СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕГРАЛЬНОЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТОВ МЕМБРАНОАТАКУЮЩЕГО КОМПЛЕКСА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 C12Q1/18 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний.

Традиционный способ определения функциональной активности комплемента человека в сыворотке крови основан на его способности лизировать клетки-мишени, каковыми являются эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к поверхностным антигенам. Для определения функциональной активности отдельных компонентов такой гемолиз проводят с образцами сыворотки в количествах, недостаточных для осуществления самостоятельного лизиса, но в присутствии реагента RX (где X - тестируемый компонент), характеризующийся отсутствием тестируемого компонента, но избыточным содержанием остальных компонентов, необходимых для осуществления лизиса. Размер фиксируемого гемолиза в этом случае определяется количеством функционально активного тестируемого компонента, находящегося в образце сыворотки, взятой в количествах, недостаточных для осуществления самостоятельного лизиса [1]. Для определения функциональной активности компонента С5 известно использование реагента R5 [1], представляющего собой сыворотку крови человека после активации в ней альтернативного пути с помощью зимозана или клеточных стенок пекарских дрожжей. Было показано, что в таком реагенте сохраняются активными компоненты С1, С2, С4, пониженная, но достаточная активность компонента С3, но полностью отсутствует активность компонента С5. Однако позже было показано [3], что при активации зимозаном в сыворотке крови происходит потребление всех компонентов мембраноатакующего комплекса с образованием неактивного растворимого комплекса SC5b-9, в связи с чем можно полагать, что определение гемолитической активности компонента С5 с использованием такого реагента R5 на самом деле характеризует наличие интегральной активности компонентов С5, С6, С7, С8, С9 и результирующая активность характеризует тот из компонентов мембраноатакующего комплекса, активность которого минимальна.

Недостатком гемолитического метода является необходимость наличия сенсибилизированных эритроцитов барана, что сопряжено с необходимостью содержания животного или приобретения свежей бараньей крови.

Преодолеть эти недостатки можно, используя другую мишень для тестирования активности комплемента. Из литературы известно [4], что комплемент морской свинки способен обездвиживать инфузории Tetrahymena pyriformis и при этом не требуется дополнительной сенсибилизации микроорганизма антителами. В работе, однако, не было изучено, какой из наблюдаемых эффектов: набухание микроорганизма, обездвиживание или дальнейший лизис мог бы послужить в дальнейшем критерием для определения активности комплемента. Кроме того, не было известно, можно ли такой подход использовать для определения активности отдельных компонентов комплемента. Получение необходимых для осуществления способа клеток Tetrahymena pyriformis существенно удобнее и дешевле, чем получение или приобретение сенсибилизированных эритроцитов барана.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа определения интегральной функциональной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента человека с использованием доступной мишени для действия активного комплемента, не требующей дополнительной сенсибилизации антителами.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения функциональной активности мембраноатакующего комплекса комплемента человека по измерению его воздействия в присутствии реагента R5 на инфузории Tetrahymena pyriformis, с использованием прибора для биологических исследований БиоЛаТ-3 [5]. Было обнаружено, что при действии комплемента на инфузории через определенный промежуток времени, зависящий от количества активного комплемента, начинается процесс обездвиживания инфузорий, протекающий со скоростью, также зависящей от количества активного комплемента. Скорость перехода подвижных инфузорий в неподвижные может быть использована для расчета количества функционально активного комплемента.

Способ определения предусматривает внесение в измерительные ячейки прибора суспензии инфузорий в буферном растворе, добавление в ячейки сыворотки крови в необходимом количестве, как источника компонентов мембраноатакующего комплекса С5-9, и реагента R5, как источника остальных, кроме С5-9, компонентов комплемента, и автоматический циклический подсчет оставшихся подвижными клеток во времени.

Метод расчета основан на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Величина константы скорости падения числа живых клеток, зависящая от количества активного компонента комплемента из числа компонентов мембраноатакующего комплекса, сравнивается с активностью мембраноатакующего комплекса комплемента в пуле не менее 10 сывороток здоровых людей, что выбирается в качестве стандарта. Тем самым достигается определение функциональной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения интегральной функциональной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента человека с использованием доступной мишени для действия комплемента, каковой являются инфузории Tetrahymena pyriformis.

Пример 1. Определение интегральной функциональной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента человека компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента человека. В измерительные ячейки прибора БиоЛаТ-3 вносят 200 мкл суспензии приблизительно 800 клеток инфузории Tetrahymena pyriformis в вероналовом буферном растворе, pH 7,4, содержащем 0,075 М NaCl, 0,075 мМ Са²⁺ и 0,25 мМ Mg²⁺, и 100 мкл того же буфера, содержащего от 4 до 20 мкл испытуемой пробы и от 5 до 20 мкл реагента R5, представляющего собой пул сывороток крови не менее 10 здоровых людей, после активации альтернативного пути с помощью зимозана или денатурированных клеток пекарских дрожжей. С помощью прибора БиоЛаТ-3 и совмещенного с ним компьютера определяют число живых клеток в ячейках каждую минуту. На основании динамики падения числа живых клеток во времени рассчитывают константу скорости реакции первого порядка, определяя тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Калибровочную кривую получают, измеряя падение числа живых клеток во времени для пула сывороток, выбранного в качестве стандарта (рис.1). На рис.1 представлен калибровочный график зависимости константы скорости обездвиживания инфузорий от количества активного компонента мембраноатакующего комплекса. (R²=0.99).Содержание активного компонента мембраноатакующего комплекса (условно С5) в стандартной сыворотке принято за 80 мкг/мл, что соответствует среднему содержанию каждого из компонентов С1-С9.

Литература

1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, С3, С4 и С5. Биоорган., химия. 1982. Т.8. С.652-659.

2. Козлов Л.В., Шибанова Е.Д., Зинченко А.А. Образование классической С3-конвертазы в ходе активации альтернативного пути комплемента человека. Биохимия. 1987. Т.52. №4. С.660-666.

3. Wang W., Okamoto К., Rounds J., Chambers E., Jacobs D.O. In vitro complement activation favoring soluble C5b-9 complex formation alters myocellular sodium homeostasis. Surgery. 2001. V.129. №2. P.209-219.

4. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology. 1958. V.1. P.291-299.

5. Черемных Е.Г., Покатаев A.C., Гридунова B.H. Прибор для биологических исследований. Патент РФ 2361913, опубл. 20.07.09 Бюл. №20.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения интегральной функциональной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента человека по его действию на инфузории. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis, реагент R5 и испытуемый образец, содержащий компоненты мембраноатакующего комплекса с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей компонентов мембраноатакующего комплекса в этих образцах. Изобретение обеспечивает эффективный способ расчета активности комплемента, пригодный при диагностике ряда заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

1. Способ определения интегральной функциональной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента человека по его действию на клетки-мишени в присутствии реагента R5, представляющего собой пул сывороток крови не менее 10 здоровых людей после активации альтернативного пути с помощью зимозана или денатурированных клеток пекарских дрожжей и являющегося сывороткой крови человека, избирательно лишенной активности компонентов С5-С9, отличающийся тем, что в качестве клеток-мишеней выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим компоненты мембраноатакующего комплекса, и реагентом R5 вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей компонентов мембраноатакующего комплекса в этих образцах.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рассчитывают тангенс угла наклона зависимости логарифма числа живых клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток, который равен константе скорости процесса и прямо пропорционален интегральной активности компонентов мембраноатакующего комплекса комплемента, и сравнивают с константой скорости процесса для стандартного образца, представляющего собой пул сывороток от 10 доноров крови.