ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В-В/ВИКТОРИЯ/2/63/87, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ В КАЧЕСТВЕ ШТАММА-ДОНОРА АТТЕНУАЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАССОРТАНТОВ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫХ ШТАММОВ ДЛЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 2014 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа.

Известно, что живая вакцина против гриппа производится из аттенуированных штаммов вируса, безвредных для людей и обладающих способностью стимулировать противогриппозный иммунитет.

В связи с тем, что антигенная специфичность вирусов гриппа весьма изменчива, вакцинные штаммы этого вируса для гриппозных вакцин приходится заменять на новые почти каждый год в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения. При получении таких новых вакцинных штаммов для живой холодоадаптированной аттенуированной гриппозной вакцины и для получения новых реассортантных холодоадаптированных вакцинных штаммов в России используют холодоадаптированные штаммы - доноры аттенуации В/СССР/60/69 и В/Ленинград/14/55, также полученные путем пассажей при пониженной температуре (RU 2084525, 1997; RU 2068271, 1996).

Однако эти штаммы обладают серьезным недостатком - авторы не имеют данных о том, какие мутации в определенных участках генов этого вируса имеются у данных ха штаммов, что не позволяет определить, какие гены вируса могут иметь отношение к аттенуации штамма, что дает возможность характеризовать генетическую однородность штаммов, а также определить их генетическую стабильность при размножении в организме вакцинированных людей. Оба штаммы были клонированы методом предельных разведении в куриных эмбрионах, что оставляет генетическую однородность этих штаммов под большим сомнением.

В США для приготовления живой холодоадаптированной гриппозной вакцины используют в качестве штамма-донора аттенуации штамм В/Анн Арбор/1/66, полученный путем пассажей при пониженной температуре (Maassab H, De Borde B. Development and characterization of cold-adapted virus for use as live virus vaccines. Vaccine, 1983й вакцины. Вопросы вирусологии, 2005, №2: 43-46).

Этот штамм имеет восемь кодирующих мутаций в трех вирусных белках (PA, NP и M1) (см. таблицу 2).

Наиболее близким к заявленному изобретению является аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Ленинград/14/17/55 для получения штаммов живой гриппозной вакцины (RU 2068271, 1996).

Задачей исследования является получение ха генетически однородного штамма-донора аттенуации вируса гриппа B, обладающего уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1 и предназначенного для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов живой гриппозной сезонной вакцины.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание аттенуированного холодоадаптированного штамма - донора вируса гриппа, обладающего генетической однородностью, охарактеризованного по количеству и распределению мутаций аминокислот в каждом из внутренних белков вируса, и способного размножаться при пониженной температуре и температуре 34°C как на куриных эмбрионах, так и в культуре клеток, в частности в линии клеток MDCK, одобренной в России для производства вирусных вакцин для людей (4, 5).

Сущность изобретения: холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87 получен методом серийных пассажей в куриных эмбрионах и клетках MDCK при постепенно снижающейся температуре инкубации. Полученный штамм прошел в сумме 63 пассажа при пониженной температуре (из них 29 пассажей на куриных эмбрионах и 34 пассажа на клетках MDCK), с последующим трехкратным клонированием методом бляшек на культуре клеток MDCK. Последнее обеспечивает полную генетическую гомогенность ха штамма. Полученный штамм обладает хорошей репродуктивной активностью в куриных эмбрионах и на клетках MDCK при пониженной температуре (26°C) и не размножается при повышенных температурах (38° и 40°C). Полученный ха штамм вируса гриппа В имеет во всех внутренних генах 8 мутаций, отличающих его от родительского дикого штамма, причем 6 из 8 мутаций кодируют замену аминокислоты в белках PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1. 5 из 6 кодирующих мутаций являются уникальными для данного штамма по сравнению со всеми эпидемическими штаммами вируса гриппа В, отсеквенированными на данный момент.

Штамм В/Виктория/2/63/87 вируса гриппа В зарегистрирован в Государственной коллекции депозитария НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером 2615 от 13.12.2010.

Штамм В/Виктория/ 2/63/87 полностью генетически охарактеризован и трижды клонирован в культуре MDCK методом бляшек. Методом секвенирования отдельных РНК-сегментов его генома доказана его генетическая однородность.

Примеры получения холодоадаптированного (ха) варианта вируса гриппа В/Виктория/2/63/87.

Пример 1. Получение холодоадаптированного варианта. Эпидемический родительский штамм вируса гриппа В/Виктория/2/87 хорошо размножался при повышенной температуре 38,5°C (ts₃₈ + признак) и не размножался при пониженной температуре 26°C (ca₂₆ - признак). Этот штамм вируса прошел в куриных эмбрионах 2 пассажа при 30°C, затем 3 пассажа при 28°C, далее 6 пассажей при 26°C, затем 34 пассажа при 26°C в культуре клеток MDCK и далее 18 пассажей при 26°C в куриных эмбрионах.

Полученный ха вариант вируса, в отличие от родительского эпидемического штамма, хорошо размножался при 26°C (ca₂₆ + признак), а также хорошо размножался при 34°C, но не размножался при 38,5°C (ts₃₈ - признак).

Для получения генетически гомогенного ха штамма вируса полученный вариант был трижды клонирован методом бляшек на линии клеток MDCK при 34°C и был выбран один клон, который хорошо размножался при 26°C (ca₂₆ + признак) и не размножался при 38,5°C (ts_38,5 - признак). Ряд пассажей полученного ха варианта на куриных эмбрионах при 34°C не изменили его са₂₆+ и ts_38.5 - признаки, что свидетельствовало о генетической однородности клонированного ха варианта этого вируса.

Пример 2. Размножение холодоадаптированного варианта в куриных эмбрионах.

При размножении в куриных эмбрионах при 34°C родительского штамма титры вируса составили 128 ГАЕ/мл и 10^8.0 ЭИД₅₀/0,1 мл, при 38,5°C - 256 ГАЕ/мл и 10^8.5 ЭИД₅₀/0,1 мл, а при 26°C вирус не размножался, т.е. обладал ts_38.5+ и ca₂₆ - признаками. При заражении куриных эмбрионов ха вариантом вируса титры при 26°C составляли 64 ГАЕ/мл и 10^6.0 ЭИД₅₀/0,1 мл, при 34°C - 256 ГАЕ /мл и 10^8.5 ЭИД₅₀/0,1 мл, а при 38,5°C этот вариант не размножался, т.е. обладал ca₂₆+ и ts₃₈ - признаками.

Пример 3. Размножение ха варианта в линии клеток MDCK.

Ха вариант вируса В/Виктория/2/63/87 хорошо размножался в линии клеток MDCK при 33° (титры составили 128-256 ГАЕ/мл и 10^8.0 ЭИД₅₀/0.1 мл) и не размножался при 26°C.

Пример 4. Размножение ха варианта и родительского штамма вируса при заражении мышей.

При интраназальном заражении самок мышей линии Balb/c (18,0-20,0 г) родительским штаммом вируса (50 мкл в две ноздри) в дозе 10^7.5 ЭИД₅₀/0,2 мл на 3-й день после заражения титры вируса в носоглотке составляли 10^4.5 ЭИД₅₀/0,2 мл, а в легких 10^3.9 ЭИД₅₀/0.2 мл.

При интраназальном заражении мышей той же дозой ха варианта титры вируса на 3-й день после заражения титры вируса в носоглотке составляла 10^2.0 ЭИД₀₅/0,2 мл, а в легких <10^1.0 ЭИД₅₀/0,2 мл. Эти данные свидетельствуют о хорошей аттенуации ха варианта, потерявшего способность размножаться при заражении мышей.

Пример 5. Анализ мутаций в геноме ха варианта.

Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов в генах родительского штамма и ха варианта вируса В/Виктория/2/63/87 выявило 8 мутаций в 6 генах, кодирующих внутренние белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, из которых 6 мутаций привели к замене аминокислот в соответствующих белках (см. таблицу 1). В РНК-сегменте 1, кодирующем белок PB2, в позиции 555 наблюдалась нуклеотидная замена G-A, которая сопровождалась аминокислотной заменой Arg-Lys в позиции 185 белка PB2. Нуклеотидная замена A-G в РНК-сегменте 2 в позиции 366 сопровождалась аминокислотной заменой Asp-Gly в позиции 120 белка PB1. В РНК-сегменте 3 наблюдались 2 мутации, из которых одна в позиции 972 (А-Т) оказалась некодирующей, а вторая в позиции 1885 (G-A) приводила к аминокислотной замене Val-Ile в позиции 625 белка PA. Уникальная нуклеотидная замена C-T в позиции 156 в РНК-сегменте 5, кодирующем белок NP, имела следствием аминокислотную замену Pro-Ser в позиции 40 белка NP. В РНК-сегменте 7 ха варианта наблюдались 2 нуклеотидные замены. Первая замена (G-A) в позиции 70 сопровождалась аминокислотной заменой Glu-Lys в позиции 23 белка M1. Вторая нуклеотидная замена C-T в позиции 387 этого РНК-сегмента оказалась некодирующей. Последняя нуклеотидная замена G-A в позиции 62 РНК-сегмента 8 приводила к аминокислотной замене Gly-Ser в белке NS1.

Сравнение мутаций, обнаруженных в геноме ха варианта штамма В/Виктория/2/63/87 и мутаций в геноме американского ха варианта вируса В/Анн Арбор/1/60 (см. таблицу 2), показало, что мутации, выявленные нами в геноме ха варианта В/Виктория/2/63/87, являются уникальными и отличаются от мутаций, обнаруженных в ха штамме В/Анн Арбор/1/60 (5).

На основе полученного штамма-донора получены реассортанты с актуальными эпидемическими штаммами вируса гриппа В.

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент №2084525 "Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/СССР (69) Е для получения живой интраназальной гриппозной вакцины." от 20.07.1997.

2. Патент №2068271. Аттенуированный холоадаптированный штамм вируса гриппа В/Ленинград/14/55 для получения штаммов живой гриппозной вакцины от 27.10.1996.

3. Maassab H, De Borde В. Development and characterization of cold-adapted virus for use as live virus vaccines. Vaccine, 1983й вакцины. Вопросы вирусологии, 2005, N2: 43-46.

4. Радаева И.Ф., Колокольцева Т.Д., Нечаева Е.Д. и др. "Создание и аттестация банков перевиваемой культуры клеток MDCK для производства гриппозной вакцины." Вопросы вирусологии, 2005, №2: 43-46.

5. Выписки из протокола №6 Комитета медицинских иммунобиологических препаратов Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 26.06.2003 г.

6. Hoffmann E., Mahmood K., Chen Z. et al. Multiple gene segments control the temperature sensitivity and attenuation phenotypes of ca B/Ann Arbor/ 1/66. J. Virol. 2005. 79: 11014-11021.

Таблица 1 Мутации во внутренних генах холодоадаптированных вариантов штамма В/Виктория/2/63/87 Сегмент РНК Длина (нт) Мутации в нуклеотидной последовательности Белок Длина (ак) Аминокислотные замены Позиция Уникальность* Вик (Дт) Вик (ха) Позиция Вик (дт) Вик (ха) 1 2396 555 Да AGG AAG PB2 770 185 Arg Lys 2 2386 366 Да GAC GGC PB1 752 120 Asp Gly 3 2304 972 Нет АСА ACT PA 726 - - -     1885 Нет GTA АТА     625 Val Ile 5 1841 156 Да ССА ТСА NP 560 40 Pro Ser 7 1191 70 Да GAA ААА M1 248 23 Glu Lys     387 Нет СТС СТТ     - - -     - - - - BM2 109 - - - 8 1096 62 Да GGT AGT NS1 281 13 Gly Ser             NS2 122       * Уникальность по сравнению с вирусами гриппа B из базы данных GenBank

Таблица 2 Аминокислотные замены, уникальные для внутренних генов штамма В/Энн Арбор/1/66 по сравнению с дикими штаммами вируса гриппа В по данным Hoffman и др (6) Сегмент РНК Длина (нт) Нуклеотидная последовательность Белок   Аминокислотные замены Позиция Уникальность* Консенсус (дт) В/Энн Арбор/1/66 (ха) Позиция Консенсус (дт) В/Энн Арбор/1/66 (ха) 1 2396 1913 Нет*¹ AGC AGA PB2 770 630 Ser Arg 2 2386         PB1 752       3 2304 1320 Да GTG A PA 726 431 Val Met     1518 Да TAT CAT     497 Tyr His 5 1841 221 Нет*² ACC GCC NP 560 55 Thr Ala     399 Да GTG GCG     114 Val Ala     1287 Да CCT CAT     410 Pro His     1583 Да GCT ACT     509 Ala Thr 7 1191 501 Нет*² CAT САА M1 248 759 His Gin     571 Да ATC GTG     183 Met Val     - - - - BM2 109 - - - 8 1096         NS1 281                   NS2 122       * Уникальность по сравнению с дикими штаммами вируса гриппа B из базы данных GenBank, в том числе с диким штаммом-предком ХА вируса В/Энн Арбор/1/66

*¹ Мутация присутствовала лишь в одном диком штамме вируса гриппа B из всех исследованных (B/Harbin/7/94 (AAF89735))   *² Эти мутации присутствовали в диком штамма В/Энн Арбор/1/66 (wt5).  

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа. Холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87 обладает уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, и предназначен для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов для получения живой гриппозной сезонной вакцины. 2 табл., 5 пр.

Холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 2615, обладающий уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, и предназначенный для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов для получения живой гриппозной сезонной вакцины.