СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, АССОЦИИРОВАННОГО С ОТЛОЖЕНИЕМ АМИЛОИДНЫХ БЕЛКОВ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2014 года по МПК A61K47/48 A61K39/385 A61P25/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к лекарственным композициям, содержащим конъюгаты альбумин-амилоидный пептид, и их применению, точнее к их применению для лечения заболеваний, ассоциированных с отложением амилоидных белков, таких как болезнь Альцгеймера.

Уровень техники

Амилоидные заболевания или амилоидозы включают ряд болезненных состояний, имеющих широкий круг внешних симптомов. При данных нарушениях, как правило, присутствуют патологические внеклеточные отложения белковых фибрилл, известных как ′′амилоидные фибриллы′′, ′′отложения амилоида′′ или ′′амилоидные бляшки′′, которые обычно составляют приблизительно 10-100 нм в диаметре и локализованы в специфических органах или участках тканей. Данные бляшки состоят в основном из природного растворимого белка или пептида. Данные нерастворимые отложения состоят в основном из латеральных агрегатов фибрилл, которые составляют приблизительно 10-15 нм в диаметре. Несмотря на различное местонахождение, все амилоидные отложения имеют общие морфологические признаки, окрашивание специальными красителями (например, тиофлавином Т, Конго красным) и обладают характерным свойством красно-зеленого двойного преломления в поляризованном свете после окрашивания.

Связанные с амилоидом заболевания характеризуются типом белка, присутствующего в отложении. Например, нейродегенеративные заболевания, такие как скрепи, коровья губчатая энцефалопатия, болезнь Крейтцфельда-Якоба и т.п., характеризуются появлением и накоплением устойчивой к протеазе формы прионового белка (обозначаемой как AScr или РrР-27) в центральной нервной системе. Аналогично болезнь Альцгеймера, другое нейродегенеративное нарушение, характеризуется отложением амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубочков. В данном случае бляшка и амилоид кровеносного сосуда образуются путем отложения фибриллярного бета-амилоидного белка. Другие заболевания, такие как диабет взрослых (диабет типа II), характеризуются локализованным накоплением амилоида в поджелудочной железе.

Каждый амилоидогенный белок обладает способностью укладываться в бета-складки и формировать нерастворимые фибриллы, которые откладываются внеклеточно или внутриклеточно. Каждый амилоидогенный белок, несмотря на отличия в последовательностях аминокислот, имеет одинаковую способность формирования фибрилл и связывания с другими элементами, такими как протеогликан, амилоид Р и компонент комплемента. Более того, каждый амилоидогенный белок имеет последовательности аминокислот, которые, несмотря на различия, могут катализировать образование клеток с бета-складками. Например, бета-амилоидные фибриллы ассоциированы с мертвыми нервными клетками и микроглиозом у пациентов с болезнью Альцгеймера. При тестировании in vitro показано, что бета-амилоидный пептид способен запускать процесс активации микроглии (макрофагов головного мозга), что объясняло бы наличие микроглиоза и воспаления головного мозга у пациентов с болезнью Альцгеймера.

При другом типе амилоидоза показано, что у пациентов с диабетом типа II амилоидогенный белок IАРР индуцирует токсичность бета-клеток островков in vitro. Следовательно, появление фибрилл IАРР в поджелудочной железе больных диабетом типа II могло бы делать вклад в потерю бета-клеток островков (Лангерганса) и дисфункцию органов.

Одним из самых известных амилоидных заболеваний является болезнь Альцгеймера, которая представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, поражающее приблизительно 0,5-1% всего населения западного мира. Болезнь Альцгеймера характеризуется отложением большого количества амилоидных бляшек в головном мозге. Предполагают, что данное отложение является причиной заболевания, и большинство подходов к предупреждению болезни Альцгеймера направлено на уменьшение, удаление или предупреждение образования амилоидных бляшек. Основным компонентом амилоидных бляшек является бета-амилоидный пептид (Аβ), белок из 40-42 аминокислот, который образуется посредством расщепления амилоидного белка-предшественника (АБП).

Патентная заявка US 20070172496 раскрывает конъюгаты, содержащие пептид Aβ(33-42), пептид, распознаваемый моноклональным антителом, и альбумин, которые используют в качестве иммобилизованных антигенов в анализах ELISA (иммуноферментных твердофазных анализах) для определения присутствия антител к Aβ в образце, полученном от пациента, который иммунизирован комплексом, образованным разными пептидами, выделенными из пептида Aβ(1-42), и так называемым лиганд-презентирующим блоком LPA.

Таким образом, в области техники имеется необходимость в дополнительных иммуногенных композициях, способных вызывать эффективное и длительное снижение уровней амилоида в плазме и уменьшать количество отложений амилоида.

Раскрытие изобретения

В первом аспекте изобретение относится к конъюгату, содержащему пептид, выделенный из C-концевого участка Аβ(1-42), и альбумин, предназначенному для применения в медицине.

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей конъюгат, включающий пептид, выделенный из C-концевого участка Аβ(1-42), и альбумин, а также адъювант, предназначенной для применения в медицине.

В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, содержащему по меньшей мере иммуногенный пептид, выделенный из C-концевого участка Аβ(1-42), и альбумин, или композиции, содержащей по меньшей мере один иммуногенный пептид, выделенный из C-концевого участка Аβ(1-42), и альбумин, а также адъювант, предназначенному для применения с целью лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Раскрывает молекулярно-массовое распределение (ММР) конъюгатов БСА с иммуногенным пептидом Аβ(35-42). Среднее значение ММР соответствует молекулярной массе конъюгата с 16 иммуногенными пептидами Аβ(35-42). Наибольшее количество конъюгатов укладывается на ММР в диапазон молекулярных масс конъюгатов, содержащих от 11 до 21 пептида.

Фигура 2: представляет собой диаграмму, иллюстрирующую схему иммунизационных инъекций пептидов Аβ (стрелки внизу) с указанием номера иммунизации ниже линии, сбор образцов крови (стрелки сверху) с указанием соответствующей точки времени сбора каждого образца в неделях (W) и сбор образцов CFS на неделе 0 и неделе 13 (двойные стрелки). (А) представляет собой схему иммунизационных инъекций пептида Аβ(x-42) и (В) - пептида Аβ(x-40). На (А) в левой рамке представляют схему, которой следуют при лечении всех животных, и в правой рамке представляют дополнительные интервенции, проводимые только в группах С и D.

Фигура 3: (А-С). Рост титров антител к Аβ в плазме. А) Титры антител к Аβ в образцах плазмы выражают в виде эквивалента количесвта мкг/мкл моноклонального антитела 6Е10. В) Титры антитела к Аβ в образцах плазмы выражают посредством их ЕС50. D) Титры антител к Аβ в образцах плазмы выражают посредством обратной величины максимального разведения плазмы, при котором поглощение в три раза выше, чем среднее поглощение в пустых лунках. Различные точки времени (в неделях) представляют на горизонтальной оси. Каждая линия представляет одно животное, как указано в легенде. Препаратами, полученными каждой группой животных, являются синтетический пептид - "Голубой носитель" (Blue Carrier) и Регидрагель НРА (А), синтетический пептид - Голубой носитель и Abisco-300 (В); синтетический пептид - BSA (бычий сывороточный альбумин) и Регидрагель НРА (С) и синтетический пептид - BSA и Abisco-300 (D). Более короткие сплошные линии соответствуют нереагирующим животным (группы А и В), лечение которых прекращают на неделе 13. Животные из группы С представлены прерывистыми линиями и соответствующим индивидуальным обозначением. Животные из группы D представлены пунктирными линиями и соответствующим индивидуальным обозначением.

Фигура 4 (А-В). Рост концентраций пептида Аβ в плазме. А) представляет рост в различных точках времени концентрации в плазме пептида Аβ(1-42). В) представляет рост в различных точках времени концентрации в плазме пептида Аβ(1-40). Горизонтальная ось пересекает ось Y в точке 3,125 пг/мл. Значение ниже 3,125 представляют как -5 пг/мл для ясности графика. Различные точки времени (в неделях) представляют на горизонтальной оси. Каждая линия представляет одно животное, как указано в легенде. Каждая из четырех групп (А, В, С и D) получает различные вакцинные препараты. Более короткие сплошные линии соответствуют нереагирующим животным (группы А и В), лечение которых прекращают на неделе 13. Животные из группы С представлены прерывистыми линиями и соответствующим индивидуальным обозначением. Животные из группы D представлены пунктирными линиями и соответствующим индивидуальным обозначением.

Фигура 5. Рост соотношений изменения титров антител в плазме и концентраций пептидов относительно преиммунного статуса для каждой экспериментальной группы. Точки времени (в неделях) представляют на горизонтальной оси. Прерывистая линия представляет рост соотношения концентрации в плазме пептида Аβ(1-42) в различных точках времени относительно преиммунного статуса (W0 (неделя 0)). Пунктирная линия представляет рост соотношения концентрации в плазме пептида Аβ(1-40) в различных точках времени относительно преиммунного статуса (W0 (неделя 0)). Непрерывная линия представляет рост соотношения титров антитела к Аβ в плазме в различных точках времени относительно преиммунного статуса (W0 (неделя 0)). Для каждого соотношения значения, отложенные на вертикальной оси, представляют сумму по трем животным в группе. Значения соотношения титров антитела к Аβ в плазме делят на двадцать для ясности графиков.

Фигура 6. Рост титров антител к Аβ(33-40) в плазме. А) Титры антител к Аβ в образцах плазмы выражают в виде эквивалента нг/мкл антитела к Аβ40 (SAR 22). В) Титры антитела к Аβ в образцах плазмы выражают посредством их ЕС₅₀ (концентрация, дающая 50% эффект). Различные точки времени (в неделях) представляют на горизонтальной оси. Каждая линия представляет одно животное, как указано в легенде (А1-А3 показано черным цветом и В1-В3 - белым цветом). Каждая из двух групп (А и В) получает различные вакцинные препараты.

Фигура 7: представляет собой график, показывающий концентрацию пептида в растворимой форме или в нерастворимой форме в двух группах, проходящих вакцинацию, по сравнению с контрольной группой. Обозначение Vacc.1 соответствует АβХ-42+BSA+адъювант Th2-типа и обозначение Vacc.2 соответствует АβХ-42+BSA+адъювант смешанного Тh1/Th2-типа. Колонка (1) соответствует растворимой форме Аβ(1-40); (2) - растворимой форме Аβ(1-42); (3) - нерастворимой форме Аβ(1-40) и (4) - нерастворимой форме Аβ(1-42).

Фигура 8 представляет собой график, показывающий концентрацию пептида в растворимой форме у вакцинированных групп по сравнению с контрольной группой. (А) соответствует растворимым пептидам Аβ(1-40) и (В) - растворимым пептидам Аβ(1-42), тогда как (1) означает образец мозжечка; (2) образец лобной; (3) энторинальной и (4) височной областей головного мозга.

Осуществление изобретения

Конъюгаты, соответствующие изобретению, предназначены для применения в медицине

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение конъюгата, содержащего пептид, выделенный из С-концевого участка бета-амилоидного белка (1-42) [Aβ(1-42)], и альбумин, неожиданно вызывает образование антител к данному пептиду и снижение сывороточных уровней белков Aβ(1-40) и Aβ(1-42), которые представляют собой основные компоненты амилоидных бляшек при болезни Альцгеймера. Данные результаты открывают новый терапевтический подход к лечению, предупреждению и/или облегчению заболеваний, ассоциированных с отложением амилоидных белков.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к конъюгату, содержащему иммуногенный пептид, выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42), и альбумин, предназначенному для применения в медицине.

Иммуногенный пептид. выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42)

Термин "иммуногенный пептид", как используют в данном контексте, относится к пептиду, который включает аллель-специфический мотив, эпитоп или другую последовательность, так что полипептид или фрагмент связывает молекулу МНС (главного комплекса гистосовместимости) и индуцирует ответ цитотоксических Т-лимфоцитов ("CTL") и/или ответ В-клеток (например, продукцию антител), и/или ответ лимфоцитов Т-хелперов, и/или ответ типа гиперчувствительности замедленного типа (DTH) в отношении антигена, из которого выделен иммуногенный пептид, а именно бета-амилоидный пептид. Подходящие способы определения, является ли данный пептид иммуногенным, приведены, в частности, в примерах, описанных в настоящем изобретении. Данные способы основаны на способности указанных иммуногенных пептидов генерировать антитела к бета-амилоиду у животных после введения данных пептидов.

Термин "бета-амилоидный пептид" используют в данном контексте взаимозаменяемо с терминами Абета, бета-амилоидный белок, "А бета", "бета-АР", "Абета пептид" или "Аβ пептид", и он относится к семейству пептидов, которые представляют собой основной химический компонент старческих бляшек и сосудистых амилоидных отложений (амилоидная ангиопатия), обнаруживаемых в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (AD), синдромом Дауна и наследственным внутримозговым кровоизлиянием с амилоидозом голландского типа (HCHWA-D). В любой форме бета-амилоидный пептид представляет собой фрагмент бета-амилоидного белка-предшественника (АРР), который содержит различное количество аминокислот, как правило 39-43 аминокислот. "Аβ(1-42)", как используют в данном контексте, относится к пептиду из 42 аминокислот, соответствующему аминокислотам 672 - 713 АРР, который образуется при последовательном протеолитическом расщеплении амилоидного белка-предшественника с помощью β- и γ-секретаз.

Бета-амилоидные пептиды обычно обозначают как Aβ(х-у), где х представляет количество аминокислот аминоконца бета-амилоидных пептидов и у представляет количество аминокислот карбоксиконца. Например, Aβ(1-40) представляет собой бета-амилоидный пептид, аминоконец которого начинается с аминокислоты номер 40, последовательность которого приведена в SEQ ID NO:1.

В контексте настоящего изобретения термин "пептид, выделенный из С-концевого участка Аβ(1-42)", предназначен для обозначения пептидов, имеющих от 2 до 40 аминокислотных остатков, включающих часть или полный С-концевой участок Aβ(1-42). Термин также охватывает пептиды, содержащие участки, имеющие существенную аналогию с С-концевым участком Aβ(1-42), такие как структурные варианты.

Термин "существенная аналогия" означает, что последовательности двух пептидов при оптимальном элайнменте обладают по меньшей мере 50 процентной идентичностью последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 60 процентной идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 70 процентной идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 80 процентной идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 90 процентной идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 95 процентной идентичностью последовательностей или больше (например, 99 процентной идентичностью последовательностей). Предпочтительно, когда положения остатков, которые неидентичны, отличаются консервативными заменами аминокислот. Термин консервативные замены аминокислот относится к взаимозаменяемости остатков, имеющих аналогичные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, представляет собой глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих боковые цепи алифатический радикал-гидроксил, представляет собой серин и треонин; группа аминокислот, имеющих амидсодержащие боковые цепи, представляет собой аспарагин и глутамин; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, представляет собой фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, имеющих основные боковые цепи, представляет собой лизин, аргинин и гистидин и группа аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи представляет собой цистеин и метионин.

Положения остатков, которые неидентичны, могут также состоять из аналогов пептидов, включая неприродные аминокислоты или их производные. Аналоги, как правило, отличаются от природных пептидов по одному, двум или нескольким положениям, часто вследствие консервативных замен.

Некоторые аналоги также включают неприродные аминокислоты или модификации N- или С-концевых аминокислоты в одной, двух или нескольких положениях. Примерами неприродных аминокислот без ограничения перечисленным являются D-аминокислоты, альфа,альфа-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат, эпсилон-N,N,N-триметиллизин, эпсилон-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, омега-N-метиларгинин и изоаспарагиновая кислота.

В конкретном варианте осуществления конъюгирования, соответствующего изобретению, пептид, выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42) выбран из Aβ(35-42) (SEQ ID NO:2), Аβ(33-42) (SEQ ID NO:3) и Аβ(33-40) (SEQ ID NO:4).

Aβ(35-42)", как используют в данном контексте, относится к пептиду из 8 аминокислот, соответствующих последним 8 аминокислотам Aβ(1-42).

"Aβ(33-42)", как используют в данном контексте, относится к пептиду из 10 аминокислот, соответствующих последним 10 аминокислотам Aβ(1-42).

“Аβ(33-40)", как используют в данном контексте, относится к пептиду из 8 аминокислот, соответствующих аминокислотам от 33 до 40 Aβ(1-42).

Пептиды, выделенные из С-концевого участка Аβ(1-42), включая пептидные линкерные группы, можно синтезировать стандартными химическими способами синтеза пептидов в твердой или жидкой фазе. Краткое описание твердофазных способов можно найти в монографиях Stewart and Young (1963) Solid Phase Peptide Synthesis (Твердофазный синтез пептидов), W. H. Freeman Co. (San Francisco) и Meienhofer (1973) Hormonal Proteins and Peptides (Гормональные белки и пептиды), Academic Press (New York). В плане классических способов синтеза в растворе см. монографию Schroder and Lupke, The Peptides (Пептиды), т.1, Academic Press (New York).

Как правило, данные способы предусматривают последовательное добавление одной или более аминокислот или подходящим образом защищенных аминокислот к растущей пептидной цепи. Обычно либо амино-, либо карбоксильную группу первой аминокислоты защищают подходящей защитной группой. Затем защищенную аминокислоту либо присоединяют к инертной твердой основе, либо используют в растворе путем добавления следующей аминокислоты в последовательность, имеющую комплементарную (амино или карбоксильную) группу, защищенную соответствующим образом, и в условиях, подходящих для формирования амидной связи. Затем защитную группу удаляют из данного вновь добавленного остатка аминокислоты и добавляют следующую аминокислоту (защищенную соответствующим образом) и т.д. После того как все необходимые аминокислоты связаны с надлежащей последовательности, все оставшиеся защитные группы (и любую твердую основу) последовательно или одновременно удаляют с получением конечного пептида. При простой модификации данного общего способа возможно добавить к растущей цепи больше одной аминокислоты за один раз, например, путем связывания (в условиях, которые не приводят к рацемизации хиральных центров) защищенного трипептида с надлежащим образом защищенным дипептидом с формированием пентапептида после снятия защиты. В предпочтительном варианте осуществления остаток цистеина добавляют к N-концу данных иммуногенных пептидов с целью облегчения связывания данных пептидов с молекулой-носителем при использовании бифункциональных реагентов, способных реагировать с сульфгидрильными группами цистеина.

Альбумин

Как отмечено выше, один аспект настоящего изобретения относится к конъюгату, содержащему пептид, выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42), и альбумин, предназначенному для применения в медицине.

Как используют в данном контексте, термин "альбумин" относится к наиболее распространенному белку в плазме крови, имеющему молекулярную массу приблизительно от 65 до 67 кД в его мономерной форме в зависимости от вида, у которого он выделен. Термин "альбумин" используют взаимозаменяемо с термином "сывороточный альбумин", ион не предусматривает определение источника альбумина, который формирует конъюгат с модифицированными пептидами, соответствующими изобретению. Таким образом термин "альбумин", как используют в данном контексте, может относиться либо к альбумину, очищенному из природного источника, такого как кровь или серозные жидкости, либо он может относиться к синтезированному химическим путем либо рекомбинантно полученному альбумину. В различных вариантах осуществления варианты альбумина или производные нативных альбуминов могут быть использованы для формирования конъюгатов, соответствующих изобретению. В некоторых вариантах осуществления альбумин представляет собой альбумин млекопитающих либо его вариант или производное. Неограничивающие примеры альбуминов млекопитающих, которые могут быть использованы, включают человеческий, бычий, овечий, козий, кроличий, кошачий, собачий, свиной альбумин, альбумин приматов или грызунов. В предпочтительном варианте осуществления альбумин млекопитающих представляет собой человеческий альбумин.

В одном варианте осуществления человеческий альбумин очищают из крови или серозных жидкостей. Например, альбумин можно очистить из образцов сыворотки или плазмы пациентов или лабораторных животных, причем чаще используют бычий альбумин, но его можно также экстрагировать из сыворотки, полученной от других животных (курица, свинья, кролик и т.п.), при использовании любого стандартного способа, такого как фракционирование холодным этанолом способом Кона (см. статью Cohn EJ et al., J Am Chem Soc 1946; 68:459-75) или способ Kistler и Nitschmann (см. статью Kistler P and Nitschmann HS., Vox Sang 1962; 7:414-24) или хроматографическая очистка (см. раздел Bergloff JH. et al. в монографии под ред. Curling JM, Separation of Plasma Proteins (Разделение белков плазмы), Uppsala: Pharmacia, 1983; 51-8) либо комбинация фракционирования холодным этанолом и хроматографической очистки. Альбумин можно также получить из яичного белка (овальбумин). Другой вид альбумина, альбумины хранения, можно экстрагировать из семян некоторых растений (например, сои).

В другом варианте осуществления альбумин представляет собой рекомбинантный альбумин. В конкретном варианте осуществления альбумин представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин (в данном контексте обозначают как "рЧА"). В различных вариантах осуществления рЧА можно получить в организме млекопитающего или немлекопитающего. В одном варианте осуществления рЧА получают в организме немлекопитающего. Примеры организмов немлекопитающих, которые можно использовать для получения рЧА, включают без ограничения перечисленным дрожжи, бактерии, растения, грибы и насекомых. В одном варианте осуществления рЧА получают в целом растении или целом грибе. В другом варианте осуществления рЧА получают в культивируемых клетках растений, культивируемых клетках грибов или культивируемых клетках насекомых. В другом варианте осуществления рЧА получают в организме млекопитающего, отличного от человека, или в клетках млекопитающего, отличного от человека. Примеры млекопитающих, отличных отчеловека, которых можно использовать для получения рЧА, включают без ограничения перечисленным принадлежащих к одному из следующих порядков: порядок Bovidae, порядок Canidae, порядок Suidae, порядок Rodentia, порядок Lagomorpha и порядок Primates (за исключением человека). В конкретном варианте осуществления млекопитающее, отличное от человека, которое используют для получения рЧА, выбрано из группы, состоящей из коровы, собаки, свиньи, овцы, козы, крысы, мыши, кролика, шимпанзе и гориллы. В другом варианте осуществления клетки млекопитающего, отличного от человека, используемые для получения рЧА, представляют собой без ограничения перечисленным бычьи, собачьи, свиные, овечьи, козьи клетки, клетки грызунов, кролика или приматов, отличных от человека. Главное преимущество рЧА, продуцируемого

организмом, отличным от человека, по сравнению с альбумином, очищенным из человеческой крови или серозных жидкостей, является отсутствие продуктов человеческой природы в способе получения рЧА. Применение данных контролируемых способов получения дает более чистый продукт с пониженной структурной неоднородностью. Предшествующие исследования показывают, что отсутствуют существенные различия между растворимым рЧА и человеческим альбумином, очищенным из крови или серозных жидкостей, в плане биохимических характеристик, эффективности введения радиоактивной метки и биологического поведения in vitro и in vivo. См. статью Dodsworth et al., 1996, Biotechnol. Appl. Biochem. 24: 171-176. В конкретном варианте осуществления альбумин представляет собой рЧА, разработанный под торговым названием RECOMBUMIN(R) (Novozymes Inc., Nottingham, UK). RECOMBUMIN(R) представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин, который получают in vitro с использованием технологии рекомбинантных дрожжей, в которой генетически модифицированные дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) секретируют растворимый рЧА, который затем собирают, очищают и получают в виде препарата, предназначенного для применения в качестве наполнителя для изготовления биологических препаратов или покрытия для медицинских устройств.

Альтернативно альбумин, варианты или производные альбумина, предназначенные для применения при формировании конъюгата, соответствующего настоящему изобретению, можно получить из коммерческого источника, например, как RECOMBUMIN(R) (Novozymes Inc., Nottingham, UK), PLASBUMIN(R) (Talecris Вютерапевтическийз, Research Triangle Park, NC), ALBAGEN(R), (New Century Pharmaceuticals, Huntsville, AL), человеческий альбумин (Cortex-Biochem, San Leandro, CA), человеческий сывороточный альбумин, ZLB Behring (King of Prussia, PA) или ALBREC(R) (Mistubishi Pharma, Japan).

В контексте настоящего изобретения термин "альбумин" относится к любому белку, растворимому в воде, который умеренно растворим в концентрированных солевых растворах, и подвергается коагуляции при нагревании (денатурация белка). Он имеет молекулярную массу приблизительно 65000, состоит из различного числа аминокислот, лежащего в интервале от 609 у большинства видов, включая человеческий альбумин, до 615 аминокислот, как у куриного альбумина. Все они содержат 35 остатков цистеина, которые можно использовать для конъюгирования иммуногенного пептида посредством дисульфидной связи. Белки альбумина, подходящие для получения конъюгатов, соответствующих настоящему изобретению, включают без ограничения перечисленным человеческий альбумин (SEQ ID NO:5) или его зрелый фрагмент (аминокислоты 25-609 SEQ ID NO:5) и бычий альбумин (SEQ ID NO:6) или его зрелый фрагмент (аминокислоты 25-607 SEQ ID NO:6). Альбумин, используемый в настоящем изобретении, также охватывает структурные варианты альбумина, происходящие из консервативных замен аминокислот, как объясняют выше для пептида, выделенного из С-концевого участка Aβ(1-42).

В ряде вариантов осуществления конъюгаты, соответствующие изобретению, включают молекулярные варианты альбумина, такие, например, как описаны в WO 2005/058958, содержание которой включено посредством ссылок во всей своей полноте. Вариант рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина коммерчески доступен в фирме New Century Pharma(Huntsville, Alabama) под названием А1bаgеn". Альбумин, используемый для формирования конъюгата, соответствующего настоящему изобретению, можно получить при использовании способов или материалов, известных компетентным специалистам в области техники. Например, альбумин можно получить из коммерческого источника, например, Novozymes Inc. (Davis, CA; рекомбинантный человеческий альбумин, выделенный из Saccharomyces cerevisiae), Cortex-Biochem (San Leandro, Calif: сывороточный альбумин), Talecris Вютерапевтическийз (Research Triangle Park, North Carolina; сывороточный альбумин), ZLB Behring (King of Prussia. PA) или New Century Pharmaceuticals ille, Ala.: рекомбинантный человеческий альбумин, выделенный из Pichia pastupsilonris).

Варианты альбумина могут включать природные варианты, являющиеся результатом полиморфизма альбумина в человеческой популяции. Более 30 очевидно различных генетических варианта человеческого сывороточного альбумина идентифицировано посредством электрофоретического анализа в различных условиях. См., например, статьи Weitkampetal, Ann. Hum. Genet., 36(4):381-92 (1973); Weitkamp, Isr. J. Med. ScL, 9(9):1238-48 (1973); Fine et al, Biomedicine, 25(8):291-4 (1976); Fine et al, Rev. Fr. Transfus. Immunohematol, 25(2); 149-63, (1982); Rochu etal, Rev. Fr. Transfus. Immunohematol. 31(5):725-33(1988); Araietal, Proc. Natl. Acad. Sc. U.S.A 86(2): 434-8 (1989), содержание которых в данном контексте включено в виде ссылки во всей своей полноте. В специальном варианте осуществления изобретение представляет собой конъюгаты, образованные с молекулярными вариантами альбумина.

В некоторых вариантах осуществления конъюгаты, соответствующие изобретению, включают производные альбумина, которые имеют существенную гомологию с альбумином. Например, конъюгаты можно сформировать с гомологом альбумина, имеющим последовательность аминокислот по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, точнее по меньшей мере на 90% и наиболее точно по меньшей мере на 95% идентичную последовательности альбумина. В ряде вариантов осуществления гомолог альбумина содержит свободный цистеин.

В некоторых вариантах осуществления конъюгаты, соответствующие изобретению, содержат структурные производные альбумина. Структурные производные альбумина могут включать белки или пептиды, которые обладают активностью типа активности альбумина, например функциональный фрагмент альбумина. В некоторых вариантах осуществления производное представляет собой антигенную детерминанту альбумина, т.е. часть полипептида, которую может распознать антитело к альбумину. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный альбумин может представлять собой любой белок с большим полупериодом существования в плазме, который можно получить путем модификации гена, кодирующего человеческий сывороточный альбумин. В качестве неограничивающего примера рекомбинантный альбумин может содержать инсерции или делеции в области связывания металлических микроэлементов альбумина, так что связывание металлических микроэлементов, например никеля и/или меди, снижается или исключается, как описано в Патенте США No 6787636, содержание которого включено в виде ссылки во всей своей полноте. Пониженный уровень связывания металлических микроэлементов альбумином может быть благоприятным в плане уменьшения вероятности аллергической реакции на металлические микроэлементы у пациента, проходящего лечение композицией альбумина.

В ряде вариантов осуществления производные альбумина включают какую-либо макромолекулу с большим полупериодом существования в плазме, полученном путем модификации белка альбумина in vitro. В некоторых вариантах осуществления альбумин модифицируют жирными кислотами. В некоторых вариантах осуществления альбумин модифицируют ионами металлов. В некоторых вариантах осуществления альбумин модифицируют маленькими молекулами, обладающими высокой аффинностью к альбумину. В некоторых вариантах осуществления альбумин модифицируют сахарами, включая, но без ограничения перечисленным, глюкозу, лактозу, маннозу и галактозу.

Структурные производные альбумина можно генерировать с помощью любого способа, известного компетентным специалистам в области техники, включая, но без ограничения перечисленным, опосредованный олигонуклеотидом (сайт-специфический) мутагенез, аланиновое сканирование и мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сайт-специфический мутагенез (см. статьи Cotter, Biochem J 237 1-7 (1986), Zoller and Smith, Methods Enzymol 154 329-50 (1987)), кассетный мутагенез, мутагенез с ограничением отбора (Wells et al, Gene 34 315-323 (1985)) или другие известные способы можно осуществить на клонированной кодирующей альбумин ДНК с получением ДНК варианта альбумина или последовательностей, которые кодируют структурные производные альбумина (см. монографии Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology (Современные протоколы молекулярной биологии), John Wiley and Sons, New York (последнее издание), Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3d ed (Лабораторное руководство по молекулярному клонированию, 3 изд.), Cold Spping Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001), содержание которых в данном контексте включено в виде ссылки во всей полноте.

В ряде вариантов осуществления производные альбумина включают любую макромолекулу, полученную путем модификации in vitro белка альбумина, с более длинным полупериодом существования в плазме, чем у нативного альбумина. В некоторых вариантах осуществления альбумин модифицируют с помощью одной или более жирных кислот.В некоторых вариантах осуществления альбумин модифицируют одним или более ионов металлов. В некоторых вариантах осуществления альбумин модифицируют одной или более маленьких молекул, обладающих высокой аффинностью к альбумину. В некоторых вариантах осуществления альбумин модифицируют одним или более cахаров, включая, но без ограничения перечисленным глюкозу, лактозу, маннозу и галактозу.

Препараты человеческого сывороточного альбумина, выделенного из сыворотки или полученного рекомбинантным путем, могут содержать неоднородную смесь немеркаптальбумина, т.е. "покрытого" альбумина, и меткаптальбумина, т.е., "непокрытого" альбумин. Полипептид человеческого альбумина содержит 35 остатков цистеинила, 34 из которых формируют 17 стабилизирующих дисульфидных мостика. В то время как остаток цистеина в положении 34 меркаптальбумина содержит свободную SH-группу, этот же остаток в немеркаптальбумине содержит смешанный дисульфид, например, с цистеином или глутатионом, или подвергается окислению ионами металлом ибо другими аддуктами, делая, таким образом, тиоловую группу менее реакционной или недоступной. Как правило, обогащения меркаптальбумином достигают путем контактирования рекомбинантного альбумина с любым агентом, способным превращать окисленный альбумин-Суs34 в восстановленный альбумин-Cys, таким как дитиотрейтол (DTT), тиогликолевая кислота (TGA) или бета-меркаптоэтанол (ВМЕ).

В ряде вариантов осуществления изобретения рекомбинантный альбумин может быть дегликирован перед проведением реакции конъюгирования. Считают, что дегликирование альбумина, особенно рекомбинантного альбумина, продуцируемого дрожжами, может давать альбумин, обладающий высокой переносимостью и стабильностью в отношении формируемых с ним конъюгатов. Как правило, дегликирование альбумина можно осуществить при использовании любого способа и в любых условиях, известных компетентным специалистам в области техники, которые эффективны в плане восстановления неферментативно гликированных белков, таких как описаны в статье Miksiket al (J. Chromatogr. В. Biomed. Sci. Appl., 1997, 699:311-345). Альтернативно альбумин можно дегликировать с помощью ферментных способов. Например, дегликирование можно осуществить с использованием эндогликозидазы Н или смеси различных эндогликозидаз.

В другом варианте осуществления рекомбинантный альбумин может быть дополнительно обработан с целью предпочтительной специфичности конъюгирования, т.е. для снижения вероятности формирования конъюгатов не-Сys. Например, можно осуществить контактирование рекомбинантного альбумина с агентами, которые химически блокируют остатки на человеческом сывороточном альбумине, на которых, как известно, происходит формирование ковалентных аддуктов. Можно использовать любой агент, который, как известно в области техники, способен блокировать реакционные центры на альбумине, отличные от Cys34. В некоторых вариантах осуществления агент блокирует остатки лизина. Альбумин содержит различное число остатков лизина (например, 60 в человеческом альбумине и 61 в бычьем альбумине), из которых 25-30 находятся на поверхности альбумина и могут быть доступны для конъюгирования. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления агент блокирует остаток лизина альбумина, который, как известно компетентному специалисту в области техники, обладает потенциальной способностью формировать ковалентные аддукты, такой как Lys71, Lys19, Lys351, Lys525, Lys541 альбумина.

Линкерный участок

Пептид, выделенный из С-концевого участка Абета(1-42), и альбумин могут быть соединены непосредственно или, альтернативно, могут быть соединены через одну или более связывающих групп (далее обозначаемых как промежуточные молекулы или спейсерная группа).

В конкретном варианте осуществления конъюгирования, соответствующего изобретению, если по меньшей мере один иммуногенный пептид и альбумин соединены линкерным участком, указанный линкерный участок содержит не более одного присоединенного к нему иммуногенного пептида.

В другом конкретном варианте осуществления конъюгирования, соответствующего изобретению, линкерный участок, связывающий по меньшей мере один иммуногенный пептид и альбумин, содержит цистеин, причем более предпочтительно, когда цистеин находится на N-конце иммуногенного пептида.

В ряде вариантов осуществления связывающая группа представляет собой биосовместимый полимер, например пептид или алкил, либо алкоксисодержащий полимер. В специфическом варианте осуществления связывающая группа представляет собой пептид, имеющий лабильную химическую связь, которая расщепляется под действием фермента, или расщепляющийся в специфических химических условиях, например в кислых условиях. В одном варианте осуществления модифицированный пептид содержит реакционную группу, ковалентно связанную с пептидом посредством одной или более связывающих групп.В ряде вариантов осуществления связывающая группа включает одну или более реакционных групп, как правило, одну связывающую группу. В ряде вариантов осуществления связывающая группа имеет длину 1-100 атомов. Как описано в данном контексте, длину связывающей группы выражают через число атомов в самой короткой цепи атомов между группами, соединенными связывающей группой. В ряде вариантов осуществления связывающая группа имеет от 1 до 100 атомов, от 1 до 80 атомов, от 1 до 60 атомов, от 1 до 50 атомов, от 1 до 40 атомов, от 1 до 30 атомов, от 1 до 20 атомов, от 10 дo 20 атомов или от 5 до 15 атомов. В случаях когда присутствует больше одной связывающей группы, данные связывающие группы могут быть одинаковыми или различными связывающими группами. Связывающая группа может быть присоединена к пептиду, выделенному из С-концевого участка Абета(1-42), способом или технологией, известной компетентным специалистам в области техники. Примеры способов или технологий описаны в Патенте США No. 6849714, содержание которого в данном контексте включено в виде ссылки во всей своей полноте.

Связывающие группы могут содержать одну или более алкильных групп, таких как метил, этил, пропил, бутил и т.п., алкоксигрупп, алкенильных групп, алкинильных групп или аминогрупп, замещенных алкильными группами, циклоалкильными группами, полициклическими группами, арильными группами, полиарильными группами, замещенными арильными группами, гетероциклическими группами и замещенными гетероциклическими группами.

В ряде вариантов осуществления связывающая группа может быть выбрана из связывающих групп, включая аминогруппу и карбоксигруппу, в том числе, но без ограничения перечисленным, АЕА, АЕЕА и ОА. В ряде вариантов осуществления связывающая группа может представлять собой полимер АЕА, имеющий длину 1 - 100 атомов. В ряде вариантов осуществления связывающая группа может представлять собой полимер АЕЕА, имеющий длину 1-100 атомов. В ряде вариантов осуществления связывающая группа может представлять собой полимер ОА, имеющий длину 1-100 атомов. Иллюстративные примеры связывающих групп включают мономеры, димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, гексамеры, септамеры, октамеры, нонамеры, декамеры, ундекамеры, додекамеры остатков глицина, лизина, глутамата, изолейцина или аргинина, АЕА, АЕЕА или ОА, например, димер ОА (-ОА-ОА-), или тример ОА (-ОА-ОА-ОА-), либо любая из их комбинаций (например, любая комбинация Gly_n, LyS_n, ОА, АЕА или АЕЕА, где n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12). В некоторых вариантах осуществления связывающая группа имеет единственный лизин. Единственный лизин можно модифицировать, чтобы связать его с реакционной группой непосредственно или через одну или более связывающих групп. Например, группа К может быть связана с реакционной группой или одним или более дополнительными линкерами посредством, например, эпсилон-аминогруппы боковой цепи. Примеры данных линкеров, включающих единственный лизин, имеют, например, последовательность (мономер)_аК(мономер)_b, К(мономер)_c и (мономер)_дК, где каждое из а, b, с и d означает целое число больше или равное единице, например один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или более. В некоторых примерах а и b могут быть одинаковыми, тогда как в других примерах а и b неодинаковы. Например, а может означать три и b может означать четыре для получения связывающей группы, имеющей следующую последовательность: (ОА)_nК(ОА)_n, (ОА)_nК(АЕА)_n, (G)_nK(OA)_n, (OA)_nK(G)_n, где n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12. В случае когда реакционная группа находится на линкере между двумя ТМР, общая длина между двумя ТМР, как правило, не будет превышать 100 атомов. Группы, присоединенные к линкерной группе, не считают частью линкера между двумя ТМР.

Связывающая группа может включать любые комбинации вышеуказанных биосовместимых полимеров. Например, полиглициновый линкер можно комбинировать с одним или более мономеров АЕА, АЕЕА или ОА в любой конфигурации. В одном варианте осуществления полиглициновый линкер присоединен к одному или более мономерам АЕА, АЕЕА или ОА либо по N-, либо по С-концевому участку первого или последнего глицинового остатка полиглицинового линкера. Альтернативно один или более мономеров АЕА, АЕЕА или ОА вводят между остатками глицина в полиглициновом линкере. В конкретных вариантах осуществления реакционная группа (например, МРА, GMBA, NHS, сульфо-NHS, MBS или GMBS) присоединена к пептиду посредством одной или более связывающих групп, включая, например, полиглициновый линкер, полиглицинлизиновый линкер, АЕЕА, АЕА или ОА, либо их любую комбинацию. В ряде вариантов осуществления, когда реакционная группа присоединена к пептиду посредством больше чем одной связывающей группы, каждая связывающая группа может быть независимо выбрана из группы, состоящей, как правило, из полиглицина, полилизина, АЕА, АЕЕА и ОА. В вариантах осуществления количество связывающих групп (например, мономерных звеньев полимера) составляет от 1 до 2, 1, до 3, 1, до 4, 1, до 5, 1, до 6, 1, до 7, 1, до 8, 1, до 9, 1, до 10, 1, до 11, 1, до 12. При наличии больше чем одной связывающей группы связывающие группы могут быть одинаковыми или различными связывающими группами. Например, можно использовать любую комбинацию одной группы полиглицина, полилизина, АЕА, АЕЕА и/или ОА в любом порядке. В одном варианте осуществления реакционную группу, как правило МРА, присоединяют к пептиду посредством 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 полиглициновых, полилизиновых, АЕА, АЕЕА или ОА связывающих групп, которые организованы в виде тандема. В другом варианте осуществления реакционная группа, как правило МРА, присоединена к пептиду посредством 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 полиглициновых, полилизиновых, АЕА, АЕЕА или ОА связывающих групп, которые организованы в виде разветвленной конфигурации.

В другом варианте осуществления связывающая группа представляет собой пептидную группу, которая способна действовать как шарнирный участок между пептидом, выделенным из С-концевого участка Аβ(1-42), и альбумином, позволяя им двигаться более независимо друг от друга, тогда как они поддерживают свою собственную индивидуальную трехмерную форму. В этом смысле предпочтительной неприродной промежуточной последовательностью аминокислот, соответствующей изобретению, будет шарнирный участок, характеризующийся структурной пластичностью, обеспечивающей возможность этого движения, или неприродный гибкий линкер. Гибкий линкер может представлять собой гибкий линкерный пептид длиной 20 аминокислот или меньше. В более предпочтительном варианте осуществления линкерный пептид содержит 2 аминокислоты или больше, выбранные из группы, состоящей из глицина, серина, аланина и треонина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный гибкий линкер представляет собой полиглициновый линкер, но без ограничения перечисленным, полиглициновую, полиглутаминовую, полиизолейциновую, полиаргининовую или другие подходящие связывающие группы, включающие две или более аминокислот. В ряде примеров аминокислотные связывающие группы могут включать по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать остатков аминокислот, например остатков глицина или лизина. Полиглициновый линкер может включать один или более различных остатков (например, остатков лизина), введенных в любой конфигурации, например, около конца N- или С-концевого участка или в середине цепи остатков глицина. В других вариантах осуществления полиглициновый линкер комбинируют с одним или более мономерами АЕА, АЕЕА или ОА в любой конфигурации. В одном варианте осуществления полиглициновый линкер присоединен к одному или более мономерам АЕА, АЕЕА или ОА либо по N-, либо по С-концу первого или последнего остатка глицина в полиглициновом линкере. Альтернативно один или более мономеров АЕА, АЕЕА или ОА вводят между остатками глицина в полиглициновом линкере. В примерах, когда полиглицин используют в качестве линкера, полиглицин может включать единственный лизин для получения свободной эпсилон-аминогруппы, способной к реакции с другим линкером или белком. Примеры данного полиглицина, который включает аминокислоту, например один лизин, имеют, например, последовательность аминокислот (G)_aK(G)_b, К(G)_c и (O)_dК, где каждое из а, b, с и d представляет собой целое числе больше или равное единице, например один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать или больше. В ряде примеров а и b могут быть одинаковыми, тогда как в других примерах а и b неодинаковы. Например, а может означать три, b может означать четыре. В ряде примеров единственный лизин в полиглициновом линкере может сам быть связан с дополнительными группами, например, связывающей группой, реакционной группой или остатком реакционной группы. Например, остаток лизина может быть присоединен к одному или более дополнительным линкерам через, например, эпсилон-аминогруппу боковой цепи.

Возможные примеры линкерных/спейсерных последовательностей включают SGGTSGSTSGTGST (SEQ ID NO:7), AGSSTGSSTGPGSTT (SEQ ID NO:8) или GGSGGAP (SEQ ID NO:9) и GGGKGGGG (SEQ ID NO:10). Данные последовательности используют для связывания сконструированных суперспиралей с другими белковыми доменами (см. статью Muller, K.M., Arndt, K.M. and Alber, Т., Meth. Enzymology, 2000, 328: 261-281). Предпочтительно, когда указанный линкер содержит или состоит из последовательности аминокислот GGGVEGGG (SEQ ID NO: 11).

Эффект линкерного участка состоит в обеспечении пространства между пептидом, выделенным из С- концевого участка Aβ(1-42), и альбумином. Это, таким образом, гарантирует, что присутствие альбумина не оказывает воздействия на вторичную структуру пептида, выделенного из С-концевого участка Aβ(1-42), и наоборот. Предпочтительно, когда спейсер имеет пептидную природу. Предпочтительно, когда линкерный пептид содержит по меньшей мере две аминокислоты, по меньшей мере три аминокислоты, по меньшей мере пять аминокислот, по меньшей мере десять аминокислот, по меньшей мере 15 аминокислот, по меньшей мере 20 аминокислот, по меньшей мере 30 аминокислот, по меньшей мере 40 аминокислот, по меньшей мере 50 аминокислот, по меньшей мере 60 аминокислот, по меньшей мере 70 аминокислот, по меньшей мере 80 аминокислот, по меньшей мере 90 аминокислот или приблизительно 100 аминокислот.

Кроме того, линкер может быть связан с компонентами, фланкирующими пептид, выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42), и альбумин, посредством ковалентных связей, и предпочтительно, когда спейсер в основном неиммуногенный и/или не содержит ни одного остатка цистеина. Аналогичным образом предпочтительно, когда трехмерная структура спейсера является линейной или в существенной степени линейной.

Линкер может включать остатки 53-56 тетранектина, формирующие β-складку тетранектина и остатки 57-59, формирующие виток в тетранектине (см. статью Nielsen, В.В. et al., FEBS Lett. 412: 388-396, 1997).

Последовательность сегмента представляет собой GTKVHMK (SEQ ID NO:12).

Данный линкер имеет преимущество в том, что, когда он присутствует в нативном тетранектине, он связывает домен тримеризации с доменом CRD и, вследствие этого, подходит для связывания домена тримеризации с другим доменом в общем. Более того, не ожидают, что полученная в результате конструкция будет более иммуногенной, чем конструкция без линкера.

Альтернативно субпоследовательность из связывающей цепи 3 человеческого фибронектина можно выбрать в качестве линкера, соответствующего аминокислотам 1992-2102 (нумерация SWISSPROT, вход Р02751). Предпочтительно, когда используют субпоследовательность PGTSGQQPSVGQQ (SEQ ID NO:13), соответствующую аминокислотам No 2037-2049, и внутри данной субпоследовательности более предпочтителен фрагмент GTSGQ (SEQ ID NO:14), соответствующий аминокислотам 2038-2042. Преимущество данной конструкции состоит в том, что она не очень подвержена протеолитическому расщеплению и не очень иммуногена, поскольку фибронектин присутствует в плазме в высоких концентрациях.

Альтернативно основой подходящего пептидного линкера может быть последовательность из 10 остатков аминокислот верхнего шарнирного участка мышиного lgG3. Данный пептид (PKPSTPPGSS, SEQ ID NO: 15) используют для получения антител, димеризованных посредством суперспирали (см. статью Pack P. and Pluckthun, A., 1992, Biochemistry 31:1579-1584), и он может быть использован как спейсерный пептид, соответствующий настоящему изобретению. Соответствующая последовательность верхнего шарнирного участка человеческого lgG3 может быть даже более предпочтительной. Не ожидают, что последовательности человеческого lgG3 будут иммуногенными для человека. В предпочтительном варианте осуществления линкерный пептид выбран из группы пептида последовательности АРАЕТКАЕРМТ (SEQ ID NO: 16) и пептида последовательности GAP.

В конкретном варианте осуществления линкерный участок не содержит следующие группы: -N(CH₂-)₂, -NНСН< или -NHCH(CH₂-)2.

В конкретном варианте осуществления конъюгат, соответствующий изобретению, не имеет следующую структуру:

$$X-LA-R{<}_{CO-L_B-NH-P-CO-Y}^{CO-L_B-NH-P-CO-Y}$$

где

R представляет собой -N(CH₂-)₂, -NHCH< или -NHCH(CH₂-)₂,

Х представляет собой водород или пептидную группу и

L_A необязательно присутствует и представляет собой аминокислоту или пептид, содержащий по меньшей мере 2 остатка аминокислот,

L_B необязательно присутствует и представляет собой аминокислоту или пептид, содержащий по меньшей мере 2 остатка аминокислот,

Р представляет собой пептид, выбранный из амилоидных белков или белков, в существенной степени близких амилоидному белку полной длины или их фрагментов,

Y представляет собой ОН или NН₂,

и их фармацевтически приемлемых солей.

Конъюгирование пептида, выделенного из С-концевого участка Aβ(1-42), и альбумина

При доступности достаточного количества пептида, выделенного из С-концевого участка Aβ(1-42), и альбумина конъюгат, соответствующий изобретению, формируют путем контактирования обоих компонентов в условиях, подходящих для формирования ковалентного комплекса между ними.

Независимо от того, связаны ли иммуногенный пептид и альбумин непосредственно или с помощью связывающей группы, изобретение предусматривает как возможность присоединения пептида через его М-конец (С-концевое представление), так и присоединения пептида к молекуле альбумина через его С-конец (N-концевое представление). В предпочтительном варианте осуществления иммуногенный пептид представлен по С-концу в молекуле альбумина. Термин "С-концевое представление", как используют в данном контексте, относится к пептидам, которые присоединены к белку-носителю (альбумину) через их N-концевой участок, так что С-конец остается доступным для распознавания иммунной системой.

Когда пептид и молекула альбумина связаны через линкер, это, как правило, достигается путем использования гомобифункциональных реагентов, которые способны реагировать либо со свободной α-аминогруппой на N-конце пептида и с первичными аминогруппами в молекуле альбумина или из лизиновых групп, либо со свободной α-аминогруппой на N-конце. Подходящие гомобифункциональные реагенты для связывания первичных аминогрупп иммуногенного пептида и альбумина включают без ограничения перечисленным диальдегиды, такие как глутаральдегид, глиоксаль, сукцинальдегид, этилсукцинальдегид, 2-метилглутаральдегид, 3-метилглутаральдегид, адипальдегид и т.п.

Альбумин контактирует с пептидом, выделенным из С-концевого участка Aβ(1-42), в растворе, содержащем конечное молярное соотношение пептида и альбумина приблизительно 0,1:1 - приблизительно 10000:1. В некоторых вариантах осуществления конечное молярное соотношение составляет приблизительно 7500:1, 5000:1, приблизительно 2500:1, приблизительно 1000:1, приблизительно 750:1, приблизительно 500:1, приблизительно 250:1, приблизительно 100:1, приблизительно 75:1, приблизительно 50:1, приблизительно 25:1, приблизительно 10:1, приблизительно 7,5:1, приблизительно 5:1, приблизительно 2,5:1 или приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления конечное молярное соотношение составляет приблизительно 0,1:1 -1:1. В некоторых вариантах осуществления конечное молярное соотношение составляет приблизительно 0,1:1, 0,2:1, 0,3:1, 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1.

Связывание первого и второго компонентов конъюгата происходит посредством реакционной группы, которая присоединена к одному центру пептида, выделенного из С-концевого домена Aβ(1-42). Реакционную группу выбирают по способности формировать стабильную ковалентную связь с альбумином, например, при реакции с одной или более аминогруппами, гидроксильными группами или тиоловыми группами на альбумине. Предпочтительно, когда реакционная группа реагирует только с одной аминогруппой, гидроксильной группой или тиоловой группой на альбумине. Соответственно, реакционная группа может быть связана с любым центром пептида или связывающей группы, которая, по мнению компетентного специалиста в области техники, является подходящей. В ряде вариантов осуществления реакционная группа связана со скелетом пептида или производного. В ряде вариантов осуществления реакционная группа присоединена к N-концу, например, N-концевому амину пептида или производного. В ряде вариантов осуществления реакционная группа присоединена к С-концу, например, С-концевому карбоксилу пептида или производного. В ряде вариантов осуществления реакционная группа присоединена к боковой цепи пептида или производного, например гидроксилу, тиолу, амино или карбоксилу боковой цепи пептида или производного. В специфических вариантах осуществления реакционная группа присоединена к эпсилон-аминогруппе лизиновой боковой цепи пептида или производного. В специфических вариантах осуществления реакционная группа присоединена к остатку цистеина, находящемуся на N-конце или С-конце пептида.

Для формирования ковалентных связей с функциональной группой на белке в качестве химической реакционной группы можно использовать широкий круг активных карбоксильных групп, в частности сложные эфиры. Карбоксильные группы, как правило, превращают в реакционные промежуточные продукты, такие как N-гидроксисукцинимид (NHS) или малеимид, которые чувствительны к воздействию аминов, тиолов и гидроксильных функциональностей на белке. Введение NHS и малеимидных реакционных групп в пептид можно осуществить путем использования бифункциональных связывающих агентов, таких как малеимид-бензоил-сукцинимид (MBS), гамма-малеимидо-бутирилоксисукцинимидный эфир (GMBS), дитиобис-N-сукцинимидилпропионат (DTSP), N-сукцинимидил 3-(2-пиридилтио) (SPDP), сукцинимидил-транс-4-(малеимидилметил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), сукцинимидилацетилтиоацетат (SATA), бензофенон 4-малеимид, лямбда'-((2-пиридилитио)этил)-4- азидосалициламид (PEAS; АЕТ). Данные бифункциональные линкеры будут активировать либо карбокси, либо аминогруппы на пептиде на основе выбора защитных групп.

Альтернативно введение малеимида в пептид можно осуществить при использовании связывающих агентов, таких как N,N,-дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-этил-3-{3-диметиламинопропил) карбодиимид, гидрохлорид (EDAC) и т.п., для активации производных, таких как малеимидопропионовая кислота, [2-[2-[2-малеимидопропионамидо

(этокси)этокси]уксусная кислота, и последующей реакции с амином на пептиде. Аналогичные агенты, такие как DCC и EDAC, также можно было бы использовать для введения производных, подобных малеимидоалкиламинам, в карбоксигруппы на пептиде.

Первичные амины являются основными мишенями NHS эфиров. Доступные эпсилон-аминогруппы, находящиеся на N-концах белков, реагируют с NHS эфирами. Однако эпсилон-аминогруппы на белке могут быть нежелательными или недоступными для связывания NHS. Хотя пять аминокислот содержат азот в боковых цепях, только эпсилон-амин лизина реагирует в существенной степени с эфирами NHS. Амидная связь может формироваться, когда реакция конъюгирования NHS эфира проходит с первичными аминами, высвобождая N-гидроксисукцинимид. Данные сукцинимидилсодержащие реакционные группы в данном контексте обозначают как сукцинимидильные группы.

В конкретных вариантах осуществления функциональная группа на альбумине представляет собой единственную свободную тиоловую группу, находящуюся на остатке аминокислоты 34 (Cys34), и химически реакционная группа представляет собой малеимидосодержащую группу, такую как МРА. МРА означает малеимидопропионовую кислоту или малеимидопропионат.

Данные малеимидосодержащие группы обозначают в данном контексте как малеимидогруппы.

В некоторых вариантах осуществления конъюгаты, образованные способами, описанными в данном контексте, содержат альбумин, ковалентно связанный с сукцинимидилом или малеимидогруппой на терапевтическом пептиде. В некоторых вариантах осуществления амино, гидроксильная или тиоловая группа альбумина ковалентно связана с сукцинимидильной или малеимидогруппой на терапевтическом пептиде. В некоторых вариантах осуществления тиол цистеина 34 альбумина ковалентно связан с [2-[2-[2-малеимидопропионамидо(этокси)этокси]ацетамидным линкером на эпсилон-аминолизина терапевтического пептида.

В специфическом варианте осуществления реакционная группа представляет собой одну реакционную группу МРА, присоединенную к пептиду, необязательно посредством связывающей группы, по одной определенной аминокислоте, и МРА ковалентно присоединяют к альбумину по одному остатку аминокислоты альбумина, предпочтительно цистеину 34. В предпочтительном варианте осуществления альбумин представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин.

В ряде вариантов осуществления реакционную группу можно присоединить к любому остатку терапевтического пептид, подходящему для присоединения данной реакционной группы. Остаток может представлять собой концевой или внутренний остаток пептида. В ряде вариантов осуществления реакционную группу можно присоединить к карбоксиконцу или аминоконцу пептида. В подходящих вариантах осуществления реакционная группа присоединена к одному центру пептида. Этого можно достигнуть при использовании защитных групп, известных компетентному специалисту в области техники. В ряде вариантов осуществления производное терапевтического пептида может содержать остаток, введенный для присоединения реакционной группы. Полезные в плане присоединения остатки включают, но без ограничения перечисленным, остатки цистеина, лизина, аспартата и глутамата. Остаток можно ввести внутрь или в конец пептида, например, на остаток N-концевой аминокислоты через свободный альфа-аминоконец. В ряде вариантов осуществления реакционная группа присоединена к внутреннему остатку лизина. В ряде вариантов осуществления реакционная группа присоединена к концевому остатку лизина. В ряде вариантов осуществления реакционная группа присоединена к аминоконцевому остатку лизина. В ряде вариантов осуществления реакционная группа присоединена к карбоксиконцевому остатку лизина, например остатку лизина на карбоксиконце терапевтического пептида.

В других вариантах осуществления активированная группа дисульфидной связи может быть присоединена к цистеину или аналогу цистеина терапевтического пептида способом преимущественного формирования межмолекулярных дисульфидных связей на основе схемы избирательной активации тиола. Описаны способы на основе избирательной активации одного тиола активирующей группой с последующей реакцией с вторым свободным тиолом с образованием асимметричных дисульфидных связей избирательно между белками или пептидами для облегчения решения проблемы пониженных выходов вследствие формирования симметричных дисульфидных связей. См. монографию D. Lambdandreu et al "Methods in Molecular Biology" (Методы молекулярной биологии) (под ред. М.W. Pennington and В.M.Dunn), т.35, стр.91., Humana Press, Totowa. N. J., (1994).

Предпочтительно, когда данные активирующие группы представляют собой группы на основе пиридинсульфенила (см. статью M. S. Bernatowicz el id., Int.J. Pept. Protein Res. 28: 107(1986)). Предпочтительно, когда используют 2,2'-дитиодипиридин (DTDP) (см. статьи Carlsson el al., Diupsilonchem. J. 173:723(1978); L. H. Kondejewski el al., Bioconjugate Chem., 5:602 (1994) или 2,2'-дитиобис(5-нитропиридин) (NPYS) (см. J. Org. Chem., 56:6477 (1991)) или N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио) (SPDP). Кроме того, 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту) (реагент Эллама) или 6,6'- дитиодиникотиновую кислоту можно использовать в качестве активирующих групп.

В соответствии с данными способами группы, активирующие дисульфидную связь, сначала реагируют с терапевтическим пептидом, содержащим цистеин или аналог цистеина, в условиях избытка активирующей группы. Данные условия в высокой степени способствуют формированию лекарственного соединения, содержащего терапевтический пептид, связанный с активированной дисульфидной группой, в основном без образования связанных дисульфидом гомодимеров пептида. После реакции связывания полученный в результате пептид очищают, например, с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной хроматографии) с обращенной фазой. Реакция со вторым свободным тиолом происходит, когда пептидное соединение реагирует с альбумином с образованием конъюгата между лекарственным соединением и сывороточным альбумином.

Цистеин или аналог цистеина терапевтического пептида превращают в содержащий S-сульфонат посредством схемы реакции сульфитолиза. В данной схеме терапевтический пептид сначала получают либо синтетическим, либо рекомбинантным путем. Затем используют реакцию сульфитолиза с целью присоединения S-сульфоната к терапевтическому пептиду через тиол его цистеина или аналога цистеина с последующей реакций сульфитолиза, соединение терапевтического пептида очищают, например, с помощью градиентной колоночной хроматографии. Затем соединение S-сульфоната используют для формирования конъюгата между соединением терапевтического пептида и компонентом крови, предпочтительно сывороточным альбумином.

Способ модификации терапевтических пептидов реакционной группой с целью конъюгирования с альбумином будет широко варьировать в зависимости от природы различных элементов, содержащих терапевтический пептид. Способы синтеза будут выбраны так, чтобы они были простыми, давали высокие выходы и позволяли получить высокоочищенный продукт. Обычно химически реакционную группу создают на последней стадии синтеза пептида, например, путем эстерификации карбоксильной группы с формированием активного сложного эфира. Специальные способы получения модифицированных инсулинотропных пептидов описаны в Патентах США Nо 6329336, 6849714 или 6887849.

Конъюгирование первого и второго компонентов конъюгата, соответствующего изобретению, можно осуществить различными путями. Одной из возможностей является непосредственное конъюгирование функциональной группы с терапевтически активным компонентом в положении, которое не нарушает активность данного компонента. Как понимают в настоящем изобретении, термин функциональные группы относится к группе специфических атомов в молекуле, которые отвечают за характерную химическую реакцию указанной молекулы. Примеры функциональных групп включают, но без ограничения перечисленным группы гидрокси, альдегид, алкил, алкенил, алкинил, амид, карбоксамид, первичный, вторичный, третичный и четвертичный амины, аминокси, азид, азо (диимид), бензил, карбонат, сложный эфир, простой эфир, глиоксилил, галоалкил, галоформил, имин, имид, кетон, малеимид, изоцианид, изоцианат, карбонил, нитрат, нитрит, нитро, нитрозо, пероксид, фенил, фосфин, фосфат, фосфоно, пиридил, сульфид, сульфонил, сульфинил, тиоэфир, тиол и окисленный 3,4-дигидроксифенилаланин (DOPA).

Другой возможностью является конъюгирование первого и второго компонентов путем использования гомо- или гетеробифункциональных групп. Бифункиональную группу можно конъюгировать сначала с пептидом, выделенным из С-концевого участка Aβ(1-42), и затем конъюгировать с альбумином, или альтернативно возможно конъюгировать бифункциональную группу с альбумином и затем конъюгировать ее с пептидом, выделенным из С-концевого участка Aβ(1-42). Иллюстративные примеры данных типов конъюгатов включают конъюгаты, известные как кетон-оксим (описаны в US20050255042), где первый компонент конъюгата содержит аминоксигруппу, которая связана с кетонной группой, присутствующей в гетеробифункциональной группе, которая, в свою очередь, связана с аминогруппой во втором компоненте конъюгата.

В другом варианте осуществления агент, который используют для конъюгирования первого и второго компонентов конъюгата, соответствующего изобретению, можно подвергнуть протеолитической, химической, температурной или ферментной обработке. Особенно интересно использование связывающих агентов, которые можно подвергнуть гидролизу ферментами, находящимися в клетке-мишени, так что терапевтически активное соединение высвобождается только внутри клетки. Примеры типов связывающих агентов, которые могут быть процессированы внутри клетки, описаны в WO 04054622, WO 06107617, WO 07046893 и WO 07112193.

Компоненты конъюгата, соответствующего изобретению, можно химически модифицировать при условии, что вторичная структура и функциональность обоих компонентов остаются неизмененными. Способы химической модификации полипептидной цепи широко известны компетентному специалисту в области техники и включают способы, основанные на конъюгировании посредством тиоловых групп, присутствующих в молекулах цистеина, способы, основанные на конъюгировании посредством первичных аминогрупп, присутствующих в молекулах лизина (US6809186), способы, основанные на конъюгировании посредством N- и С-концевых групп. Реагенты, подходящие для модификации полипептидов с целью получения возможности связывать их с другими соединениями, включают глутаральдегид (он позволяет связывать соединения с N-концевой частью полипептидов), карбодиимид (он позволяет связывать соединения с С-концевой частью полипептида), сукцинимидные сложные эфиры (например, MBS, SMCC), которые позволяют активировать N-концевую часть цистеиновых групп, бензидин(ВЭВ), который позволяет активировать тирозиновые группы, перйодат, который позволяет активировать углеводные группы и белках, которые гликозилированы.

В конкретном варианте осуществления пептид, выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42), содержит, кроме того, дополнительный N-концевой Cys.

В другом варианте осуществления модифицированный пептид,

содержащий сывороточный белок, получают in vitro (ex vivo) путем ковалентного присоединения модифицированного пептида к сывороточному белку in vitro, так что остаток реакционной группы пептида формирует ковалентную связь с сывороточным белком. В одном варианте осуществления сывороточный белок является аутологичным для пациента. В специфическом варианте осуществления сывороточный белок выделяют у пациента. В ряде вариантов осуществления выделенный сывороточный белок пациента очищают из других белков, присутствующих в крови и/или из клеток крови перед ковалентным присоединением к модифицированному пептиду. В соответствии с данным вариантом осуществления полученный в результате конъюгат вводят пациенту, у которого выделен сывороточный белок, или аутологичному пациенту. В другом варианте осуществления сывороточный белок представляет собой рекомбинантный сывороточный белок. Как правило, сывороточный белок представляет собой рекомбинантный альбумин, наиболее часто сывороточный белок представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин. В предпочтительном варианте осуществления конъюгат, соответствующий изобретению, формируют контактированием модифицированного пептида, содержащего малеимидогруппу, с тиолсодержащим сывороточным белком, как правило альбумином, в условиях, предусматривающих рН от 6,5 до 7,4, обычно с формированием при этом стабильной тиоэфирной связи, которая не может расщепляться в физиологических условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления сывороточный белок представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин или рекомбинантный бычий альбумин).

В одном варианте осуществления модифицированный пептид амидирован по С-концевой части. В другом варианте осуществления модифицированный пептид не амидирован по С-концевой части. Модифицированный пептид, конъюгат или соединение, соответствующие изобретению, могут также включать данный амидированный пептид. В одном варианте осуществления модифицированный пептид ацилирован по N-концевой части. В другом варианте осуществления модифицированный пептид неацилирован по N-концевой части. Модифицированный пептид, конъюгат, соединение, соответствующие изобретению, могут также включать данный ацилированный пептид.

Связывание иммуногенного пептида с альбумином посредством остатка цистеина на N-конце пептида позволяет связать с одной молекулой альбумина столько молекул пептида, сколько остатков цистеина находится в молекуле альбумина. Например, бычий сывороточный альбумин (BSA) содержит 35 остатков цистеина, которые могут быть заняты таким количеством, как 35 пептидов, модифицированных по N-концевому Cys, чтобы получить конъюгат, содержащий по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29,30,31, 32, 33, 34 или 35 молекул пептида.

Альтернативно связывание иммуногенного пептида с альбумином осуществляют с использованием гомобифункционального реагента, способного реагировать с первичными аминогруппами, причем конъюгат может включать столько молекул пептида, сколько остатков лизина находится в молекуле альбумина. Например, бычий сывороточный альбумин (BSA) содержит 58 остатков лизина, которые могут быть заняты таким количеством, как 58 иммуногенных пептидов, чтобы получить конъюгат, содержащий по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 или 58 молекул пептида.

Таким образом, к бычьему сывороточному альбумину, содержащему 35 остатков цистеина и 58 остатков лизина, может быть присоединено через названные остатки по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 или 93 молекул пептида. На Фигуре 1 на примере пептида Аβ(35-42) представлено молекулярно-массовое распределение для конъюгатов бычьего сывороточного альбумина с вышеуказанным количеством пептидов.

Композиции, соответствующие изобретению, предназначенные для применения в медицине

Конъюгаты, соответствующие изобретению, способны индуцировать иммунный ответу пациента, приводящий к увеличению количества антител, специфических в отношении Аβ(1-42), и снижению нагрузки амилоида в сыворотке. Однако, как известно компетентному специалисту, иммунный ответ можно усилить при использовании адъювантов с целью повышения антигенности конъюгата. Таким образом в другом аспекте в изобретении представляют композицию, содержащую конъюгат, соответствующий изобретению, и адъювант, предназначенный для применения в медицине.

Термин "адъювант", как используют в данном контексте, относится к иммуномодулирующей субстанции, пригодной для комбинирования с конъюгатом, соответствующим изобретению, с целью усиления, повышения или модуляции иным образом иммунного ответа пациента без вредного воздействия на пациента.

Адъюванты проявляют свои иммуномодулирующие свойства посредством нескольких механизмов, таких как рекрутирование лимфоидных клеток и индукция цитокинов. Адъюванты-цитокины включают без ограничения перечисленным гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин-12, GM-CSF, синтетический аналог мурамилового дипептида или монофосфориллипида. Дополнительные примеры адъювантов выбраны из группы, содержащей полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, QS21, гель гидроксида алюминия, MF59, фосфат кальция, липосин, сапонин, сквален, L121, эмульсиген монофосфориллипида (MPL), полисорбат 80, холерный токсин (СТ), LTK и LTK63. Предпочтительно, когда адъюванты такие, которые одобрены для применения у человека, такие как гель гидроксида алюминия, фосфат кальция и MF59.

В более конкретном варианте осуществления адъювант относится к типу, который стимулирует тип ТП2 иммунного ответа, такой как, например, гель гидроксида алюминия и СТ. При индукции ответа типа ТП2 преобладает продукция противовоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-4, ИЛ-10 и бета-TGF (трансформирующий фактор роста бета), а также продукция антител классов lgG1 и lgG2b. Предпочтительные адъюванты для применения с целью получения преимущественного ответа типа ТН2 включают, например, фосфополимер (см. статью Guy et al. 1998, Vaccine 16:850-856) и квасцы (например, гидроксид алюминия, фосфат алюминия).

В изобретении можно использовать любые из "гидроксидных" или "фосфатных" адъювантов, которые, как правило, используют в качестве адъювантов. Адъюванты, известные как "гидроксид алюминия", как правило, представляют собой соли оксигидроксида алюминия, которые обычно являются по меньшей мере частично кристаллическими. Адъюванты, известные как "фосфат алюминия", как правило, представляют собой гидроксифосфаты алюминия, часто содержащие маленькое количество сульфата (т.е. гидроксифосфат сульфат алюминия). Их можно получить осаждением, и условия реакции, а также концентрации в процессе осаждения влияют на степень замещения гидроксила фосфатом в соли.

Волокнистая морфология (например, как видно на фотографиях, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа) типична для адъювантов на основе гидроксида алюминия. р1 адъювантов на основе гидроксида алюминия составляет, как правило, приблизительно 11, т.е. сам адъювант обладает положительным поверхностным зарядом при физиологическом рН. Для адъювантов на основе гидроксида алюминия описана адсорбционная способность 1,8-2,6 мг белка/мг Al³⁺ при рН 7,4.

Адъюванты на основе фосфата алюминия, как правило, имеют молярное соотношение PO₄/Al от 0,3 до 1,2, предпочтительно от 0,8 и 1,2 и более предпочтительно 0,95±0,1. Фосфат алюминия обычно бывает аморфным, особенно у гидроксифосфатов. Типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным соотношением РО₄/Аl от 0,84 до 0,92, в том числе при 0,6 мг Al³⁺/мл. Фосфат алюминия будет, как правило, находиться в форме частиц (например, иметь пластинчатую морфологию, как видно на фотографиях, полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа. Типичные диаметры частиц лежат в интервале 0,5-20 мкм (например, приблизительно 5-10 мкм) после адсорбции какого-либо антигена. Для адъювантов на основе фосфата алюминия описана адсорбционная способность 0,7-1,5 мг белка/мг Аl³⁺ при рН 7,4.

Точка нулевого заряда (PZC) фосфата алюминия находится в обратной зависимости от степени замещения фосфата гидроксилом, и данная степень замещения может изменяться в зависимости от условий реакции и концентрации реагентов, используемых для получения соли путем осаждения.

PZC изменяется также при изменении концентрации свободных ионов фосфата в растворе (больше фосфата=более кислая PZC) или путем добавления буфера, такого как гистидиновый буфер (делает PZC более основным). Фосфаты алюминия, используемые в соответствии с изобретением, будут, как правило, иметь PZC от 4,0 до 7,0, более предпочтительно от 5,0 до 6,5, например приблизительно 5,7. Суспензии солей алюминия, используемые для получения композиций, соответствующих изобретению, могут содержать буфер (например, фосфатный или гистидиновый или Трис-буфер), но это не всегда необходимо. Предпочтительно, когда суспензии стерильны и апирогенны. Суспензия может включать свободные водные ионы фосфата, например, присутствующие в концентрации от 1,0 до 20 мМ, предпочтительно от 5 до 15 мМ и более предпочтительно приблизительно 10 мМ. Суспензии могут также включать хлорид натрия.

В изобретении можно использовать смесь как гидроксида алюминия, так и фосфата алюминия. В данном случае фосфата алюминия может быть больше, чем гидроксида, например, при массовом соотношении по меньшей мере 2:1, например >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1 и т.п.

Предпочтительно, когда концентрация Al⁴⁺ в композиции, предназначенной для введения пациенту, составляет меньше чем 10 мг/мл например, <5 мг/мл, <4 мг/мл, <3 мг/мл, <2 мг/мл, <1 мг/мл и т.п. Предпочтительный интервал составляет от 0,3 до 1 мг/мл. Максимум 0,85 м г/дозу является предпочтительным.

С другой стороны, адъювант относится к типу, который стимулирует тип Th1 иммунного ответа. Как используют в данном контексте, термин адъювант типа 1 или адъювант Th1 предназначен для определения адъюванта, который стимулирует ответ Th1 (типа 1) (или ответ, который поляризован или смешен в сторону ответа типа 1 при относительно слабом ответе Th2 (типа 2)). Могут требоваться иммунные ответы Th1 (характеризующиеся продукцией гамма-интерферона (γ-ИФН) и связанные с защитным иммунитетом к вирусам и внутриклеточным бактериям), и, вследствие этого, в другом конкретном варианте осуществления адъювант относится к типу, который стимулирует иммунный ответ типа Th1. Предпочтительные адъюванты, предназначенные для применения с целью вызвать преимущественно ответ типа Th1, могут быть выбраны из группы, состоящей из полного адъюванта Фрейнда, монофосфориллипида А, 3-дез-O-ацилированного монофосфориллипида А (3D-MPL), соли алюминия, CpGсодержащих олигонуклеотидов, иммуностимулирующих последовательностей ДНК, сапонина, Монтанида ISA 720 (Seppic, France), SAF, ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), SBAS-3, SB. Другие адъюванты для предпочтительного Th1 включают SAF (Chiron, Calif., United States), серия адъювантов SBAS (например, SBAS-2 или SBAS-4, производимые фирмой SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Детокс (Corixa, Hamilton, Mont.), RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.) и другие аминоалкилглюкозаминид 4-фосфаты (AGPs), такие, как описано в Патентах CLLlANos. 6113918 и 6355257, описания которых включены в данном контексте в виде ссылки во всей своей полноте.

Изобретение предусматривает также использование комбинации адъювантов, которые стимулируют оба типа, Th1 и Th2. В предпочтительном варианте осуществления адъювантом, который стимулирует оба типа, Th1 и Th2, является сапонин. Сапонины представляют собой гетерогенную группу стериновых гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые обнаружены в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветках широкого круга видов растений. Сапонин из коры дерева Quillaia saponaria Molina широко исследован в качестве адъювантов. Сапонин может быть также коммерчески получен из Smilaxornata (сассапариль), Gypsophilla paniculata (перекати-поле или гипсофилла метельчатая) и Saponaria officinalis (мыльный корень). Адъювантные препараты сапонина включают очищенные препараты, такие как QS21, а также липидные препараты, такие как ISCOMs. Композиции сапонина очищают с использованием ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ (ВЭЖХ с обращенной фазой). С помощью данных способов идентифицируют специфические очищенные фракции, включая QS7, QS 17, QS 18, QS21, QH-A, QH-B и QH-С. Предпочтительно, когда сапонин представляет собой QS21. Препараты сапонина могут также содержать стерин, такой как холестерин. Комбинации сапонинов и холестеринов можно использовать для образования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOMs). ISCOMs, как правило, включают также фосфолипид, такой какфосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. Любой известный сапонин можно использовать в ISCOMs. Предпочтительно, когда ISCOM включает один или более компонентов из QuilA, ОНА и QHC. ISCOMs подробно описаны в ссылках 45-47. Необязательно ISCOMs могут быть свободны от дополнительного детергента. Обзор разработки адъювантов на основе сапонинов можно найти в статьях Barr et al. (Advanced Drug Delivery Reviews, 1998, 32:247-271) и Sjolanderet et al. (Advanced Drug Delivery Reviews, 1998, 32:321-338).

Конъюгаты, соответствующие изобретению, могут обладать улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с неконъюгированными пептидами. Фармакокинетические свойства пептида включают, например, его скорость всасывания и выведения, его профиль распределения в тканях, его скорость метаболизма и его токсичность. Как правило, конъюгаты, соответствующие изобретению, имеют пониженную скорость выведения и/или увеличенный полупериод существования в кровотоке in vivo по сравнению с неконъюгирванными пептидами.

Предпочтительные конъюгаты, предназначенные для использования в настоящем изобретении, включают:

Пептид Носитель Адъювант NH₂-MVGGWIA-COOH (Aβ35-42) Альбумин Регидрагель НРА NH₂-GLMVGGWIA-COOH (Аβ33-42) Альбумин Регидрагель НРА NH₂-MVGGWIA-COOH (Аβ35-42) Альбумин Abisco NH₂-GLMVGGWIA-COOH (Аβ33-42) Альбумин Abisco NH₂-CMVGGWIA-COOH (AS35-42Cys) Альбумин Регидрагель НРА NH₂-CGLMVGGWIA-COOH (Aβ33-42Cys) Альбумин Регидрагель НРА NH₂-CMVGGWIA-COOH (Aβ35-42Cys) Альбумин Abisco NH₂-CGLMVGGWIA-COOH (Aβ33-42Cys) Альбумин Abisco NH₂-CGLMVOGW-COOH (Aβ33-40Cys) Альбумин Регидрагель НРА NH₂-CGLMVGGW-COOH (Aβ33-40Cys) Альбумин Abisco

Способы лечения, соответствующие изобретению

Как уже упомянуто в начале описания, композиция, соответствующая настоящему изобретению, как показано, эффективна при лечении заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков. Вследствие этого в другом аспекте изобретение относится к конъюгату, содержащему пептид, выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42), и альбумин, или к композиции, содержащей пептид, выделенный из С- концевого участка Aβ(1-42), и альбумин, а также адъювант, предназначенной для лечения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков.

В другом аспекте изобретение относится к конъюгату, содержащему пептид, выделенный из С-концевого участка Аβ(1-42), и альбумин, или к композиции, содержащей пептид, выделенный из С-концевого участка Аβ(1-42), и альбумин, а также адъювант, предназначенным для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков, предусматривающему введение нуждающемуся в этом субъекту конъюгата, содержащего пептид, выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42), и альбумин, или к композиции, содержащей пептид, выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42), и альбумин, а также адъювант.

Как используют в данном контексте, термины "лечить", "лечение" и "проведение лечения" относятся к облегчению одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием, которое является результатом введения терапевтически эффективного количества композиции, соответствующей изобретению, или содержащего ее фармацевтического препарата пациенту, нуждающемуся в указанном лечении. Таким образом, термин "лечение", как используют в данном контексте, покрывает лечение заболевания, нарушения или состояния млекопитающего, в частности человека, и включает: (а) предупреждение возникновения заболевания или состояния у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию или состоянию, но у которого оно еще не диагностировано, (b) подавление заболевания или состояния, т.е. остановку его развития, или (с) ослабление заболевания или состояния, т.е. обратное развитие заболевания или состояния, либо облегчение одного или более симптомов заболевания или состояния. Группа пациентов, подвергаемых лечению данным способом, включает пациента, страдающего от нежелательного состояния или заболевания, а также пациентов из группы риска развития состояния или заболевания. Таким образом компетентный специалист в области техники предполагает, что лечение может улучшить состояние пациента, но может не полностью излечить заболевание. Как используют в данном контексте, термины "нарушение" и "заболевание" используют взаимозаменяемо в отношении аномального или патологического состояния пациента, которое нарушает функции организма и может быть смертельным.

Выражение "терапевтически эффективное количество" используют в данном контексте для обозначения количества, достаточного для предупреждения и, предпочтительно, снижения по меньшей мере приблизительно на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% клинически важного изменения в характере патологии. В отношении настоящего изобретения термин может также означать количество, достаточное для облегчения или обратного развития одного или более симптомов, связанных с заболеванием, ассоциированным с отложением амилоидных белков, таким как болезнь Альцгеймера. В частности, "терапевтически эффективное количество" лекарственного препарата может привести в результате к облегчению, уменьшению или устранению по меньшей мере одного из следующих симптомов: ухудшение памяти, постоянная печаль и тревога, чувство опустошенности, безнадежность, пессимизм, чувство вины, непригодность, беспомощность, потеря интереса или удовольствия от увлечения и деятельности, которые раньше доставляли удовольствие, пониженная энергия или усталость, трудность концентрации, запоминания или принятия решений, бессонница, пробуждение ранним утром или чрезмерная сонливость, потеря аппетита и/или массы тела либо переедание и набор массы тела, мысли о смерти или суициде и попытки суицида, возбужденное состояние, раздражительность и постоянные физические симптомы, которые не реагируют на лечение, такие как головные боли, нарушения пищеварения и хроническая боль. Применительно к индивидуальному активному ингредиенту, вводимому в виде монотерапии, термин относится только к данному ингредиенту. Применительно к комбинации термин относится к комбинированным количествам активных ингредиентов, которые приводят в результате к терапевтическому эффекту, вводят ли их в комбинации, последовательно или одновременно.

Термин "пациент" относится к животному, предпочтительно млекопитающему, включая неприматов (например, корову, свинью, лошадь, кошку, собаку, крысу или мышь) и приматов (например, обезьяну или человека). В предпочтительном варианте осуществления пациентом является собака. В более предпочтительном варианте осуществления пациентом является примат, причем в еще более предпочтительном варианте осуществления указанный примат является человеком.

В контексте настоящего изобретения выражение "заболевание, ассоциированное с отложением амилоидных белков", включает заболевания, ассоциированные с накоплением амилоидного белка, которое может быть либо ограничено одним органом, т.е. "локализованный амилоидоз", либо распространяться на несколько органов, которое называют "системным амилоидозом". Заболевания, ассоциированные с отложением амилоидных белков, которые можно лечить композициями, соответствующими настоящему изобретению, включают без ограничения перечисленным заболевание, представленное в таблице 1.

Заболевание Характерный белок Болезнь Альцгеймера Бета-амилоид Миозит с тельцами включений (IBM), Бета-амилоид Сахарный диабет типа 2 1АРР (Амилин) Болезнь Паркинсона альфа-синуклеин Трансмиссивная губчатая энцефалопатия Прион Болезнь Гентингтона Гентингтин Медуллярная карцинома щитовидной железы Кальцитонин Сердечные аритмии Атриальный натрийуре- Атеросклероз Аполипопротеин АI Ревматоидный артрит Сывороточный амилоид А Амилоид срединной аорты Медин Пролактиномы Пролактин Семейная амилоидная полиневропатия Транстиретин Наследственный неневропатический Лизоцим Амилоидоз, связанный с диализом β2-микроглобулин Финский амилоидоз Джелсолин Решетчатая дегенерация роговицы Кератоэпителин Церебральная амилоидная ангиопатия Бета-амилоид Церебральная амилоидная ангиопатия Цистатин Системный AL амилоидоз Легкая цепь

Вторичный амилоидоз может быть ассоциирован с хронической инфекцией (такой как туберкулез) или хроническим воспалением (таким как ревматоидный артрит), включая семейную форму вторичного амилоидоза, которую наблюдают также при семейной средиземноморской лихорадке (FMF), и другой тип системного амилоидоза, обнаруженный у пациентов, в течение длительного времени находящихся на гемодиализе. Локализованные формы амилоидоза включают без ограничения перечисленным диабет типа II и любые связанные с ним нарушения, нейродегенеративные заболевания, такие как скрепи, коровья губчатая энцефалопатия, болезнь Крейтцфельда-Якоба, болезнь Альцгеймера, церебральная амилоидная ангиопатия и нарушения, связанные с прионовыми белками. Признаком амилоидных заболеваний является отложение в органах амилоидных бляшек, состоящих в основном из фибрилл, которые, в свою очередь, состоят из характерных белков или пептидов фибрилл.

Вследствие этого в конкретном варианте осуществления заболевание, ассоциированное с отложением амилоидных белков, выбрано из болезни Альцгеймера, болезни Крейтцфельда-Якоба, церебральной амилоидной ангиопатии и нарушений, связанных с прионовыми белками, а также мышечной дегенерции.

Как будет иметь в виду компетентный специалист, все конкретные варианты осуществления, относящиеся к соответствующим изобретению композиции или набору, предназначенным для применения в медицине, применимы также, когда указанные композицию или набор используют для лечения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков. Вследствие этого конкретные варианты осуществления, относящиеся к способам лечения, соответствующим изобретению, с использованием конъюгата или композиции, представляют собой:

пептид, выделенный из С-концевого участка /W-42), который выбран из Aβ(35-42) (SEQ ID NO:2), Aβ(33-42) (SEQ ID NO:3) и Aβ(33-40) (SEQ ID NO:4);

пептид, выделенный из С-концевого участка Aβ(1-42), который

содержит, кроме того, дополнительный N-концевой Cys;

альбумин, который представляет собой бычий сывороточный альбумин,

предпочтительно, когда адъювант представляет собой адъювант типа Th1 или Th2, и

композицию изобретения или активные компоненты из набора, соответствующие изобретению, которые вводят один раз в две недели.

Детальное описание данных конкретных вариантов осуществления можно найти в предшествующих абзацах.

В другом конкретном варианте осуществления заболевание, ассоциированное с отложением амилоидного белка, выбрано из болезни Альцгеймера, болезни Крейтцфельда-Якоба, церебральной амилоидной ангиопатии и нарушений, связанных с прионовыми белками.

Конъюгат, соответствующий изобретению, или композицию, соответствующую изобретению, можно вводить различными способами, например внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно, наружно, внутрикожно, перорально, интраназально или интрабронхиально, а также местно, системно или непосредственно в область-мишень (локализованным путем). Обзор различных способов введения активных ингредиентов, наполнителей, предназначенных для использования, и способов их получения можно найти в Tratado de Farmacia Galenica (Фармацевтический справочник по галеновым препаратам) С.Fault i Trillo, Luzan 5, S.A. de Ediciones, 1993 и в Remington's Pharmaceutical Sciences (Справочник по фармацевтическим наукам Ремингтона (под ред. A.R. Gennaro), 20 изд., Williams & Wilkins PA, USA (2000).

В настоящем изобретении выражение "локализованным путем" понимают как местное введение конъюгата, соответствующего изобретению, в определенную область тела человека или животного. Предпочтительно, когда введение производят в область с быстрым током крови, например, внутривенно в периферическую или центральную вену. Другие пути могут найти применение, когда введение комбинируют со способами замедленного высвобождения или с использованием защитной матрицы. Кроме того, подходящим способом является иммунизация через слизистые посредством назального введения, поскольку известно, что данный путь введения благоприятен для ответа типа Th2.

Схему дозирования определяет врач и клинические факторы. Как хорошо известно в медицине, дозы зависят от многих факторов, включая физические характеристики пациента (возраст, размер, пол), используемый способ введения, тяжесть заболевания, конкретное используемое соединение и фармакокинетические свойства пациента.

В конкретном варианте осуществления композицию, соответствующую изобретению, или активные компоненты из набора, соответствующего изобретению, вводят один раз в две недели.

Композиция, соответствующая изобретению, или активные компоненты из набора, соответствующего изобретению, как показано, эффективны в плане применения в медицине.

Для использования в медицине композиция, соответствующая изобретению, может находится в виде пролекарства, соли, сольвата или клатрата, либо в выделенной форме, либо в комбинации с дополнительными активными агентами. Композицию, соответствующую настоящему изобретению, можно получить вместе с наполнителем, который приемлем с точки зрения фармацевтики. Наполнители, предпочтительные для использования в настоящем изобретении, включают сахара, крахмалы, целлюлозы, камеди и белки.

Как будет иметь в виду компетентный специалист, композицию, соответствующую изобретению, можно получить принятыми способами, известными в области техники, в твердой (например, таблетки, капсулы, таблетки с сахарным покрытием, гранулы, суппозитории, кристаллические или аморфные стерильные твердые вещества, которые можно восстановить с получением жидких форм и т.п.), жидкой (например, растворы, суспензии, эмульсии, эликсиры, лосьоны, мази и т.п.) или полутвердой (гели, мази, кремы и т.п.) фармацевтической лекарственной форме. Примеры фармацевтически приемлемых носителей известны в области техники и включают забуференные фосфатом солевые растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы смачивающих компонентов, стерильные растворы и т.п.

Следующие способы и примеры следует истолковывать как иллюстративные и не ограничивающие объем изобретения.

Примеры

Иммунизация собак С-концевыми последовательностями бета-амилоидного белка безопасна и выводит белок из крови

Пример 1. Иммунизация пептидами Аβ(х-42)

I. Материалы и способы

1. Характеристики животных

В данном изобретении используют двенадцать взрослых собак породы Бигль обоих полов. Характеристики животных суммированы в таблице 1. Животных получают из коммерческих источников и содержат в собачьих питомниках университета Сантьяго для разведения. В период эксперимента животных содержат в трех общих помещениях со свободным входом/выходом и снабжают готовым кормом для собак и водой по потребности. Животных тщательно идентифицируют непосредственно перед началом экспериментов, включая физическое и неврологическое обследование, биохимический анализ крови и гемограмму, и находят, что они здоровы.

Ветеринарный врач, неосведомленный относительно лечения, в конечном счете назначенного каждой группе, распределяет животных на четыре группы (А, В, С и D; n=3). Животных обследуют каждую неделю на появление любого клинического признака реакции на вакцины. Дополнительное полное обследование, снова включающее биохимический анализ крови и гемограмму, проводят после третьей иммунизации.

Животных лечат согласно Европейскому и Испанскому закону об обращении с животными (86/609/EU, Real Decreto 1201/2005) и прилагают все усилия к тому, чтобы уменьшить страдания животных. Исследование одобрено Комитетом по этике Университета Сантьяго.

2. Получение иммуногенов

Синтетический пептид АВ(35-42) (с дополнительным N-концевым Cys

при конъюгировании посредством SPDP) в качестве антигена (0,4 мг/инъекцию), включенный в четыре различных вакцинных препарата, используют для иммунизации животных. Каждый из данных препаратов комбинируют с белковым носителем, либо "голубым носителем" (ВС; Pierce, Rockford, ИЛ, группы А и В), либо бычьим сывороточным альбумином (BSA; Sigma, Madrid, Spain; группы С D), и адъювантом, либо регидрагелем НРА (RH; Quimibios (производитель Reheis), Barcelona, Spain; группы А и С), либо Abisco-300 (AB; Isconova AB, Uppsala Science Park, SE-751 83 Uppsala, SWEDEN; группы В и D).

2.1. Связывание синтетических пептидов с BSA с помощью SPDP:

Сначала получают исходный раствор 20 мМ SPDP (М-сукцинимидил 3-(2-пиридилтио)пропионата, 50 мг/8 мл ДМСО (диметилсульфоксид)). Затем 5 мг BSA (бычьего сывороточного альбумина) растворяют в 1 мл PBS (забуференный фосфатами солевой раствор)/5 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 8 и добавляют к BSA 50 мкл 20 мМ раствора SPDP. Раствор инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого обессоленную колонку уравновешивают PBS/EDTA заменяют буфер модифицированным SPDP BSA с целью удаления побочных продуктов реакции и избытка непрореагировавшего реагента SPDP.

Затем определяют уровень модификации SPDP, используя следующий протокол:

а) Разводят 100 мкл модифицированного SPDP и обессоленного BSA до 1 мл с использованием PBS.

b) Измеряют и регистрируют поглощения при длине волны 343 нм образца белка по сравнению с чистой системой PBS/EDTA (тест повторяют в трех повторностях).

c) Добавляют 10 мкл 15 мг/мл DTT (дитиотрейтол) к 1 мл образца модифицированного SPDP белка, перемешивают.

d) Ровно через 15 минут измеряют и регистрируют поглощение при длине волны 343 нм восстановленного образца.

e) Используют следующее уравнение:

При значении X от 5 до 6,5 к 5 мг модифицированного SPDP BSA добавляют 2 мг синтетического пептида.

После определения уровня SPDP-модификации реакционную смесь инкубируют при перемешивании в течение 18-24 часов и лиофилизируют реакционную смесь с получением конъюгатов бычий сывороточный альбумин - иммуногенный пептид. Для конъюгатов, содержащих в качестве иммуногенного пептида Аβ(35-42), на Фигуре 1 представлено молекулярно-массовое распределение конъюгатов по их усредненной молекулярной массе.

2.2. Связывание синтетических пептидов с Голубым носителем с использованием глутаральдегида:

2 мл боратного буфера, pH 10 и 66 мкл (200 мг/мл) Голубого носителя добавляют в реакционную емкость и осторожно перемешивают. Затем в реакционную емкость добавляют 12 мг синтетического пептида. Одновременно глутаральдегид разводят до 0,3% добавлением боратного буфера pH 10.

Затем 1 мл свежеприготовленного 0,3% раствора глутаральдегида медленно добавляют в реакционную емкость при перемешивании при комнатной температуре, позволяя реакции протекать в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте (раствор приобретает желтый цвет). Для того, чтобы блокировать непрореагировавший глутаральдегид, в реакционную емкость добавляют 250 мкг 1М глицина и осторожно перемешивают, инкубируя при комнатной температуре в течение дополнительных 20 минут.

После этого реакционную смесь переносят в обессоливающую колонку уравновешенную PBS. Реакционную смесь лиофилизируют и растворяют до подходящей концентрации.

Таким образом, в данном изобретении используют следующие четыре

различных препарата:

A) 400 мкг Abeta35-42, конъюгированного с Голубым носителем, с добавлением 200 мкл Регидрагель НРА.

B) 400 мкг Abeta35-42, конъюгированного с Голубым носителем, с добавлением 200 мкл Abisco-300.

C) 400 мкг Abeta35-42, конъюгированного с BSA, с добавлением 200 мкл Регидрагель НРА.

D) 400 мкг Abeta35-42, конъюгированного с BSA, с добавлением 37 мкл Abisco-300.

Используемые синтетические пептиды представляют собой:

При конъюгировании с Голубым носителем с помощью глутаральдегида:

1.Аβ (35-42) (NH₂-MVGGWIA-COOH) (SEQ ID NO:2) у собак (и мышей, см. ниже).

2. Аβ (33-42) (NH₂-GLMVGGWIA-COOH) (SEQ ID NO:3) у кроликов (см. ниже).

При конъюгировании с BSA с помощью SPDP:

1. Aβcys-(35-42) (NH₂-CMVGGWIA-COOH) (SEQ ID NO:17) у собак (и мышей, см. ниже).

2. Aβcys-(33-42)(NH₂-CGLMVGGVVIA-COOH) (SEQ ID NO:18) у кроликов (см. ниже).

3. Протокол иммунизации и взятие проб крови

Животных (собак) делят на 4 группы и предназначают для одного из четырех вакцинных препаратов. Животных иммунизируют Abeta35-42 подкожно в спину и мониторируют побочные реакции. Схема иммунизации и взятия проб представлена на Фигуре 2 (А). Вкратце, животным делают инъекцию один раз в две недели семь раз. Собаки в группах С и D получают дополнительную 8-ю иммунизацию через семь месяцев после седьмой инъекции.

Пробы крови собирают из яремной вены в полипропиленовые флаконы с ЭДТА и ингибиторами протеазы (полный мининабор мг/10 мл, Roche) непосредственно перед первой иммунизацией (W0 (неделя 0)) и через неделю после третьей (на неделе 5: W5), пятой (W9) и седьмой (W13) иммунизаций (см. Фигуру 2). Дополнительные пробы крови получают у животных из групп С и D через четыре месяца после седьмой иммунизации (W31) и через одну и три недели после бустерной иммунизации (W43 и W45 соответственно).

Пробы осторожно перемешивают и хранят при 4°C максимум в течение 2 часов перед центрифугированием при 4000 g в течение 10 минут. Затем берут аликвоты плазмы и замораживают при -80°C до использования. Кроме того, при каждой экстракции ~1 мл крови каждого животного собирают в не содержащий ЭДТА полипропиленовый флакон для получения сыворотки. Данной пробе дают образовать сгусток в течение одного часа при комнатной температуре, затем центрифугируют при 4000 g в течение 10 минут и собирают сыворотку и хранят при -80°C до проведения анализа на биохимические характеристики крови.

Образцы спинно-мозговой жидкости (CSF) собирают под общей анестезией в асептических условиях за неделю до первой и на неделе 13 после седьмой иммунизации (см. Фигуру 2). Берут аликвоты данных проб CSF и замораживают при -80°C до использования.

4. Анализы антител к Аβ в плазме и CSF

Антитела к Аβ определяют посредством прямого ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ) в 96-луночных полипропиленовых планшетах. Лунки для микротитрования покрывают 2,5 мкг/мл человеческого пептида Аβ(1-42) (# 24224 AnaSpec. San Jose, CA, USA) в 100 мМ бикарбонате натрия и 2М буфере на основе гуанидина гидрохлорида (pH 9,6) при 4°C в течение ночи. Затем планшеты трижды промывают 300 мкл буфера для промывания (0,5 М Трис, 1,5 М хлорид натрия, 0,5% Твин 20, pH 8), блокируют 300 мкл блокирующего буфера (0,05 М Трис, 0,2% Твин 20, 0,5% BSA; pH 8) в течение двух часов при 37°C и снова промывают еще три раза. Планшеты с покрытием инкубируют в течение одного часа при 37°C со 100 мкл трехкратных серийных разведений образцов собачьей плазмы в буфере-носителе (0,05 М Трис, 0,5 М хлорид натрия, 0,05% BSA, 0,05% Твин 20; pH 8) в ряду из 10 лунок, начиная с разведения плазмы 1:30 в первой лунке. Самое большое из оцениваемых разведений плазмы составляет 1/10×3¹⁰. Одиннадцатую и двенадцатую колонки в каждом планшете заполняют буфером-носителем без плазмы в качестве пустых контролей. Затем планшеты промывают и инкубируют в течение одного часа при 37°С со 100 мкл разведения 1:1000 в буфере-носителе пероксидазы хрена, конъюгированной с кроличьим IgG к собаке (Jackson InmunoResearch. Suffolk, UK), трижды промывают и инкубируют с 0,0375% ABTS (Roche, Barcelona, Spain) в буфере для ABTS (Roche. Barcelona, Spain). Поглощение при длине волны 405 нм читают на автоматизированном ридере для планшетов (Synergy 4, Biotek. Winooski, Vermont, USA).

Концентрации антитела к Aβ в плазме рассчитывают, используя моноклональное антитело 6Е10 в качестве стандарта на тех же планшетах для ELISA, и выражают в мкг/мл. Значение ЕС50 для каждого образца плазмы определяют путем нелинейной регрессии поглощения относительно логарифма разведении в каждой лунке (GraphPad Prism 3.02). Кроме того, конечный титр в плазме определяют как максимальное разведение плазмы, при котором поглощение в три раза превышает среднее поглощение пустых лунок.

Определение свободных пептидов Aβ в плазме

Уровни Aβ(1-42) и Aβ(1-40) в плазме и CSF собак измеряют с использованием непрямого сэндвичевого ELISA с использованием наборов для ELISA ABtest-40 и ABtest-42 фирмы Araclon Biotech (Zaragoza, Spain), следуя инструкциям изготовителя.

II. Результаты

Животные остаются здоровыми и активными на протяжении всего периода эксперимента. В частности, не выявляют никаких признаков реакции на вакцины. Среднее увеличение массы тела с недели 0 до недели 13 составляет 1±1,7 кг (см. таблицу 1). Только у двух животных уменьшилась масса тела за данный период (1 кг у каждого, что составляет 4% и 7% от их массы в неделю 0 соответственно).

Таблица 1. Характеристики животных Группа/Собака Пол Возраст (лет) Масса (кг) в W Масса (кг) в W Увеличение массы (кг) Изменение массы, % А1 самка 11 16 18 2 12,50 А2 самец 6 23 22 -1 -4,35 A3 самец 8 22 23,45 1,45 6,59 В1 самка 10 13 13 0 0,00 В2 самец 6 21 23 2 9,52 В3 самец 12 24,45 26,7 2,25 9,20 С1 самка 6 18 18 0 0,00 С2 самец 6 16 16 0 0,00 С3 самец 10 24,5 29 4,5 18,37 D1 самец 6 14 13 -1 -7,14 D2 самец 6 15 15 0 0,00 D3 самец 10 18,7 21,5 2,8 14,97                   Среднее 18,80 19,89 1,08 4,97     SD* 4,10 5,22 1,68 8,03 * стандартная ошибка

Титры антител к Аβ(1-42)

Группы А и В

Интерполяция значений поглощения в плазме у животных в группе А и В относительно стандарта 6Е10 не выявляет систематической разницы между преиммунными пробами и пробами, собранными на неделях W5, W9 и W13 (см. Таблицу 2А и Фигуру 3А). Порядок приращения в титрах антител в плазме, измеренный как эквивалентность количеству мкг/мкл 6Е10, после трех и семи иммунизаций (W5 и W13 соответственно) является очень низким (0,8±0,2 и 0,8±0,2 соответственно для группы А; 1,2±0,1 и 1,3±0,3 соответственно для группы В. См. таблицу 3). Значения EC₅₀ плазмы для специфического антитела (к Аβ42) у животных групп А и В являются очень низкими от недели 0 до недели 13. В самом деле значения EC₅₀ плазмы снижаются от W0 до W5 у всех данных собак за исключением собаки В2, у которой показано несущественное приращение исключительно в данной точке времени (см. таблицу 2В и Фигуры 3А-С). Кроме того, даже не самое концентрированное разведение плазмы (1:30) данных собак после иммунизации дает значение поглощения в три раза превышающее это значение, измеренное в образцах преиммунной плазмы (Table 2C). Таким образом считают, что собаки в данных двух группах не реагируют на соответствующие вакцинные препараты (А и В).

Таблица 2. Титры в плазме специфических антител к Aβ42 в различные точки времени Панель A: эквивалент мкг/мл моноклонального антитела 6Е10 Группа/Собака W 0 W 5 W 9 W 13 W 31 W 43 W 45 А1 0,0028 0,0016 0,0015 0,0016       А2 0,0024 0,0023 0,0018 0,0023       A3 0,0027 0,0022 0,0028 0,0021       В1 0,0019 0,0023 0,0070 0,0033       В2 0,0025 0,0031 0,0022 0,0028       В3 0,0027 0,0028 0,0029 0,0032       С1 0,0016 0,0205 0,0147 0,0084 0,0008 0,0017 0,0019 С2 0,0010 0,0113 0,0083 0,0093 0,0007 0,0040 0,0041 С3 0,0022 0,0276 0,0214 0,0206 0,0021 0,0089 0,0102 D1 0,0025 0,1075 0,0933 0,1048 0,0076 0,0716 0,0520 D2 0,0017 0,0529 0,0406 0,0294 0,0028 0,0229 0,0164 D3 0,0019 0,0321 0,0138 0,0256 0,0024 0,0088 0,0071                 Панель В: значения ЕС50 плазмы для специфического антитела (к Аβ42) А1 49 42 35 29       А2 170 85 158 133       A3 155 111 132 115       В1 51 47 235 66       В2 186 253 123 93       ВЗ 79 60 41 59       С1 45 773 722 385 68 46 49 С2 147 473 350 385 70 114 129 СЗ 123 1349 994 853 70 336 460 D1 51 6759 5738 6302 319 4202 2733 D2 53 2956 2021 1378 66 1122 790 D3 57 1550 752 1169 61 365 267                 Панель С: обратная величина максимального разведения плазмы с поглощением в 3 А1 270 270 90 270       А2 270 270 270 270       A3 270 270 270 270       В1 270 270 810 810       В2 270 810 270 270       ВЗ 270 270 270 270       С1 90 2430 2430 2430 270 270 270 С2 90 2430 2430 2430 90 810 810 СЗ 270 2430 2430 2430 810 2430 2430 D1 270 21870 21870 21870 2430 21870 7290 D2 270 7290 7290 7290 810 7290 2430 D3 270 7290 2430 7290 810 2430 810

Таблица 3. Порядок приращения относительно преиммунной плазмы (эквивалентность Группа/Собака W0/W0 W5/W0 W9/W0 W13/W0 W31/W0 W43/W0 W45/W0 А1 1,0 0,6 0,5 0,6       А2 1,0 1,0 0,8 1,0       A3 1,0 0,8 1,0 0,8                       Среднее 1,0±0,0 0,8±0,2 0,8±0,3 0,8±0,2       В1 1,0 1,2 3,6 1,7       В2 1,0 1,2 0,9 1,1       В3 1,0 1,1 1,1 1,2       Среднее 1,0±0,0 1,2±0,1 1,9±1,5 1,3±0,3                       С1 1,0 12,5 8,9 5,1 0,5 1,0 1,1 С2 1,0 11,8 8,6 9,7 0,7 4,2 4,2 С3 1,0 12,6 9,7 9,4 1,0 4,1 4,6 Среднее 1,0±0,0 12,3±0,4 9,1±0,6 8,1±2,6 0,7±0,2 3,1±1,8 3,3±1,9                 D1 1,0 42,8 37,2 41,7 3,0 28,5 20,7 D2 1,0 30,6 23,5 17,0 1,6 13,2 9,5 D3 1,0 17,1 7,4 13,7 1,3 4,7 3,8 Среднее 1,0±0,0 30,2±12,8 22,7±14, 24,1±15,3 2,0±0,9 15,5±12,1 11,3±8,6

Группы С и D

В противоположность наблюдаемому в группах А и В у собак, леченных вакцинными препаратами С и D, показаны существенные модификации титров антител в плазме. Ответ всех собак в данных двух группах, как измерено по стандарту 6Е10, и EC₅₀ или конечное разведение соответствуют одному и тому же типу, хотя количественные различия наблюдают как между, так и внутри групп (см. Таблицу 2А-С). Основной тип характеризуется существенным повышением титров после трех иммунизаций, которые сохраняются только с небольшими отклонениями от W5 до W13 (см. Фигуры 3А-С). Таким образом, титры антител существенно повышаются после трех иммунизаций, но не повышаются в существенной степени (или даже немного снижаются) после последующих четырех инъекций вакцины, проводимых один раз в две недели. Конкретно титры, измеренные как эквивалентность количеству мкг/мл 6Е10, после трех и семи иммунизации (W5 и W13 соответственно) умножают на порядок 12,3±0,4 и 8,1±2,6 соответственно для группы С; 30,2±12,8 и 24,1±15,3 соответственно для группы D (см. Таблицу 3).

Через четыре месяца после последней иммунизации (W31) титры падают до очень низких уровней (см. таблицу 2). Однако у собак группы D они еще остаются в два раза выше, чем в преиммунной плазме (см. таблицу 3). Затем собаки групп С и D получают дополнительную восьмую иммунизацию, осуществляемую через семь месяцев после седьмой соответствующим вакцинным препаратом. После данной бустерной инъекции следует существенное повышение титров антител в группе D (повышение в 15,5±12,1 раз относительно преиммунной плазмы, см. таблицу 3) и, в меньшей степени, в группе С (повышение в 3,1±1,8 раз относительно преиммунной плазмы, см. таблицу 3) (см. Фигуры 3А-С). Как правило, в любой точке времени титры антител всегда выше у животных группы D, чем у животных группы С. Тем не менее, приращения титров у собак с более низким ответом в группе D (случай D3) очень близки к приращениям титров у собак в группе С (см. таблицу 3, фигуры 2, 3).

2. Титры пептида Аβ

Сэндвичевый ELISA не выявляет существенных различий в концентрациях пептидов Аβ1-42 или Аβ1-40 между преиммунной плазмой и пробами, собранными в недели W5, W9 и W13 у животных нереагирующих групп (А и В) (см. таблицу 4А-В, Фигуры 4А-В). Порядок изменения концентрации Аβ1-42 в плазме после трех и семи иммунизации (W5 и W13 соответственно) очень низкий (1,2±0,7 и 1,0±0,0 соответственно для группы А; 0,9±0,0 и 1,0±0,1, соответственно для группы В. См. таблицу 5А). Аналогично порядок изменения концентрации Aβ1-40 в плазме после трех и семи иммунизации (W5 и W13 соответственно) очень низкий (0,9±0,1 для обеих недель и обеих групп. Таблица 5В).

Таблица 4А. Концентрация пептида Aβ(1-42) в пг/мл Группа/Собака W 0 W 5 W 9 W 13 W 31 W 43 W 45 CSF W CSF W А1 4,16 7,50 2,76 4,31       556,85 509,70 А2 32,92 32,92 32,92 32,71       253,06 322,77 A3 19,98 20,07 20,24 19,62       421,88 300,12 В1 47,00 46,40 47,00 47,00       299,86 420,84 В2 20,33 20,33 21,83 22,01       283,94 367,18 ВЗ 33,33 33,33 32,82 32,71       314,82 228,06 С1 5,20 <3,125 <3,125 <3,125 4,70 <3,125 <3,125 718,84 532,56 С2 26,46 15,00 <3,125 <3,125 17,53 <3,125 <3,125 519,74 581,28 СЗ 16,35 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 671,03 649,07 D1 74,76 30,58 23,33 28,60 41,96 42,62 29,10 677,44 731,28 D2 17,56 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 783,95 888,61 D3 16,85 15,51 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 488,97 762,05                    

Таблица 4B. Концентрация пептида Aβ(1-40) в пг/мл Группа/Собака W 0 W 5 W 9 W 13 W 31 W 43 W 45 CSF W CSF W А1 61,29 52,55 52,55 55,19       3633,9 3831,7 А2 58,67 52,76 55,21 60,84       2269,6 2719,6 A3 60,26 64,88 63,00 54,64       2534,5 2822,0 В1 104,31 38,70 39,86 <3,125       2890,5 3586,1 82 68,77 58,67 63,87 65,16       2371,5 2610,9 ВЗ 79,30 80,89 93,87 84,78       2449,4 2273,4 С1 27,47 <3,125 21,72 <3,125 24,44 <3,125 <3,125 3503,8 2711,6 С2 56,89 33,03 29,62 35,53 39,39 28,49 21,67 2632,5 3416,4 С3 41,67 <3,125 <3,125 <3,125 27,80 <3,125 <3,125 3121,2 2945,8 D1 106,94 59,06 48,69 46,14 70,71 46,78 55,07 3139,0 3206,7 D2 59,70 <3,125 <3,125 22,04 24,92 <3,125 25,55 3737,7 3426,4 D3 51,67 38,71 26,44 <3,125 33,26 <3,125 35,30 2955,1 3214,8

Таблица 5А. Порядок приращений пептида Аβ (1-42) Группа/Собака W0/W0 W5/W0 W9/W0 W13/W0 W31/W0 W43/W0 W45/W0 А1 1,0 1,8 0,7 1,0       А2 1,0 1,0 1,0 1,0       A3 1,0 1,0 1,0 1,0       среднее± 1,0±0,0 1,2±0,5 0,8±0,2 1,0±0,0       В1 1,0 1,0 1,0 1,0       В2 1,0 1,0 1,1 1,1       В3 1,0 1,0 1,0 1,0       среднее± 1,0±0,0 0,9±0.0 1,0±0.0 1,0±0.1       С1 1,0 0,2 0,2 0,2 0,9 0,2 0,2 С2 1,0 0,6 0,0 0,0 0,7 0,0 0,0 С3 1,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 среднее± 1,0±0,0 0,2+0,3 0,0±0,1 0,0±0,1 0,5±0,1 0,0±0,1 0,0±0,1 D1 1,0 0,4 0,3 0,4 0,6 0,6 0,4 D2 1,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 D3 1,0 0,9 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 среднее± 1,0±0,0 0,4±0,4 0,1±0,1 0,1±0,2 0,2±0,3 0,2±0,3 0,1±0,2                

Таблица 5В. Порядок приращения пептида Аβ (1-40) относительно преиммунной Группа/Собака W0/W0 W5/W0 W9/W0 W13/W0 W31/W0 W43/W0 W45/W0 А1 1,0 0,9 0,9 0,9       А2 1,0 0,9 0,9 1,0       A3 1,0 1,1 1,0 0,9       среднее± 1,0±0,0 0,9±0,1 0,9±0,1 0,9±0,1       В1 1,0 1,0 1,0 1,0       В2 1,0 0,9 0,9 0,9       В3 1,0 1,0 1,2 1,1       среднее± 1,0±0,0 0,9±0,1 1,0±0,1 0,9±0,1       С1 1,0 0,0 0,8 0,0 0,9 0,0 0,0 С2 1,0 0,6 0,5 0,6 0,7 0,5 0,4 С3 1,0 0,0 0,0 0,0 0,7 0,0 0,0 среднее± 1,0±0,0 0,2±0,3 0,4±0,4 0,2±0,3 0,7±0,1 0,1±0,3 0,1±0,2 D1 1,0 0,6 0,5 0,4 0,7 0,4 0,5 D2 1,0 0,0 0,0 0,4 0,4 0,0 0,4 D3 1,0 0,7 0,5 0,0 0,6 0,0 0,7 среднее± 1,0±0,0 0,4±0,4 0,3±0,3 0,2±0,2 0,5±0,1 0,1±0,2 0,5±0,1

В противоположность наблюдаемому в группах А и В, у собак, леченных вакцинными препаратами С и D, показывают существенные модификации концентраций Аβ(1-42) в плазме. Данное изменение соответствует типу, характеризующемуся существенным снижением уровня Аβ(1-42) на неделе W5, после трех иммунизаций, до точки, в которой у пяти из шести собак пептид становится неопределяемым (<3,125 пг/мл, см. таблицу 4А, Фигуру 4А). Концентрация пептида поддерживается на неопределяемом уровне до недели W13, в эксперименте повышается на W31, через четыре месяца после седьмой иммунизации, когда титры антител приближаются к преиммунным уровням, и затем снижается снова после бустерной (8-ой) инъекции на неделе W42 (см. Фигуру 2). Величина данных изменений отражена в Таблице 5А. Несколько неожиданно, что концентрация Аβ1-40 в плазме, по-видимому, соответствует типу изменения, очень близкому Аβ(1-42) (см. таблицы 4В и 5В, Фигуру 4В). Соответствие титров антител и концентрации пептида в любой точке времени представляют на Фигуре 5.

Несмотря на существенные различия между группами С и D в плане титров антител в плазме в любой точке времени в период эксперимента, флуктуации концентраций пептида Aβ происходят в аналогичный период времени. Это дает возможность предположить, что даже высоких титров антител недостаточно для достижения выведения пептидов Aβ из кровотока.

Пример 2: Иммунизация пептидом Аβ(х-40) I. Материалы и способы

1. Характеристики животных

В данном изобретении используют шесть взрослых собак породы Бигль обоих полов. Животных получают из коммерческих источников и содержат в собачьих питомниках университета Сантьяго для разведения. В период эксперимента животных содержат в трех общих помещениях со свободным входом/выходом и снабжают готовым кормом для собак и водой по потребности. Животных тщательно идентифицируют непосредственно перед началом экспериментов, включая физическое и неврологическое обследование, биохимический анализ крови и гемограмму, и находят, что они здоровы.

Ветеринарный врач, неосведомленный относительно лечения, в конечном счете назначенного каждой группе, распределяет животных на две (А и В, n=3). Животных обследуют каждую неделю на появление любого клинического признака реакции на вакцины. Дополнительное полное обследование, снова включающее биохимический анализ крови и гемограмму, проводят после третьей иммунизации.

Животных лечат согласно Европейскому и Испанскому закону об обращении с животными (86/609/EU, Real Decreto 1201/2005) и прилагают все усилия к тому, чтобы уменьшить страдания животных. Исследование одобрено Комитетом по этике Иниверситета Сантьяго.

2. Получение иммуногенов

Синтетический пептид АВ(33-40) (с дополнительным N-концевым Cys при конъюгировании посредством SPDP) в качестве антигена (0,4 мг/инъекцию), включенный в два различных вакцинных препарата, используют для иммунизации животных. Каждый из данных препаратов комбинируют с белковым носителем, либо "голубым носителем" (ВС; Pierce, Rockford, ИЛ, группы А), либо бычьим сывороточным альбумином (BSA; Sigma, Madrid, Spain; группа В), и адъювантом Abisco-300 (AB; Isconova AB, Uppsala Science Park, SE-751 83 Uppsala, SWEDEN).

Для конъюгирования пептидов, содержащих N-концевой цистеин, с "Голубым носителем" и альбумином с помощью SPDP используют тот же способ, что в Примере 1 (см. раздел 2.1 Материалы и способы).

В данном изобретении используют следующие два различных препарата:

(A) 400 мкг синтетического пептида, конъюгированного с Голубым носителем, с добавлением 200 мкл Abisco-300.

(B) 400 мкг синтетического пептида, конъюгированного с BSA, с добавлением 37 мкл Abisco-300.

Используемые синтетические пептиды представляют собой:

При конъюгировании с SPDP:

ABcys-(33-40) (NHa-CGLMVGGW-COOH) (SEQ ID NO:19) у кроликов (см. ниже).

3. Протокол иммунизации и взятие проб крови

Животных делят на 2 группы и определяют для одного из двух вакцинных препаратов (cм. выше (А) и (В)). Животных иммунизируют подкожно в спину и мониторируют побочные реакции. Схема иммунизации и взятия проб представлена на Фигуре 2 (В). Вкратце, животным делают инъекцию один раз в две недели семь раз.

Пробы крови собирают из яремной вены в полипропиленовые флаконы с ЭДТА и ингибиторами протеазы (полный мининабор мг/10 мл, Roche) непосредственно перед первой иммунизацией (W0 (неделя 0)) и через неделю после этого (W1), на неделе 5 (W5), на неделе 7 (W7), на неделе 9 (W9), на неделе 11 (W11 и на неделе 13 (W13) после первой иммунизации (см. Фигуру 2 (В)).

Пробы осторожно перемешивают и хранят при 4°C максимум в течение 2 часов перед центрифугированием при 4000 g в течение 10 минут. Затем берут аликвоты плазмы и замораживают при -80°C до использования. Кроме того, при каждой экстракции ~1 мл крови каждого животного собирают в не содержащий ЭДТА полипропиленовый флакон для получения сыворотки. Данной пробе дают образовать сгусток в течение одного часа при комнатной температуре, затем центрифугируют при 4000 g в течение 10 минут и собирают сыворотку и хранят при -80°C до проведения анализа на биохимические характеристики крови.

Образцы спинно-мозговой жидкости (CSF) собирают под общей анестезией в асептических условиях за неделю до первой (W0) и на неделе 13 (W13) после седьмой иммунизации (см. Фигуру 2 (В)). Берут аликвоты данных проб CSF и замораживают при -80°C до использования.

4. Анализы антител к Аβ в плазме и CSF

Антитела к Аβ определяют посредством прямого ELISA в 96-луночных полипропиленовых планшетах. Лунки для микротитрования покрывают 2,5 мкг/мл человеческого пептида W-40) (# 24224 AnaSpec. San Jose, CA, USA) в 100 мМ бикарбонате натрия и 2М буфере на основе гуанидина гидрохлорида (рН 9,6) при 4°С в течение ночи. Затем планшеты трижды промывают 300 мкл буфера для промывания (0,5 М Трис, 1,5 М хлорид натрия, 0,5% Твин 20, рН 8), блокируют 300 мкл блокирующего буфера (0,05 М Трис, 0,2% Твин 20, 0,5% BSA; рН 8) в течение двух часов при 37°С и снова промывают еще три раза. Планшеты с покрытием инкубируют в течение одного часа при 37°С со 100 мкл трехкратных серийных разведении образцов собачьей плазмы в буфере-носителе (0,05 М Трис, 0,5 М хлорид натрия, 0,05% BSA, 0,05% Твин 20; рН 8) в ряду из 10 лунок, начиная с разведения плазмы 1:30 в первой лунке. Самое большое из оцениваемых разведении плазмы составляет 1/10х3¹⁰. Одиннадцатую и двенадцатую колонки в каждом планшете заполняют буфером-носителем без плазмы в качестве пустых контролей. Затем планшеты промывают и инкубируют в течение одного часа при 37°С со 100 мкл разведения 1:1000 в буфере-носителе пероксидазы хрена, конъюгированной с кроличьим IgG к собаке (Jackson InmunoResearch. Suffolk, UK), трижды промывают и инкубируют с 0,0375% ABTS (Roche, Barcelona, Spain) в буфере для ABTS (Roche. Barcelona, Spain). Поглощение при длине волны 405 нм читают на автоматизированном ридере для планшетов (Synergy 4, Biotek. Winooski, Vermont, USA).

Концентрации антитела к Aβ в плазме рассчитывают, используя моноклональное антитело 6Е10 в качестве стандарта на тех же планшетах для ELISA, и выражают в мкг/мл. Значение ЕС50 для каждого образца плазмы определяют путем нелинейной регрессии поглощения относительно логарифма разведений в каждой лунке (GraphPad Prism 3.02). Кроме того, конечный титр в плазме определяют как максимальное разведение плазмы, при котором поглощение в три раза превышает среднее поглощение пустых лунок.

Определение свободных пептидов Аβ в плазме

Уровни Аβ(1-42) и Аβ(1-40) в плазме и CSF собак измеряют с использованием непрямого сэндвичевого ELISA с использованием наборов для ELISA ABtest-40 и ABtest-42 фирмы Araclon Biotech (Zaragoza, Spain), следуя инструкциям изготовителя.

II. Результаты

Животные остаются здоровыми и активными на протяжении всего периода эксперимента. В частности, не выявляют никаких признаков реакции на вакцины.

1. Титры антител к Аβ(1-40)

Лечение собак вакцинным препаратом В более эффективно, демонстрируя существенные модификации титров антител к Аβ40 в их плазме. Ответ всех собак в данной группе, как измерено по концентрации антитела к Аβ40, и EC₅₀ или конечное разведение, соответствуют одному и тому же типу, хотя количественные различия наблюдают как между, так и внутри групп (см. Таблицу 6, Панели А-В). Основной тип у собак, леченных препаратом В, характеризуется существенным повышением титров после двух иммунизаций (W5), которые сохраняются только с небольшими отклонениями от W5 до W9 (см. Фигуру 6А). Таким образом, титры антител существенно повышаются после двух иммунизаций, но не повышаются или даже немного снижаются после последующих инъекций вакцины, в частности, после седьмой иммунизации (W13) титры немного падают до уровней, более низких, чем значения W5 (см. Таблицу 6 и Фигуру 6А) в группе В.

Таблица 6. Титры специфических антител к Аβ40 в плазме в различных точках Панель А: Эквивалент количеству нг/мкл антитела к Аβ40 Группа/Собака W0 W5 W9 W13 А1 0,3483 0,4705 0,7251 0,8830 А2 0,4196 0,5876 0,6284 0,4501 A3 0,5214 0,4450 0,5214 0,4603 В1 0,3585 10,1860 11,6729 8,0932 В2 0,7913 7,1359 9,9314 6,0361 В3 1,6111 2,2272 2,2629 2,5175 Панель В: значения ЕС50 плазмы для специфического антитела (к Аβ40) А1 49,47 26,92 38,54 31,01 А2 НО НО НО 14,97 A3 25,2 29,84 24,14 46,67 В1 31,44 1328 1593 831,1 В2 66,85 906,8 1031 571,9 В3 42,15 150,9 154 129,1 НО: не определяется

2. Титры пептида Aβ

У собак, леченных вакцинным препаратом В, показывают существенные модификации концентраций Аβ(1-42) в плазме. Данные изменения соответствуют типу, характеризующемуся существенным снижением уровня пептида Аβ(1-42) на неделе W5, после двух иммунизаций, до точки, когда пептид становится неопределяемым (<3,125 пг/мл; см. Таблицу 7А).

Концентрация пептида остается неопределяемой до недели W13. Однако у собак, леченных вакцинным препаратом А, не показывают никаких модификаций в концентрациях Aβ(1-42) в плазме. Концентрация пептида Aβ(1-40) в плазме, по-видимому, соответствует типу изменений, очень близкому Aβ(1-42) (см. таблицу 7 В).

После сравнения уровней CSF до иммунизации (W0) и на неделе W13 с помощью ELISA показано, что уровни пептида Аβ(1-40) и Aβ(1-42) снижаются у животных из обеих групп (А и В) после лечения вакциной. Неожиданно оказывается, что уровни даже ниже у собак из группы А, чем у собак из группы В, хотя собаки из группы А не показывают иммуногенный ответ.

Таблица 7А. Концентрация пептида Aβ(1-42) в пг/мл Группа/Собака W0 W1 W5 W7 W9 W11 W13 CSF CSF А1 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 13,28 12,00 13,60 464,35 441,77 А2 10,64 11,49 13,19 10,08 15,17 12,62 15,17 349,84 160,32 A3 17,15 14,60 14,04 14,60 15,17 18,85 15,74 345,00 196,61 В1 17,43 23,81 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 403,06 237,74 В2 30,19 18,38 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 263,55 195,81 В3 <3,125 12,34 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 261,13 200,65

Таблица 7В. Концентрация пептида Аβ(1-40) в пг/мл Группа/Собака W0 W1 W5 W7 W9 W11 W13 CSF W0 CSF W13 А1 47,89 47,70 49,95 49,01 50,14 52,01 54,64 2576,97 2053,48 А2 48,56 47,36 40,16 40,76 42,36 45,56 48,36 2734,55 1414,09 A3 37,76 44,96 40,36 45,36 50,76 42,76 49,16 2616,36 1393,64 В1 59,33 51,08 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 2752,73 2363,33 В2 67,20 52,20 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 1665,61 1042,88 В3 46,36 44,56 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 1831,52 1676,97

Пример 3: Эффект иммунизации в головном мозге

I. Материалы и способы

Для изучения эффекта иммунизации в головном мозге проводят острый эксперимент, к котором животных умерщвляют после трех иммунизаций следующими препаратами:

(1) Aβ Х-42+BSA+адъювант Тh2-типа (Регидрагель).

(2) Aβ Х-42+BSA+адъювант смешанного Тh1/Тh2-типа (Abisco).

(3) Контроль: альбумин+адъювант Тh2-типа.

Образцы лобной, энторинальной, височной и мозжечковой областей головного мозга гомогенизируют в TBS, рН 7,4, содержащем ингибитор коктейля протеаз, с последующим центрифугированием при 175000 g в течение 30 минут при 4°С, используя прибор Beckman MLA-55. Полученный в результате супернатант считают растворимой фракцией каждого из них. Затем снова гомогенизируют осадок в TBS-TX рН 7,4, содержащем ингибитор коктейля протеаз, и центрифугируют в тех же условиях, что ранее. Снова полученный в результате осадок повторно гомогенизируют в TBS-гуанидинхлориде и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре при вращающейся мешалке с последующим центрифугированием при 13000 g в течение 1 часа 30 минут при 4°С, используя прибор Beckman MLA-55. Осадок отбрасывают и полученный в результате супернатант ресуспендируют в TBS-гуанидинхлориде и считают нерастворимой фракцией. Затем концентрацию пептидов количественно определяют с помощью ELISA.

II. Результаты

Иммунизация Aβ Х-42, конъюгированным с BSA, дает в результате сильный эффект в отношении растворимой формы пептидов при снижении концентрации больше чем на 50% в каждой леченой группе относительно контрольной группы. Концентрация нерастворимой формы в существенной степени не снижается (см. Фигуру 7). Касательно различных областей головного мозга, снижение аналогично во всех областях для растворимой формы пептидов Аβ40 и Аβ42 при незначительных различиях (см. Фигуру 8).

Как показано в Примерах 2 и 3, различия в концентрации пептида в CSF отсутствуют по сравнению с исходным уровнем и точкой времени после лечения.

Результаты, полученные в данном изобретении, согласуются с расширенным представлением о том, что иммунизация Аβ должна быть более эффективной, если ее проводят до того, как началась агрегация Аβ.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к применению конъюгата иммуногенного пептида, и может быть использовано в медицине. Указанный конъюгат, содержащий 1÷93 иммуногенных пептидов Аβ(35-42) (SEQ ID NO: 2), или 1÷93 иммуногенных пептидов Аβ(33-42) (SEQ ID NO: 3), или 1÷93 иммуногенных пептидов Аβ(33-40) (SEQ ID NO: 4), соединенных с нативным альбумином посредством линкерного участка, содержащего цистеин и бифункциональный линкер, при условии, что линкерный участок присоединен цистеином к N-концу не более чем одного иммуногенного пептида, может быть использован для применения в лечении или предупреждении заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков. Изобретение также относится к применению фармацевтической композиции, содержащей указанный конъюгат, для лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков. Изобретение позволяет эффективно снижать уровни амилоидного пептида при использовании простой в получении структуры конъюгата иммуногенного пептида. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 табл., 3 пр.

1. Применение конъюгата, содержащего 1÷93 иммуногенных пептидов Аβ(35-42) (SEQ ID NO: 2), или 1÷93 иммуногенных пептидов Аβ(33-42) (SEQ ID NO: 3), или 1÷93 иммуногенных пептидов Аβ(33-40) (SEQ ID NO: 4), а также нативный альбумин, при этом пептиды связаны с альбумином линкерным участком, содержащим цистеин и бифункциональный линкер, причем линкерный участок присоединен цистеином к N-концу не более чем одного иммуногенного пептида, для лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков.

2. Применение по п.1, в котором заболевание, ассоциированное с отложением амилоидного белка, выбрано из группы заболеваний, включающей болезнь Альцгеймера, Крейтцфельда-Якоба, церебральную амилоидную ангиопатию и нарушения, связанные с прионовыми белками.

3. Применение по п.1, в котором нативный альбумин представляет собой бычий сывороточный альбумин.

4. Применение по п.1, в котором конъюгат вводят один раз в две недели.

5. Применение композиции, содержащей эффективное количество конъюгата, состоящего из 1÷93 иммуногенных пептидов Aβ(35-42) (SEQ ID NO: 2), или из 1÷93 иммуногенных пептидов Аβ(33-42) (SEQ ID NO: 3), или из 1÷93 иммуногенных пептидов Аβ(33-40) (SEQ ID NO: 4), а также нативного альбумина, при этом пептиды связаны с альбумином линкерным участком, содержащим цистеин и бифункциональный линкер, причем линкерный участок присоединен цистеином к N-концу не более чем одного иммуногенного пептида, и адъювант, для лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с отложением амилоидных белков.

6. Применение по п.5, в котором адъювант является адъювантом, выбранным из группы, включающей адъювант типа Th1, адъювант типа Th2 и смешанный адъювант типа Th1/Th2.

7. Применение по п.5, в котором заболевание, ассоциированное с отложением амилоидного белка, выбрано из группы заболеваний, включающей болезнь Альцгеймера, Крейтцфельда-Якоба, церебральную амилоидную ангиопатию и нарушения, связанные с прионовыми белками.

8. Применение по п.5, в котором нативный альбумин представляет собой бычий сывороточный альбумин.

9. Применение по п.5, в котором композицию вводят один раз в две недели.