СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАКТОРА D КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 C12Q1/18 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний. Активация комплемента может происходить по трем путям: классическим, альтернативным и лектиновым. Первые компоненты и факторы, участвующие в запуске соответствующего пути активации - разные, а мембраноатакующий концевой комплекс для всех путей один и тот же. Различаются также и условия среды: для запуска классического и лектинового пути требуются ионы кальция и магния. А для альтернативного пути - только магния. Главными отличительными факторами запуска активации по альтернативному пути являются факторы B и D. Эти факторы в других путях комплемента не участвуют.

Традиционный способ определения функциональной активности компонентов комплемента человека классического пути активации основан на способности комплемента лизировать в присутствии ионов кальция и магния клетки-мишени, каковыми являются эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к поверхностным антигенам эритроцитов. Для определения функциональной активности отдельных факторов альтернативного пути комплемента в тестируемом образце исследуют гемолиз эритроцитов кролика в присутствии ионов магния в бескальциевой среде, а также в присутствии реагента RX (где X - тестируемый фактор: B или D), характеризующийся отсутствием тестируемого фактора, но избыточным содержанием остальных компонентов, необходимых для осуществления лизиса. Размер фиксируемого гемолиза в этом случае определяется количеством функционально активного тестируемого фактора, находящегося в образце [1]. Для определения функциональной активности фактора D в качестве реагента RD используется пул не менее 10 сывороток здоровых доноров, лишенный фактора D с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента в результате хроматографической сорбции фактора D на колонке с CM-сефадексом С-50 [1].

Недостатком гемолитического метода является необходимость наличия свежих эритроцитов кролика, что сопряжено с необходимостью содержания животного, а также зачастую индивидуального подбора подходящего животного-донора.

Преодолеть эти недостатки можно, используя другую мишень для тестирования активности комплемента. Из литературы известно [2], что комплемент морской свинки способен обездвиживать инфузории Tetrahymena pyriformis. В работе, однако, не было изучено, какой из наблюдаемых эффектов: набухание микроорганизма, обездвиживание или дальнейший лизис мог бы послужить в дальнейшем критерием для определения активности комплемента, а также какой из путей активации комплемента участвует в этом процессе. Кроме того, не было известно, можно ли такой подход использовать для определения активности отдельных факторов альтернативного пути активации комплемента. Получение необходимых для осуществления способа клеток Tetrahymena pyriformis существенно удобнее и дешевле, чем получение или приобретение эритроцитов кролика.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности фактора D комплемента человека с использованием доступной мишени для действия активного комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения функциональной активности фактора D комплемента человека по измерению его воздействия в присутствии реагента RD на инфузории Tetrahymena pyriformis, с использованием прибора для биологических исследований БиоЛаТ-3 [3]. Было обнаружено, что при действии комплемента на инфузории в бескальциевой среде, специфичной для альтернативного пути, через определенный промежуток времени, зависящий от количества активного комплемента, начинается процесс обездвиживания инфузорий, протекающий со скоростью, также зависящей от количества активного комплемента. Скорость перехода подвижных инфузорий в неподвижные может быть использована для расчета количества функционально активного комплемента.

Способ определения предусматривает внесение в измерительные ячейки прибора суспензии инфузорий в буферном растворе, добавление в ячейки сыворотки крови в необходимом количестве, как источника фактора D, и реагента RD, как источника остальных, кроме фактора D, компонентов комплемента, и автоматический циклический подсчет оставшихся подвижными клеток во времени.

Метод расчета основан на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Величина константы скорости падения числа живых клеток, зависящая от количества активного фактора D комплемента, сравнивается с активностью фактора D комплемента в пуле не менее 10 сывороток здоровых людей, что выбирается в качестве стандарта. Тем самым достигается определение функциональной активности фактора D комплемента методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности фактора D комплемента человека с использованием доступной мишени для действия комплемента, каковой являются инфузории Tetrahymena pyriformis.

Пример 1. Определение функциональной активности фактора D комплемента человека. В измерительные ячейки прибора БиоЛаТ-3 вносят 200 мкл суспензии приблизительно 800 клеток инфузории Tetrahymena pyriformis в вероналовом буферном растворе, pH 7,4, содержащим 0,05 М NaCl, 0,83 мМ Mg²⁺ и 3,3 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N' - тетрауксусную кислоту (ЭГТА), и 100 мкл того же буфера, содержащего от 1 до 6 мкл испытуемой пробы и от 5 до 15 мкл реагента RD, представляющего собой пул не менее 10 сывороток здоровых доноров, лишенный фактора D с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента в результате хроматографической сорбции фактора D на колонке с CM-сефадексом С-50 [1]. С помощью прибора БиоЛаТ-3 и совмещенного с ним компьютера определяют число живых клеток в ячейках каждую минуту. На основании динамики падения числа живых клеток во времени рассчитывают константу скорости реакции первого порядка, определяя тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Калибровочную кривую получают, измеряя падение числа живых клеток во времени для пула сывороток, выбранного в качестве стандарта (рис.1). На рис.1, представлен калибровочный график зависимости константы скорости обездвиживания инфузорий от количества активного фактора D (R²=0.99).

Содержание активного фактора D в стандартной сыворотке принято за 2 мкг/мл [4].

Литература

1. Козлов Л.В., Соляков Л.С. Возможность участия зимогенных форм факторов B и D в активации альтернативного пути системы комплемента. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. №3. С.342-348.

2. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology. 1958. V.1. P.291-299.

3. Черемных Е.Г., Покатаев A.C., Гридунова B.H. Прибор для биологических исследований. Патент РФ 2361913 опубл. 20.07.09. Бюл. №20.

4. Miyata Т., Oda О., Inagi R., Sugiyama S., Miyama A., Maeda K., Nakashima I., Yamanaka N. Molecular and functional identification and purification of complement component factor D from urine of patients with chronic renal failure. Mol. Immunol. 1990. V.27. №7. P.637-644.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии и предназначено для определения функциональной активности фактора D комплемента человека по его действию на инфузории в бескальциевой среде, содержащей ионы магния. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis, реагент RD, представляющий собой пул не менее 10 сывороток здоровых доноров, лишенный фактора D с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента в результате хроматографической сорбции фактора D на колонке с CM-сефадексом C-50, и испытуемый образец, содержащий определяемый фактор D, с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей фактора D комплемента в этих образцах. Изобретение обеспечивает эффективный способ расчета функциональной активности комплемента, пригодный при диагностике ряда заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

1. Способ определения функциональной активности фактора D комплемента человека по его действию на клетки-мишени в бескальциевой среде, содержащей ионы магния, в присутствии реагента RD, представляющего собой пул не менее 10 сывороток здоровых доноров, лишенный фактора D с сохранением активностей остальных компонентов и факторов комплемента в результате хроматографической сорбции фактора D на колонке с CM-сефадексом C-50, отличающийся тем, что в качестве клеток-мишеней выбраны инфузории Tetrahymena pyriformis, суспензию которых вместе с испытуемым образцом, содержащим определяемый фактор D, и реагентом RD вносят в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемого образца и контрольного, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей фактора D комплемента в этих образцах.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что рассчитывают тангенс угла наклона зависимости логарифма числа живых клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток, который равен константе скорости процесса и прямо пропорционален активности фактора D комплемента, и сравнивают с константой скорости процесса для стандартного образца, представляющего собой пул сывороток от 10 доноров крови.