АТТЕНУИРОВАННЫЙ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В СССР(69)Е ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 

Настоящее изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано для производства живой гриппозной вакцины и получения производственных штаммов живой гриппозной вакцины для профилактики гриппа у детей и взрослых.

Известно, что живая вакцина против гриппа производится из аттенуированных (ослабленных) штаммов вируса, безвредных для людей и обладающих способностью стимулировать противогриппозный иммунитет, т.е. защищать людей от гриппа.

Учитывая изменчивость возбудителя гриппа, вакцинные штаммы приходится заменять в период появления новых возбудителей гриппа. Ранее для получения вакцинных штаммов отбирали новый эпидемический вирус и проводили ряд пассажей его на развивающихся куриных эмбрионах, которые культивировали при оптимальной (32^oC) температуре. Варианты, полученные через 10, 15, 20 и т.д. пассажей, изучали по ряду лабораторных тестов (маркеров) для выявления отличий от исходного эпидемического вируса, а затем проверяли на людях в отношении безвредности и иммуногенности для людей.

Вирусы, удовлетворяющие требованиям фармакопейных статей на живую гриппозную вакцину для взрослых или детей, использовали в производстве указанных вакцин. Эти штаммы, как правило, не отличались по биологическим свойствам от исходных эпидемических вирусов, что затрудняло отбор аттенуированных вариантов перед их испытанием на людях и обусловливало необходимость повторных проверок вариантов, полученных после проведения ряда дополнительных пассажей в развивающихся куриных эмбрионах.

Известен эпидемический вирус В/СССР/69 (1) прототип, вызвавший эпидемию в 1969 г. Он был подвергнут 60 пассажам в развивающихся куриных эмбрионах при температуре 25^oC, что придало полученному таким образом штамму В/СССР/60/69 аректогенность для детей и наличие одного лабораторного признака холодоадаптированности (ха маркер). Придание второго отличительного признака температурочувствительности (ts маркер) было достигнуто процедурой последующего селективного клонирования на тканевой культуре почки цыпленка (методом пляк) при температуре, пониженной до 25^oC.

Эта процедура позволила изолировать клон В/С ССР/60/69/Е с ограничительной температурой 37^oC, который по этому признаку отличается от всех известных эпидемических штаммов вируса гриппа В.

Кроме того, полученный клон В/СССР/69/Е утратил способность к размножению в нижних отделах респираторного тракта мышей, что явилось дополнительным дифференцирующим признаком нового штамма и свидетельством большей степени аттенуации по сравнению с вакцинным штаммом В/СССР/60/69.

Аттенуированный вирус В/СССР/60/69 был усовершенствован как вакцинный штамм путем дополнительного селективного клонирования 7 раз методом пляк на тканевой культуре и приобрел 2 дополнительных отличительных признака.

Предметом изобретения является температурочувствительный вариант вируса гриппа В штамм В/СССР/69/Е.

Характеристика штамма.

Гемагглютинирующая активность: 1:256.

Инфекционная активность 7,5 8,5 lg ЭИД 50/0,2 мл (инфекционных эмбриональных доз).

Ха маркер (маркер холодоадаптированности), т.е. повышенной способности к репродукции в куриных эмбрионах при 25^oC lg ЭИД 50/0,2 мл, 6,0 lg, т.е. штамм является холодоадаптированным (ха +).

ts маркер (признак температурочувствительности), т.е. неспособность к бляшкообразованию в культуре ткани почки цыпленка при температуре 37^oC и выше.

Аттенуация для мышей неспособность к репродукции в легких мышей.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков, т.е. не меняет свойств (маркеров) после 5 пассажей в куриных эмбрионах при оптимальной температуре.

Пример 1. Группе из 20 серонегативных детей 3 -15 лет был введен интраназально в объеме 0,5 мл вакцинный штамм В/СССР/69/Е с инфекционным титром 8 lg ЭИД 50/0,2 мл. В группе привитых детей не регистрируется ни одной температурной реакции выше 37,5^oC (показатель реактивности 0).

Процент четырех и более кратных сероконверсий: иммуногенность составила по группе 80%
Пример 2. Была организована интраназальная вакцинация 20 взрослых серонегативных добровольцев вакциной на основе вируса В/СССР/69/Е. Реактогенность, рассчитанная по числу температурных реакций (температура более 37,6^oC), составила менее 1% что соответствовало требованиям на живую гриппозную вакцину для взрослых.

Иммуногенность (т. е. процент четырех и более кратных сероконверсий, прироста антител в крови) была более 60%
Пример 3. Была организована интраназальная вакцинация детей 3 6 лет (120 детей) вакциной из штамма В/СССР/69/Е.

Реактогенность, рассчитанная по числу температурных реакций (температурные реакции более 37,6^oC), не превышала 1,0%
Показатели иммуногенности (т.е. процент прироста антител в крови) превышали 65%
Источники информации
1. T.Ja.Luzyanina et al. Acta virol. 1979, N 23, 113 119.

Использование: медицинская вирусология. Сущность изобретения: вакцинный штамм В/СССР/60/Е, используемый для производства живой гриппозной вакцины и получения производственных штаммов живой гриппозной вакцины для профилактики гриппа у детей и взрослых, получен 60-кратным пассивированием в развивающихся куриных эмбрионах при температуре 250^oC и последующим дополнительным 7-кратным селективным клонированием промежуточного вируса В/СССР/60/69 на тканевой культуре почки цыпленка при температуре 250^oC. Клон В/СССР/60/69/Е утратил способность к размножению в нижних отделах респираторного тракта мышей. Штамм обладает холодоадаптированностью (ха МАРКЕР) и температурочувствительностью (ts МАРКЕР). Штамм характеризуют: гемагглютинирующая активность: 1: 256; инфекционная активность 7,5 - 8,5 lg ЭИД 50/0,2 мл (инфекционных эмбриональных доз); генетическая стабильность после 5 пассажей в куриных эмбрионах при оптимальной температуре.

Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа В СССР(69)Е ГКВ N 2310 для получения живой интраназальной гриппозной вакцины.