БЫСТРОЕ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ ТКАНЕЙ И КАРКАСОВ В КАЧЕСТВЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ИМПЛАНТАТОВ Российский патент 2014 года по МПК A61L27/38 A61L27/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к способам, техническим устройствам и композициям для изготовления в короткие сроки «интеллектуальных» графтов или трансплантатов в форме каркаса, которые могут найти применение при лечении или способствовании заживлению повреждений или травм различных тканей и органов центральной или периферической локализации в организме человека или животного. В частности, изобретение относится к регенерации тканей при помощи стволовых клеток и различных факторов, способствующих заживлению специализированных тканей и органов, стимулирующих дифференцировку упомянутых эндогенных или экзогенных стволовых клеток в специализированные клетки тканей, таким образом воссоздавая исходное микроокружение клеток, пострадавших при повреждении. Изобретение также относится к срокам изготовления, являющимся настолько краткими, что могут составлять несколько минут, включая подготовку стволовых клеток, внедрение стволовых клеток, активацию стволовых клеток и коммитирование. В зависимости от размера дефекта стволовые клетки либо добавляют, как в случае крупных дефектов, либо вызывают их локальную мобилизацию, как в случае мелких дефектов. Возможно сочетание обоих вариантов мобилизации для обеспечения продолжительной регенерации в течение нескольких недель в организме до достижения полного восстановления морфологии и функций тканей.

В частности, данное изобретение относится к новому способу, который может положить начало уникальной технологии подготовки стволовых клеток, настолько краткосрочной, что требуемое для нее время занимает от нескольких секунд до нескольких минут.

В основе способа лежит идея экстракорпорального запуска формирования ниши, что позволяет стволовым клеткам обеспечивать ремоделирование ex vivo/in vivo и in situ без необходимости какой-либо экспансии in vitro или длительного процесса культивирования. Этот новый способ позволяет создавать матрицы, которые после завершения последовательности операций, выполняемых вне организма, самостоятельно подвергаются ремоделированию в заданную ткань, представляющую интерес. Изобретение касается практически всех видов тканей человека или животных.

В конечном итоге изобретение также относится к композициям и препаратам или каркасам, покрытым указанными композициями, содержащим (i) препараты стволовых клеток, (ii) эритропоэтин (ЕРО) и (iii) факторы, способствующие дифференцировке стволовых клеток, (iv) факторы, повышающие доступность стволовых клеток, и, возможно, (v) факторы, как правило, присутствующие в местном очаге повреждения.

Изобретение может найти применение для быстрого и безопасного изготовления индивидуальных искусственных графтов, трансплантатов или имплантатов, предпочтительно в форме каркаса, для быстрой и высококачественной регенерации тканей, выгодной с экономической точки зрения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Создание искусственных тканевых имплантатов является длительным и связанным с риском процессом в том, что касается поддержания стерильности, что подразумевает взятие донорских клеток, перенос клеток в лабораторию и манипуляции с такими клетками для запуска их экспансии и/или дифференцировки. После периода экспансии клетки зачастую отделяют от временной подложки, например, при помощи трипсинизации и затем переносят на каркас и вновь культивируют на этом каркасе. Для эффективного осуществления этого процесса, таким образом, зачастую требуются не дни, а недели.

Быстрого и точного изготовления сложных трехмерных графтов в предшествующем уровне техники не известно. По существу, это противоречит существующей доктрине, согласно которой клеточные технологии применяют для экспансии и дифференцировки клеток для запуска коммитирования in vitro с последующим их высаживанием на каркасы или непосредственным выращиванием на таких каркасах. Ожидается, что такие клетки дифференцируются in vitro. Этот процесс зачастую занимает в среднем по меньшей мере 1-2 недели или даже больше.

Во второй группе изобретений в качестве клеточной терапии во время операции применяют инъекции недифференцированных стволовых клеток из костного мозга или крови или необработанного костного мозга непосредственно в ткань, включая, например, сердечную мышцу. Для восстановления при спинальной травме клетки либо культивируют для увеличения их количества, либо получают из определенных источников, например из носа, или используют эмбриональные клетки. Применение последних связано с риском трансформации или формирования опухолей. Клетки, происходящие из тканей носа, представляют достаточно инфекционное окружение для того, чтобы их брать в качестве донорских, и не могут с клинической точки зрения считаться универсальным вариантом. Клетки, происходящие из костного мозга, изучаются.

Другой альтернативой является регенерация тканей de novo. Ожидалось, что местное окружение впоследствии будет способствовать дифференцировке этих клеток. При более пристальном изучении окружения, в которое вводят клетки, было обнаружено, что клетки не дифференцируются, например, в клетки сердечной мышцы после инъекции в сердце. В этих случаях вообще не было зарегистрировано формирования мышечных клеток. Наоборот, было предположено, что скорее всего благоприятный эффект, способствующий восстановлению, связан с секреторной активностью трансплантированных стволовых клеток. Суммарный эффект в таких исследованиях заключался в улучшении сердечной функции всего на 4%. Это означает, что согласно данной теории о микроокружении не удается достичь формирования тканей de novo, a микроокружение всего лишь выполняет роль адъюванта.

В другом исследовании MCK после экспансии in vitro вводили в очищенный от клеток каркас клапана. В ходе культивирования in vitro клетки подвергались процессу селекции, что позволяло отобрать клетки, имеющие выраженные характеристики стволовых клеток (стабильную репликацию) и способные снизить выраженность воспаления in vitro.

На настоящий момент не известно, какую роль могут играть цитокины в этом контексте. Однако из предшествующего уровня техники хорошо известно, что молекулы могут применяться in vitro для регулирования мультипотентности и индукции дифференцировки и коммитирования в специализированные ткани.

Заживление ран тесно связано с воспалительным ответом. После хирургической имплантации искусственной трахеи определяющими для приживления графта и долговременного успеха имплантации являются скорость и качество местного заживления, жизнеспособность имплантата и его врастание.

При воспалении выделяются провоспалительные цитокины, такие как IL-6, IL-1 и TNF, поддерживающие воспалительный ответ. Однако воспаление может быть «палкой о двух концах», если воспаление не заканчивается своевременно из-за неудовлетворительного ремоделирования каркаса имплантата.

Ремоделирование каркаса в тканевой инженерии считалось недостаточно изученным процессом, и запускающие его механизмы были либо непонятны, либо неосуществимы в клинике. Традиционно клетки «высевают» на выбранный материал, а их внедрение в этот материал является процессом, который объясняют теоретически временем экспансии клеток и их проникновением в материал за счет миграции.

По существу, позитивным эффектом воспаления является то, что оно является преимуществом для заживления, что требуется принимать во внимание при создании искусственных биологических имплантатов.

На существующем уровне техники отсутствуют надлежащие указания, как поддерживать микроокружение после трансплантации графта для достижения стойкого ремоделирования, дифференцировки недифференцированных клеток после трансплантации, и описания того, как стволовые клетки распознают зоны повреждения, а также отсутствуют надлежащие указания, как добиться дифференцировки трансплантированных клеток после экспансии in vitro для достижения абсолютного безрубцового заживления.

Было показано, что такая пре-экспансия стимулирует онкогенез. Это связано с воздействием искусственного окружения и, возможно, также с повторением циклов пролиферации, в основе которых не лежат нормальные регулирующие механизмы репарации повреждений и ремоделирования. Такая искусственная ситуация, конечно же, не согласуется со способностью тела к регенерации после ранения и повреждения. Активация стволовых клеток у человека и коммитирование стволовых клеток требуют полного контроля над пролиферацией при одновременном недопущении активации онкогенов.

Эти требования являются обязательными, и их игнорирование стандартным учением может быть причиной самых серьезных и пагубных отрицательных эффектов существующей технологии воспроизведения клеточных процессов in vitro, являющихся не только достаточно тяжелыми, но и неизбежно связанными с риском.

Другой альтернативой являются простые инъекции стволовых клеток, что, с другой стороны, не является решением, поскольку участки введения клеток очень сильно различаются и не могут полностью контролироваться лицом, осуществляющим трансплантацию каркаса и клеток. Во всех описанных на настоящий момент случаях при тщательном рассмотрении оказывалось, что стволовые клетки не достигали своего подлинного предназначения, а именно надлежащего формирования ткани de novo.

Следовательно, существует необходимость в поддержании мультипотентности стволовых клеток после трансплантации и во время трансплантации. В существующей доктрине внимание было сосредоточено на поддержании мультипотентности скорее до трансплантации. Также существует необходимость избегать процессы культивирования клеток, в которых может делаться попытка управлять дифференцировкой клеток, но при этом создаются искусственные дополнительные условия, губительные для клеток, и которые к тому же невыгодны экономически.

Осуществление этих известных из предшествующего уровня техники способов связано с большими трудностями в том, что касается качества и функциональности трансплантата. Следовательно, существует потребность в способе, позволяющем ликвидировать все эти недостатки. Целью данного изобретения является преодоление описанных трудностей и создание удобного способа быстрого изготовления искусственных тканей дыхательных путей и клапанов и, в общем, всех тканей тела человека или животного.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для решения проблемы клеточного культивирования или „слепой" трансплантации клеток в данном изобретении предлагается новый способ и подход к регулированию дифференцировки стволовых клеток, быстрый способ подготовки имплантатов ex vivo и имплантации таких предварительно обработанных имплантатов in vivo хирургом в то же самое время.

Всего этого можно достичь путем выбора конкретной мишени: стволовой клетки, прошедшей специальную обработку согласно изобретению.

Было обнаружено, что эндогенные или экзогенные стволовые клетки или их предшественники могут быть активированы в поврежденных тканях и искусственных или естественных каркасах, если их поместить в условия естественного микроокружения. Было обнаружено, что такое микроокружение нарушается при возникновении крупных повреждений. В таких условиях необходимые клетки и факторы отсутствуют в местном окружении поврежденной ткани или потеряли свою активность или эффективность. Согласно изобретению такое микроокружение может поддерживаться, если на ткань, подлежащую регенерации или восстановлению, или на соответствующие тканевые каркасы или матрицы воздействуют необходимые факторы, способствующие репарации клеток и тканей. В такой ситуации эндогенные факторы, такие как цитокины или другие провоспалительные факторы, обычно секретируемые в местах повреждения, также могут благоприятствовать и способствовать этому процессу восстановления. Согласно изобретению, важную роль здесь играют стволовые клетки, предпочтительно CD90-положительные стволовые клетки. Однако для формирования новых специализированных тканей без рубцевания или иных нежелательных эффектов эти стволовые клетки требуется активировать с учетом их способности к специфической дифференцировке.

Активацию стволовых клеток in situ можно производить согласно изобретению при помощи нескольких различных факторов, которые способствуют созданию и поддержанию оптимального микроокружения поврежденной ткани, таким образом способствуя улучшенной дифференцировке и росту регенерированной специфичной для данного конкретного участка ткани.

Первая группа содействующих факторов, согласно данному изобретению, представляет собой стволовые клетки или их клетки-предшественники, которые обладают способностью дифференцироваться в клетки любого типа тканей, включая клетки нейрональной и лимфоидной ткани. Эти факторы также называют "клеточные факторы". Таким стволовым клеткам или их клеткам-предшественникам могут содействовать, согласно изобретению, моноциты периферической крови (РВМС), CD90-положительные клетки или CD45-положительные клетки.

Вторая группа содействующих факторов, действующих таким образом, представлена факторами, стимулирующими стволовые клетки и ускоряющими ремоделирование клеток тканей. Такие факторы обозначаются "усиливающими факторами". Эти факторы не являются факторами роста в обычном понимании специалистов в данной области техники. Предпочтительным усиливающим фактором по изобретению является эритропоэтин (ЕРО).

Третья группа содействующих факторов, согласно изобретению, обозначается "коммитирующими факторами", поддерживающими дифференцировку стволовых клеток. Предпочтительным коммитирующим фактором для хондрогенной дифференцировки согласно изобретению является комплексное применение TGFR.

Четвертая группа содействующих факторов согласно изобретению повышает доступность стволовых клеток, что означает повышение количества стволовых клеток как на периферии, так и в местном окружении поврежденной ткани и обозначается "мобилизующими факторами". Предпочтительным мобилизующим фактором по изобретению является гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF).

Пятая группа содействующих факторов согласно изобретению обозначается "пермиссивными факторами". Эти факторы, например цитокины, как правило, уже присутствуют в тканях с локализованной травмой или секретируются эндогенно в процессе воспаления, сопровождающего местное повреждение ткани.

Согласно изобретению факторы первой, второй, третьей и четвертой групп являются обязательными согласно изобретению и должны быть доставлены к месту повреждения тканей или в каркас, предназначенный для трансплантации в поврежденную ткань, посредством экзогенного нанесения. Пермиссивные факторы могут применяться факультативно.

Согласно изобретению трансплантация стволовых клеток или индукция активации эндогенных стволовых клеток сопровождается воздействием ряда факторов. Ни один из этих факторов по отдельности не позволяет полностью пройти всему циклу событий, ведущих к безрубцовому заживлению и ремоделированию. Однако они являются важными дополнениями для регулирования мультипотентности клеток, действуя согласованно друг с другом.

Наличие этих факторов можно обеспечить по меньшей мере тремя способами: А) добавлением на этапе внесения клеток или активации клеток (например, в виде лиофилизата для избежания разведения концентрата стволовых клеток костного мозга); Б) добавлением к каркасу на этапе производства. Предпочтительной является внедрение во время производства каркаса и внедрение в материал. Этого можно добиться, например, путем добавления к биологическим каркасам факторов вместе с матриксом каркаса (например, коллагеном, хитозаном, кровью и компонентами крови) во время процедуры лиофилизации или в ходе процесса электроспиннинга, преимуществом при этом является сложная структура и состав, а также безвредность в применении, большая емкость); В) применением полностью аутологичного заменителя. Многие из этих факторов, особенно коммитирующие факторы, появляются в здоровых тканях. Предпочтительной является методика измельчения небольших количеств биоптата и его распределение в покрытии стволовых клеток, в концентрате стволовых клеток. В сочетании с концентратом тромбоцитов, продукты измельчения (например, фрагменты хряща, мениска, сухожилий, кожи, сердца, ткани сфинктера, клапанов или тканей аорты и фактически любой другой ткани) являются важным инициирующим компонентом и ценной альтернативой и/или дополнением к изолированному применению отдельных факторов. Не все из них доступны в клинической практике в настоящее время, и для их клинического применения требуются дальнейшие разработки.

В первом аспекте изобретения применяется естественный или синтетический каркас, имитирующий определенные поврежденные ткани. Такой материал каркаса служит образцом, катализирующим процесс, в результате которого образуется матрикс ткани, которую необходимо сформировать. В конкретном воплощении изобретения этот материал каркаса содержит собственную специализированную ткань, которую требуется сформировать, полученную путем биопсии у пациента, имеющего повреждение или дефект ткани. Каркас покрывают или частично или селективно нагружают упомянутыми выше факторами (включая "клеточные факторы") in vitro или ex vivo. В конкретном воплощении изобретения обработка каркаса факторами и, возможно, собственной специализированной ткани пациента производится интраоперационно, что означает сопряженно во времени с хирургическим вмешательством на пациенте. Предпочтительно, факторы и/или каркасы предварительно обрабатывают согласно изобретению перед их объединением.

Во втором аспекте изобретения факторы, как указывалось выше, доставляют непосредственно в поврежденные или дефектные ткани пациента без отдельной предварительной обработки искусственного или естественного каркаса определенной комбинацией факторов. В этом случае факторы предпочтительно находятся в составе гелевой или клеевой композиции, которой заполняют дефект ткани или рану, чтобы их закрыть.

Главным преимуществом такого подхода является то, что полностью устраняется необходимость в экспансии стволовых клеток и их предварительной дифференцировке перед трансплантацией. Кроме того, удается достичь лучшего качества имплантата после ремоделирования, что подтверждается гистологически и функционально. Следующим преимуществом является сайт-специфичное действие коммитирующих факторов, что позволяет избежать побочных системных эффектов. Согласно данному описанию, местное присутствие пермиссивных факторов наряду с экзогенным введением усиливающих факторов позволяет обеспечить чрезвычайно быструю подготовку графта. Еще одним эффектом изобретения является то, что применяемый каркас проходит ремоделирование быстрее и на 40-50% эффективнее по сравнению с контролем, проходящим подготовку традиционным образом.

В предпочтительном воплощении способа стволовые клетки получают во время той же процедуры или операции, которая выполняется в связи с имплантацией.

Изобретение относится к разряду фундаментальных, т.е. не ограничивается эволюционными барьерами в том, что касается скорости, качества и размера репарации дефекта и замещения ткани. Оно позволяет сформировать новообразованную ткань и обеспечить репарацию в ситуациях, когда организм не способен к репарации, и позволяет достичь эффекта, который обычно не встречается в организме человека или животного. Фундаментальность изобретения, таким образом, обеспечивает все необходимые применения для всех видов тканей всех людей и животных, поскольку оно закладывает основу стандартной технологии, которая действует для всех видов тканей за счет создания благоприятных условий для заживления ран при заболеваниях, которые в противном случае не могли бы быть репарированы естественным или искусственным образом.

Области применения включают все заболевания, сопровождающиеся ишемией, воспалением, а также наличием дефектов такого размера, что они либо не могут заживать самостоятельно, либо закрытие раны сопровождалось бы образованием рубцовой ткани. Рубцовая ткань является показателем плохого заживления повреждения, не обеспечивающего нормального или исходного функционирования ткани. Это имеет значение для любой ткани организма.

Изобретение может найти применение в лечении, например, повреждения спинного мозга или использоваться в лечении разорванной, поврежденной или травмированной нервной ткани центральной или периферической локализации в организме человека или животного. Оно относится к подготовке аутологичных имплантатов, передаче сигналов стволовых клеток для индукции ремоделирования тканей отдельно взятого графта, но не ограничивается этими тканями, поскольку оно может также найти применение для замещения других нервных тканей (нервов, спинного мозга, при инсульте мозга, травме мозга), кожи, глаз, роговицы, мышц (сердца, ткани сфинктера, скелетных мышц, мышечной ткани сосудов), сосудистой системы (вен, артерий, капилляров), кожи, лимфатической ткани, мочевого пузыря, уретры, пениса, яичников, трахеи, клапанов сердца, ткани мочевыводящих путей, заменителя костной или хрящевой ткани или любых других тканей организма человека. Основой для такой возможности применения является организация манипуляций со стволовыми клетками, что позволяет достичь восстановления за счет координированного взаимодействия клеток, материалов и сигнальных путей.

Следующий стандартный протокол формирует согласно изобретению основу для достижения полноценного ремоделирования с применением каркаса. Данный протокол не является исчерпывающим для изобретения: при необходимости отдельные этапы могут повторяться, дополняться, пропускаться, добавляться, замещаться или выполняться в другой последовательности. Последовательность этапов согласно способу данного изобретения, с применением устройств (автономной мобильной производственной установки, MU), выглядит следующим образом.

(i) Подготовка каркаса стерильным образом. Материал служит материалом для запуска процесса копирования, который в окончательном итоге приводит к образованию матрикса ткани, которую требуется сформировать. Каркас может быть синтетическим, таким как коллагеновые матрицы, или естественного происхождения (например, свиные клапаны).

(ii) Забор и подготовка в стерильных условиях взрослых/мезенхимных стволовых клеток ("клеточные факторы") из подходящих источников, таких как периферическая кровь или костный мозг, путем концентрирования или приготовления лейкоцитарной пленки.

(iii) Забор моноцитов периферической крови (РВМС) в стерильных условиях путем концентрирования или приготовления лейкоцитарной пленки.

(iv) Инкубация концентрата стволовых клеток с усиливающим фактором согласно изобретению, предпочтительно ЕРО, с получением таким образом предварительно обработанных стволовых клеток.

(v) Инкубация естественного или искусственного каркаса с усиливающим фактором согласно изобретению, предпочтительно ЕРО.

(vi) Внедрение или инъекция собранных предварительно обработанных или возможно необработанных стволовых клеток в/на предварительно обработанный или возможно необработанный каркас in vitro/ex vivo диффузно или мозаично, в зависимости от желаемой структуры, которую необходимо сформировать (например, хряща, кости, клапана или др). В системе, имеющей каналы, инъекция предварительно обработанных стволовых клеток осуществляется в/на области, расположенные ниже поверхности.

(vii) Внедрение или инъекция (как указано в пункте (vi)) дополнительно клеток ткани (например, эпителиальных клеток), полученных при отдельной биопсии поврежденной или дефектной специализированной ткани пациента, подлежащей регенерации, в/на указанный каркас.

(viii) Инкубация указанных предварительно обработанных или возможно необработанных каркасов с усиливающим фактором (предпочтительно ЕРО) и коммитирующим фактором (предпочтительно TGFB) и мобилизующим фактором (предпочтительно G-CSF), или, в альтернативном случае, только с коммитирующим фактором и мобилизующим фактором, возможно в виде гелеобразных или клейких композиций/препаратов, включающих указанные факторы.

(ix) Инкубация, как указано в пункте (viii), возможно дополнительно с препаратом РВМС.

(x) Подготовка тканеспецифичных фрагментов (например, измельченного хряща реципиента, эпителия или др.) для покрытия имплантата.

(xi) При необходимости применение биореактора или закрытого устройства для инокуляции и фиксирования смеси клеток на каркасе имплантата (например, кости, клапана, коллагеновой матрицы) согласно нормам GMP и требованиям автоматизации.

(xii) Предоставление подготовленного таким образом каркаса хирургу для имплантации в поврежденный или дефектный участок ткани пациента.

(xiii) Интраоперационное и in situ покрытие имплантатов из доступных участков с целью сокращения потери клеток. Клеточные гели наносят местно после индукции свертывания концентрата стволовых клеток костного мозга. Клеточные гели содержат один или более усиливающих, коммитирующих и мобилизующих факторов.

Этапы (i)-(ix) выполняются согласно изобретению в боксе с ламинарным воздушным потоком или соответствующем биореакторе или закрытом устройстве, предпочтительно сопряжено по времени с хирургическим вмешательством в течение 10-30 минут без необходимости репликации клеток или промежуточной транспортировки (все манипуляции выполняются в той же самой операционной).

После имплантации согласно описанию данного изобретения предпочтительно обработать имплантированный каркас гелеобразными или клейкими композициями, содержащими предпочтительно все факторы: клеточные факторы (стволовые клетки), коммитирующие факторы, усиливающие факторы, мобилизующие факторы и, возможно, пермиссивные факторы, согласно изобретению. Композицию наносят in situ поверх всех доступных участков для сокращения потери клеток.

Описанный выше способ запускает каскад восстановительных реакций, обеспечивающий ремоделирование in situ матрикса или совместно вводимых каркасов. Инъекции/введение, выполненные с указанными гелевыми или клеевыми композициями, содержащими клетки и факторы, согласно описанию, позволяют создать депо, обеспечивающее эффект медленного высвобождения, что является эффективным в процессе заживления in vivo.

Инъекции (например, также без совместного введения клеток в суставы) позволяют запустить каскад восстановительных реакций, обеспечивающий ремоделирование in situ матрикса или совместно вводимых каркасов.

В другом абсолютно новом аспекте изобретения предлагается способ, полностью отвечающий социологическим и нормативным требованиям, предоставляющий технологию, кардинально повышающую скорость подготовки имплантата, предназначенного для хирургической имплантации пациенту. Данная концепция соответствует бионическим принципам построения человеческого организма (Фиг.1). Изготовление графта не должно занимать 2-3 недели согласно описанию предшествующего уровня техники, а может быть выполнено за несколько минут/менее чем за час для получения различных видов требуемой ткани. Весь процесс в идеальном варианте осуществляется интраоперационно и, следовательно, исключает необходимость отправки соответствующих клеток в лабораторию. Это позволяет преодолеть логистические ограничения, избежать ненужной анестезии и затрат, включая время, которое может быть сэкономлено благодаря этому способу интраоперационного создания искусственного имплантата. Выполняемый врачом, лечащим пациента и не покидающим операционный зал, способ полностью соответствует существующим нормативным требованиям и требованиям к качеству. Таким образом, имплантат является не частным продуктом, который применяется отдельно, а процесс создания имплантата представляет собой часть терапии. Это самая безопасная из существующих методик, поскольку позволяет избежать трансформации и риска инфекций, таким образом обеспечивая повышенное качество. Каркас, применяемый согласно изобретению, способен отвечать на стимулы, вызывающие ремоделирование, и, предпочтительно, изготавливается с применением полностью закрытых, соответствующих нормам GMP устройств одностороннего действия, которые в большинстве своем известны и применяются в данной области техники. Данная технология характеризуется прежде всего тем, что репликации клеток in vitro удается полностью избежать за счет применения и нанесения вышеперечисленных факторов, которыми являются: клеточные факторы ("клетки"), усиливающие факторы (предпочтительно, естественным образом возникающие биологические молекулы, такие как ЕРО или гормон роста), коммитирующие факторы (предпочтительно, естественным образом возникающие биологические молекулы, такие как TGFβ, VEGF, гормоны или витамины), мобилизующие факторы (предпочтительно, естественным образом возникающие биологические молекулы, такие как G-CSF, GM-CSF) и, возможно, пермиссивные факторы (предпочтительно, естественным образом возникающие биологические молекулы, такие как ассоциированные с травмой цитокины, высвобождающиеся при повреждении). Результатом такого подхода является быстрое, эффективное и полное ремоделирование дефекта или повреждения ткани, которое на 40-50% быстрее по сравнению с соответствующими подходами, в которых не применяются указанные стимулирующие содействующие факторы. Новая бионическая технологическая концепция, представленная здесь, использует врожденные механизмы избирательного заживления ран в качестве пусковых событий, а также способность организма развивать сайт-специфический ответ независимо от типа и локализации ткани.

Одним из преимуществ изобретения является то, что нанесение ЕРО на каркас приводит к более быстрой экспансии предшественников эндотелиальных и гладкомышечных клеток из прилежащих областей для заселения каркаса. Использованная техника в альтернативном случае заключается в смешивании структур нормальных клеток-мишеней или фрагментов ткани в препарат стволовых клеток для усиления передачи паракринных сигналов.

Объект данного изобретения также является способ лечения поврежденной, травмированной или дефектной ткани пациента, обеспечивая таким образом полное восстановление (restitutio ad integrum), где здоровые клетки из ткани, требующей лечения, служат копируемыми клетками, способ включает этапы:

(i) мобилизации аутологичных стволовых клеток, полученных у пациента, которому предстоит лечение, путем взятия костного мозга, крови или других тканей;

(ii) мобилизации здоровых окружающих или выживающих клеток в качестве со-дифференцирующихся клеток, полученных из дефектной, травмированной или поврежденной ткани или ее окружения;

(iii) применения пациенту путем внутривенного, подкожного или местного введения композиции или препарата, содержащих (А) стволовые клетки из этапа (i), (Б) здоровые клетки ткани из этапа (ii) и (В) препарат, содержащий (а) по меньшей мере один фактор, стимулирующий стволовые клетки и ускоряющий ремоделирование клеток ткани, (б) по меньшей мере один фактор, способный контролировать и направлять дифференцировку указанных стволовых клеток, и (в) по меньшей мере один фактор, повышающий количество стволовых клеток как in situ, так и в периферической циркуляции.

В целом, изобретение направлено на решение следующих задач:

- способ интраоперационного изготовления ex vivo индивидуального искусственного имплантата на основе естественного или синтетического каркаса, служащего в качестве копируемого матрикса для ткани, которую требуется сформировать, вследствие дефекта ткани или повреждения ткани у пациента, способ включает этапы:

(i) подготовки естественного или синтетического каркаса в качестве матрикса, поддерживающего рост клеток ткани;

(ii) подготовки аутологичных стволовых клеток, полученных у пациента, которому предстоит лечение;

(iii) подготовки здоровых клеток в качестве копируемых клеток, полученных путем биопсии из дефектной или поврежденной ткани пациента, которому предстоит лечение;

(iv) инкубирования препарата стволовых клеток из этапа (ii) с композицией, содержащей фактор, стимулирующий стволовые клетки и ускоряющий ремоделирование клеток ткани;

(v) загрузки или инъекции клеточного препарата из этапа (iii) на или в матрикс каркаса;

(vi) инкубирования предварительно обработанного матрикса каркаса из этапа (v) в присутствии препарата предварительно обработанных стволовых клеток из этапа (iv) совместно с композицией, содержащей (а) нативный фактор, мобилизующий стволовые клетки и повышающий их доступность, (б) нативный фактор, способствующий дифференцировке стволовых клеток или их клеток-предшественников, и (в) фактор из этапа (iv); и

(vii) подготовки обработанного таким образом каркаса для имплантации пациенту, которому предстоит хирургическое вмешательство, причем этапы (iv)-(vi) выполняются в стерильных условиях в камере биореактора или боксе с ламинарным воздушным потоком в течение периода времени от 10 до 30 минут.

- Описанный выше способ, в котором аутологичные стволовые клетки из этапа (ii) и/или препарат копируемых клеток ткани из этапа (iii) предварительно обрабатывают композицией, содержащей (а) фактор, мобилизующий стволовые клетки и повышающий их доступность, (б) фактор, способствующий дифференцировке стволовых клеток или их клеток-предшественников, и, возможно, (в) фактор, стимулирующий стволовые клетки и ускоряющий ремоделирование клеток ткани.

- Указанный способ, в котором фактор, стимулирующий стволовые клетки и ускоряющий ремоделирование клеток ткани, выбран из группы, состоящей из ЕРО и гормона роста человека, и в котором фактор, мобилизующий стволовые клетки и повышающий их доступность, выбран из группы, состоящей из G-CSF и GM-CSF, и в котором фактор, способствующий дифференцировке стволовых клеток или их клеток-предшественников, выбран из группы, состоящей из TGFB, VEGF, витамина С и витамина Е.

- Указанный способ, в котором фактором, мобилизующим стволовые клетки и повышающим их доступность, является G-CSF, фактором, способствующим дифференцировке стволовых клеток или их клеток-предшественников, является TGFB, и фактором, стимулирующим стволовые клетки и ускоряющим ремоделирование клеток ткани, является ЕРО.

- Указанный способ, в котором стволовые клетки получают из костного мозга или периферической крови пациента, которому предстоит лечение, и предпочтительно не подвергают экспансии ранее в ходе отдельного этапа процесса.

- Соответствующий способ, в котором инкубация на этапе (vi) включает добавление аутологичных моноцитов периферической крови (РВМС).

- Указанный способ, в котором этапы (iv)-(vi) выполняются одновременно с предварительной подготовкой пациента к имплантации каркаса в или на дефектную или поврежденную ткань.

- Способ по любому из пунктов с 1 по 10, в котором различные факторы и/или различные клетки, указанные в любом из предыдущих пунктов, доставляют в каркас в составе вязкой гелеобразных или клейких препарата или композиции.

- Применение каркаса, полученного согласно указанному способу, для изготовления имплантата для лечения поврежденной или дефектной ткани, что таким образом позволяет достичь полного восстановления (restitutio ad integrum).

- Соответствующие применение, при котором вязкие гелеобразные или клейкие препарат или композицию различных факторов и/или клеток, указанныя в любом из предыдущих пунктов, используют при интраоперационной обработке in situ только что имплантированного каркаса во всех или некоторых выбранных участков дефектной или поврежденной ткани.

- Применение препарата или композиции, содержащих

(i) свежеприготовленные аутологичные стволовые клетки, не проходившие экспансию,

(ii) фактор, стимулирующий стволовые клетки и ускоряющий ремоделирование клеток ткани, выбранный из группы, состоящей из ЕРО и гормона роста человека,

(iii) фактор, мобилизующий стволовые клетки и повышающий их доступность, выбранный из группы, состоящей из G-CSF и GM-CSF, и

(iv) фактор, способствующий дифференцировке стволовых клеток или их клеток-предшественников, выбранный из группы, состоящей из TGFβ, VEGF, витамина С и витамина Е,

для изготовления лекарственного препарата для лечения поврежденной или дефектной ткани пациента отдельно или совместно с имплантированным каркасом, поддерживающим рост специализированных клеток, таким образом достигая полного восстановления (restitutio ad integrum).

- Применение, согласно описанию, в котором препарат, или композиция, или каркас дополнительно содержат здоровые клетки из дефектной или поврежденной ткани пациента, которому предстоит лечение, служащие в качестве копируемых клеток, и, возможно, аутологичные РВМС, и указанные клетки предпочтительно предварительно обработаны ЕРО и/или G-CSF и/или TGFβ.

- Применение, согласно описанию, в котором композиция или препарат доставляют в виде вязкого гелеобразного или клейкого препарата, который наносят на или инъецируют в дефектную или поврежденную ткань во всех или некоторых выбранных участках, причем указанный препарат предпочтительно состоит из крови, плазмы или костного мозга, концентрата костного мозга, который наносят или инъецируют в дефектную или поврежденную ткань во всех или некоторых выбранных участках и вызывают полимеризацию путем добавления Ca++, или тромбина, или другого подходящего полимеризующего компонента.

- Соответствующее применение, в котором каркас предварительно обрабатывают здоровыми клетками из дефектной или поврежденной ткани пациента, которому предстоит лечение, и, возможно, аутологичными РВМС, и/или в котором стволовые клетки предварительно обрабатывают ЕРО и/или гормоном роста человека.

- Применение, согласно описанию, в котором в случае использования каркаса, подготовка, обработка и предварительная обработка соответствующих клеток проводится интраоперационно одновременно с хирургической операцией и занимает короткое время от нескольких минут до менее чем одного часа.

- Применение, согласно описанию, в котором в случае, если каркас не используют, композиция или препарат соответствующих клеток и факторов доставляют для системного введения посредством внутривенного или подкожного введения, или если ткань, требующая обработки, доступна - посредством прямого местного введения.

- Способ интраоперационного приготовления аутологичных клеток, индуцирующих, стимулирующих и способствующих дифференцировке и росту клеток ткани в дефектной или поврежденной ткани в виде естественного или синтетического каркаса у пациента, в ходе предварительной подготовки и обработки пациента для имплантации указанного каркаса указанному пациенту, в котором указанные клетки являются (а) аутологичными стволовыми клетками из костного мозга, ткани или крови пациента, имеющего дефект ткани, травму ткани или повреждение ткани, и (б) здоровых клеток ткани в качестве копируемых клеток для покрытия матрикса каркаса, имплантируемого пациенту, способ включает этапы:

(i) выявления участка повреждения у пациента;

(ii) мобилизации аутологичных стволовых клеток пациента, которому предстоит лечение, путем взятия костного мозга, крови или других тканей;

(iii) мобилизации аутологичных стволовых клеток пациента, которому предстоит лечение, путем биопсии здоровых окружающих или выживших клеток из дефектной или поврежденной ткани; эти клетки служат в качестве клеток матрицы на матриксе каркаса;

(iv) обработки концентрата стволовых клеток из этапа (ii) ex vivo без их экспансии при помощи ЕРО, или hGH, или других факторов, стимулирующих стволовые клетки и ускоряющих ремоделирование клеток ткани в течение 10-30 минут в биореакторе или боксе с ламинарным воздушным потоком, расположенном в операционном зале в стерильных условиях;

(v) обработки клеток, играющих роль матрицы, из этапа (iii) ex vivo по меньшей мере при помощи одного фактора, выбранного из группы, состоящей из ЕРО, hGH, GM-CSF, G-CSF и TGFβ, в течение 10-30 минут в биореакторе или боксе с ламинарным воздушным потоком, расположенном в операционном зале в стерильных условиях;

(vi) покрытия каркаса или инъецирования в него ех vivo предварительно обработанных клеток из этапов (iv) и (v) в течение 10-30 минут в биореакторе или боксе с ламинарным воздушным потоком, расположенном в операционном зале в стерильных условиях;

(vii) предварительной подготовки пациента к имплантации с одновременным выполнением этапов с (iv) no (vi);

(viii) имплантации частично или полностью покрытого каркаса из этапа (v) в дефект ткани или рану и, возможно,

(ix) нанесения посредством местного введения гелеобразных или клейких композиции или препарата на имплантированный каркас и на ткань, окружающую имплантат, в котором указанная композиция или препарат содержит клетки из этапов (ii) и (iii) и один или несколько факторов из этапа (v).

- Указанный выше способ, в котором композицию или препарат, содержащие по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из ЕРО, hGH, GM-CSF, G-CSF и TGFβ, назначают пациенту в фармакологически эффективном количестве посредством системного введения до начала операции на этапе (i).

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

(А) Определения:

Термин "содействующие факторы", используемый в данном изобретении, объединяет группу факторов, состоящих из: "клеточных факторов", "усиливающих факторов", "коммитирующих факторов", "мобилизующих факторов " и "пермиссивных факторов".

Термин "клеточные факторы" относится, в частности, не столько к факторам, известным как ростовые факторы и им подобным, а к специфическим клеткам, которые проявляют или сохраняют свою способность дифференцироваться в клетки ткани определенного фенотипа со специфической биологической функцией. Наиболее предпочтительными клеточными факторами или клетками, согласно изобретению, являются все виды стволовых клеток, такие как эмбриональные стволовые клетки или взрослые стволовые клетки, такие как мезенхимные стволовые клетки, например клетки, полученные из периферической крови или костного мозга. Стволовые клетки присутствуют во всех тканях и являются положительными по CD90. Эти клетки можно выделить путем обработки коллагеназой из ткани кожи, печени и сердца, из большинства других тканей. Клетки экспрессируют не только CD90, но также и другие маркеры, как правило, обнаруживаемые на клетках костного мозга.

Однако клетки не только экспрессируют рецептор к эритропоэтину, но также и к его субъединице бета-cR. Бета-cR является мишенью для ЕРО и опосредует его ремоделирующую внеклеточный матрикс активность в CD90+клетках. Показано, что ко-экспрессия бета-cR обнаруживается в таких тканях, как кожа, селезенка и почки, наряду с экспрессией рецептора гормона роста GHR. Экспрессия бета-cR, действительно, обнаруживается во всех тканях совместно с GHR. Таким образом, все клетки, экспрессирующие бета-cR, являются подходящими "клеточными факторами", согласно изобретению. Экспрессия бета-cR, действительно, обнаруживается во всех тканях совместно с GHR. На Фигуре 1 экспрессия бета-cR и гормона роста показана в коже, селезенке и почках в качестве примера, поскольку ко-экспрессия не ограничивается этими тканями, а является универсальной.

Термин "интеллектуальный графт" или "интеллектуальный каркас" означает высокоспецифичную матрицу ткани, распознающую окружение раны, в которое он имплантирован, и реагирующую соответствующим образом, используя это окружение для собственного ремоделирования в конкретную целевую ткань за счет активации стволовых клеток, в результате приводя к появлению специализированной безрубцовой ткани высокого качества.

Термин "усиливающие факторы", используемый в данном изобретении, описывает соответствующие биологические молекулы предпочтительно естественного происхождения, стимулирующие экспрессию вышеупомянутых рецепторов на CD90 положительных клетках, предпочтительно на стволовых клетках. Назначением этих "усиливающих факторов" является облегчение ремоделирования, сокращение воспаления и стимулирование стволовых клеток к росту и защита от ишемии и других повреждений ткани. Группа факторов включает, кроме эритропоэтина, тромбопоэтин и гормон роста человека. Она также включает производные эритропоэтина и его пептидные последовательности, которые, например, стимулируют бета-CR субъединицу рецептора эритропоэтина, рецептор ТРО или рецептор гормона роста. Провоспалительные цитокины обладают стимулирующим влиянием на мезенхимные стволовые клетки, когда их ко-стимуляция происходит в присутствии эритропоэтина. В такой ситуации может быть запущена активация in vitro CD90 положительных стволовых клеток (фибробластоподобных прогениторов). В отдельности эритропоэтин не оказывает инициирующего влияния на полностью дифференцированные клетки, что означает, что он не действует как обычный ростовой фактор, а, согласно изобретению, выполняет сенсибилизирующую роль, связывая активацию стволовых клеток, вызванную травмой, и ответ в виде регенеративного роста. Это означает, что во время трансплантации в местном окружении повреждения запускается сайт-специфичный процесс активации. Очевидно, что человеческий организм способен реагировать на локализованную травму путем запуска сайт-специфичного ответа, приводящего к восстановлению. Сайт-специфичное восстановление должно быть связано со сложным характером действия высвобождающихся при травме цитокинов и усиливающих факторов. Согласно данному изобретению, "усиливающие факторы" в идеальном случае ко-трансплантируют либо при предварительной инкубации клеток во время подготовительных этапов, либо путем их интегрирования (во всю толщу, в виде микроструктур) и/или их фиксации вместе с другими содействующими факторами в каркасе для трансплантации. Таким образом, каркас становится материалом, который способен посылать сигнальные факторы клеткам во время инокуляции, а в идеальном варианте также на протяжении всего периода своего существования или его части. Это представляет собой пролонгированный механизм высвобождения. Примерами подходящих усиливающих факторов, согласно изобретению, являются: ЕРО, ТРО и гормон роста человека (HGH).

Термин "мобилизующий фактор" означает, согласно изобретению, биологические молекулы, предпочтительно естественного происхождения, способные повышать количество стволовых клеток как in situ, так и в периферической циркуляции, но не ограничивается ими. Мобилизующие факторы можно добавлять дополнительно или альтернативно при нагрузке графта in situ стволовыми клетками, подготовленными во время операции.

Термин "коммитирующий фактор" означает, согласно изобретению, биологические молекулы, предпочтительно естественного происхождения, способные контролировать и направлять дифференцировку, предпочтительно in situ, а не in vitro, стволовых клеток, их клеток-предшественников и клеток, которые не являются окончательно дифференцированными, но не ограничивается ими. Примерами таких факторов, согласно изобретению, являются: некоторые гормоны, витамины, такие как витамины С, А и Е, TGFβ и VEGF.

Термин "пермиссивный фактор" означает, согласно изобретению, биологические молекулы, предпочтительно естественного происхождения, которые, как правило, присутствуют или вырабатываются в ходе воспаления раны, например типичные цитокины, ассоциированные с травмой, но не ограничивается ими. In vitro эти ассоциированные с травмой молекулы, как правило, отсутствуют и могут быть дополнительно добавлены к клеткам, полученным и обработанным согласно описанию данного изобретения. Другой пермиссивный фактор образуется на фоне самой ишемии. Эти молекулы и условия указывают на сайт-специфичность и необходимость пермиссивных факторов и их вклад в активацию стволовых клеток при одновременном присутствии содействующих и коммитирующих факторов. Это объясняет, почему этот процесс настолько быстро позволяет индуцировать ремоделирование графта и представляет собой мощный инструмент для достижения ремоделирования графта при одновременном применении, согласно описанию данного изобретения. В случае хронических или дегенеративных состояний, не сопровождающихся состоянием воспаления, или в случае отсутствия какой-либо травмы или повреждения, существует по меньшей мере два варианта согласно изобретению, которые применяют для достижения полного спектра стимуляции стволовых клеток: А) совместное введение ассоциированных с травмой цитокинов, таких как IL-1, TNFalpha, IL-6, в очень низкой концентрации и предпочтительно местными способами. Это включает, например, покрытие или внедрение в используемые каркасы. Б) В случаях менее значительных повреждений (касательно размера дефекта, подлежащего регенерации) используется механическая стимуляция, например, иглой, натирание поверхности до развития гиперемии, воздействие УФ излучения, воздействие лазера и выполнение надрезов, приводящие к эндогенному выбросу таких пермиссивных факторов. Этот процесс может, таким образом, осуществляться одновременно с внесением других факторов, а также стволовых клеток или без них.

Возможные трудности, связанные с наличием факторов, можно обойти, согласно изобретению, путем применения свежесобранных аутологичных клеток ткани, полученных у того же пациента из ткани, подлежащей регенерации или заживлению. Эти клетки ткани можно использовать в виде смеси кусочков ткани, которые можно добавлять к концентрату стволовых клеток или композиции, приготовленной для имплантации, покрытия каркаса или системного введения, как отдельно, так и в дополнение к имплантации.

Каждый из этих факторов и все они вместе, а также их применение согласно изобретению могут устранить трудности и ограничения, связанные со "слепой" трансплантацией в окружающие ткани или в синтетический или биологический/естественный каркас.

Термин "интраоперационно", или "интраоперационный процесс", или "процесс интраоперационного создания имплантата" согласно изобретению означает процесс, при котором подготовка импланта/каркаса ex vivo и хирургическое вмешательство в организм человека или животного в участках дефекта, травмы или повреждения ткани осуществляются в основном параллельно, включая биопсию соответствующих клеток для нагрузки каркаса ех vivo сопряженно по времени. Это означает, что операции ex vivo, касающиеся стволовых клеток или других клеточных препаратов и их предварительной обработки, включая инкубацию поддерживающих матриц (каркасов), начинают незадолго до или одновременно с хирургической операцией пораженной ткани, органа, сустава и т.д. и заканчивают самое позднее после имплантации каркаса, нагруженного клетками и факторами, как описано выше. Термин также включает нанесение полученных таким образом или обработанных таким образом клеток и факторов в форме подходящей композиции или препарата, предпочтительно в виде препарата геля или клея, для обработки имплантированного каркаса и окружающей ткани вокруг имплантата и дефектной или поврежденной ткани, окружающей только что имплантированный каркас.

(Б) Подробное описание изобретения и конкретных воплощений

Отличительным признаком изобретения является то, что клетки совместно трансплантируют с набором различных факторов, как указано выше. Согласно описанию изобретения эти факторы действуют in situ и контролируют и индуцируют дифференцировку и рост также in situ.

Согласно изобретению факторы вводят предпочтительно местно, вместе с каркасом ех vivo и/или in vivo и одновременно в присутствии экзогенно введенных (стволовых) клеток или без них. Возможно также использовать только некоторые из перечисленных выше факторов. Кроме того, в предпочтительном воплощении изобретения факторы, а также соответствующие клетки (стволовые клетки, клетки ткани пациента) могут быть введены отдельно или совместно с предпочтительно предварительно обработанным каркасом/имплантатом путем системного введения пациенту, которому предстоит лечение, за достаточное время (1-5 дней) до хирургической операции и начала процесса согласно изобретению.

Другим отличительным признаком изобретения является, что применение факторов согласно изобретению позволяет полностью исключить проведение культивирования in vitro, что подразумевает любую экспансию клеток, включая стволовые клетки. Преимуществом этого воплощения является то, что интервал времени, необходимый для этапа подготовки клеток, может быть сокращен до нескольких минут, что таким образом исключает все неудобства, связанные с экспансией клеток и дифференцировкой клеток in vitro. В отсутствие репликации клеток in vitro риск существенно снижается и/или устраняется. С другой стороны, данное воплощение позволяет контролировать дифференцировку in situ в участке травмы (участок имплантата) совместно с воздействием усиливающего фактора, такого как ЕРО.

Единичные факторы, как указано в изобретении, взаимодействуют друг с другом и клетками, предпочтительно стволовыми клетками, in situ в участке травмы.

Факторы применяют для совместной инкубации с клетками-предшественниками во время трансплантации или применяют для непосредственного покрытия каркаса. „Коммитирующий фактор", как указано в изобретении, таким образом, может быть также нанесен на каркас мозаично. В коллагеновой, или гиалуроновой, или хитозановой губке применяют TGF бета 1, 2 или 3 для запуска дифференцировки мезенхимных стволовых клеток в участке имплантата. Таким образом, взаимодействие усиливающих и коммитирующих механизмов способствует регенерации тканей, делая ее существенно быстрее и качественнее. Разница объясняется тем фактом, что в случае клеток хряща, производных MSC (мезенхимных стволовых клеток), дифференцировку клеток стандартным способом требуется начать за 2-4 недели до имплантации. Клетки также теряют и не всегда сохраняют свой дифференцировочный статус in vivo после имплантации. В данной области техники хорошо известно, что, как правило, хрящ, сформированный in vitro или in vivo, дедифференцируется в фиброзную ткань в течение нескольких месяцев. Полученный согласно изобретению гиалиновый хрящ сохраняет свое высокое качество в организме животных по меньшей мере в течение 1 года (эквивалентно 5-7 годам у человека). Технология согласно изобретению позволяет осуществить подготовительную фазу гораздо быстрее (полностью исключив культивирование, занимающее недели), она является лучшей с точки зрения качества (отсутствие фиброза/рубцов) и она более выгодна экономически для производства. Продукция клеток отвечает нормам GMP (надлежащей производственной практики).

Например, в каркасе трахеи хрящевые кольца, образующие цилиндр, имеют ширину 3-4 мм. Здесь можно различить каждый миллиметр дифференцированной зоны. Таким образом, сочетание факторов согласно изобретению, например коммитирующих факторов, может применяться для структурирования каркасов. Одним из коммитирующих факторов является, например, витамин С, который может нанесен мозаично в зонах между хрящевыми кольцами для поддержания синтеза и развития матрикса. Другим примером коммитирующего фактора является IL-15, который поддерживает развитие бронхиального эпителия и может быть доставлен в просвет каркаса трахеи.

Как подчеркивалось выше, усиливающие факторы, такие как ЕРО или гормон роста, по определению находятся во взаимодействии с условиями, существующими в месте повреждения, и способны реагировать на их изменение. Для полноты представления, это объясняется экспрессией ассоциированных с травмой цитокинов, известных в данной области техники (J Trauma, 2008, vol. 65, n°6, pp.1374-1378). Эти факторы, включая ассоциированные с травмой цитокины, вырабатываются физиологически. IL-12 (р70) и IL-18 и цитокины Th2 типа IL-4, IL-10 и IL-11 определяли с применением методики иммуноферментного анализа у пациентов и у здоровых контролей. IL-2 и интерферон y определялись редко. Все другие медиаторы были существенно повышены по сравнению с контролем (p<0,05). Все цитокины были повышены наиболее выражено во время 1 и 2 недели после травмы и затем снижались. Другие цитокины включают IL-1, IL-6 и TNF alpha, и способствуют усиливающему эффекту ЕРО/ТРО и гормона роста. Пермиссивные факторы обусловливают появление CD90 клеток в участках травмы при стимуляции ЕРО (усиливающим фактором) заживления без образования рубцов. Это актуально, например, для ишемии сердца, повреждении спинного мозга, восстановлении хряща, регенерации сухожилий и всех других тканей, поскольку означает полное восстановление („restitutio ad integrum"), а не дефект (образование рубцов при заживлении).

Важным действием факторов согласно изобретению, например усиливающих факторов, является увеличение популяции стволовых клеток (таких как С90 положительных клеток) при наличии травмы. На Фигуре 2 показано, что С90+ (Thy1) обнаруживается в сосудистой сети в нормальных условиях. На панелях А и Б показана нормальная паренхима печени на модели грызунов. При воздействии на ткань ЕРО (250 единиц/кг веса тела) экспрессия С90+ клеток запускается повсеместно в паренхиме в течение 24-48 часов, достигая максимальных показателей, когда на каждые 5-10 клеток приходится одна CD90+ клетка. На Фигуре 2 (В) также показано, что травма сама по себе как патофизиологическое состояние нисколько не отличается от состояния в отсутствие травмы в отношении CD90+, т.е. паренхима свободна от CD90+ клеток. На панели Б также показано, что этот эффект не зависит от ЕРО, поскольку в отсутствие травмы не происходит стимуляции появления CD90+ клеток. Стимулирующий эффект скорее зависит от сенсорной и реактивной роли ЕРО, что проявляется в виде стимуляции экспрессии CD90+ клеток в случае травмы (Г). Такое сенсорное действие показано на Фигуре 2. Только в условиях, сопровождающихся травмой, применение ЕРО приводит к увеличению популяции CD90+ клеток. Эти клетки принимают на себя ключевую роль в содействии заживлению без формирования рубцов или без развития фиброза во всех ситуациях, связанных с травмой (Фигура 2).

Технология согласно изобретению дает возможность осуществлять одновременную мобилизацию стволовых клеток путем совместного введения таких молекул, как GM-CSF или GSF, для повышения выхода MSC из костного мозга в требуемых участках. Важно, что эти мобилизующие клетки операции выполняются в одних и тех же или перекрывающихся временных интервалах. В свою очередь, за счет местного внедрения молекул обеспечивается их медленное высвобождение и возможность применения очень низких концентраций, составляющих менее 200 мкг/м² поверхности тела.

В ситуациях, когда используют экзогенно полученные стволовые клетки, например при их выделении из костного мозга или любого другого участка тела, совместное введение таких мобилизующих факторов обеспечивает поддержание регенеративных сигналов, которые уже не возникают физиологически в условиях тяжелых повреждений.

Согласно изобретению, для дополнения сети одновременных взаимодействий и запуска регенерации „мобилизующие факторы" предпочтительно добавляют как для повышения количества стволовых клеток в периферической циркуляции, так и для обеспечения местной мобилизации стволовых клеток. Новизна изобретения состоит в их синхронном действии и значении для регенерации при использовании, например, совместно с самим каркасом (свободным от клеток во время имплантации) и, в альтернативном случае, при использовании во время имплантации каркаса с инокулированными стволовыми клетками. Третьей альтернативой является отсутствие применение каркаса. Это дает особые преимущества при нейрональных заболеваниях, включая рассеянный склероз, инсульт, болезнь Альцгеймера, психиатрические заболевания и нейродегенеративные нарушения, не отвечающие на изолированную стимуляцию единственным фактором (например, ЕРО) полностью и стабильно.

На Фигуре 3 показана упрощенная схема изобретения и взаимодействие между компонентами, обеспечивающими максимальное заживление. Для этой цели содействующие факторы могут использоваться в покрытии, но предпочтительно их внедряют в материалы каркаса (внутрь). Это позволяет обеспечить их последующее высвобождение во время процесса ремоделирования трансплантированного каркаса для стимуляции растущих клеток в ходе процесса ремоделирования. Это означает, что процесс сайт-специфической активации обеспечивается местным окружением раны во время трансплантации. Очевидно, человеческий организм способен реагировать на локализованную травму путем запуска сайт-специфического ответа, приводящего к восстановлению. Сайт-специфичное восстановление должно быть связано со сложным характером действия высвобождающихся при травме цитокинов и усиливающих факторов.

Процесс начинается при взятии приблизительно 100-200 мл периферической крови (у взрослых, 10-50 мл у детей) и центрифугированием для получения так называемой лейкоцитарной пленки, содержащей CD45+ клетки-предшественники. В альтернативном случае стволовые клетки могут быть получены путем аспирации костного мозга. При подготовке стволовых клеток свертывание аспирата предотвращают за счет добавления гепарина или хелатирующих агентов. Клеточный аспират может быть сконцентрирован или применен непосредственно после индукции полимеризации и нанесен на графт как биополимерное покрытие. В этом случае свертывание компонентов крови или плазмы аспирата стволовых клеток запускают путем добавления тромбина или Ca++. Кроме того, с этим препаратом могут быть смешаны губка на основе коллагена, фрагменты губки или порошок коллагена для усиления когезивных и клеящих свойств продукта полимеризации. Одновременно этот гелеобразный препарат требуется нанести на поверхности материала каркаса, например на матрикс трахеи. В этом случае гель стволовых клеток наносят преимущественно на внешнюю сторону имплантата. Перед этим стволовые клетки инкубируют с TGF бета 3 и эритропоэтином. Этот клеточный препарат наносят на каркас в форме дуги или кольца. Люминальную поверхность и периферические участки также предварительно обрабатывают ЕРО и TGF бета 3 (трахея). Такое добавление стволовых клеток одновременно способствует улучшению васкуляризации графта за счет активации стволовых клеток. Местное нанесение различных факторов, упомянутых выше, обеспечивает их достаточно высокую локальную концентрацию, но очень низкое системное присутствие. Системное нанесение может быть впоследствии выполнено обычным образом.

Согласно данному изобретению, любой каркас графта (например, очищенный от клеток или нативный клапан сердца или очищенная от клеток или нативная трахея) могут быть использованы в качестве матрицы для быстрого ремоделирования. Весь процесс подготовки занимает всего несколько минут, или всего 30-45 минут. В этом смысле материал, требующий ремоделирования, становится материалом, который, не будучи полностью сформированным графтом, служит матрицей для получения нужного результата.

Главное преимущество этого подхода заключается в том, что необходимость в экспансии и предварительной дифференцировке стволовых клеток перед трансплантацией полностью отпадает. Кроме того, достигается лучшее качество имплантата, что подтверждается гистологически и по восстановлению функции после ремоделирования. Еще одним преимуществом является сайт-специфичность действия коммитирующих факторов, позволяющая избежать системных побочных эффектов. Согласно данному описанию локальное присутствие пермиссивных факторов совместно с экзогенно вводимыми усиливающими факторами обеспечивает возможность чрезвычайно быстрой подготовки графта.

В альтернативном случае стволовые клетки могут быть получены путем аспирации костного мозга. При подготовке стволовых клеток свертывание аспирата предотвращают за счет добавления гепарина или хелатирующих агентов. Клеточный аспират может быть сконцентрирован или применен непосредственно после индукции полимеризации и нанесен на графт как биополимерное покрытие. В этом случае свертывание компонентов крови или плазмы аспирата стволовых клеток запускают путем добавления, например, тромбина или Ca++. Кроме того, губка на основе коллагена, фрагменты губки или порошок коллагена могут быть смешаны с этим препаратом для улучшения когезивных и клеящих свойств продукта полимеризации. Одновременно этот гелеобразный препарат требуется нанести на поверхности материала каркаса, например на матрикс трахеи. В этом случае гель стволовых клеток наносят преимущественно на внешнюю сторону имплантата. Перед этим стволовые клетки инкубируют с TGF бета3 и эритропоэтином. Этот клеточный препарат наносят на каркас в форме дуги или кольца. Люминальную поверхность и периферические участки также предварительно обрабатывают ЕРО и TGF бета3 (трахея). Такое добавление стволовых клеток одновременно способствует улучшению васкуляризации графта за счет активации стволовых клеток. Местное нанесение различных факторов, упомянутых выше, обеспечивает их достаточно высокую локальную концентрацию, но очень низкое системное присутствие. Системное нанесение может быть впоследствии выполнено обычным образом.

Согласно данному изобретению любой каркас графта (например, очищенный от клеток или нативный клапан сердца или очищенная от клеток или нативная трахея) могут быть использованы в качестве матрицы для быстрого ремоделирования.

Следующий протокол, приведенный в качестве примера, но не являющийся исчерпывающим, был разработан для ремоделирования каркаса:

1) Подготовка каркаса стерильным образом.

2) Внедрение эритропоэтина в виде стерильного порошка в толщу каркаса для создания депо, инъекция.

3) Инкубация только что изолированных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток с ЕРО (250 ME/кг веса тела), время.

4) Инкубация только что выделенных мононуклеарных клеток периферической крови с ЕРО (250 ME/кг веса тела).

5) Рекомендуется: выделенные из крови РВМС внутри, костный мозг снаружи, предпочтительно в смеси с островками местного эпителия и фрагментами ткани, полученными при биопсии здоровых тканей.

6) Инкубация с/покрытие каркаса TGFβ, паратиреоидным гормоном, инсулином, дексаметазоном (в альтернативном случае используется препарат, обеспечивающий медленное высвобождение из наноносителей, таких как гиалуроновая кислота).

7) Инокуляция этих клеток во время операции в стерильное устройство для «засеивания» (процесс вращения или нанесения).

8) Имплантация в течение приблизительно 45 мин.

На Фигуре 4 графически представлен производственный процесс по данному способу для достижения у пациента безрубцового заживления и полного восстановления ("restitutio ad integrum"). Главным преимуществом технологии является то, что она заложит основы для обеспечения самых высоких стандартов, которых можно добиться на настоящий момент, по сравнению с предшествующим уровнем техники в отношении стерильности, безопасности, воспроизводимости, экономичности, качества результатов и возможностью массового использования. После взятия стволовых клеток в стерильных условиях и их подготовки тотчас же продолжают выполнение всех технологических процессов параллельно с проводимым терапевтическим или оперативным лечением пациента или интраоперационной обработкой. Главным преимуществом является временная последовательность событий, позволяющая избежать манипуляций вне стен операционного зала, выбывания из больницы, экспансии клеток, сложной транспортной логистики (машина, поезд, самолет и другие курьерские службы), а также клеточной трансформации и активации онкогенов, селекции клеток или клонирования в условиях искусственного культивирования in vitro и нежелательных манипуляций и дедифференцировки клеток, а также риска, связанного с инфекцией.

Все манипуляции могут быть выполнены тут же в условиях чистой комнаты, преимущество заключается в отсутствии необходимости покидать зону экстренного лечения, поскольку при любых обстоятельствах операционный зал является наиболее чистой комнатой. Это обеспечивает ряд преимуществ с точки зрения безопасности и норм GMP. Затем манипуляции с клетками проводятся в помещениях класса «А», оборудованных биореакторами, стерильными сосудами, стерильным льдом, штативами для пробирок, стерильными салфетками и предварительно простерилизованными инструментами. Концентрат стволовых клеток переносят из резервуара, в который их забирали, для инокулирования в каркас, находящийся в стерильной упаковке (например, каркас сердечного клапана, коллагеновая губка). Каркас и соответствующие лиофилизаты с усиливающими, коммитирующими или мобилизующими молекулами уже могут содержаться в биореакторах. В первом устройстве стволовые клетки, находящиеся в крови, или костном мозге, или в форме другого концентрата (особенно жировые стволовые клетки), подвергают воздействию этих факторов и хранят на льду. В это время подготавливают каркас путем инъекции усиливающих, коммитирующих и/или мобилизующих факторов в условиях ламинарного воздушного потока. Биореактор или устройство, в котором содержится каркас, помещают на приспособление для измерения веса для регистрации увеличения веса. Показания этого инструмента записывают в диалоговом режиме при помощи специального программного обеспечения. Это программное обеспечение также позволяет записывать увеличение веса, когда на следующем этапе на каркас наносят концентрат стволовых клеток. Внутри ламинара температура и концентрация частиц в воздухе записываются в диалоговом режиме и отображаются на экране вблизи ламинара. Программное обеспечение также регистрирует время от начала фильтрации воздуха до начала выполнения протокола для обеспечения стерильности. Поскольку для прочистки фильтров требуется небольшое время, оборудование включают заблаговременно. Для подтверждения выполнения определенных этапов и допуска к переходу к следующим этапам подготовки клеток и каркаса лицо, проводящее манипуляции с клетками, использует, например, инструмент с педальным управлением, связанный с сервером (персональным компьютером), во избежание контаминации руками. Таким образом, программное обеспечение выполняет функции контроля и деблокировки помимо регистрации процесса. Это превращает устройство на Фигуре 10 в автономную самоконтролируемую производственную установку для обработки стволовых клеток, отвечающую нормам GMP. Весь процесс записывается на видео при помощи встроенной камеры, которая также посылает данные в программное обеспечение. Это важно для документирования соответствия процессов требованиям GMP. Окончание подготовительного процесса и подтверждение специальным сотрудником, выполняющим его, позволяет отсоединить биореактор и транспортировать на операционный стол. Перед транспортировкой биореактор/устройство закрывают или накрывают, чтобы исключить поступление контаминантов с воздухом из операционного зала (как правило, помещений класса В или С). В том случае, если для подготовки стволовых клеток применяют центрифугу, центрифуга может быть размещена вне производственной установки, если возможно закрытое производство. Этапы манипуляций с центрифугой также регистрирует специальное программное обеспечение. После извлечения имплантата производственную установку очищают и деконтаминируют для подготовки к следующему пациенту. Оба этих этапа также регистрируются программным обеспечением и подтверждаются выполняющим их работником. Всю собранную информацию передают в диалоговом режиме, когда это возможно, в централизованный реестр. В этом реестре данные о пациенте, включая диагноз, стадию заболевания и состояние в послелечебный период, заполняются врачами/лечащим персоналом. Это позволяет гарантировать полный контроль качества и доступность для третьих лиц, осуществляющих независимый контроль качества. Данный подход, включающий интраоперационную обработку, технологические условия и программное обеспечение для управления и контроля, позволяет при осуществлении независимого контроля качества достичь самых высоких в мире стандартов получения имплантатов стволовых клеток и в то же время снизить стоимость производства в 10-100 раз по сравнению со стандартной обработкой. Сочетание этих преимуществ производственного процесса является ключевым элементом для массового производства и всеобщей доступности индивидуальных имплантатов/персонализированных имплантатов на основе стволовых клеток. Таким образом, научное изобретение позволяет положить начало индустриальной технологии первостепенной важности, полностью дополняющей научные, технологические и лечебные преимущества процесса и способа данного изобретения.

На Фигуре 11 кратко изложено внедрение в процесс компонентов контроля качества согласно изобретению. Контроль качества включает получение стволовых клеток, подготовку стволовых клеток, этапы инокуляции внутри мобильной производственной установки. Все этапы регистрируются в диалоговом режиме в реальном времени и независимо от действий работника (производящего манипуляции с клетками) путем автоматического сбора данных. Выпуск имплантата осуществляется после контроля всех параметров. Биореактор/устройство доставки герметизируется/закрывается перед передачей оператору. Его открывание снова документируется. Процесс заканчивается документированием состояния пациентов.

Устройство на Фигуре 10 представляет собой производственную установку, которая для надлежащего функционирования согласно изобретению содержит следующие компоненты в качестве модулей: основное программное обеспечение, контролирующее все операции и таким образом формирующее управляющий модуль, имеющий сенсорную, измерительную и контролирующую функции, а также общее документирующее назначение. Инструментальные компоненты в полной комплектации включают помещение с ламинарным воздушным потоком класса А, биореактор или устройство для культивирования клеток, видеокамеру, инструмент, измеряющий температуру. Несмотря на существующую вариабельность в отношении различной техники инокуляции или инструментов, в которых проводится культивирование клеток (биореакторов) или чашек Петри, основным преимуществом производственной установки является гибкость ее модульного построения, скомпонованная с таким же гибким компонентом - контролирующим центральным процессором, позволяющая ей функционировать в виде автономной производственной установки в любых операционных или терапевтических условиях, что позволяет обеспечить специализированное массовое производство индивидуальных имплантатов наилучшего качества для каждого отдельного случая.

Кроме того, согласно изобретению такое устройство, как ротационный биореактор, описанный ранее, применяется для выполнения процедур инокуляции в стерильных условиях непосредственно внутри операционного зала. Главное преимущество изобретения становится наиболее очевидным, когда такие устройства применяют внутри установки с ламинарным воздушным потоком, обеспечиваемым в инокуляционном боксе чистого помещения класса А. Биореактор, установленный внутри такой системы, может эксплуатироваться как мобильная единица внутри операционного зала только для одного пациента за прием. В этом смысле согласно изобретению создается полностью замкнутое производственное оборудование, состоящее из мобильной установки с ламинарным воздушным потоком или изолятором, внутри которой расположена производственная установка, контактирующая с клетками или кровью пациента. Эти внутренние устройства (биореакторы) в идеале являются одноразовыми системами (одностороннего действия), которые размещаются на стойках, допускающих многоразовое применение. Сочетание таких качеств устройства, как одноразовое применение, мобильность, проведение инокуляции и обработки в помещениях класса А, а также малый размер, позволяют использовать всю установку в качестве производственного бокса для манипуляций со стволовыми клетками во время операции согласно способу, описанному выше.

Согласно изобретению, ЕРО добавляют, например, к концентрату стволовых клеток в виде раствора или лиофилизата, предпочтительно в виде лиофилизата с концентрацией 150-300, предпочтительно 200-250 единиц/кг веса тела. Для местного введения дозировка может быть выше.

Концентрат стволовых клеток доводится по объему в зависимости от типа ткани, подлежащей регенерации. Он составляет 0,5-1 мл для местного применения, 2-3 мл для чрескожного размещения, например на поверхности зоны инфаркта сердца. Он может составлять 10-30 мл для регенерации кости нижней челюсти.

Такая изменчивость достигается за счет центрифугирования всего объема полученного костного мозга, жировой ткани, крови при скорости, позволяющей осадить все клетки, содержащиеся в исходном объеме. Кроме того, происходит отделение плазмы (бесклеточной фракции). Поскольку осадок клеток находится на дне, всегда возможно его включение в больший объем, и таким образом можно получить обогащенный концентрат костного мозга с тромбоцитами и эритроцитами. Ранее, эти другие компоненты предписывалось отбрасывать. Преимущество данного подхода состоит в извлечении пользы из способности этих клеток взаимодействовать, что позволяет получить лучшие результаты по сравнению с изолированным применением, например, выделенных иммунологическим способом CD133+ клеток, что обусловливает разницу между безрубцовым заживлением и заживлением с образованием рубца.

Возможность местного применения G-CSF или GM-CSF в сочетании со стволовыми клетками позволяет применять очень низкие концентрации по сравнению со стандартным системным применением. При стандартном подходе на каркас, подлежащий ремоделированию, наносят 200 мкг в 10-20 сайтах инъекции. ЕРО может быть совместно введен одновременно или незадолго до или после этого, путем системного введения. При инъекции используют концентрат стволовых клеток. Впоследствии в течение 1-2 недель выполняют инъекцию компонентов, например, подкожно в том же количестве.

Для регенерации хряща для инъекций в каркас добавляют TGFβ в количестве 100-500 нг на участок 10 см².

Витамин С добавляют, в частности, для прорастания в каркас нейронов в количестве 500 мкг. Витамин Е добавляют, в частности, для нейрональной дифференцировки в количестве 30000 ME.

Вязкий гель или гидрогели, содержащие биологические факторы или клетки ткани, хорошо известны в данной области техники. Согласно изобретению для изготовления соответствующих препаратов предпочтительно могут применяться полимерные композиции, такие как полимерные целлюлозные гели, например, на основе карбоксиметилцеллюлозы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1: экспрессия EpoR, бета-cR и рецептора гормона роста, показанная параллельно в тканях и стволовых клетках.

Фигура 2: в данном примере показано применение изобретения для индукции экспрессии стволовых клеток в паренхиме: на панелях А и В представлены группы с отсутствием травмы, на панелях В и Г - группы с травмой. Добавление rhEPO вызывает экспрессию CD90+ клеток в паренхиме печени только в группе с травмой.

Фигура 3: здесь схематично показано взаимодействие между мобилизующими, усиливающими и коммитирующими факторами при их применении при наличии пермиссивных условий (например, травмы). Процесс подготовки стволовых клеток соответствующим образом корректируют, за счет чего он может протекать очень быстро, занимая всего несколько минут, и проводиться во время операции. Матрицу для ремоделирования применяют в зависимости от размера дефекта, который требуется восстановить.

Фигура 4: в данном примере показан производственный процесс, связывающий изобретение с последовательностью интраоперационных событий, разделенный на II этапа. I этап представляет собой этап подготовки и стимуляции клеток in vitro. II этап включает нанесение стволовых клеток на графт после его размещения in situ. Например, клапан сердца может быть покрыт с периферической стороны, что снизит риск стрессовых воздействий на клетки при манипуляциях и отделения клеток во время имплантации.

Фигура 5а и Фигура 5б: на данном примере показана поверхность синтетического графта после инокуляции прогениторов (стволовых клеток), полученных из гребня подвздошной кости и периферической крови. Клетки были смешаны с аутологичной плазмой (3 мл). Плазма была полимеризована путем добавления тромбина (0,1 ед/мл) и нанесена на наружную поверхность графта. Преимуществом процесса согласно изобретению является то, что формируется сгусток, позволяющий запустить такие же процессы, как при нормальном заживлении ран. Кинетика свертывания, структура сгустка и фибринолиз сгустка создают микронишу, что в сочетании с усиливающими факторами, коммитирующими факторами и мобилизующими факторами, согласно изобретению, обеспечивает идеальные условия для запуска процесса безрубцового заживления. Затем в течение 1-2 недель внутри тела реципиента формируют графт.

На внутренней стороне (б) клетки были точечно нанесены на люминальную поверхность при помощи шприца. На панели «б» показано пролонгированное применение in vitro через 14 дней. Культивирование продолжали в стандартных условиях.

Фигура 5в и Фигура 5г: на данном примере показан графт, изготовленный согласно изобретению. На его продольном разрезе демонстрируется красивая блестящая (не имеющая тромбов) полость. На данной модели крупных животных у контролей через 4 недели всегда отмечалось свертывание (г). В клинике это было бы абсолютно неблагоприятным исходом.

Флуоресцентные клетки свидетельствуют о почти 100% жизнеспособности как на люминальной, так и на внешней поверхности. Гели костного мозга/плазмы представляют собой трехмерное питательное микроокружение, формирующее трехмерную зону роста, даже при изначальном существовании неблагоприятных условий на материалах графта (см. далее аллогенные или ксеногенные клапаны сердца, покрытые аналогичным образом).

Фигура 5д и Фигура 5е: на данных Фигурах вновь показаны результаты гистологического исследования имплантированного 4 недели назад графта, подготовленного согласно изобретению. На панели Фиг.5д показана центральная полимерная часть графта с новообразованной тканью, сформированной по направлению к просвету и к периферии. В просвете «незасеянного» клетками графта имеется тромб. На Фиг.5е показана новообразованная ткань, окружающая синтетический волокнистый (не подвергающийся деградации) материал в центре.

Фигура 5ж и Фигура 5з: на Фигуре 5ж показано окрашивание на CD31 (эндотелиальный маркер) люминальной поверхности графта, изготовленного согласно изобретению. Новообразование сосудистого эндотелия предотвратило формирование тромба. На панели Фиг.5з показан биологический каркас, демонстрирующий, что реэндотелизация, опосредованная прогениторами, может также иметь место и при применении биологического матрикса (ксенографта).

Фигура 6: сердечный клапан изготовлен после очистки от клеток. Показано, что изобретение позволяет получить клапан, по физиологическим характеристикам неотличимый от нормального. Клапаны имплантированы в области аорты. Не было зарегистрировано недостаточности по причине высокого давления в данной области.

Фигура 7а и Фигура 7б: на Фигуре 7а показаны результаты имплантации после культивирования в биореакторе стволовых клеток, подготовленных в плазменном геле. Культивирование in vitro проводили в течение 1 недели. Данные результаты рентгенографического исследования, относящиеся к группе Г на панели Фиг.7б, демонстрируют хорошее прогрессирование укрепления кости через 2, 4 и 6 недель наблюдения. В нижней части (Фиг.7б) на панели А изображен дефект, приведенный в качестве контроля (дефекты критического размера были получены на модели на свиньях), панель Б: инокуляция только лишь трикальцийфосфата с кровью приводит к недостаточному формированию костных трабекул, панель В: смешивание во время операции материала для замены кости с костным мозгом реципиента (выполнено согласно предшествующему уровню техники, а не в соответствии с изобретением), обеспечивает только частичное заживление. В отличие от этого, на панели Г показаны наилучшие результаты с полной регенерацией кости в данном эксперименте с моделированием критического размера дефекта кости. Это доказывает, что применение только лишь костного мозга для инокуляции материала является недостаточным для достижения подобного прогрессирования регенерации, которого можно добиться при помощи стандартного культивирования клеток с соответствующей экспансией стволовых клеток и дифференцировкой остеобластов. Это более низкое качество, присущее предшествующему уровню техники, характерно для стандартной формы интраоперационного применения костного мозга для поддержки формирования кости. Преимущества способа и технологии согласно изобретению становятся очевидны из данных, проиллюстрированных на следующих Фигурах.

Фигура 8а (в соответствии с предшествующим уровнем техники, 6 и 16 недель после имплантации) и Фигура 8б (пример применения изобретения, 6 недель после имплантации).

Фигура 8б демонстрирует результаты культивирования в биореакторе (7 дней/1 неделя культивирования в биореакторе) по сравнению с контролями. А: материал (трикальцийфосфат + кровь) согласно интраоперационной технологии согласно изобретению в сочетании с ЕРО. На панели Г показан приведенный в качестве контроля дефект без заполнения. Приведены данные через 6 недель. Очевидно, что интраоперационный процесс (10) согласно изобретению настолько же эффективен, как и процесс клеточного культивирования, занимающий несколько недель. Из данных, приведенных на Фиг.8а, очевидно, что «засевание» клетками во время операции, осуществляемое в соответствии с предшествующим уровнем техники посредством добавления только костного мозга не обеспечивает эффективного формирования кости (большое отверстие в кости все еще наблюдается через 16 недель, Фиг.8а - стандартная интраоперационная методика). На Фиг.8б в сравнении с Фиг.8а четко видны преимущества комбинированного процесса согласно изобретению, поскольку во всех группах заживление завершается уже через 6 недель. Напротив, при использовании стандартной интраоперационной методики согласно предшествующему уровню техники, как показано на Фиг.8а, остается большой дефект как через 6, так и через 16 недель (Фиг.8а).

При более крупных дефектах клетки костного мозга, подготовленные в соответствии с изобретением, снова будут предпочтительными по сравнению с применением только лишь крови.

Фигура 9а, Фигура 9б.

На этой Фигуре показан пациент, получавший терапию стволовыми клетками согласно изобретению, с размером дефекта, в 100 раз превышающим критический размер дефекта, приведенного на Фигурах 8. Процесс заживления является быстрым (б) и свидетельствует о стойком и долговременном существовании новообразованной кости с формированием трабекулярных структур отличного качества. В обычных условиях (уровень техники с применением культивированных стволовых клеток кости) такой имплантат деформировался бы через 6-8 недель или совсем не прошел бы ремоделирование с образованием кости такого качества. Как правило, использованный материал претерпевает незначительное ремоделирование за многие годы или замещается фиброзной тканью. В ходе процесса согласно изобретению не требовалось какой-либо экспансии клеток, не образовывалось рубцов или фиброзной ткани, и кость оставалась стабильной в течение нескольких лет.

Фигура 9в: окончательный результат через 1,5 года, демонстрирующий кость с хорошей морфологией, отсутствие деформации и стабильность результатов.

Фигура 10 показывает образец подвижной установки, состоящей из биореактора одностороннего действия (закрывающееся устройство) (1), размещенного на установочной платформе или стойке (как описано ранее), центрифуги (3), (в альтернативном случае может быть снаружи) и стерилизующего устройства, например, УФ излучателя. 4 изображает фильтрующую систему для стерилизации воздуха. Особенностью данного комбинированного устройства является то, что оно представляет миниатюрную лабораторию внутри операционного зала. Это устройство может применяться для выполнения процессов, связанных с культивированием клеток, обычно занимающих 2-3 недели, менее чем за 1 час согласно способу изобретения. Важной чертой является то, что 1, обозначающее любой биореактор для тканевой инженерии, в идеальном варианте является устройством одностороннего действия. Установка может перемещаться с закрытым фронтальным окном и полностью поддерживать стерильность за счет повышения давления воздуха внутри по сравнению с давлением воздуха в окружающей среде для поддержания стерильности воздушного потока внутри (контролируется заданная температура 37°). Для этой цели воздух удаляется снаружи при помощи 2 работающих в одном направлении клапанов (6а и 6б), которые активируются при закрывании окна на фронтальной панели. Кроме того, имеется система мониторирования, позволяющая полностью регистрировать все процессы в биореакторе (положение, температуру, вращение, работу насоса с учетом давления, скорости и объема, открытое и закрытое положение окна). Система также замеряет концентрацию частиц в воздухе внутри и включает сигнал тревоги незамедлительно при превышении пороговых значений, указанных для класса А. Все эти технологии по отдельности известны на предшествующем уровне техники, но при их сочетании существенно повышается их ценность и расширяется возможность их применения для мобильного производства искусственных графтов на основе стволовых клеток в стенах операционного зала. Устройство является полностью независимым и имеет собственный источник электроэнергии (питается от аккумуляторной батареи).

Установка может быть простерилизована изнутри при помощи газа или перекиси водорода. Кроме того, установка имеет антимикробную поверхность, содержащую в одном воплощении серебряное покрытие, получаемое методом плазменной ионизации.

Фигура 11: Внедрение контроля качества и сопроводительная документация, оформляемая в соответствии с технологическими требованиями.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

Следующие ниже примеры описывают изобретение более подробно. Подчеркивается, что выбор клеток, факторов, условий, концентраций, способов, каркасов, препаратов и т.д., приведенный в данных примерах, не является ограничивающим изобретение, они могут быть заменены, если не указано иначе, соответствующими аналогичными, подходящими или эквивалентными клетками, факторами, условиями, концентрациями, способами, каркасами, препаратами и т.д., при условии, что специалист в данной области техники осуществит эти модификации или замены, не меняя сущности изобретения.

Пример 1:

- За 24 часа до начала операции: эритропоэтин подкожно (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 10000 ед) и GM-CSF (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 250 ед/м², 1 ампула) для активации продукции стволовых клеток в костном мозге и для направленного действия ЕРО на аутологичные стволовые клетки.

- Начало анестезии пациента с дефектом трахеи, требующим репарации.

- Взятие 100 мл крови для получения аутологичной плазмы (антикоагулянт - небольшое количество гепарина).

- Забор 30-60 мл аспирата костного мозга из гребня подвздошной кости пациента.

- Помещение крови/костного мозга на лед (4°C) в гепаринизированных пробирках в стерильной вторичной упаковке.

- Подготовка операционного поля и дополнительное получение образцов биопсийного материала диаметром 1-2 мм в случае возможного доступа к аналогичной ткани-мишени. Хранение на льду в стерильном контейнере в стерильном физиологическом растворе.

- Перенос аспирата костного мозга и биоптата ткани в ламинарный воздушный поток, в идеальном варианте локализованный непосредственно внутри операционного зала или в непосредственной близости от него.

- Подготовка аспирата костного мозга и/или крови или другого источника стволовых клеток для доведения концентрации и/или получения доступа к клеткам. Подготовка стволовых клеток при помощи всех возможных методов, известных в данной области техники, включая подготовку градиента плотности, иммунологическое разделение, концентрирование, фильтрацию, расщепление или измельчение матрикса и отмывку, но не ограничиваясь ими.

- Подготовка растворов для инъекций путем аликвотирования концентратов стволовых клеток или, в альтернативном случае, плазмы, и применение в качестве растворителей для усиливающих, коммитирующих и/или мобилизующих факторов.

- Промежуточная инкубация мезенхимных стволовых клеток, которые были недавно получены из костного мозга, со смесью ЕРО/TCF бета 3 (500 мкл), хранение на стерильном льду/при комнатной температуре (в зависимости от имеющегося в распоряжении интервала времени и хода параллельной операции) и кондиционирование этими факторами in vitro.

- Инъекция специальных растворов в каркас в нескольких равномерно расположенных сайтах для замедленного высвобождения in situ после имплантации и формирования структур стволовыми клетками позднее при индукции сайт-специфического коммитирования, при контакте клеток с этими факторами точно в заданных участках.

- Инъекции в соответствующие участки стволовых клеток с продуктами измельчения тканей или без (например, в просвет цилиндрических имплантатов (например, клапанов, сосудов, протоков)) и инъекции в просвет немного ниже внешней поверхности для формирования клеточных островков.

- Перенос на операционное поле и имплантация.

- Покрытие стенок смесью стволовых клеток с аутологичной плазмой или фибриновым клеем во время операции для их мягкой фиксации и для предупреждения их удаления во время манипуляций с имплантатом. Имплантация в течение 45 мин.

- Постоперационное лечение пациента усиливающими и/или мобилизующими факторами до конца этапа смоделированного заживления раны (часто на протяжении 2 недель, при необходимости дольше, например в случае спинальных повреждений).

Пример 2: ИНЖЕНЕРИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ТКАНЕЙ

В экспериментальной модели замены клапанов аорты у овец было получено 6 аллогенных и 4 ксеногенных клапана. 2 из клапанов были подвергнуты процессу очистки от клеток при помощи детергента (хенодезоксихолевой кислоты), согласно известному уровню техники. Затем эти клапаны хранили при 4° и приносили в операционный зал в стерильных условиях. В просвет клапанов инъецировали эритропоэтин (5000 ед) и G-CSF (Leukine, Sargramostim), а также гормон роста при помощи шприца очень малого диаметра (0,5 мм) для минимизации повреждения. Одновременно забирали костный мозг в общем объеме 30 мл. Костный мозг центрифугировали при 1500хg в течение 7 минут. Центрифугирование проводили с гепаринизированной кровью. 1 см³ Полученного осадка инъецировали под слой поверхностного матрикса люминальной поверхности, что приводило к распределению стволовых клеток в виде островков. Это делалось с целью предотвращения отделения клеток после введения в кровоток. После имплантации клапаны покрывали дополнительно 5 мл готового концентрата костного мозга.

Пример 3: МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА С СИНТЕТИЧЕСКИМ ГРАФТОМ

В этом случае применяли синтетический графт. Такие графты могут быть выполнены из политетрафторэтилена (PTFE), полиэфира, смеси полиэфира с силиконом, коллагеновых волокон, коллагена с эластином, могут быть представлены биологическими графтами с очисткой от клеток или без. Полимеризацию покрытия из стволовых клеток вызывали путем добавления таких полимеризующих агентов, как тромбин (0,1 ед/мл) или Ca++, антагонистов противосвертывающих агентов, использованных в ходе взятия костного мозга или крови. Свертывание приводило к запуску последующего процесса заживления, структура сгустка и фибринолиз сгустка создавали микронишу, что в сочетании с усиливающими факторами, коммитирующими факторами и мобилизующими факторами согласно изобретению создавало идеальные условия для обеспечения безрубцового заживления. Клетки не прорастают в пустые участки или отверстия. Гель, образованный в ходе свертывания, является полимером, которому в предпочтительном случае искусственно придают форму, для получения требуемой геометрии. Задерживание клеток является преимуществом для формирования сигнальных путей между стволовыми клетками, тромбоцитами, волокнами, эритроцитами, лейкоцитами и всеми захваченными стволовыми клетками, включая CD90, CD133, CD106 и CD45.

Затем в течение 1-2 недель в организме реципиента формируется графт. Механизмы замедленного высвобождения обеспечивают контролируемое взаимодействие покрытия графта с клетками, запускающими процесс ремоделирования. Процесс продолжается до тех пор, пока не завершится стимуляция цитокинами, поступающими из зоны повреждения и захваченных воспалительных клеток, параллельно (одновременно) с достижением заживления. Было обнаружено, что IL-6, IL-1 и TNF являются важными провоспалительными цитокинами, активирующими стволовые клетки (пермиссивные факторы). Процесс полимеризации и захват иммунокомпетентных клеток способствует протеканию каскада взаимодействий (согласно Фигуре 3 изобретения). Даже на гетерогенных синтетических поверхностях формируется нео-графт, имеющий с биологической точки зрения полноценные люминальную и периферическую поверхности. Дифференцированные клетки включают фибробласты, гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки (CD31+). Технология обеспечивает существенно улучшает потенциальные возможности применения за счет значительного снижения тромбогенности. Гиперплазия не развивалась. Таким образом, важной областью применения является обработка эндолюминальных (сердечно)сосудистых стентов, которые чаще всего выходят из строя из-за гиперплазии, особенно в краевых зонах. Имеет место новообразование сосудистого эндотелия, что предотвращает формирование тромбов. Каркас может быть очищен от клеток трипсином или с применением детергента (например, хенодезоксихолевой кислотой). Можно применять следующий протокол:

- Способ индивидуального изготовления во время операции синтетического имплантата с применением полиэфира, коллагена, хитозана, графта с полиэфирным и силиконовым покрытием, или, например, графта из PTFE, но не ограничиваясь ими.

- За 24 часа до начала операции: эритропоэтин подкожно (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 10000 ед) и GM-CSF (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 1 ампула) для активации продукции стволовых клеток в костном мозге и для направленного действия ЕРО на аутологичные стволовые клетки.

- Начало анестезии пациента с дефектом графта, требующим репарации.

- Взятие 50 мл крови для получения аутологичной плазмы (антикоагулянт - небольшое количество гепарина).

- Забор 30 мл аспирата костного мозга из гребня подвздошной кости пациента.

- Помещение этих 30 мл на лед в гепаринизированных пробирках в стерильной вторичной упаковке.

- Подготовка участка трахеи и получение 5 образцов биоптатов бронхиального эпителия диаметром 1-2 мм и хранение на льду в стерильном контейнере в стерильном физиологическом растворе.

- Перенос аспирата костного мозга и биоптата эпителия в бокс с ламинарным воздушным потоком для дальнейшей обработки.

- Центрифугирование аспирата костного мозга в течение 7 мин при 4°C для концентрации клеток.

- Отделение плазмы от концентрата стволовых клеток путем переноса в стерильную пробирку на льду.

- Приготовление раствора эритропоэтина из 1 мл супернатанта плазмы, полученного при центрифугировании (50000 ед, Neorecormone, Roche).

- Добавление стерильного TGF бета 3 к раствору ЕРО в плазме для специфичного местного воздействия.

- Инкубация свежевыделенных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток со смесью ЕРО/TGF бета 3 (500 мкл) - хранение на стерильном льду.

- Инъекция раствора EPO/TGF в 10 различных участков каркаса трахеи для отстроченного высвобождения in situ после имплантации.

- Инкубация 1 мл смеси стволовых клеток и клеток эпителия в просвете каркаса трахеи и инъекции в просвет для формирования островков клеток.

- Перенос на операционное поле и имплантация.

- Покрытие стенок смесью стволовых клеток с аутологичной плазмой или фибриновым клеем во время операции для их мягкой фиксации и для предупреждения их удаления во время манипуляций с имплантатом. Имплантация в течение последующих 45 мин.

Пример 4: ИНЖЕНЕРИЯ КЛАПАНА

Основными ограничениями тканевой инженерии с применением очищенных от клеток тканей в настоящее время, в первую очередь, является отсутствие стабильности и устойчивости к давлению, осложняющих применение таких клапанов в условиях с высоким давлением. Кроме того, в педиатрической практике предполагаемый рост стали расценивать как дилатационный ответ, а не истинный рост. Эти проблемы может разрешить следующий протокол. В альтернативном случае очищенные от клеток сосуды или клапаны одинаково быстро подвергают праймингу для осуществления быстрого ремоделирования in vivo. Процесс согласно изобретению таким образом может также улучшать качества очищенных от клеток матриц.

Протокол для клапанов: способ интраоперационного создания индивидуальных аллогенных имплантатов клапанов

- За 24 часа до начала операции: эритропоэтин ПК (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 10000 ед) и GM-CSF (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 1 ампула) для активации продукции стволовых клеток в костном мозге и для направленного действия ЕРО на аутологичные стволовые клетки.

- Начало анестезии пациента с дефектом клапана, требующим репарации.

- Взятие 200 мл крови для получения аутологичной плазмы (антикоагулянт - небольшое количество гепарина) и лейкоцитарной пленки.

- Забор 10 мл аспирата костного мозга из гребня подвздошной кости пациента.

- Помещение этих 10 мл на лед в гепаринизированных пробирках в стерильной вторичной упаковке.

- Подготовка участка клапана и получение 5 образцов биоптатов клапана диаметром 1-2 мм и хранение на льду в стерильном контейнере в стерильном физиологическом растворе.

- Перенос аспирата костного мозга и биоптата эпителия на рабочую поверхность с ламинарным воздушным потоком для дальнейшей обработки.

- Центрифугирование аспирата костного мозга в течение 5 мин при 4°C для концентрации клеток.

- Отделение плазмы от концентрата стволовых клеток путем переноса в стерильную пробирку на стерильном льду.

- Приготовление раствора эритропоэтина из 1 мл супернатанта плазмы, полученного при центрифугировании (50000 ед, Neorecormone, Roche).

- Добавление HGF и/или VEGF к раствору ЕРО в плазме.

- Инкубация свежевыделенных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток с ЕРО, хранение на стерильном льду.

- Инъекция раствора EPO/HGF в 10 различных участков каркаса трахеи для отстроченного высвобождения in situ после имплантации.

- Инкубация 1 мл стволовых клеток, смеси стволовых и эндотелиальных клеток в просвете каркаса трахеи и инъекции в просвет для формирования островков клеток; применение свежеполученных клеток, не проходивших эксплантацию.

- Высевание в просвет клеток, полученных из лейкоконцентрата.

- Перенос на операционное поле и имплантация.

- Покрытие стенок смесью стволовых клеток с аутологичной плазмой или фибриновым клеем во время операции для их мягкой фиксации и для предупреждения их удаления во время манипуляций с имплантатом. Имплантация в течение последующих 45 мин.

Пример 5: ИНЖЕНЕРИЯ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

"Протокол для трахеи": процесс создания во время операции индивидуального имплантата трахеи

- За 24 часа до начала операции: эритропоэтин подкожно (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 10000 ед) и GM-CSF (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 1 ампула) для активации продукции стволовых клеток в костном мозге и для направленного действия ЕРО на аутологичные стволовые клетки.

- Начало анестезии пациента с дефектом трахеи, требующим репарации.

- Взятие 50 мл крови для получения аутологичной плазмы (антикоагулянт - небольшое количество гепарина).

- Забор 10 см³ аспирата костного мозга из гребня подвздошной кости пациента.

- Помещение этих 10 мл на лед в гепаринизированных пробирках в стерильной вторичной упаковке.

- Подготовка участка трахеи и получение 5 образцов биоптатов бронхиального эпителия диаметром 1-2 мм и хранение на льду в стерильном контейнере в стерильном физиологическом растворе.

- Перенос аспирата костного мозга и биоптата эпителия в лабораторию с ламинарным воздушным потоком (криолабораторию) для дальнейшей обработки.

- Центрифугирование аспирата костного мозга в течение 5 мин при 4°C для концентрации клеток.

- Отделение плазмы от концентрата стволовых клеток путем переноса в стерильную пробирку на стерильном льду.

- Приготовление раствора эритропоэтина с 1 мл супернатанта плазмы, полученного при центрифугировании (50000 ед, Neorecormone, Roche).

- Добавление стерильного TGF бета 3 к раствору ЕРО в плазме.

- Инкубация свежевыделенных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток со смесью ЕРО/TGF бета 3 (500 мкл), хранение на стерильном льду.

- Инъекция раствора EPO/TGFβ в 10 различных участков каркаса трахеи для отстроченного высвобождения in situ после имплантации.

- Инкубация 1 см³ смеси стволовых клеток и клеток эпителия в просвете каркаса трахеи и инъекции в просвет для формирования островков клеток.

- Перенос на операционное поле и имплантация.

- Покрытие стенок смесью стволовых клеток с аутологичной плазмой или фибриновым клеем во время операции для их мягкой фиксации и для предупреждения их удаления во время манипуляций с имплантатом. Имплантация в течение последующих 45 мин.

Пример 6: ИНЖЕНЕРИЯ ПЕЧЕНИ

- За 24 часа до начала операции: эритропоэтин подкожно (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 10000 ед) и GM-CSF (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 1 ампула) для активации продукции стволовых клеток в костном мозге и для направленного действия ЕРО на аутологичные стволовые клетки.

- Начало анестезии пациента с дефектом печени, требующим репарации. К ним обычно относятся пациенты с хроническим циррозом, острой или хронической печеночной недостаточностью, обширной резекцией печени, включая пересадку органов от живого донора и трансплантацию печени.

- Взятие 200 мл крови для получения богатой тромбоцитами плазмы (антикоагулянт - небольшое количество гепарина) и/или РВМС, или их общего концентрата (в сочетании для получения лучшего результата и удобства получения).

- Забор 100 мл аспирата костного мозга из гребня подвздошной кости пациента.

- Помещение этих 100 мл на лед в гепаринизированных пробирках в стерильной вторичной упаковке.

- Одновременное проведение эндоскопической операции и подготовка участка печени и получение 5 образцов биоптатов печени диаметром 1-2 мм (полученных при резекции печени из края печени) и хранение при 4°C на льду в стерильном контейнере в стерильном физиологическом растворе.

- Перенос аспирата костного мозга и биоптата печени на рабочую поверхность с ламинарным воздушным потоком для дальнейшей обработки.

- Центрифугирование аспирата костного мозга в течение 5 мин при 4°C для концентрации клеток.

- Отделение плазмы от концентрата стволовых клеток путем переноса в стерильную пробирку на стерильном льду.

- Приготовление раствора эритропоэтина с 1 мл супернатанта плазмы, полученного при центрифугировании (10000 ед, Neorecormone, Roche).

- Добавление HGF к раствору ЕРО в плазме.

- Инкубация свежевыделенных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток с ЕРО, хранение на стерильном льду.

- Инъекция раствора EPO/G-CSF/HGF в 10 различных участков каркаса коллагеновой губки для отстроченного высвобождения in situ после имплантации.

- Инкубация полученных 5 мл концентрата стволовых клеток, фрагментов ткани печени / смеси стволовых клеток на поверхности каркаса. Полимеризация за счет добавления тромбина.

- Перенос на операционное поле и имплантация, фиксация на печени за счет приклеивания к поверхности участка резекции или к поверхности пораженной циррозом печени. Выполнение 10-20 небольших микропроколов на поверхности для обеспечения доступа крови к губке.

- Покрытие стенок смесью стволовых клеток с аутологичной плазмой или фибриновым клеем во время операции для их мягкой фиксации и для предупреждения их удаления во время манипуляций с имплантатом. Имплантация в течение последующих 30 мин.

Пример 7: ИНЖЕНЕРИЯ КОЖИ

Протокол для пролежней, диабетических язв, ишемического поражения нижних конечностей, инфицированных ран любой локализации.

- В начале операции: эритропоэтин подкожно (стандартная однократная доза согласно рекомендациям производителя, 10000 ед) и GM-CSF (200 мкг/м² для пациента весом 70 кг/ низкая доза) для активации продукции стволовых клеток в костном мозге и для направленного действия ЕРО на аутологичные стволовые клетки. Поскольку состояние зачастую не сравнимо по тяжести, GM-CSF или G-CSF можно исключить.

- Начало анестезии пациента.

- Взятие 200 мл крови для получения богатой тромбоцитами плазмы (антикоагулянт - небольшое количество гепарина) и или РВМС, или их общего концентрата (их сочетание для получения лучшего эффекта и удобства получения).

- Забор 30-60 мл аспирата костного мозга из гребня подвздошной кости пациента.

- Помещение собранного материала на лед в гепаринизированных пробирках в стерильной вторичной упаковке.

- Хирургическая обработка инфицированных ран. Удаление некротизированной ткани в обычном порядке.

- В частности, в случае ожогов или при наличии грануляции ткани при хронических ранах, подготовка 10 образцов биоптатов кожи диаметром 1-2 мм (взятых из здоровых участков) для поддержания эпителиализации. Образцы хранят при 4°C на льду в стерильном контейнере в стерильном физиологическом растворе или аутологичной плазме.

- Перенос аспирата костного мозга и биоптатов кожи на рабочую поверхность с ламинарным воздушным потоком для дальнейшей обработки.

- Центрифугирование аспирата костного мозга при 4°C для концентрации клеток.

- Отделение плазмы от концентрата стволовых клеток путем переноса в стерильную пробирку на стерильном льду.

- Приготовление раствора эритропоэтина с 1 мл супернатанта плазмы, полученного при центрифугировании (10000 ед, Neorecormone, Roche).

- Добавление к раствору ЕРО в плазме.

- Инкубация свежевыделенных из костного мозга мезенхимных стволовых клеток с ЕРО, хранение на стерильном льду.

- Инъекция раствора EPO/G-CSF в 10 различных участков каркаса коллагеновой губки для отстроченного высвобождения in situ после имплантации. В альтернативном случае смешивание с концентратом стволовых клеток и индукция полимеризации.

- Инкубация полученных 5 мл концентрата стволовых клеток, фрагментов ткани кожи/смеси стволовых клеток на поверхность каркаса. Полимеризация за счет добавления тромбина. В случае отсутствия доступного каркаса концентрат костного мозга полимеризуют на пластиковой поверхности (например, чашке Петри, биореакторе). Это позволяет сформировать гелеобразную мембрану, которую после застывания можно перенести, чтобы покрыть рану.

- Перенос на операционное поле и имплантация, фиксация в области повреждения (трансплантация в течение последующих 30 мин).

- В альтернативном случае или дополнительно, смесь клеток/факторов инъецируют в края раны (в общей сложности 5 мл в 10 различных участках).

- Покрытие коллагеновой губкой и покрытие всей зоны прозрачной пленкой.

Пример 8: ИНЖЕНЕРИЯ СЕРДЦА

Протокол для ишемии сердца, инфаркта миокарда, кардиомиопатии. Целью является чрескожная фиксация геля стволовых клеток под перикардиальной сумкой согласно изобретению

- В начале операции и даже в случае, если пациент поступил после диагностирования острого инфаркта миокарда: эритропоэтин 10000 ед и GM-CSF назначают как экстренное лечение в дозе 250 ед/кг веса тела, G-CSF в дозе 250 мкг/пациенту весом 70 кг. В нетяжелых случаях достаточно одного ЕРО.

- Взятие 200 мл крови для получения богатой тромбоцитами плазмы (антикоагулянт - небольшое количество гепарина) и/или РВМС, или их общего концентрата (их сочетание для получения лучшего эффекта и удобства получения).

- Забор 30-60 мл аспирата костного мозга из гребня подвздошной кости пациента под местной анестезией.

- Помещение собранного материала на лед в гепаринизированных пробирках в стерильной вторичной упаковке.

- Начало местной анестезии пациента в области грудной клетки.

- Введение катетера в грудную клетку под рентгеновским контролем для достижения зоны перикарда и фиксация его отверстия под перикардом у поверхности зоны инфаркта.

- Перенос аспирата костного мозга на рабочую поверхность с ламинарным воздушным потоком для дальнейшей обработки.

- Центрифугирование аспирата костного мозга при 4°C для концентрации клеток.

- Приготовление раствора эритропоэтина, G-CSF с 1 мл концентрата стволовых клеток, полученного при центрифугировании (10000 ед, Neorecormone, Roche), хранение на стерильном льду.

- Возможно добавление высококонсервативного фактора SRF (от англ. serum response factor) и миогенина для поддержания дифференцировки сердечной мышцы.

- Индукция полимеризации и инъекция через катетер у поверхности зоны инфаркта.

- Ушивание перикарда.

- Требуемое время: 10-20 мин.

Пример 9: ИНЖЕНЕРИЯ РОГОВИЦЫ

Восстановление роговицы, особенно в случаях, когда с противоположной стороны отсутствует здоровый глаз с интактными лимбальными стволовыми клетками, невозможно. При стандартном подходе было бы необходимо также проводить экспансию стволовых клеток. Другие случаи возможного применения с поражением глаз включают дегенерацию макулы, слепоту, ретробульбарный нефрит, синдром сухих глаз. При дегенерации макулы могут требоваться более глубокие инъекции. Согласно изобретению процесс может быть осуществлен в 3 раза быстрее:

A) прямая стимуляция при остром поражении после промывки с применением в качестве усиливающего фактора ЕРО, наносимого в виде лиофилизата, в смеси с искусственными слезами;

Б) подготовка биопсии роговицы противоположного глаза, измельчение для получения очень маленьких фрагментов или мягкая диссоциация для получения изолированных клеток и отмывка. Инкубация клеточных образцов с ЕРО и фиксация на поверхности глаза. В альтернативном случае клетки можно инъецировать под или в поврежденную роговицу. В некоторых участках роговица может быть удалена хирургическим путем. В очень тяжелых случаях одновременно с ЕРО назначают G-CSF подкожно до окончания заживления раны (1-2 недели);

B) при невозможности проведения биопсии роговицы стволовые клетки, полученные из РВМС или концентрата костного мозга, добавляют к искусственным слезам или плазме и фиксируют вместе с ЕРО и G-CSF на или в поврежденной роговице.

Пример 10: РЕКОНСТРУКЦИЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ИЛИ ПОДГОТОВКА ИМПЛАНТАТА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Восстановление молочной железы достигается при помощи серии инъекций геля стволовых клеток согласно изобретению после резекции для построения недостающей ткани. Их также применяют для подготовки поверхности молочного имплантата для предупреждения образования рубцов и развития фиброза. В качестве коммитирующих факторов для направления дифференцировки стволовых клеток в клетки ткани молочной железы используют половые гормоны. Согласно изобретению процесс может быть осуществлен в 2-3 раза быстрее:

А) прямая стимуляция имплантата с применением в качестве усиливающего фактора ЕРО, наносимого в виде лиофилизата, в смеси с концентратом стволовых клеток

Б) подготовка биопсии контралатеральной молочной железы, измельчение до получения очень маленьких фрагментов или мягкая диссоциация для получения изолированных клеток и отмывка. Инкубация образцов клеток с ЕРО и инъекция концентрата стволовых клеток. В альтернативном случае клетки можно инъецировать в ходе нескольких повторных процедур для наращивания их концентрации. G-CSF назначают подкожно вместе с ЕРО до окончания заживления раны (1-2 недели). Применяемые гормоны включают эстроген, ФСГ (фолликулостимулирующий гормон), гормон роста, прогестерон и пролактин.

Пример 11: РЕГЕНЕРАЦИЯ СПИННОГО МОЗГА ИЛИ РЕГЕНЕРАЦИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕРВОВ

Регенерация нейронов достигается за счет фиксации геля стволовых клеток или на поверхности зоны ишемии после декомпрессии, или путем замещения с применением коллагеновой трубки в качестве направляющей. При помощи такого геля стволовых клеток согласно изобретению возможна регенерация недостающей нервной ткани. Его также применяют для подготовки имплантата для предупреждения образования рубцов и развития фиброза. В качестве коммитирующих факторов применяют фактор роста нервов в сочетании с витамином С (или отдельно для формирования отростков) и витамином D (для нейрональной дифференцировки) для запуска созревания стволовых клеток в нейрональном направлении.

Согласно изобретению процесс можно осуществить в 2 раза быстрее:

A) прямая стимуляция пораженной нервной ткани с применением в качестве усиливающего фактора ЕРО, наносимого в виде лиофилизата в смеси с концентратом стволовых клеток;

Б) инъекции G-CSF, ЕРО, витамина С и витамина D подкожно в течение периода времени до 4-6 недель, при отсутствии хирургического доступа;

B) внедрение стволовых клеток в виде геля с вышеупомянутыми факторами, индукция полимеризации. Для повышения стабильности геля в полимеризуемый концентрат стволовых клеток костного мозга вместе с факторами примешивают коллагеновый порошок.

Пример 12: РЕГЕНЕРАЦИЯ СУХОЖИЛИЙ, СВЯЗОК, МЕЖПОЗВОНОЧНЫХ ДИСКОВ, МЕНИСКА, ХРЯЩА

Регенерация такой соединительной ткани достигается путем нанесения геля стволовых клеток либо на поверхность пораженной зоны, либо путем инъекции в зону повреждения. Для получения материала для коммитирования получают измельченную исходную ткань из области разрыва или повреждения (зачастую при травме). При дегенеративных нарушениях ассоциированные с повреждением цитокины генерируют при искусственном пунктировании иглой для защиты геля стволовых клеток/смеси факторов согласно изобретению. В случае поражения межпозвоночных дисков дополнительно наносят TGF бета для поддержания реформации студенистого ядра. Если можно получить фрагменты, их смешивают вместе с гелем стволовых клеток.

При помощи такого геля стволовых клеток согласно изобретению возможна регенерация без образования рубцов и развития фиброза. В качестве коммитирующих факторов можно добавлять фактор роста фибробластов для ускорения и достижения быстрых результатов.

Согласно изобретению процесс можно осуществить в 3 раза быстрее:

- Прямая стимуляция пораженной ткани с применением в качестве усиливающего фактора ЕРО, наносимого в виде лиофилизата в смеси с концентратом стволовых клеток.

- Инъекции GCSF, ЕРО в течение периода времени до 1-2 недель при отсутствии возможности хирургического доступа (особенно в качестве превентивной меры).

Инъекция геля стволовых клеток с вышеперечисленными факторами, индукция полимеризации. Для повышения стабильности геля в полимеризуемый концентрат стволовых клеток костного мозга вместе с факторами примешивают коллагеновый порошок.

В случае регенерации хряща применяют каркас/гель, приготовленный из хитозана, и во время имплантации выполняют инокуляцию геля стволовых клеток/факторов, включая TGF бета (20 нг). Фиксация геля достигается путем приклеивания к поврежденной поверхности. В идеальном случае может применяться хитозановый гель или фибриногеновый гель.

В ходе фазы заживления возможно сопутствующее подкожное введение факторов (ЕРО, G-CSF). Можно также повторно применить TGF.

Пример 12: ИНЖЕНЕРИЯ СФИНКТЕРА

Восстановление сфинктеров проводится интраоперационно, в некоторой степени аналогично инженерии сердца. Гель стволовых клеток/факторов инъецируют в оставшуюся ткань сфинктера. Дополнительно может быть сформировано кольцо новообразованной ткани, окружающей старый сфинктер. Ремоделирование проходит в течение 2 недель.

Пример 13: ИНЖЕНЕРИЯ ВЕНОЗНЫХ КЛАПАНОВ

Для регенерации венозных клапанов коллагеновая губка со стволовыми клетками, содержащая ЕРО и/или GCSF, в процессе операции оборачивается вокруг вены. Она имеет длину 2-3 см и может быть сшита, чтобы приблизительно соответствовать клапану, ставшему неполноценным. Дополнительно может применяться FGF, но он не всегда необходим.

Пример 14: ИНЖЕНЕРИЯ КОСТЕЙ ПОЗВОНОЧНИКА

Гель стволовых клеток инъецируют в разрушенный позвонок после его репозиции. Гель полимеризуется внутри. Он может быть смешан с коллагеновым порошком и любым видом материала для замещения кости. Содействующим коммитирующим фактором является витамин D. Применение BMP или его производных не является необходимостью, но возможно его совместное применение с другими факторами и стволовыми клетками.

Изобретение относится к способам, техническим устройствам и композициям для изготовления в краткие сроки графта или трансплантата в форме каркаса, которые могут найти применение для лечения или заживления повреждений и травм разнообразных тканей и органов центральной или периферической локализации организма человека или животного. В частности, изобретение относится к регенерации тканей при помощи стволовых клеток и различных факторов, способствующих репарации специализированных тканей и органов, стимулирующих дифференцировку упомянутых эндогенных или экзогенных стволовых клеток в клетки специализированных тканей, таким образом воссоздавая исходное микроокружение пострадавших при повреждении клеток. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 11 ил., 14 пр.

1. Быстрый интраоперационный способ изготовления ex vivo индивидуальных искусственных имплантатов на основе естественных или синтетических каркасов, служащих в качестве копируемого матрикса для ткани, подлежащей генерации вследствие дефекта ткани или повреждения ткани у пациента, включающий этапы:
(i) подготовки естественного или синтетического каркаса в качестве поддерживающего матрикса для роста клеток ткани;
(ii) подготовки препарата аутологичных стволовых клеток, полученных у пациента, которому предстоит лечение;
(iii) подготовки препарата здоровых клеток в качестве копируемых клеток, полученных путем биопсии из дефектной или поврежденной ткани пациента, которому предстоит лечение;
(iv) инкубации препарата стволовых клеток из этапа (ii) с композицией, содержащей фактор, стимулирующий стволовые клетки и ускоряющий ремоделирование клеток ткани, где указанный фактор представляет собой ЕРО;
(v) загрузки или инъекции клеточного препарата из этапа (iii) на или в матрикс каркаса;
(vi) инкубации матрикса каркаса, полученного на этапе (v), в присутствии препарата стволовых клеток, полученного на этапе (iv), совместно с композицией, содержащей (а) нативный фактор, мобилизующий стволовые клетки и повышающий их доступность, где указанный фактор представляет собой G-CSF или GM-CSF, (б) нативный фактор, способствующий дифференцировке стволовых клеток или их клеток-предшественников, где указанный фактор выбран из группы, состоящей из TGFβ, VEGF, витамина С и витамина Е, и (в) фактор из этапа (iv); и
(vii) подготовки обработанного таким образом каркаса для имплантации пациенту, которому предстоит хирургическое лечение, в котором этапы (iv)-(vi) выполняются в стерильных условиях в камере биореактора или в боксе с ламинарным воздушным потоком на протяжении периода времени от 10 до 30 минут.

2. Способ по п.1, в котором препарат аутологичных стволовых клеток, полученный на этапе (ii), и/или препарат копируемых клеток ткани, полученный на этапе (iii), предварительно обработан композицией, содержащей (а) фактор, мобилизующий стволовые клетки и повышающий их доступность, где указанный фактор представляет собой G-CSF или GM-CSF, (б) фактор, способствующий дифференцировке стволовых клеток или их клеток-предшественников, где указанный фактор выбран из группы, состоящей из TGFβ, VEGF, витамина C и витамина E, и, возможно, (в) фактор, который стимулирует стволовые клетки и ускоряет ремоделирование клеток ткани, где указанный фактор представляет собой ЕРО или hGH.

3. Способ по п.1, в котором фактором, мобилизующим стволовые клетки и повышающим их доступность, является G-CSF, фактором, способствующим дифференцировке стволовых клеток или их клеток-предшественников, является TGFβ, а фактором, стимулирующим стволовые клетки и ускоряющим ремоделирование клеток ткани, является ЕРО и где
стволовые клетки получают из костного мозга или периферической крови пациента, которому предстоит лечение.

4. Способ по п.1, в котором этап инкубации по этапу (vi) п.1 включает добавление аутологичных моноцитов периферической крови (РВМС).

5. Способ по п.1, в котором этапы (iv)-(vi) по п.1 выполняются одновременно с предварительной подготовкой пациента к имплантации каркаса в или на дефектную или поврежденную ткань.

6. Способ по п.1, в котором аутологичные стволовые клетки до этого не проходили экспансии в ходе отдельного этапа процесса.

7. Способ по п.1, в котором различные факторы и/или различные клетки, как указано в любом из предыдущих пунктов, наносят на каркас в виде вязкого гелеобразных или клейких препарата или композиции.

8. Способ интраоперационной подготовки аутологичных клеток, индуцирующих, стимулирующих и способствующих дифференцировке и росту клеток ткани в дефектной или поврежденной ткани посредством естественного или синтетического каркаса у пациента, в ходе предварительной подготовки и обработки пациента к имплантации указанного каркаса указанному пациенту, в котором указанные клетки являются (а) аутологичными стволовыми клетками из костного мозга, ткани или крови пациента, имеющего дефект ткани, травму ткани или повреждение ткани, и (б) здоровыми клетками ткани в качестве копируемых клеток для покрытия матрикса каркаса, который требуется имплантировать пациенту, способ включает этапы:
(i) выявления участка повреждения у пациента;
(ii) мобилизации аутологичных стволовых клеток у пациента, которому предстоит лечение, путем взятия костного мозга, крови или другой ткани;
(iii) мобилизации аутологичных стволовых клеток у пациента, которому предстоит лечение, путем биопсии здорового окружения или выживших клеток из дефектной или поврежденной ткани; эти клетки служат в качестве матричных клеток на матриксе каркаса;
(iv) обработка концентрата стволовых клеток из этапа (ii) ex vivo без проведения их экспансии ЕРО, или hGH, или другими факторами, стимулирующими стволовые клетки и ускоряющими ремоделирование клеток ткани, в течение 10-30 минут в биореакторе или боксе с ламинарным воздушным потоком, расположенным в операционном зале в стерильных условиях;
(v) обработка матричных клеток из этапа (iii) ex vivo по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ЕРО, hGH, GM-CSF, G-CSF и TGFβ, в течение 10-30 минут в биореакторе или боксе с ламинарным воздушным потоком, расположенным в операционном зале в стерильных условиях; (vi) покрытие или инъецирование предварительно обработанных клеток каркаса ех vivo из этапов (iv) и (v) в течение 10-30 минут в биореакторе или боксе с ламинарным воздушным потоком, расположенным в операционном зале в стерильных условиях;
(vii) предварительная подготовка пациента к имплантации в ходе проведения этапов с (iv) по (vi);
(viii) имплантация частично или полностью покрытого каркаса из этапа (v) в дефект ткани или рану; и, возможно,
(ix) нанесение путем местного введения гелеобразных или клейких композиции или препарата на имплантированный каркас и на ткань в окружении имплантата, причем указанная композиция или препарат содержат клетки из этапов (ii) и (iii) и один или более факторов из этапа (v).

9. Способ по п.7, в котором композицию или препарат, содержащие по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из ЕРО, hGH, GM-CSF, G-CSF и TGFβ, наносили пациенту в фармакологически эффективном количестве путем системного введения до начала операции по этапу (i).

10. Способ по п.8, в котором композиция или препарат содержат ЕРО, G-CSF и TGFβ.