пиррол, фуран, тиофен, оксазол, тиазол, имидазол.

"Гетероаренантрацендион" означает, если не указано иное, линейную замещенную тетрациклическую систему, состоящую из пятичленного гетероарена, конденсированного с антрацендионом по связи 2-3.

"Гетероциклил" означает одновалентный насыщенный остаток, включающий от одного до трех циклов и один или два гетероатома (выбранные из N, О или S). Гетероциклильный цикл необязательно замещен, как указано выше. Примеры гетероциклильных остатков включают, без ограничения перечисленным, пиперидинил, пиперазинил, азепинил, пирролидинил, пиразолидинил, имидазолинил, имидазолидинил, пиридинил, пиридазинил, оксазолидинил, изоксазолидинил, морфолинил, тиазолидинил, изотиазолидинил, хинуклидинил, бензимидазолил, тетрагидрофурил, тетрагидропиранил, дигидрохинолинил, дигидроизохинолинил, тетрагидрохинолинил и т.п.

"Гидроксиалкил" означает алкильный радикал, указанный выше, замещенный одной или более, предпочтительно одной, двумя или тремя гидроксигруппами при условии, что к одному углеродному атому присоединено не более одной гидроксигруппы. Примеры гидроксиалкильных радикалов включают, без ограничения перечисленным, гидроксиметил, 2-гидроксиэтил, 2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил, 2,3-дигидроксипропил и т.п.

Термином "защитная группа" обозначается группа, подходящая для блокирования функциональной группы в условиях проведения реакций, как описано литературе [Green, Т.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis. J. Wiley & Sons, N.-Y., 1991, 351]. Пример таких групп для блокирования амино-, имино- или гуанидино-групп включает, без ограничения перечисленным, трет-бутоксикарбонильную (Boc), адамантилоксикарбонильную (Adoc), флуоренилметоксикарбонильную (Fmoc), карбонилбензилокси (Cbz), метоксикарбонильную, этоксикарбонильную, тозильную группы. Пример таких групп для блокирования карбоксигруппы включает, без ограничения перечисленным, трет-бутильную, метальную, этильную, бензильную группы. Пример таких групп для блокирования гидроксигруппы включает, без ограничения перечисленным, метальную, этильную, бензильную, метоксиметильную, этоксиметильную, триметилсилильную и т.п.

"Изомеры" означает соединения с одинаковой молекулярной формулой, но отличающиеся природой или последовательностью химических связей, или пространственным расположением атомов.

Термин "ингибитор" относится к соединению, которое уменьшает активность фермента или снижает скорость деления опухолевых клеток.

"Инертный органический растворитель" означает растворитель, инертный в условиях описываемой в тексте реакции, включающий, например, бензол, толуол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метилпирролидон, диметилсульфоксид, сульфолан, хлороформ, дихлорметан, дихлорэтан, этилацетат, ацетон, метилэтилкетон, метанол, этанол, пропанол, изопропанол, трет-бутанол, диоксан, пиридин и т.п. Если не указано иное, растворители, используемные в реакциях по настоящему изобретению, являются инертными растворителями.

"Карбоксиалкил" обозначает группу, соответствующую формуле: -CO₂R, где R означает алкил.

"Карбоксамидо" обозначает группу, соответствующую формуле: -CONR₁R₂, где NR₁R₂ означает амино, аминоалкиламино или азотсодержащий гетероциклил. Примеры NR₁R_z радикалов включают, без ограничения перечисленным, амино, метиламино, этиламино, диметиламино, метилэтиламино, диэтиламино, аминоэтиламино, морфолинил, пиперазинил.

"G-квадруплекс", если не указано иное, означает четырехцепочечный элемент пространственной укладки гуанин-богатых последовательностей нуклеиновых кислот, формируемый стопкой плоских структур - G-квартетов (G-тетрады), в которых четыре остатка гуанина связаны между собой восемью водородными связями.

"Лиганд", если не указано иное, означает молекулу, способную за счет многоцентрового связывания (которое может включать ионные, водородные, гидрофобные связи и стекинг-взаимодейстия) образовывать комплекс с биомолекулой или ее фрагментом.

"Необязательный" или "необязательно" означает, что последующее событие или обстоятельство может произойти, но необязательно произойдет, и что описание включает случаи, когда это событие или обстоятельство произойдет, и случаи, когда оно не произойдет. Например, термин "необязательно замещенный" при использовании в связи с термином "арил", "фенил", "бензил", "бензоил", "гетероарил" или "гетероциклил" означает арил, фенил, бензил, бензоил, гетероарил или гетероциклил, который необязательно и независимо содержит от одного до пяти заместителей, предпочтительно один или два заместителя, выбранных из группы, включающей алкил, алкокси, циклоалкил, галогеналкил, гидрокси, гидроксиалкил, галоген, нитро, пиано, гидрокси, алкокси, амино, ациламино, аминоалил, карбоксиалкил, карбомоил, ацилокси и т.п.

"Сольваты" означает сольватированные формы, содержащие стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя. Некоторые соединения способны удерживать в кристаллической решетке фиксированное количество молекул растворителя, образуя сольват. Гидраты образуются в том случае, если в качестве растворителя используется вода, а если растворителем является спирт, образуются алкоголяты.

"Субъект" означает млекопитающих, т.е. любого члена класса млекопитающих, включая, без ограничения перечисленным, человека, приматов, сельскохозяйственных животных, лабораторных животных и т.п., предпочтительно человека. Термин субъект не означает конкретный возраст или пол.

"Таутомеры" означает соединения, структуры которых отличаются пространственным расположением атомов, но находятся в равновесном состоянии. Соединения формулы 3 содержат группы, которые могут находиться в таутомерном равновесии, поэтому подразумевается, что настоящее изобретение включает все таутомерные формы соединений 3, а их названия не исключают любые таутомерные формы.

"Терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, которое при введении субъекту является достаточным для оказания фармакологического действия при лечении патологического состояния субъекта. Терапевтически эффективное количество варьируется в зависимости от типа соединения, патологического состояния, подлежащего лечению, тяжести болезни, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, от способа и формы введения, от мнения лечащего врача или практикующего ветеринара и других факторов.

"Уходящая группа" означает группу, название которой обычно ассоциируется с ее использованием в синтетической органической химии, т.е. означает атом или группу атомов, которая замещается в условиях реакции. Примеры уходящей группы включают, без ограничения перечисленным, галоген, алкансульфонилокси (такие, как метансульфонилокси, этансульфонилокси), аренсульфонилокси, (такие, как бензолсульфонилокси, тозилокси), алкокси (метокси), алкилтио (тиометил), арилокси (фенокси), амино (диметиламино) и т.п.

"Фармакологическое действие" означает термин, используемый в описании заявки, включает результаты воздействия на субъект, при которых достигается предполагаемая цель терапии. Например, фармакологическое действие означает такие результаты воздействия, которые приводят к излечению, замедлению развития или предупреждению рецидива заболевания.

"Фармацевтически приемлемый" означает материал, который используют при получении фармацевтической композиции, обычно являющийся безопасным, нетоксичным, безопасным в биологическом или ином отношении и включает материал, приемлемый как в ветеринарии, так и в фармацевтике.

"Фармацевтически приемлемые соли соединения" означают соли, которые являются фармацевтически приемлемыми и обладают необходимой фармакологической активностью исходного соединения. Эти соли включают: (1) кислотно-аддитивные соли неорганических кислот таких, как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т.п., или органических кислот таких, как уксусная кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, фумаровая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, метансульфоновая кислота, пропионовая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, винная кислота, толуолсульфоновая кислота и т.п., или (2) соли, образующиеся при замене кислотного протона (в O-Н, N-H или S-H-группах), присутствующего в исходном соединении, на ион металла, например ион щелочного металла, ион щелочно-земельного металла или ион алюминия, или при образовании координационного соединения с органическим или неорганическим основанием. Приемлемые органические основания включают диэтаноламин, этаноламин, триэтаноламин и т.п. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид калия, карбонат натрия, гидроксид натрия, гидроксид алюминия, гидроксид кальция и т.п. Подразумевается, что фармацевтически приемлемые соли включают сольваты или кристаллические формы (полиморфные образования) указанной кислотно-аддитивной соли. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми солями являются соли уксусной кислоты, соляной кислоты, серной кислоты, метансульфоновой кислоты, малеиновой кислоты, фосфорной кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, соли натрия, калия, кальция, цинка и магния.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой стабилизационный сдвиг теломерного G-квадруплекса соединениями 1b, 3b, 3с, 3d, 3е до и после добавления 0, 2.2, 11, 33 мкМ (по) конкурирующей тимДНК. Концентрация TelQ22-DA - 100 нМ (нитей); соединений 1b, 3b-3е - 1 мкМ. Тестирование проводилось в буферном растворе, содержащем 10 мМ Na-фосфатного буфера (рН 7.6), 10 мМ KCl, 80 мМ LiCl, как описано в примере 6.

Фиг.2 представляет собой влияние бис(гуанидино)- и трис(гуанидино)производных гетероаренантрацендионов 1b, 3а, 3b на активность теломеразы (TRAP-assay) в концентрациях 0.1, 1.0 и 10 мкМ. Р (трек 1) - достройка ДНК в отсутствие соединений (положительный контроль реакции), N (трек 2) - реакция достройки ДНК в отсутствие теломеразы (отрицательный контроль), как показано в примере 7.

Один из методов синтеза соединений структурной формулы 3 (схема 2) и типичные представители по изобретению приводятся в ряде примеров, описанных ниже. Исходные производные 2-карбоновых кислот 4, 11-диалкоксигетероаренантрацендионов с одним гетероатомом, соответствующие формуле 4, могут быть получены, например, описанными ранее методами [Тихомиров А.С.и др. ХГС, 2011, 10, 1464; Щекотихин А.Е. и др. ХГС, 2007, 4, 53 8]. В результате модификации карбоксильной группы и замещения метоксигрупп гетероаренантрацендионов формулы 4 получен полупродукт 5, гуанидирование терминальных аминогрупп которого приводит к производным гетероаренантрацендионов, содержащих три боковых цепи с терминальными гуанидиногруппами, соответствующие формуле 3.

Пример 1

N-(2-Гуанидиноэтил)-4,11-бис(2-гуанидиноэтиламино)-5,10-диоксоантра[23-b]фуран-2-карбоксамида тригидрохлорид (3а)

К раствору 75 мг (0.19 ммоль) 4,11-диметокси-5,10-диоксоантра[2,3-b]фуран-2-карбоновой кислоты (4а, Х=O, схема 2 [Тихомиров А.С. и др. ХГС, 2011, 10, 1464]) в 5 мл ДМСО прибавляют 0.3 мл (4.5 ммоль) этилендиамина, 200 мг (0.38 ммоль) бензтриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфата (РуВОР) и перемешивают 1 ч, после чего к реакционной массе дополнительно прибавляют 2.0 мл (0.03 моль) этилендиамина и перемешивают 24 ч. Смесь выливают в воду, экстрагируют продукт н-бутанолом, промывают экстракт водой и отгоняют растворитель в вакууме. Остаток очищают методом колоночной хроматографии (CHCl₃-МеОН-конц. NH₄OH, 1:0:0→2:2:1). Полученные синие кристаллы N-(2-аминоэтил)-4,11-бис(2-аминоэтиламино)-5,10-диоксоантра[2,3-b]фуран-2-карбоксамида (5а, Х=O, n=m=2, схема Б) растворяют в 5 мл ДМСО и при перемешивании прибавляют 0.5 мл (3 ммоль) этилдиизопропиламина и 300 мг (2.0 ммоль) гидрохлорида пиразол-1-карбоксамидина. Реакционную массу выдерживают 3 ч при 60°C и охлаждают. Продукт осаждают избытком ацетона и фильтруют. Темно-синий продукт переосаждают дважды из теплой воды ацетоном, промывают ацетоном и сушат. Выход трис(гуанидино)производного 3а 53 мг (44%), темно-синие кристаллы.

Пример 2

N-(2-Гуанидиноэтил)-4,11-бис(2-гуанидиноэтиламино)-5,10-диоксоантра[2,3-b]тиофен-2-карбоксамида тригидрохлорид (3b)

Получают по аналогичной методике, приведенной в примере 1, из 4,11-диметокси-5,10-диоксоантра[2,3-b]тиофен-2-карбоновой кислоты (4b, X=S, схема 2 [Щекотихин А.Е. и др. ХГС, 2007, 4, 538]). Выход трис(гуанидино)производного 3b 42%, темно-синие кристаллы.

Пример 3

N-(3-Гуанидинопропил)-4,11-бис(2-гуанидиноэтиламино)-5,10-диоксоантра[2,3-b]тиофен-2-карбоксамида тригидрохлорид (3с)

К раствору 80 мг (0.22 ммоль) 4,11-диметокси-5,10-диоксоантра[2,3-b]тиофен-2-карбоновой кислоты (4b, X=S, схема 2) в 5 мл ДМСО прибавляют 0.3 мл (3.6 ммоль) 1,3-диаминопропана, 200 мг (0.38 ммоль) бензтриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфата (РуВОР) и перемешивают 1 ч. Реакционную смесь выливают в воду, и экстрагируют продукт н-бутанолом. Экстракт несколько раз промывают водой, сушат и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 5 мл ДМСО, к раствору прибавляют 2.0 мл (0.03 моль) этилендиамина и перемешивают 24 ч. Смесь выливают в воду, экстрагируют продукт н-бутанолом, промывают экстракт водой и отгоняют растворитель в вакууме.

Остаток очищают методом колоночной хроматографии (CHCl₃-МеОН-конц. NH₄OH, 1:0:0→2:2:1). Полученные синие кристаллы N-(3-аминопропил)-4,11-бис(2-аминоэтиламино)-5,10-диоксоантра[2,3-b]тиофен-2-карбоксамида (5с, X=S, n=2, m=3, схема Б) растворяют в 5 мл ДМСО и при перемешивании прибавляют 0.5 мл (3.0 ммоль) этилдиизопропиламина и 300 мг (2.0 ммоль) гидрохлорида пиразол-1-карбоксамидина. Реакционную смесь перемешивают 3 ч при 60°C и охлаждают. Продукт осаждают избытком ацетона и фильтруют. Темно-синий продукт переосаждают дважды из теплой воды ацетоном, промывают ацетоном и сушат. Выход трис(гуанидино)производного 3с 45 мг (30%), темно-синие кристаллы.

Пример 4

N-(2-Гуанидиноэтил)-4,11-бис(3-гуанидинопропиламино)-5,10-диоксоантра[2,3-b]тиофен-2-карбоксамида тригидрохлорид (3d)

К раствору 80 мг (0.22 ммоль) 4,11-диметокси-5,10-диоксоантра[2,3-b]тиофен-2-карбоновой кислоты (4b, X=S, схема 2) в 5 мл ДМСО прибавляют 0.3 мл (4.5 ммоль) этилендиамина, 200 мг (0.38 ммоль) бензтриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфата (РуВОР) и перемешивают 1 ч. Реакционную смесь выливают в воду, и экстрагируют продукт н-бутанолом. Экстракт несколько раз промывают водой, сушат и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 5 мл ДМСО, прибавляют к раствору 2.0 мл (0.024 моль) 1,3-диаминопропана и перемешивают 24 ч. Смесь выливают в воду, экстрагируют продукт н-бутанолом, промывают экстракт водой, и отгоняют растворитель в вакууме. Остаток очищают методом колоночной хроматографии (CHCl₃-МеОН-конц. NH₄OH, 1:0:0→2:2:1). Полученные синие кристаллы N-(3-аминопропил)-4,11-бис(2-аминоэтиламино)-5,10-диоксоантра[2,3-6]тиофен-2-карбоксамида (5d, X=S, n=3, m=2, схема Б) растворяют в 5 мл ДМСО и при перемешивании прибавляют 0.5 мл (3.0 ммоль) этилдиизопропиламина и 300 мг (2.0 ммоль) гидрохлорида пиразол-1-карбоксамидина. Реакционную массу перемешивают 3 ч при 60°C и охлаждают. Продукт осаждают избытком ацетона и фильтруют. Темно-синий продукт переосаждают дважды из теплой воды ацетоном, промывают ацетоном и сушат. Выход трис(гуанидино)производного 3d 40 мг (26%), темно-синие кристаллы.

Пример 5

N-(3-Гуанидинопропил)-4,11-бис(3-гуанидинопропиламино)-5,10-диоксоантра[2,3-b]тиофен-2-карбоксамида тригидрохлорид (3е)

Получают по аналогичной методике, приведенной в примере 1, из 4,11-диметокси-5,10-диоксоантра[2,3-b]тиофен-2-карбоновой кислоты (4b, X=S, схема 2) и 1,3-диаминопропана. Выход трис(гуанидино)производного 3е 25%.

Примеры, подтверждающие наличие биологической активности

Пример 6

Исследование связывания новых лигандов с теломерным G-квадруплексом

Ранее в ряду гетероаренантрацендионов для соединений 1b, 2, содержащих две гуанидино- или амидиногруппы в боковых цепях соответственно, показано наличие связывания с G-квадруплексами нуклеиновых кислот [Cogoi S., et. al. J. Med. Chem., 2013, DOI: 10.1021/jm3019063; Kaluzhny D., et. al. PLoS ONE, 2011, 6 (11), е27151]. Поэтому для лигандов формулы 3, содержащих три гуанидиногруппы в боковых цепях, являющихся предметом настоящего изобретения, было проведено исследование параметров связывания с теломерным G-квадруплексом в сравнении с ранее описанным лигандом 1b.

Способность лигандов стабилизировать теломерный G-квадруплекс и селективность связывания по сравнению с двутяжевой ДНК были оценены методом FRET-плавления [Mergny J.L., Lacroix L. Oligonucleotides., 2003, 13 (6), 515]. Для исследования влияния лигандов 1b, 3b-3е на тепловую денатурацию (плавление) G-квадруплекса использована последовательность FAM-5'-d(AGGGTTAGGG-TTAGGGTTAGGG)-3'-BHQ1 (TelQ22-DA), формирующая в присутствии ионов К+«гибридную» 3+1 внутримолекулярную квадруплексную структуру TelQ_K+ с тремя G-квартетами. FRET-плавление проводилось с использованием 96-ти луночного прибора для ПЦР в режиме реального времени (Applied Biosystems 7500) с фильтром для флуоресцеина и SYBR Green I. Образцы общим объемом 25 мкл содержали смесь солей и буфера (10 мМ KCl, 10 мМ Na фосфатный буфер, рН 7.6, 80 мМ LiCl), 100 нМ олигонуклеотида TelQ22-DA без и в присутствии 1 мкМ одного из соединений 1b, 3b-3е. Температура плавления Т_1/2 определялась как температура, при которой достигается максимум первой производной кривой плавления. Для увеличения точности проведено усреднение результатов шести независимых экспериментов.

По результатам FRET-плавления для лигандов 1b и 3b-3е был определен стабилизационный сдвиг. Он определяется как разность температуры полуперехода комплекса G-квадруплекса с лигандом и температуры плавления свободного квадруплекса Те10к+. Стабилизационный сдвиг характеризует сродство лиганда к квадруплексу. Данные, представленные на Фиг.1, демонстрируют, что лиганды на основе гетероаренантрацендионов, содержащие в боковых цепях остатки гуанидина, существенно повышают температуру денатурации теломерного G-квадруплекса (T_m=64.8±0.3°C). Ранее описанный лиганд 1b с двумя гуанидиногруппами в боковых цепях значительно стабилизирует квадруплекс (ΔT_m=16°C). Лиганды нового химотипа формулы 3, имеющие три гуанидиногруппы в боковых цепях с этиленовыми спейсерами в положениях 4 и 11 (n=2), например, соединения 3b и 3с вызывают существенно больший стабилизационный сдвиг, увеличивая температуру плавления G-квадруплекса (T_m) до ~90°C (ΔT_m~25°C). Увеличение длины спейсеров в положениях 4, 11 на одну метиленовую группу дополнительно повышает аффинность лигандов к теломерному G-квадруплексу - соединения 3d, е с пропиленовыми группами (n=3) увеличивают температуру плавления G-квадруплекса до ~95°C (ΔT_m~30°C).

Таким образом, введение дополнительной боковой цепи в положение 2 гетероаренантрацендионов с терминальным остатком гуанидина и варьирование длины боковых цепей вызывают существенный рост аффинности лиганда к G-квадруплексной структуре ДНК, о чем свидетельствует значительное увеличение стабилизационного сдвига TelQ_K+ (почти в два раза). По стабилизационному эффекту для теломерного G-квадруплекса лиганды 3d и 3е превосходят известный высокоаффинный G-квадруплексный лиганд - BRACO-19, для которого зафиксирован ΔT_m=27.3°C [Read F., Neidle S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 4844].

Плавление комплексов лиганд/G-квадруплекс в присутствии фиксированного количества тимусной ДНК, конкурирующей за связывание лиганда, позволяет ранжировать лиганды по их избирательности к G-квадруплексу относительно дуплекса ДНК. Для анализа селективности связывания соединений с G-квадруплексом к раствору с 100 нМ TelQ22-DA и 1 мкМ тестируемого соединения добавлялась тимусная ДНК в избытке разной кратности. Были использованы 2.2, 11 и 33 мкМ (пар оснований) тимусной ДНК, то есть в растворе достигался 2-х, 10-ти, и 30-ти кратный избыток дуплексной ДНК над G-квадруплексом при выражении концентраций в нуклеотидах.

Наличие двухцепочечной ДНК вызывает перераспределение лиганда от G-квадруплекса к дуплексу и, следовательно, приводит к уменьшению стабилизационного сдвига (фиг.1). Величина сдвига температуры плавления G-квадруплекса в присутствии лиганда и избытка двутяжевой ДНК коррелирует со степенью специфичности лиганда. [Campbell N.H., et. al. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130 (21), 6722]. Сравнительную избирательность разных лигандов в пользу G-квадруплекса при наличии конкурирующей двутяжевой ДНК можно условно характеризовать отношением стабилизационных сдвигов в присутствии фиксированного количества тимусной ДНК и без тимусной ДНК:

S_FRET=ΔT_{m(+11 мМ ДНК)}/ΔT_m,

где ΔT_m - стабилизационный сдвиг плавления G-квадруплекса без конкурирующего дуплекса; ΔT_{m(+11 мМ ДНК)} - стабилизационный сдвиг плавления G-квадруплекса в присутствии 11 мкМ (по) тимусной ДНК.

На основании результатов, представленных на фиг. 1, определены величины S_FRET для соединения 1b и для новых лигандов 3b-3е (таблица 1). По значению параметра селективности (S_FRET) лиганды, содержащие в боковых цепях три гуанидиногруппы с этиленовыми спейсерами в положениях 4, 11 (n=2, соединения 3b, 3с), несколько уступают, а производные с пропиленовыми цепями (n=3, соединения 3d, 3е) существенно превосходят ранее описанный бисгуанидин 1b.

Представленные данные свидетельствуют, что введение в лиганды на основе гетероаренантрацендионов третьей боковой цепи с остатком гуанидина значительно увеличивает аффинность лигандов к квадруплексным структурам нуклеиновых кислот, и, таким образом, новый химотип лигандов, соответствующий структурной формуле 3, обеспечивает высокие параметры аффинности к G-квадруплексам. Варьирование длины спейсерных групп в положениях 4, 11 гетероаренантрацендионов формулы 3 позволяет модулировать селективность связывания лигандов с квадруплексными/дуплексными структурами ДНК.

Таблица 1 Специфичность связывания (S_FRET) бис(гуанидино)- и трис(гуанидино)-производных антратиофендиона 3b-3е с теломерным G-квадруплексом по сравнению с тимусной двутяжевой ДНК, определенная методом FRET-плавления. Концентрация TelQ22-DA - 0.1 мкМ (нитей); соединений 1b, 3b-3е - 1 мкМ, ДНК - 11 мкМ (по)       № примера Соединение S_FRET       2 3b 0.37 3 3с 0.33 4 3d 0.60 5 3е 0.67 1b 0.48

Пример 7

Влияние соединений на активность теломеразы

Ранее описанные бисгуаниногетероаренантрацендионы 1а, 1b, стабилизирующие теломерный G-квадруплекс, формируемый на однотяжевом участке теломерной ДНК, способны ингибировать теломеразу - фермент, активность которого обусловливает неконтролируемое деление клеток [Shchekotikhin A.E., et. al. Bioorg. Med. Chem., 2009, 77, 1861; Shchekotikhin A.E. et. al. Eur. J. Med. Chem., 2011, 46, 423]. В связи с этим для лигандов 3а и 3b, обладающих высокой аффинностью к теломерному G-квадруплексу и соответствующих заявленному в изобретении новому химотипу, а также для ранее описанного лиганда 1b было проведено сравнение способности ингибировать теломеразу.

Результаты, представленные на Фиг.2, демонстрируют, что в концентрации 1 мкМ все тестируемые лиганды ингибируют активность теломеразы. Наблюдаемый для этих лигандов эффект ингибирования теломеразы специфичен, поскольку эти производные не влияют на полимеризацию ДНК с других (нетеломерных) праймеров. Сравнение набора теломеров, образующихся в присутствии 1 мкМ двухцепочечного лиганда 1b и трехцепочечных лигандов 3а и 3b, показывает, что введение в положение 2-гетероцикла гетероаренантрацендионов дополнительной цепи, содержащей гуанидиногруппу, ведет к повышению активности ингибирования теломеразы, и в случае антратиофендиона 3b теломеры образуются лишь в следовых количествах.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что соединения структурной формулы 3, являющиеся предметом настоящего изобретения, превосходят по активности ингибирования теломеразы ранее описанные лиганды на основе гетероаренантрацендинов, содержащих две боковые цепи (например, соединение 1b).

Пример 8

Антипролиферативная активность соединений

Изучение антипролиферативной активности заявленных соединений проводилось в тестах in vitro на культурах человеческих опухолевых клеток лейкоза К562 и карциномы кишечника НСТ-116. Данные об антипролиферативной активности (IC₅₀ - концентрация, ингибирующая рост клеток на 50%) заявленных по изобретению соединений 3a-3d приводятся в таблице 2, где для каждого соединения указана структура и номер примера (описанных выше), а также приводятся данные об антипролиферативной активности ранее описанных квадруплексных лигандов 1b и 2. Определение IC₅₀ проводилось с помощью МТТ-теста по стандартной методике, описанной в литературе [Mossman Т.J. Immunol. Methods, 1983, 65, 55].

Таблица 2 Антипролиферативная активность (IC₅₀, мкМ) G-квадруплексных лигад, клеток лейкоза К562 и карциномы кишечника НСТ-116 № примера № соединения   IC₅₀(MKM) Структура   K562 HCT-116         1 3а 11.2±0.9 8.7±0.4                 2 3b 24.5±1.2 17.5±0.6                 3 3с 18.2±0.4 11.0±0.3                 4 3d 16.7±1.2 6.2±0.2                 1b 48±2.5 18.5±1.8               2 >50 >50      

Как видно из представленных данных, соединения, являющиеся предметом настоящего изобретения и описанные в примерах, способны ингибировать пролиферацию опухолевых клеток в микромолярных концентрациях и превосходят по активности ранее описанные лиганды 1b, 2 [Shchekotikhin A.E., et. al. Bioorg. Med. Chem., 2009, 77, 1861; Kaluzhny D., et. al. PLoS ONE, 2011, 6 (11), е27151].

Изобретение относится к линейным гетероциклическим производным антрацендиона, содержащим гуанидино(алкиламино)-группы в положениях 2, 4, 11, и соответствующим формуле:

а также к их фармакологически приемлемым солям, где Х означает независимо гетероатом, выбранный из О, S, или NH-группы, формирующий пятичленный гетероарен, конденсированный с антрацендионовым ядром по связи 2-3; n - означает независимо число от 2 до 4, равное количеству спейсерных СН₂-групп, соединяющих аминогруппы в пери-положениях гетероаренантрацендиона с атомами азота остатков гуанидиногрупп, расположенных в боковых цепях; m - означает независимо число от 2 до 4, равное количеству спейсерных СН₂-групп, соединяющих атом азота карбоксамидной группы, расположенной в положении 2 гетероциклического ядра гетероаренантрацендиона, с атомом азота остатка гуанидиногруппы, расположенной в боковой цепи. Технический результат: получены новые соединения, которые могут найти применение в медицине для терапии онкологических заболеваний. 2 табл., 2 ил., 8 пр.

Линейные гетероциклические производные антрацендиона, содержащие гуанидино(алкиламино)-группы в положениях 2, 4, 11, обладающие высокой аффинностью к G-квадруплексным структурам нуклеиновых кислот и пригодные для терапии онкологических заболеваний и соответствующие формуле:

а также их фармакологически приемлемые соли, где Х означает независимо гетероатом, выбранный из О, S, или NH-группы, формирующий пятичленный гетероарен, конденсированный с антрацендионовым ядром по связи 2-3; n - означает независимо число от 2 до 4, равное количеству спейсерных СН₂-групп, соединяющих аминогруппы в пери-положениях гетероаренантрацендиона с атомами азота остатков гуанидиногрупп, расположенных в боковых цепях; m - означает независимо число от 2 до 4, равное количеству спейсерных СН₂-групп, соединяющих атом азота карбоксамидной группы, расположенной в положении 2 гетероциклического ядра гетероаренантрацендиона, с атомом азота остатка гуанидиногруппы, расположенной в боковой цепи.