СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА, ЛАБОРАТОРНЫХ, ДОМАШНИХ, СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, ПТИЦ И ЗЕМНОВОДНЫХ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови организма при диагностике ряда заболеваний.

Традиционный способ определения функциональной активности комплемента человека и морской свинки основан на его способности лизировать клетки-мишени, каковыми являются эритроциты барана, сенсибилизированные кроличьими антителами к поверхностным антигенам. При этом мерой активности комплемента является разбавление сыворотки, при котором лизис эритроцитов достигает 50% после инкубации в течение 30 мин. Недостатком этого способа является то обстоятельство, что он ограниченно применим для других видов животных. Во-первых, нельзя использовать эритроциты барана для определения активности комплемента мелкого рогатого скота. Для определения комплемента коз оказались пригодными эритроциты человека и кроличьи антитела [1]. Трудности возникают также с антителами к антигенам эритроцитов. Так, для определения комплемента мыши наиболее предпочтительной мишенью оказались эритроциты кролика, сенсибилизированные козьими антителами против них [2]. Та же мишень оказалась пригодной для определения активности комплемента верблюда [3] и молозива буйволицы [4]. Таким образом, для определения функциональной активности комплемента по гемолизу отсутствует единая мишень для всех видов животных. Кроме того, в большинстве случаев необходима дополнительная сенсибилизация эритроцитов антителами.

Другим недостатком гемолитического метода является то, что комплемент в крови больных в фазе острого воспаления способен приводить к реактивному гемолизу [5], что завышает результаты определения активности комплемента.

Преодолеть эти недостатки можно, используя другую мишень для тестирования активности комплемента. Из литературы известно [6], что комплемент морской свинки способен обездвиживать инфузории Tetmhymena pyriformis и при этом не требуется дополнительной сенсибилизации микроорганизма антителами. В работе, однако, не было изучено, какой из наблюдаемых эффектов: набухание микроорганизма, обездвиживание или дальнейший лизис мог бы послужить в дальнейшем критерием для определения активности комплемента. Кроме того, вопрос об использовании инфузорий в качестве мишени для определения функциональной активности комплемента не ставился. Действие комплемента человека или других животных на инфузории не исследовалось.

Описание фигур.

Рис.1. Изменение количества живых клеток во времени при с добавлением разных количеств сыворотки крови: 1-50 мкл, 2-40 мкл, 3-30 мкл.

Рис.2. Калибровочный график зависимости времени половинного обездвиживания инфузорий от количества сыворотки, принятой за стандарт.

Рис.3. Калибровочный график зависимости константы скорости обездвиживания инфузорий от количества сыворотки, принятой за стандарт.

Задачей заявленного изобретения является разработка универсального способа и метода расчета для определения функциональной активности комплемента человека, лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных и птиц с использованием доступной и пригодной для всех видов животных мишени для действия активного комплемента, не требующей дополнительной сенсибилизации антителами и не подверженной реактивному лизису.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и метода расчета функциональной активности комплемента человека, животных и птиц по измерению его воздействия на инфузории Tetrahymena pyriformis, с использованием прибора для биологических исследований Био-ЛаТ-3 [7]. Было обнаружено, что при действии комплемента на инфузории через определенный промежуток времени, зависящий от количества активного комплемента, начинается процесс обездвиживания инфузорий, протекающий со скоростью, также зависящей от количества активного комплемента (рис.1). Обе измеряемые величины: время инкубации, необходимое для достижения обездвиживания половины микроорганизмов, а также скорость перехода подвижных инфузорий в неподвижные могут быть использованы для расчета количества функционально активного комплемента.

Способ определения предусматривает внесение в измерительные ячейки прибора суспензии инфузорий в буферном растворе, добавление в ячейки сыворотки крови в необходимом количестве, как источника комплемента, и автоматический циклический подсчет оставшихся подвижными клеток во времени.

Методы расчета основаны либо на определении времени инкубации инфузорий с комплементом, необходимого для гибели половины инфузорий, либо на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Обе величины, зависящие от количества активного комплемента, могут быть сравнены с активностью комплемента в пуле не менее 10 сывороток человека, что выбирается в качестве стандарта. Тем самым достигается определение функциональной активности комплемента методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка универсального способа и метода расчета для определения функциональной активности комплемента человека, лабораторных, домашних и сельскохозяйственных животных и птиц, нечувствительного к реактивному лизису и обладающего отсутствием необходимости сенсибилизации мишени антителами.

Пример 1. Определение функциональной активности комплемента человека. В измерительные ячейки прибора БиоЛаТ-3 вносят 200 мкл суспензии приблизительно 800 клеток инфузории Tetrahymena pyriformis в вероналовом буферном растворе, рН 7,4, содержащим 0,075 М NaCl, 0,075 мМ Ca²⁺ и 0,25 мМ Mg²⁺, и 100 мкл того же буфера, содержащего от 2 до 50 мкл испытуемой сыворотки. Определяется число живых клеток в ячейках каждую минуту. Динамика изменения числа живых клеток во времени для измеряемой активности комплемента сравнивается с аналогичной динамикой, полученной для контрольного образца, представляющего пул 10 сывороток здоровых доноров. Для совпадающих динамиках опытного и контрольного образцов полагают равенство активности комплемента и рассчитывают соотношения объемов взятых опытной и контрольной сывороток.

Пример 2. Аналогично примеру 2 только для расчета функциональной активности комплемента измеряют время наступления обездвижения половины клеток для разных количеств контрольной сыворотки и строят калибровочный график зависимости времени от количества контрольной сыворотки (рис.2). По времени половинного обездвижения клеток, полученному для сыворотки в опыте, по калибровочному графику находят, какому количеству контрольной сыворотки соответствует активность сыворотки в опыте. Соотношение объемов сывороток обратно пропорционально соотношению активностей в опыте и контроле.

Пример 3. Аналогично примеру 2 только для расчета функциональной активности комплемента определяют тангенс угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток в качестве константы скорости процесса для взятого количества сыворотки. Калибровочный график представляет собой зависимость констант скоростей от количества сыворотки, принятой за стандарт (рис.2). На основании константы скорости в опыте по графику определяют, какому количеству стандартной сыворотки соответствует активность комплемента в сыворотке в эксперименте.

Пример 4. Аналогично примеру 3, только в качестве исследуемой сыворотки используют сыворотку крови сельскохозяйственных, домашних, лабораторных животных, птиц или земноводных. Табл.1.

Таблица 1 Активность комплемента сельскохозяйственных, домашних, лабораторных животных, птиц или земноводных, в %% относительно активности комплемента сыворотки человека Название животного Общая активность комплемента, % Человек 100 Бык 200 Свинья 100 Овца 100 Коза 100 Собака 100 Кошка 50 Мышь 20 Кролик 20 Крыса 350 Морская свинка 100 Курица 30 Лягушка 400

Литература

1. Moreno-Indias I., Dodds A.W., Argüello A., Castro N., Sim R.B. The complement system of the goat: Haemolytic assays and isolation of major proteins. B.M.C. Vet. Res. 2012. V.8. №1. P.91.

2. Van Dijk H., Rademaker P.M., Willers J.M. Estimation of classical pathway of mouse complement activity by use of sensitized rabbit erythrocytes. J. Immunol. Methods. 1980. V.39. №3. P.257-268.

3. Olaho-Mukani W., Nyang'ao J.N., Kimani J.K., Omuse J.K. Studies on the haemolytic complement of the dromedary camel (Camelus dromedarius). I. Classical pathway haemolytic activity in serum. Vet. Immunol. Immunopathol. 1995. V.46. №3-4. P.337-347.

4. Matheswaran K., Dhinakar Raj G., Nachimuthu K. Demonstration of alternative and classical complement pathway activity in colostrum from buffalo (Bubalus bubalis). Vet. Res. Commun. 2003. V.27. №6. P.445-552.

5. Thompson R.A., Rowe D.S. Reactive haemolysis - a distinctive form of red cell lysis. Immunology. 1968. V.14. №5. P.745-762.

6. Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology. 1958. V.1. P.291-299.

7. Черемных Е.Г., Покатаев А.С., Гридунова В.Н. Прибор для биологических исследований. - Патент РФ 2361913, опубл. 20.07.09. Бюл. №20.

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной иммунологии и предназначено для определения функциональной активности комплемента по его действию на инфузории. В измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis и испытуемую сыворотку крови с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемой сыворотки и контрольной, представляющей пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей сывороточного комплемента в этих сыворотках. Предлагаемое изобретение обеспечивает универсальный способ расчета определения функциональной активности комплемента с использованием пригодной для всех видов животных мишени для действия активного комплемента, не требующей дополнительной сенсибилизации антителами и не подверженной реактивному лизису. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Способ определения функциональной активности комплемента по его действию на инфузории, отличающийся тем, что в измерительные ячейки прибора для автоматизированного подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis и испытуемую сыворотку крови с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту, при этом совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемой сыворотки и контрольной, представляющей пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей сывороточного комплемента в этих сыворотках.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения динамики изменения числа живых клеток во времени измеряют время инкубации инфузорий с испытуемой сывороткой, необходимое для гибели половины клеток, которое обратно пропорционально активности комплемента, и сравнивают со временем половинной гибели клеток для стандартной сыворотки, представляющей собой пул сывороток от 10 доноров крови.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения динамики изменения числа живых клеток во времени рассчитывают тангенс угла наклона зависимости логарифма числа живых клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток, который является константой скорости процесса и прямо пропорционален активности комплемента, и сравнивают с константой скорости процесса для стандартной сыворотки, представляющей собой пул сывороток от 10 доноров крови.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве испытуемой сыворотки используется сыворотка крови человека, сельскохозяйственных, домашних, лабораторных животных, птиц или земноводных.