МУЛЬТИТАРГЕТНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА НА ОСНОВЕ ЛИНЕЙНЫХ ГЕТЕРОАРЕНАНТРАЦЕНДИОНОВ Российский патент 2014 года по МПК C07D307/77 C07D333/50 C07D231/54 C07D209/56 A61K31/381 A61K31/343 A61K31/407 A61K31/416 A61P35/00 

Область техники

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается линейных тетрациклических гетероциклических производных антрацендиона, их структуры, методов получения и медицинского использования в качестве цитотоксических агентов, ингибирующих активность нескольких внутриклеточных мишеней, важных для опухолевого роста (включая топоизомеразы I, II, теломеразу, протеинкиназы, G-квадруплексные структуры нуклеиновых кислот).

Уровень техники

Среди производных 9,10-анрацендиона (антрахинона) было выявлено большое количество производных обладающих противоопухолевой активностью. Так, антрациклиновые антибиотики и их полусинтетические производные успешно используются для лечения онкологических заболеваний. Однако клиническое применение антрациклинов выявило ряд недостатков, основными из которых являются высокая кардиотоксичность и развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) в опухолевых клетках. Поиск более доступных и эффективных противоопухолевых препаратов с пониженной кардиотоксичностью привел к открытию высокоактивных 1,4-бис-(2-аминоэтиламино)антрацендионов (например, препаратов митоксантрон и аметантрон (1a-b) [Zee-Cheng R.K.Y., Cheng C.C. Drugs Future. 1983, 8, 228]).

Позднее в ходе оптимизации полициклического ядра и варьирования структуры боковых цепей были найдены препараты с улучшенными химиотерапевтическими свойствами - оксантразол (2), пиксантрон (3), нортопиксантрон (4) [Patterson L.H. GB pat. №2254614; Krapcho P.A. et al. EP pat. №503537; JP 1995165726]. Характерной особенностью этого класса противоопухолевых агентов является наличие полициклического ядра на основе 9,10-антрацендиона или его гетероциклического аналога и двух боковых аминоалкиламиногрупп, содержащих терминальную амино, метиламино или этаноламиногруппы.

В ряду линейных тетрациклических гетероаренантрацендионов также были описаны подобные соединения с высокой противоопухолевой активностью, содержащие в положениях 4 и 11 аминоалкиламиногруппы, например нафтоиндолдион 5а и антратиофендион 5b [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861; Shchekotikhin A.E. et al., Eur. J. Med. Chem., 2011, 46, 423, Curd J.G. et al. WO pat. №2006031719].

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение призвано получить цитотоксические производные тетрациклических линейных гетероаренантрацендионов, содержащие в боковых цепях остатки галогенацетамидинов. Из-за особенностей строения и реакционной способности боковых цепей производные этого нового химотипа обладают мультитаргетным действием, т.е. способны ингибировать активность нескольких внутриклеточных мишеней (включая топоизомеразы I, II, теломеразу, протеинкиназы, G-квадруплексные структуры нуклеиновых кислот), важные для пролиферации опухолевых клеток. Настоящее изобретение включает соединения, соответствующие формуле 6, и их фармакологически приемлемые соли, пригодные для терапии онкологических заболеваний.

Где X, Y, Z - означают независимо СН- или NH-группы или гетероатомы, выбранные из О, N и S, формирующие пятичленный гетероарен, необязательно замещенный алкилом. Примеры гетероциклических ядер, пригодных для формирования базовой структуры гетероаренантрацендиона, включают без ограничения перечисленным, пиррол, фуран, тиофен, пиразол, оксазол, тиазол, изотиазол, имидазол;

Hal независимо означает атом фтора, хлора, брома или йода;

m и n означают независимо число от 2 до 4 и равное количеству спейсерных СН₂-групп, соединяющих аминогруппы в пери-положениях гетероаренантрацендиона с атомами азота остатков галогенацетамидинов, расположенных в боковых цепях.

W означает заместители, независимо выбранные из группы: амино, гидрокси, алкокси, фтор. Известно, что наличие таких групп в пери-положениях хинонового фрагмента (например, в препаратах 1а, 2), не вызывающих существенных стерических затруднений при связывании с ДНК, в ряде случаев приводит к росту или к изменению спектра противоопухолевой активности антрахинонсодержащих препаратов [Lown J.W. (Ed.) Anthracycline and Anthracendione based Anticancer Agents (Bioactive molecules), Elsevier, Science Publishers B.V.: Amsterdam, 1988, 6, 738 p.; Krohn К. (Ed.) Anthracycline chemistry and biology II. Mode of action, clinical aspects and new drugs. In Topics Current Chemistry; Springer: Heidelberg, 2008, 283, 224 p.; Swenton J.S. et al. US pat. №4663445; Curd J.G. et al. WO pat. № 2006031719];

k означает число заместителей W в антрацендионовом фрагменте, независимо равное от 0.

Подразумевается, что кратные связи в гетероаренантрацендионе и остатках галогенацетамидинов могут принимать различные резонансные формы.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного соединения формулы 6, или его фармацевтически приемлемых солей или сольватов.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению таких соединений в качестве терапевтически активных для лечения заболеваний человека, связанных с повышенной скоростью роста клеток (т.е. гиперпролиферацией), прежде всего онкологических заболеваний различного генеза, включая без ограничения перечисленным, карциномы, лейкемии, лимфомы, меланомы, саркомы и т.п. В дополнение к настоящему изобретению относится способ лечения, заключающийся во введении указанной выше фармацевтической композиции субъекту с заболеванием.

Биологическое действие изобретения отличается от полученных ранее аналогов за счет модификации боковых аминогрупп в остатки галогенацетамидинов. Так, основной мишенью линейных тетрациклических гетероаренантрацендионов 5 а, b, содержащих аминогруппы в цепях, является топоизомераза I [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2006, 14, 5241; Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861]. Ведение в боковые цепи гетероаренантрацендионов основных групп с делокализованными зарядами (например, гуанидино- и ацетамидиногрупп в соединениях 7 a, b) приводит повышению ингибиторной активности в отношении топоизомеразы I, a также в отношении другой перспективной мишени противоопухолевой терапии - теломеразы за счет повышения аффинности лиганда к G-квадруплексным структурам ДНК [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861; Kaluzhny D. et al., PLoS ONE, 2011, 6 (11), е27151].

Известно, что α-галогенациламидины обладают высокой реакционной способностью и легко образуют ковалентные связи с нуклеофильными группами ферментов, белков и других биомолекул (схема A) [Causey С.Р., Thompson P.R. Tetrahedron Lett. 2008, 48, 4383; Luo Y., Knuckley В., Lee Y. - H., Stallcup M.R., Thompson P.R.J. Am. Chem. Soc., 2006, 128 (4), 1092].

Таким образом, введение галогенациламидинов в боковые цепи гетероаренантрацендионов может привести к появлению у соединений мультитаргетного (многоцелевого) действия и потенцированию их антипролиферативной активности за счет дополнительной способности остатков галогенациламидинов образовывать ионные и ковалентные комплексы с внутриклеточными мишенями. Аналогичный подход был использован для дизайна противоопухолевого препарата Алкемикс (8), содержащего реакционноспособную бис(β-хлорэтил)аминогруппу в боковой цепи, которая придает соединению способность образовывать ковалентные комплексы с мишенями и делает его активным в отношении антрациклин - и цисплатин-резистентных опухолей [Patterson L.H. et al. Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 607].

Соединения по настоящему изобретению могут быть получены различными способами. Описанная ниже схема лишь иллюстрируют возможность синтеза заявленных структур. Исходные материалы и реагенты, которые используются при получении соединений формулы 6, являются коммерческими химическими препаратами, поставляемыми фирмами, такими как Aldrich Chemical Co., или их можно получить методами, известными специалисту в данной области или описанными в литературе.

Если не указано иное, реакции, приведенные в описании заявки, предпочтительно проводят при атмосферном давлении от приблизительно -78°С до 180°С, более предпочтительно от 0°С до 120°С в инертном растворителе или без него.

Один из способов получения соединений формулы 6 по настоящему изобретению основан на взаимодействии тетрациклических линейных гетероаренантрацендионов 9, содержащих в боковых цепях аминоалкиламиногруппы, с производными иминоэфиров, иминотиоэфиров, нитрилов или иминохлорангидридов α-галогенкарбоновых кислот и т.п., однако предпочтительным является использование производных иминоэфиров или иминотиоэфиров карбоновых кислот, содержащих радикал R и галоген Hal в α-положении (схема Б). В этом случае LG (уходящая группа) означает алкокси, арилоксигруппу или алкилтиогруппу.

Исходные аминоалкиламинопроизводные гетероаренантрацендионов 9 могут быть получены различными методами, например по методикам, описанным в литературе [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 77, 1861; Shchekotikhin A.E. et al., Eur. J. Med. Chem., 2011, 46, 423; Curd J.G. et al. WO pat. № 2006031719].

Если не указано иное, термины, используемые в описании заявки и пунктах формулы изобретения, имеют значения, указанные ниже. Следует отметить, что, если не указано иное, используемые в описании и пунктах формулы формы единственного числа включают также формы множественного числа.

"Алкил" означает, если не указано иное, одновалентный насыщенный углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью или циклический радикал, включающий только атомы углерода и водорода и содержащий от 1 до включительно 6 атомов углерода. Примеры алкильных радикалов включают, без ограничения перечисленным, метил, этил, пропил, изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, н-гексил и т.п.

"Алкилтио" означает радикал -SR, где R означает указанный выше алкил. Примеры алкилтиорадикала включают, без ограничения перечисленным, метилтио, этилтио и т.п.

"Алкилен" означает насыщенный двухвалентный углеводородный радикал с прямой цепью, содержащий от одного до четырех атомов углерода, или насыщенный двухвалентный углеводородный радикал с разветвленной цепью, содержащий от трех до шести атомов углерода. Например, С2-С3 алкилен включает метилен, этилен, 2,2-диметилэтилен, пропилен, 2-метилпропилен и т.п.

"Алкокси" означает радикал -OR, где R означает указанный выше алкильный радикал. Примеры алкоксирадикалов включают, без ограничения перечисленным, метокси, этокси, изопропокси, изобутокси и т.п.

"Амино" означает группы -NH₂, -NHR¹, -NR¹R², где R¹ и R² каждый независимо означает алкильные радикалы, указанные выше. Примеры амино радикалов включают, без ограничения перечисленным, метиламино, этиламино, диметиламино, метилэтиламино, диэтиламино и т.п.

"Аминоалкиламино" означает насыщенный углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью, содержащий от одного до четырех атомов углерода, связанный с двумя аминогруппами, указанными выше, при условии, что к одному углеродному атому присоединено не более одной аминогруппы. Примеры аминоалкиламинорадикалов включают, без ограничения перечисленным, 2-аминоэтиламино, 2-(метиламино)этиламино, 2-(этиламино)этиламино, 2-[(2-гидроксиэтил)амино]этиламино, 2-аминопропиламино, 3-аминопропиламино и т.п.

"Антрацендион" означает остаток необязательно замещенного 9,10-антрацендиона (антрахинона).

"Ацил" означает группу, соответствующую формуле: -COR, -CSR, где R означает, без ограничения перечисленным, водород или алкил, алкенил, арил, гетероарил, гетероциклил.

"Ацилокси" означает группу, соответствующую формуле: -OCOR, -OCSR, где R означает, без ограничения перечисленным, водород или алкил, алкенил, арил, гетероарил.

"Галоген" означает радикал фтора, брома, хлора, иода.

"Галогеналкил" означает алкильный радикал, имеющий значения, указанные выше, замещенный в любом положении одним или более атомами галогена. Примеры галогеналкильного радикала включают, без ограничения перечисленным, 1-фторметил, 1,2-дифторметил, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, хлорметил и т.п.

"Гетероарил" означает, если не указано иное, одновалентный ароматический карбоциклический радикал, содержащий один или более циклов, включающих в цикле один, два или три гетероатома (выбранных из N, О или S), и необязательно замещенный заместителем, выбранным из группы, включающей гидрокси, циано, алкил, алкокси, тиоалкил, галоген, галогеналкил, гидроксиалкил, нитро, алкоксикарбонил, амино, алкиламино, диалкиламино, аминокарбонил, карбониламино, аминосульфонил, сульфониламино и/или алкилсульфонил. Примеры гетероарильных радикалов включают, без ограничения перечисленным, пирролил, тиофенил, фурил, имидазолил, оксазолил, тиазолил, пиразолил, оксадиазолил, пиранил, пиридинил, хинолинил, изохинолинил, бензофурил, бензотиофенил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензотиазолил, бензопиранил, индазолил, индолил, изоиндолил и т.п.

"Гетероаренантрацендион" означает, если не указано иное, линейную замещенную тетрациклическую систему, состоящую из пятичленного гетероарена, конденсированного с антрацендионом по связи 2-3. Примеры гетероаренов, пригодных для построения гетероаренантрацендионов, включают содержащие не менее двух атомов углерода (общих с антрацендионовым фрагментом) гетероциклы: пиррол, фуран, тиофен, пиразол, оксазол, тиазол, изотиазол, имидазол, триазол и т.п.

"Изомеры" означает соединения с одинаковой молекулярной формулой, но отличающиеся природой или последовательностью химических связей или пространственным расположением атомов.

Термин "ингибитор" относится к соединению, которое уменьшает активность фермента или снижает скорость деления опухолевых клеток.

"Инертный органический растворитель" означает растворитель, инертный в условиях описываемой в тексте реакции, включающий, например, бензол, толуол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метилпирролидон, диметилсульфоксид, сульфолан, хлороформ, дихлорметан, дихлорэтан, этилацетат, ацетон, метилэтилкетон, метанол, этанол, пропанол, изопропанол, трет-бутанол, диоксан, пиридин и т.п. Если не указано иное, растворители, использованные в реакциях по настоящему изобретению, являются инертными растворителями.

"Карбоксиалкил" обозначает группу, соответствующую формуле: -CO₂R, где R означает алкил.

"Карбоксамидо" обозначает группу, соответствующую формуле: -CONR₁R₂, где NR₁R₂ означает амино, аминоалкиламино или азотсодержащий гетероциклил. Примеры NR₁R₂ радикалов включают, без ограничения перечисленным, амино, метиламино, этиламино, диметиламино, метилэтиламино, диэтиламино, аминоэтиламино, морфолинил, пиперазинил.

"Необязательный" или "необязательно" означает, что последующее событие или обстоятельство может произойти, но необязательно произойдет и что описание включает случаи, когда это событие или обстоятельство произойдет, и случаи, когда оно не произойдет. Например, термин "необязательно замещенный" при использовании в связи с термином "арил", "фенил", "бензил", "бензоил", "гетероарил" или "гетероциклил" означает арил, фенил, бензил, бензоил, гетероарил или гетероциклил, который необязательно и независимо содержит от одного до пяти заместителей, предпочтительно один или два заместителя, выбранных из группы, включающей алкил, алкокси, циклоалкил, галогеналкил, гидрокси, гидроксиалкил, галоген, нитро, циано, гидрокси, алкокси, амино, ациламино, аминоалил, карбоксиалкил, карбомоил, ацилокси и т.п.

"Сольваты" означает сольватированные формы, содержащие стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя. Некоторые соединения способны удерживать в кристаллической решетке фиксированное количество молекул растворителя, образуя сольват. Гидраты образуются в том случае, если в качестве растворителя используется вода, а алкоголяты образуются в том случае, если растворителем является спирт.

"Субъект" означает млекопитающих, т.е. любого члена класса млекопитающих, включая, без ограничения перечисленным, человека, приматов, сельскохозяйственных животных, лабораторных животных и т.п., предпочтительно человека. Термин «субъект» не означает конкретный возраст или пол.

"Таутомеры" означает соединения, структуры которых отличаются пространственным расположением атомов, но находятся в равновесном состоянии. Соединения формулы 6 содержат группы, которые могут находиться в таутомерном равновесии, поэтому подразумевается, что настоящее изобретение включает все таутомерные формы соединений 6, а их названия не исключают любые таутомерные формы.

"Терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, которое при введении субъекту для лечения патологического состояния является достаточным для оказания фармакологического действия при лечении патологического состояния субъекта. Терапевтически эффективное количество варьируется в зависимости от типа соединения, патологического состояния, подлежащего лечению, тяжести болезни, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, от способа и формы введения, от мнения лечащего врача или практикующего ветеринара и других факторов.

"Уходящая группа" означает группу, название которой обычно ассоциируется с ее использованием в синтетической органической химии, т.е. означает атом или группу атомов, которая замещается в условиях реакции. Примеры уходящей группы включают, без ограничения перечисленным, галоген, алкансульфонилокси (такие, как метансульфонилокси, этансульфонилокси), аренсульфонилокси, (такие, как бензолсульфонилокси, тозилокси), алкокси (метоксти), алкилтио (тиометил), арилокси (фенокси), амино (диметиламино) и т.п.

"Фармакологическое действие" означает термин, используемый в описании заявки, включает результаты воздействия на субъект, при которых достигается предполагаемая цель терапии. Например, фармакологическое действие означает такие результаты воздействия, которые приводят к излечению или замедлению развития, предупреждению рецидива заболевания.

"Фармацевтически приемлемый" означает материал, который используют при получении фармацевтической композиции и который обычно является безопасным, нетоксичным, безопасным в биологическом или ином отношении и включает материал, приемлемый как в ветеринарии, так и в фармацевтике.

"Фармацевтически приемлемые соли" соединения означают соли, которые являются фармацевтически приемлемыми и обладают необходимой фармакологической активностью исходного соединения. Такие соли включают: (1) кислотно-аддитивные соли неорганических кислот, таких как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т.п., или органических кислот, таких как уксусная кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, фумаровая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, метансульфоновая кислота, пропионовая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, винная кислота, толуолсульфоновая кислота и т.п., или (2) соли, образующиеся при замене кислотного протона (в O-Н, N-H или S-H-группах), присутствующего в исходном соединении, на ион металла, например, ион щелочного металла, ион щелочно-земельного металла или ион алюминия, или при образовании координационного соединения с органическим или неорганическим основанием. Приемлемые органические основания включают диэтаноламин, этаноламин, триэтаноламин и т.п. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид калия, карбонат натрия, гидроксид натрия, гидроксид алюминия, гидроксид кальция и т.п. Подразумевается, что фармацевтически приемлемые соли включают сольваты или кристаллические формы (полиморфные образования) указанной кислотно-аддитивной соли. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми солями являются соли уксусной кислоты, соляной кислоты, серной кислоты, метансульфоновой кислоты, малеиновой кислоты, фосфорной кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, соли натрия, калия, кальция, цинка и магния.

Краткое описание фигур

Фиг.1 представляет собой электрофореграммы продуктов реакции релаксации суперскрученной плазмидной ДНК под действием топоизомеразы I в присутствии 0.5, 1, 5, 10 мкМ тестируемых веществ 6а, 6с, 6е, 6j на гелях с бромистым этидием (А) и без него (Б). ДНКсс - суперскрученная плазмида рВК₃₂₂ без топоизомеразы I и веществ; T-I - топоизомераза I + ДНКсс без веществ; ОК - открытая кольцевая форма ДНК; РЛ-релаксированная кольцевая форма ДНК; остальные дорожки - вещества с соответствующих концентрациях + ДНКсс + топоизомераза I, как описано в примере А.

Фиг.2 представляет собой электрофореграмму продуктов реакции релаксации суперскрученной плазмидной ДНК под действием топоизомеразы I в присутствии/в отсутствие веществ 6b и 6 с на гелях с бромистым этидием (А) и без него (Б). ДНКсс - суперскрученная плазмида pBR₃₂₂ без топоизомеразы I и веществ; T-I - топоизомераза I + ДНКсс без веществ; ОК - открытая кольцевая форма ДНК; РЛ - релаксированная кольцевая форма ДНК; остальные дорожки - вещества в соответствующих концентрациях + ДНКсс + топоизомераза I, как показано в примере А.

Фиг.3 представляет собой электрофореграмму продуктов реакции релаксации суперскрученной плазмидной ДНК под действием топоизомеразы II в присутствии/в отсутствие веществ 6b и 6с на геле без бромистого этидия. ДНКсс-суперскрученная плазмида р-НОТ-1 без топоизомеразы II и веществ; T-II - топоизомераза II + ДНКсс без веществ; ДНКлин - линейная форма ДНК; остальные дорожки - вещества в соответствующих концентрациях + топоизомераза II + ДНКсс, как показано в примере А.

Фиг.4 представляет собой внутриклеточное накопление бисхлорацетамидина 6е и бисгуанидина 7а в клетках карциномы мочевого пузыря Т24 после 8 ч инкубации с соединениями, как показано в примере Г.

Один из возможных методов синтеза соединений структурной формулы 6 (схема В) и типичные представители по изобретению приводятся в ряде примеров, описанных ниже.

Исходные 4,11-бис(аминоалкиламино)производные гетаренантрацендионов формулы 9а-l могут быть получены, например, описанными ранее методами [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861; Shchekotikhin A.E. et al., Eur. J. Med. Chem., 2011, 46, 423; Curd J. G. et al. WO pat. № 2006031719].

Пример 1

4,11-Бис[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]нафто[2,3-f]индол-5,10-дион дигидрохлорид (6а)

К раствору 100 мг (0.26 ммоль) 4,11-бис(2-аминоэтиламино)нафто[2,3-b]индол-5,10-диона (9а, m=n=2, X=NH, Y=Z=C-H, схема В), полученного по методу [Shchekotikhin А.Е. et al., Bioorg. Med. Chem., 2006, 14, 5241], в 10.0 мл ДМСО прибавляют 10 мл метанола, 0.16 мл (1.1 ммоль) триэтиламина и 170 мг (1.1 ммоль) гидрохлорида этил 2-хлорацетамидата. Реакционную смесь перемешивают 3 ч при 45°С, охлаждают и осаждают ацетоном. Темно-фиолетовый осадок очищают хроматографически на носителе с обращенной фазой (H₂O-MeCN-HCO₂H, 50:10:1). Очищенный продукт растворяют в теплом МеОН и переосаждают 0.5 мл 1 н. раствора HCl в МеОН, осадок промывают ацетоном и сушат. Выход бисамидина 6а 59 мг (44%). Т. пл. >250°С (разл.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 9.75 мин, чистота 98%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), δ, м. д., J (Гц): 8.14 (2Н, м, Н-6,9); 7.60 (2Н, м. Н-7,8); 7.41 (1Н, м, Н-2); 6.95 (1Н, м, Н-3); 4.48 (2Н, с, CH₂Cl); 4.44 (2Н, с, CH₂Cl); 4.07 (4Н, м, HNCH₂); 3.79 (2Н, м, CH₂NH); 3.73 (2Н, м, CH₂NH). Найдено: m/z (ESI), найдено: 514.1455 [М+Н]⁺. C₂₄H₂₅Cl₂N₇O₂. Вычислено: 514.1525.

Пример 2

4,11-Бис[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]антра[2,3-b]фуран-5,10-дион дигидрохлорид (6b)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4,11-бис(2-аминоэтиламино)антра[2,3-b]фуран-5,10-диона (9b, m=n=2, X=O, Y=Z=CH, схема В). Выход 41% бисамидина 6b. Т. пл. >250°С (разд.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С - 18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 12.09 мин, чистота 98%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), δ, м. д., J(Гц): 8.17 (2Н, м, Н-6,9); 7.89 (1Н, д, J=2.2, Н-2); 7.64 (2Н, м, Н-7,8); 7.30 (1Н, д, J=2.2, Н-3);4.48 (2Н, с, CH₂Cl); 4.41 (2Н, с, CH₂Cl); 4.16 (2Н, м, HNCH₂); 4.03 (2Н, м, HNCH₂); 3.77 (2Н, т, J=6.5, CH₂NH); 3.71 (2Н, т, J=6.1, CH₂NH). Найдено: m/z (ESI), найдено: 515.1353 [M+H]⁺. C₂₄H₂₄Cl₂N₆O₃. Вычислено: 515.1365.

Пример 3

4,11-Бис[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]-2-метилантра[2,3-b]фуран-5,10-дион дигидрохлорид (6с)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4,11-бис(2-аминоэтиламино)-2-метилантра[2,3-6]фуран-5,10-диона (9с, m=n=2, X=O, Y=C-Me, Z=CH, схема В), синтезированного по методу [Shchekotikhin A.E. et al., Eur. J. Med. Chem., 2011, 423]. Выход 44% бисамидина 6с. Т. пл. >250°С (разл.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 14.2 мин, чистота 95%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), δ, м. д., J (Гц): 8.18 (2Н, м, Н-6,9); 7.67 (2Н, м, Н-7,8); 6.85 (1Н, с, Н-3); 4.49 (2Н, с, CH₂Cl); 4.41 (2Н, с, CH₂Cl); 4.14 (2Н, т, J=6.5, HNCH₂); 3.99 (2Н, т, J=6.1, HNCH₂); 3.77 (2Н, т, J=6.5, CH₂NH); 3.71 (2Н, т, J=6.1, NH₂NH); 2.47 (3Н, с, СН₃). Найдено: m/z (ESI), найдено: 529.1466 [M+H]⁺. C₂₅H₂₆Cl₂N₆O₃. Вычислено: 529.1521.

Пример 4

4,11-Бис[3-(2-хлорацетимидамидо)пропиламино]-2-метилантра[2,3-b]фуран-5,10-дион дигидрохлорид(6d)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4,11-бис(2-аминопропиламино)-2-метилантра[2,3-6]фуран-5,10-диона (9d m=n=3, X=O, Y=C-Me, Z=CH, схема В). Выход 38% бисамидина 6d. Т. пл. >250°С (разл.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 16.29 мин, чистота 95%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, ДМСО-d₆), δ, м. д., J(Гц): 12.31 (1Н, с, NH); 11.78 (1Н, с, NH); 10.55 (1Н, с, NH); 10.44 (1Н, с, NH); 9.73 (2H, с, NH); 9.45 (1Н, с, NH); 9.36 (1Н, с, NH); 8.25 (2H, м, Н-6,9); 7.75 (2H, м, Н-7,8); 7.21 (1Н, с, Н-3); 4.51 (2H, с, CH₂Cl); 4.49 (2H, с, CH₂Cl); 3.92 (2H, м, HN₂CH₂); 3.80 (2H, м, CH₂NH); 3.55 (2H, м, CH₂NH); 3.47 (6Н, м, CH₂); 2.02 (3Н, с, СН₃). Найдено: m/z (ESI), найдено: 557.1818 [М+Н]⁺. C₂₇H₃₀Cl₂N₆O₃. Вычислено: 557.1834.

Пример 5

4,11-Бис[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]антра[2,3-b]тиофен-5,10-дион дигидрохлорид (6е)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4,11-бис(2-аминоэтиламино)антра[2,3-b]тиофен-5,10-диона (9е m=n=2, X=S, Y=Z=CH, схема В), синтезированного по методу [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861]. Выход 38% бисамидина 6е. Т. пл. >250°С (разл.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 11.87 мин, чистота 97%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), δ, м. д., J(Гц): 8.18 (2H, м, Н-6,9); 7.98 (1Н, д, J=7.8, Н-3); 7.89 (1Н, д, J=7.8, Н-2); 7.67 (2Н, м, Н-7,8); 4.43 (4Н, с, CH₂Cl); 4.15 (2Н, м, HNCH₂); 4.00 (2Н, м, HNCH₂); 3.73 (4Н, м, CH₂NH). Найдено: m/z (ESI), найдено: 531.1040 [М+Н]⁺. C₂₄H₂₄Cl₂N₆O₂S. Вычислено: 531.1137.

Пример 6

11-[3-(2-Хлорацетимидамидо)пропиламино]-4-[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]-антра[2,3-b]тиофен-5,10-дион дигидрохлорид (6f)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4-(2-аминоэтиламино)-11-(2-аминопропиламино)антра[2,3-b]тиофен-5,10-диона (9f m=2, n=3, X=S, Y=Z=CH, схема В). Выход 41% бисамидина 6f. Т. пл. >250°С (разл.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 14.28 мин, чистота 96%. Найдено: m/z (ESI), найдено: 545.1288 [М+Н]⁺. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), δ, м. д., J(Гц): 8.13 (2Н, м, Н-6,9); 7.96 (1Н, д, 7=5.8, Н-3); 7.85 (1Н, д, J=5.8, Н-2); 7.64 (2Н, м, Н-7,8); 4.45 (2Н, с, CH₂Cl); 4.42 (2Н, с, CH₂Cl); 3.98 (4Н, уш. м, 2HNCH₂); 3.72 (2Н, т, J=5.8, CH₂NH); 3.58 (2Н, т, J=6.8, CH₂NH); 2.16 (2Н, м, CH₂). C₂₅H₂₆Cl₂N₆O₂S. Вычислено: 545.1293.

Пример 7

11-[3-(2-Хлорацетимидамидо)пропиламино-4-[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]-антра[2,3-b]тиофен-5,10-дион дигидрохлорид (6g)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4-(2-аминопропиламино)-11-(2-аминоэтиламино)антра[2,3-b]тиофен-5,10-диона (9g m=3, n=2, X=S, Y=Z=CH, схема В). Выход 43% бисамидина 6g. Т. пл. >250°С (разд.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 14.38 мин, чистота 97%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), 5, м. д., J (Гц): 8.19 (2Н, м, Н-6,9); 8.07 (1Н, д, J=5.8, Н-3); 8.01 (1Н, д, J=5.8, Н-2); 7.71 (2Н, м, Н-7,8); 4.45 (2Н, с, CH₂Cl); 4.43 (2Н, с, CH₂Cl); 4.22 (2Н, м, HNCH₂); 3.82 (2Н, м, HNCH₂); 3.77 (2Н, т, J=5.9, CH₂NH); 3.56 (2Н, т, J=6.9. CH₂NH); 2.28 (2Н, м, CH₂). Найдено: m/z (ESI), найдено: 545.1273 [М+Н]⁺. C₂₅H₂₆Cl₂N₆O₂S. Вычислено: 545.1293.

Пример 8

4,11-Бис[3-(2-хлорацетимидамидо)пропиламино]антра[2,3-b]тиофен-5,10-дион дигидрохлорид (6h)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4-бис(2-аминопропиламино)антра[2,3-6]тиофен-5,10-диона (9h m=n=3, X=S, Y=Z=CH, схема В). Выход 37% бисамидина 6h. Т. пл. >250°С (разл.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 15.06 мин, чистота 94%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), 8, м. д., J(Гц): 8.15 (2Н, м, Н-6,9); 8.031 (2Н, м, Н-2,3); 7.70 (2Н, м, Н-7,8); 4.45 (2Н, с, CH₂Cl); 4.43 (2Н, с, CH₂Cl); 3.80 (2Н, уш. м, HNCH₂); 3.65 (6H, уш. м, HNCH₂, 2CH₂NH); 2.21 (2Н, м, CH₂). Найдено: m/z (ESI), найдено: 559.1432 [М+Н]⁺. C₂₆H₂₈Cl₂N₆O₂S. Вычислено: 559.1450.

Пример 9

4-Бис[4-(2-хлорацетимидамидо)бутиламино]антра[2,3-b]тиофен-5,10-дион дигидрохлорид (6i)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4-бис(2-аминобутиламино)антра[2,3-6]тиофен-5,10-диона (9i m=n=4, X=S, Y=Z=CH, схема В). Выход 33% бисамидина 6i. Т. пл. >250°С (разл.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - Н₃РО₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 16.88 мин, чистота 97%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), δ, м. д., J(Гц): 8.21 (2Н, м, Н-6,9); 8.03 (1Н, д, J=6.8, Н-3); 7.95 (1Н, д, J=6.8, Н-2); 7.70 (2Н, м, Н-7,8); 4.42 (4Н, с, CH₂Cl); 3.73 (4Н, уш. м, 2HNCH₂); 3.45 (4Н, м, CH₂NH); 1.91 (8Н, м, 2(CH₂)₂). Найдено: m/z (ESI), найдено: 587.1740 [М+Н]⁺. C₂₈H₃₂Cl₂N₆O₂S. Вычислено: 587.1763.

Пример 10

4,11-Бис[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]нафто[2,3-f]индазол-5,10-дион дигидрохлорид (6j)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4,11-бис(2-аминоэтиламино)нафто[2,3-f]индазол-5,10-диона (9j m=n=2, X=NH, Y=N, Z=CH схема В), синтезированного по методу [А.Е. Щекотихин. Гетероциклические аналоги 5,12-найтаценхинона. Синтез, химические свойства и биологическая активность, Lambert Academic Publishing, 2011, с.408]. Выход 35% бисамидиана 6j. Т. пл. >250°С (разд.). ВЭЖХ: колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 (4.0×250 мм, LW=564 нм), элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин), время элюирования 11.24 мин, чистота 95%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), δ, м. д., J (Гц): 8.52 (1Н, с, Н-3); 8.11 (2Н, м, Н-6,9); 7.64 (2Н, м, Н-7,8); 4.54 (2Н, с, CH₂Cl); 4.45 (2Н, с, CH₂Cl); 4.42 (2Н, т, J=4.0, HNCH₂); 3.98 (2Н, т, J=3.1, HNCH₂); 3.85 (2Н, т, J=4.0, CH₂NH); 3.78 (2Н, т, J=3.1, CH₂NH). Найдено: m/z (ESI), найдено: 515.1411 [М+Н]⁺. C₂₃H₂₄Cl₂N₈O₂. Вычислено: 515.1477.

Пример 11

4,11-Бис[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]антра[2,3-d]имидазол-5,10-дион дигидрохлорид (6k)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4,11-бис(2-аминоэтиламино)антра[2,3-d]изоксазол-5,10-диона (9k, m=n=2, X=NH, Y=CH, Z=N схема В), синтезированного по методу [А.Е. Щекотихин. Гетероциклические аналоги 5,12-найтаценхинона. Синтез, химические свойства и биологическая активность, Lambert Academic Publishing, 2011, с.427]. Выход 45% бисамидина 6k. T. пл. >250°С (разд.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 9.05 мин, чистота 97%. Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, CD₃OD), δ, м. д., J(Гц): 8.19 (2Н, м, Н-6,9); 7.82 (1Н, с, Н-2); 7.68 (2Н, м, Н-7,8); 4.51 (2Н, с, CH₂Cl); 4.43 (2Н, с, CH₂Cl); 4.39 (2Н, т,.7=4.2, HNCH₂); 3.96 (2Н, т, J=3.0, HNCH₂); 3.84 (2Н, т, J=4.2, CH₂NH); 3.77 (2Н, т, J=3.0, CH₂NH). Найдено: m/z (ESI), найдено: 515.1461 [М+Н]⁺. C₂₃H₂₅Cl₂N₈O₂. Вычислено: 515.1472.

Пример 12

4,11-Бис[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]антра[2,3-d]изотиазол-5,10-дион дигидрохлорид (6l)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1, из 4,11-бис(2-аминоэтиламино)антра[2,3-b]фуран-5,10-диона (9l, m=n=2, X=S, Y=N, Z=CH, схема В), [А.Е. Щекотихин, Гетероциклические аналоги 5,12-найтаценхинона. Синтез, химические свойства и биологическая активность, Lambert Academic Publishing, 2011, с.412]. Выход 38% бисамидина 61. Т. пл. >250°С (разл.). ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.0×250 мм, LW=564 нм, элюент: А - H₃PO₄ (0.01 М), рН 2.6, В - MeCN; градиент В 15 → 40% (20 мин): время элюирования 10.65 мин, чистота 98%. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, CD₃OD), 5, м. д., J(Гц): 9.39 (1Н, с, Н-3);8.21 (2Н, м, Н-6,9); 7.69 (2Н, м, Н-7,8); 4.44 (4Н, с, CH₂Cl); 4.13 (2Н, м, HNCH₂); 4.02 (2Н, м, HNCH₂); 3.75 (4Н, м, CH₂NH). Найдено: m/z (ESI), найдено: 532.1067 [M+H]⁺. C₂₃H₂₄Cl₂N₇O₂S. Вычислено: 532.1084.

Примеры, подтверяодающие наличие биологической активности

Пример А

Ингибирование активности топоизомераз I и II

Известно, что топоизомеразы, ферменты, осуществляющие релаксацию сверспирализованной ДНК, являются одними из важнейших внутриклеточных мишеней для противоопухолевого действия антрахинон-содержащих препаратов [Li T. - K., Liu L. F. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2001, 40, 53]. Для выявления способности заявленных соединений ингибировать каталитическую активность топоизомеразы I или II были использованы стандартные протоколы (topoisomerase I/II assays) [Nitiss J.L. Current Protocols in Pharmacolog. 1998, 3.3.1-3.3.21; Bailly С.Methods Enzymol. 2001, 340, 610], основанные на различиях в электрофоретической подвижности топоизомеров ДНК, образующихся из плазмидной ДНК (ДНКсс) при действии топоизомераз (I или II).

Для исследования влияния новых производных линейных гетероаренантрацендионов, содержащих в боковых цепях остатки галогенацетамидинов, на каталитическую активность топоизомеразы I использовалась суперскрученная плазмидная ДНК (pBR₃₂₂, Fermentas, Литва) и топоизомераза I (Promega, USA). Результаты проведенного эксперимента с топоизомеразой I представлены на Фиг.1-А, Б. При действии на суперскрученную плазмиду (позиция ДНКсс, Фиг.1-А - отрицательный контроль реакции) топоизомеразы плазмида релаксирует, образуя набор ДНК-топоизомеров (позиция T-I, Фиг.1-А - положительный контроль реакции). Присутствие в реакционной смеси 4,11-бис(хлорацетамидино)производных гетаренантрацендинонов (6а, 6с, 6е, 6j) в диапазоне концентраций от 0,5 мкМ до 10 мкМ дозозависимо снижает активность топо I, приводя к полному прекращению реакции при концентрациях >1 мкМ (см. позиции 5 и 10 мкМ, Фиг.1-А).

Введение бромистого этидия (БЭ, 10^-6 г·мл^-1) в гель до проведения электрофореза вызывает значительное снижение подвижности открытой кольцевой форма ДНК (ОК) по сравнению с ДНКсс и релаксированной ДНК (РЛ) (Фиг.1-Б). В этом тесте наибольшую активность и высокую специфичность продемонстрировал антрафурандион 6с, который в концентрациях >1 мкМ вызывает достоверно значительно большее накопление открытой кольцевой формы ДНК (ОК), по сравнению с другими бисамидинами (Фиг.1-Б).

Важную роль в специфичности ингибирования топоизомеразы I играет заместитель в гетероциклилическом ядре бисамидинов. Так, 2-метильное производное 6с вызывает значительно больше накопление ОК в концентрациях выше 10 мкМ, чем его аналог 6b, без метильной группы в гетероциклическом ядре, причем существенное различие заметно как на геле в отсутствие (Фиг.2-А), так и в присутствии БЭ (Фиг.2-Б).

Для исследования влияния гетероаренантрацендионов 6 на каталитическую активность топоизомеразы II использовалась суперскрученная плазмидная ДНК (р-НОТ-1, TopoGen, USA) и топоизомераза II (TopoGen, USA). Соединения 6b и 6 с ингибируют активность топоизомеразы II в исследованном интервале концентраций от 1 мкМ до 20 мкМ (Фиг.3).

Как видно из представленных данных, соединения 6, являющиеся предметом настоящего изобретения, ингибируют активность обоих типов топоизомераз (как I, так и II типа) в микромолярных и субмикромолярных концентрация, в то время как ранее описанные аналоги 5а, b ингибируют активность лишь топоизомеразы I, причем в концентрациях выше 5 мкМ [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861; Деженкова Л.Г., и т.д. Бюлл. Экспер. Биол. и Мед. 2008, 3, 304].

Пример Б

Ингибирование активности протеинкиназ

Известно, что в ряду производных антрацендиона были обнаружены высокоактивные ингибиторы протеинкиназ [Cozza G. et al. Bioorg. Med Chem. Lett., 2008, 18 (20), 5672]. В связи с этим для соединений, являющихся предметом настоящего изобретения, было на активность протинкиназ исследовано влияние структуры боковых цепей гетероаренантрацендионов. Для этого было проведено сравнительное изучение противокиназной активности бисамидина 6е и его аналога 5b, не содержащего остатков хлорацетамидинов в боковых цепях.

Способность соединений влиять на активность протеинкиназ была изучена на панели из 16 эукариотических протоонкогенных протинкиназ (АКТ1, ARK5, Aurora-B, AXL, B-RAF-V600E, CK2-alphal, FAK, IGF1-R, INS-R, MET, PIM, PLK1, PRK1, SRC, TRK-B, VEGF-R2) с помощью ³³PanQmase^®Activity Assay (ProQinase GmbH, Freiburg, Germany). Активность соединений определялась по их влиянию на включение киназами меченого фосфата (³³P) в соответствующие белки-субстраты. Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1. Остаточная активность протонкогенных протеинкиназ (% от исходной активности фермента) в присутствии бис(амидина) 6е и его бис(метиламино)аналога 5b в концентрации 10 мкМ.

Бисхлоацетамидин 6е в концентрациях менее 10.0 мкМ ингибирует 11 протеинкиназ скрининговой панели, что составляет 68%. Его аналог, содержащий в боковых цепях метиламиногруппы 5b, заметно ингибирует лишь две протеинкиназы (AXL и PRK1). Таким образом, полученные результаты свидетельствует о важной роли хлорацетаминогрупп в способности заявленных соединений ингибировать активность протоонкогенных протеинкиназ.

Пример В

Аффинность соединений к G-квадруплексным структурам ДНК

Ранее были выявлены лиганды теломерного G-квадруплекса на основе гетероаренантрацендионов, содержащих в боковых цепях две группы с делокализованными основными центрами (например, бис(гуанидино)- или бис(амидино)производные 7a, b), поэтому для бис(хлорацетамидина) 6е, являющегося примером соединений, заявленных в настоящем изобретении, было проведено исследование параметров связывания с рядом четырехцепочечных G-квадруплексных структур в сравнении с ранее описанным ингибитором теломеразы 7а [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 77, 1861].

Аффинность лигандов к G-квадруплексным структурам ДНК оценена методом FRET-плавления [Mergny J.L., Lacroix L. Oligonucleotides. 2003, 13 (6), 515] с использованием дезоксирибонуклеотидов, формирующих в присутствии ионов K⁺ четырехцепочечные структуры. Для тестирования использовались G-богатые полинуклеотиды, соответствующие теломерной последовательности человека -(TTAGGG)₄ (htelo), а также последовательностям из промотерных участков онкогенов KRAS и HRAS-2. Формирование G-квадруплексов этими последовательностями ДНК играет важную роль в модулировании связывания транскрипционных факторов и других белков, вовлеченных в активации экспрессии, с промоторами онкогенов [Membrino A. et al. PLoS One, 2011, 6, е24421; Cogoi S. et al. J Biol Chem. 2010, 285, 22003].

Для FRET-плавления были использованы олигонуклеотиды, содержащие на 5′ и 3′ концах карбоксифлуоресцеин (донор) и тетраметилродамин (акцептор) [Membrino A. et al. Chem Commun (Camb), 2010, 46, 625]. FRET-плавление проводилось в 96-луночном приборе для ПЦР в режиме реального времени (CFX96, BioRad, Hercules, CA). Образцы объемом 50 мкл содержали смесь солей и Трис/HCl-буфера (50 мМ, рН 8, 100 мМ KCl), 200 нМ олигонуклеотидов и 5-6 эквивалентов лигандов 6е и 7а. Влияние соединений 6е и 7а на температуру плавления G-квадруплекса (стабилизационный сдвиг - ΔT_M) и константа связывания (K_D) и полученные методом FRET-плавления [Mergny J.L., Lacroix L. Oligonucleotides, 2003, 13 (6), 515] по результатам пяти повторных экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Константы связывания (K_D) и стабилизационный сдвиг (ΔT_M) бис(хлорацетамидина) 6е и бис(гуанидина) 7а для теломерного G-квадруплекса (htelo) и квадруплексов из промотеров онкогенов KRAS и HRAS-2._____________________________________

Как видно из представленных данных, соединение 6е, являющееся предметом настоящего изобретения, как и ранее описанный лиганд 7а, имеет высокие константы связывания для теломерного G-квадруплекса (htelo). Бис(хлорацетамидин) 6е также обладает высокой аффиностью к G-квадруплексным структурам из промоторных участков онкогенов KRAS и HRAS, причем константа связывания с квадруплексом KRAS в два раза выше, чем для лиганда 7а. Кроме того, стабилизационный сдвиг для обоих промотерных квадруплексов (KRAS и HRAS), для лиганда 6е на 5°С выше, чем для бисгуанидина 7а, что указывает на большую стабильность образующихся комплексов.

Таким образом, полученные данные подтверждают, что заявленные соединения имеют высокую аффинность к четырехцепочечным G-квадруплексным структурам ДНК и способны их стабилизировать. Это расширяет перечень внутриклеточных мишеней для заявленных соединений за счет действия на теломеразу и потенциальной способности G-квадруплексных лигандов вызывать репрессию транскрипции онкогенов, в промотерных областях которых содержатся последовательности, способные формировать четырехцепочечные элементы вторичной структуры.

Пример Г

Исследование накопления в опухолевых клетках

Поскольку заявленные соединения способны действовать на широкий перечень внутриклеточных мишеней, участвующих в делении клеток (топоизомеразы, протеинкиназы, теломераза, G-квадруплексные структуры ДНК), индуцируемые ими биологические эффекты зависят от способности соединений проникать в опухолевые клетки. Поэтому методом проточной цитофлуориметрии (FACS) для клеток карциномы мочевого пузыря Т24 был проведен сравнительный анализ внутриклеточного накопления бисхлорацетамидина 6е и ранее описанного бисгуанидина 7а [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861].

Исследование проводилось в 24-луночных планшетах, содержащих в 5×10⁴ клеток Т24 в ячейке. Клетки инкубировались в питательной среде одни сутки, после чего обрабатывались соединениями 6е или 7а в пяти концентрациях (0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10 мкМ) и выдерживались 2, 4, 6 и 8 ч после чего клетки трипсинизировали, осаждали, повторно суспендировали и анализировали с помощью FACS-сканирующего проточного цитометра (Becton-Dickinson, San Jose, USA) с аргоновым лазером (488 нм).

Полученные результаты, представленные на Фиг.4, показывают существенно различие в способности лигандов 6е и 7а проникать в опухолевые клетки. Интенсивность свечения клеточной популяции при обработке производным 6е во всех пяти тестированных концентрациях в 2-3 раза выше, чем при действии его бисгуанидированного аналога 7а, что свидетельствует о значительно большей внутриклеточной концентрации бисхлорацетамидина 6е. Аналогичные результаты были получены при анализе интенсивности свечения клеточной популяции через 2, 4, 6 ч после начала инкубации с тестируемыми соединениями, что свидетельствует о том, что большая внутриклеточная концентрация соединения 6е связана не со снижением скорости проникновения бисгуандина 7а через биологические мембраны.

Таким образом, найденная новая модификация гетероаренантрацендионов, заключающаяся во введении в боковые цепи хлорацетамидиновых групп, вызывает значительное повышение внутриклеточной концентрации лигандов по сравнению с гуанидинопроизводными, что приводит к потенцированию воздействия на внутриклеточные мишени.

Пример Д

Антипролиферативная активность соединений

Изучение антипролиферативной активности заявленных соединений (in vitro) проводилось на культурах клеток лейкоза L1210 мышей и злокачественных Т-лимфоцитов человека линий СЕМ. Данные об антипролиферативной активности (IC₅₀ - концентрация, ингибирующая рост клеток на 50%), заявленных в изобретении соединений, приводятся в таблице 3, где для каждого соединения указана структура и номер примера (описанных выше), а также приводятся данные антипролиферативной активности ранее описанного ингибитора теломеразы 7а [Shchekotikhin A.E. et al., Bioorg. Med. Chem., 2009, 17, 1861]. Определение IC₅₀ проводилось с помощью МТТ-теста по стандартной методике, описанной в литературе [Mossman, Т.J. Immunol. Methods, 1983, 65, 55].

Таблица 3. Антипролиферативная активность (IC₅₀, µ.M) бисхлорацетамидинов 6а-l для клеток лейкоза L 1210 и Т-лимфоцитов СЕМ.

Как видно из представленных данных, соединения, являющиеся предметом настоящего изобретения и описанные в примерах, обладающие антипролиферативным действием в микромолярных и субмикромолярных концентрация, в 4-100 раз превосходят активность ранее описанного бисгуанидин 7а.

Пример Е

Противоопухолевая активность

В качестве примера, подтверждающего наличие противоопухолевых свойств у заявленных соединений, была исследована активность дигидрохлорида 4,11-бис[2-(2-хлорацетимидамидо)этиламино]антра[2,3-b]тиофен-5,10-диона (6е), описанного в примере 5, при однократном введении мышам с лимфомой Р388. Самкам мышей BDF1 привиты внутрибрюшинно по 10⁶ клеток асцитной лимфомы Р388 в день 0. Препарат, растворенный в физиологическом растворе 0.1-0.2% концентрации, вводился однократно внутрибрюшинно через сутки после трансплантации опухоли.

При применении бисамидина 6е в диапазоне доз от 10 до 20 мг/кг получено достоверное увеличение продолжительности жизни мышей. Средняя продолжительность жизни в дозировке 10 мг/кг достигает 14.5 дней, что соответствует Т/С=126% (р<0,05) при отсутствии признаков токсичности. Таким образом, при однократном внутрибрюшинном введении бисамидина 6е мышам с внутрибрюшинным лейкозом Р388 соединение вызывает увеличение продолжительности жизни мышей на уровне порогового критерия (Т/С=125%).

Изобретение относится к производным линейных тетрациклических гетероаренантрацендионов, содержащих в боковых цепях остатки галогенацетамидинов и соответствующих формуле:

а также к их фармакологически приемлемым солям, где X, Y, Z означают независимо СН- или NH-группы или гетероатомы, выбранные из О, N и S, формирующие пятичленный гетероарен, необязательно замещенный алкилом; Hal независимо означает атом фтора, хлора, брома или йода; m и n означают независимо число от 2 до 4 и равное количеству спейсерных СН₂-групп, соединяющих аминогруппы в пери-положениях гетероаренантрацендиона с атомами азота остатков галогенациламидинов, расположенных в боковой цепи; W означает заместители, независимо выбранные из группы: амино, гидрокси, алкокси, фтор; k означает число заместителей W в антрацендионовом фрагменте, независимо равное от 0. Технический результат: получены новые соединения, которые могут найти применение в медицине для терапии онкологических заболеваний. 3 табл., 4 ил., 12 пр.

Производные линейных тетрациклических гетероаренантрацендионов, содержащих в боковых цепях остатки галогенацетамидинов, ингибирующие активность нескольких внутриклеточных мишеней, важных для пролиферации опухолевых клеток (включая топоизомеразы I, II, теломеразу, протеинкиназы, G-квадруплексные структуры нуклеиновых кислот), пригодные для терапии онкологических заболеваний и соответствующие формуле:

а также их фармакологически приемлемые соли, где X, Y, Z означают независимо СН- или NH-группы или гетероатомы, выбранные из О, N и S, формирующие пятичленный гетероарен, необязательно замещенный алкилом; Hal независимо означает атом фтора, хлора, брома или йода; m и n означают независимо число от 2 до 4 и равное количеству спейсерных СН₂-групп, соединяющих аминогруппы в пери-положениях гетероаренантрацендиона с атомами азота остатков галогенациламидинов, расположенных в боковой цепи; W означает заместители, независимо выбранные из группы: амино, гидрокси, алкокси, фтор; k означает число заместителей W в антрацендионовом фрагменте, независимо равное от 0.