СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОРОШКА ВЫСУШЕННЫХ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ Российский патент 2015 года по МПК A61K35/56 A61K9/14 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу получения сухого порошка дождевых червей, в частности способу получения сухого порошка дождевых червей, посредством которого может быть получен сухой порошок дождевых червей, содержащий высокий титр ферментов, с устранением токсических веществ, содержащихся в теле дождевых червей.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Экстракты дождевых червей и сухие порошки дождевых червей использовали с древних времен главным образом в восточных странах в качестве профилактических средств и терапевтических средств для лечения различных заболеваний, и примеры их применения до настоящего времени включают применение в качестве средств, уменьшающих камни мочевого пузыря, и средств, обеспечивающих экскрецию камней мочевого пузыря, средств для лечения желтухи, средств, стимулирующих родовую деятельность, тонизирующих средств, средств, улучшающих рост волос, афродизиаков, жаропонижающих средств, средств для лечения судорог, усилителей циркуляции крови, средств для лечения гемиплегии, непрямых анальгетиков, диуретиков, средств для лечения бронхиальной астмы и средств для лечения гипертензии.

Однако дождевые черви, которых держат и откармливают в культивационных подложках, содержат токсические элементы, такие как ртуть, кадмий, свинец и мышьяк, и патогенные микроорганизмы, даже если дождевым червям дают тщательно отобранные корма. Если такие токсические вещества поглощаются дождевыми червями и накапливаются в их телах во время культивации, прием терапевтического средства, полученного из живых дождевых червей, может нежелательно повлиять на человеческий организм.

Следовательно, когда средство для перорального применения получают с использованием живых тел дождевых червей в качестве сырого материала, такие токсические вещества необходимо устранять, и для этого было предложено множество методов. Примеры методов, предложенных таким образом, включают методы, где живых дождевых червей погружают в водный раствор щелочной соли, такой как натриевая соль или калиевая соль, чтобы вызвать экскрецию масс в пищеварительном тракте, с последующим влажным измельчением дождевых червей и вакуумной лиофилизацией полученной суспензии для получения сухого порошка дождевых червей, применимого в качестве средства для лечения сахарного диабета, антигиперлипидемического средства или средства для регуляции артериального давления (см. Патентные документы 1-4); и метод, где живых дождевых червей оставляют стоять в водном растворе кислоты, хранящемся при 6-26°С в течение 0,1-5 часов для удаления отходов из пищеварительного тракта, с последующим измельчением дождевых червей, дегазацией полученного измельченного продукта и затем вакуумной сушкой дегазированного продукта при пошаговом повышении температуры для получения терапевтического средства для пациентов, страдающих от тромбоза (см. патентный документ 5).

Кроме того, был предложен метод, где с целью удаления или снижения содержания тяжелых металлов и веществ, подавляющих фибринолитическую активность и предшественников фактора активации тромбоцитов, порошок сухих дождевых червей получают в водном растворе и из него удаляют густые компоненты для получения водного раствора дождевых червей, имеющего мутность не более чем 1,5 в отношении поглощения при длине волны 700 нм (см. патентный документ 6).

ДОКУМЕНТЫ СВЯЗАННОЙ ОБЛАСТИ ТЕХНИКИ

Патентные документы:

Патентный документ 1: публикация Японской нерассмотренной патентной заявки № Н1-47718

Патентный документ 2: публикация Японской нерассмотренной патентной заявки № Н1-47719

Патентный документ 3: публикация Японской нерассмотренной патентной заявки № Н1-47720

Патентный документ 4: публикация Японской нерассмотренной патентной заявки № Н1-268639

Патентный документ 5: публикация Японской нерассмотренной патентной заявки № Н3-72427

Патентный документ 6: публикация Японской нерассмотренной патентной заявки № 2006-96673

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, РЕШЕМЫЕ С ПОМОЩЬЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Однако погружение живых дождевых червей в свежую воду, водный раствор щелочной соли или водный раствор кислоты в течение длительного времени может вызывать физическое истощение дождевых червей, приводя к денатурации белков, содержащихся в живом теле, и снижению ферментативного действия, способствуя ухудшению фармакологических эффектов полученного порошка дождевых червей. Кроме того, если дождевой червь умирает в присутствии воды, тело дождевого червя быстро растворяется из-за действия фибринолитических ферментов, существующих в дождевом черве, и гниет. Следовательно, обработку в водном растворе необходимо проводить быстро, что проблематично.

Следовательно, настоящее изобретение имеет целью предоставить способ для получения сухого порошка дождевых червей, посредством которого можно получить сухой порошок дождевых червей, содержащий высокий титр ферментов, с устранением токсических веществ, содержащихся в теле дождевого червя.

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования для решения вышеуказанных проблем и обнаружили, что вышеуказанные проблемы могут быть решены путем контакта живого дождевого червя с хлоридом(ами) металла(ов) с последующим контактом живого дождевого червя с гидроксикарбоновой кислотой(ами), таким образом, осуществляя настоящее изобретение.

СРЕДСТВА ДЛЯ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ

Таким образом способ по настоящему изобретению для получения сухого порошка дождевых червей включает:

контакт живых дождевых червей с хлоридом(ами) по меньшей мере одного металла, выбираемого из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; и

последующий контакт живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислот(ы) и разведение полученной смеси водой с доведением рН от 2 до 5 с последующим оставлением живого дождевого червя стоять в течение от 3 до 180 минут, промывка живых дождевых червей водой, измельчение промытых дождевых червей и лиофилизация полученного измельченного продукта.

Кроме того, способ по настоящему изобретению для получения сухого порошка дождевых червей включает:

контакт живых дождевых червей с хлоридом(ами) металла(ов), выбранными из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция;

последующее погружение живых дождевых червей в водный раствор гидроксикарбоновой кислот(ы), рН которого установлена на уровне 2-5 с последующим оставлением живых дождевых червей стоять в течение 3-180 минут, промывка живых дождевых червей водой, измельчение живых дождевых червей и лиофилизация полученного измельченного продукта.

Предпочтительно в способе по настоящему изобретению для получения сухого порошка дождевых червей живых дождевых червей оставляют стоять в светлом месте в течение 10-50 часов и затем отшелушивают грязь, прилипшую к поверхности тела, перед контактом с хлоридом(ами) металла(ов).

Кроме того, в способе по настоящему изобретению для получения сухого порошка дождевых червей лиофилизацию предпочтительно проводили путем замораживания измельченного продукта при -18°С - -35°С в течение 20-240 часов и затем лиофилизации полученного продукта в вакууме.

Кроме того, в способе по настоящему изобретению для получения сухого порошка дождевых червей хлоридом металла предпочтительно является хлорид натрия.

Кроме того, в способе по настоящему изобретению для получения сухого порошка дождевых червей гидроксикарбоновая кислота(ы) представляет собой по меньшей мере одну, выбираемую из группы, состоящей из уксусной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, молочной кислоты, малоновой кислоты и янтарной кислоты.

ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Посредством настоящего изобретения возможно обеспечить способ для получения сухого порошка дождевых червей, при помощи которого может быть получен сухой порошок дождевых червей, содержащий высокий титр ферментов, с устранением токсических веществ, содержащихся в теле дождевого червя.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В способе по настоящему изобретению для получения сухого порошка дождевых червей, живые дождевые черви контактируют с хлоридом(ами) по меньшей мере одного металла, выбираемого из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция, после чего происходит

контакт живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислот(ы), разведение полученной смеси водой для доведения рН от 2 до 5 и оставление живых червей стоять в течение от 3 до 180 минут; или

погружение живых дождевых червей в водный раствор гидроксикарбоновой кислот(ы), рН которого доведена до 2-5, и оставление живых дождевых червей стоять от 3 до 180 минут;

таких дождевых червей затем промывают водой и измельчают, с последующей лиофилизацией полученного измельченного продукта.

Посредством контакта живых дождевых червей с заранее определенным хлоридом(ами) металла и затем с гидроксикарбоновой кислотой(ами) перед обработкой дождевых червей образуется окружение, неблагоприятное для дождевого червя, и в результате чего дождевые черви экскретируют пищу из пищеварительного тракта для адаптации к окружающей среде и в то же самое время экскретируются токсические вещества, такие как ртуть, кадмий и свинец, содержащиеся в теле.

Известны способы, где окружение, неблагоприятное для дождевых червей, создается для того, чтобы дождевой червь изверг фекалии и подобные массы, содержащие токсические вещества в организме дождевого червя, с последующим измельчением дождевого червя. Настоящее изобретение было осуществлено на основании открытия, что комбинация специфических методов, среди вышеуказанных методов, для получения неблагоприятного окружения, и проведение таких методов в определенном порядке, позволяет получить сухой порошок дождевых червей, имеющий превосходную ферментативную активность. То есть важно, чтобы хлорид(ы) металла (осмотический стресс) и гидроксикарбоновую кислоту(ы) (рН стресс) применяли в таком порядке.

Хотя для дождевых червей не был разработан молекулярный биологический анализ и, следовательно, подробные механизмы не полностью ясны, известно, что осмотический стресс активирует транскрипцию различных генов стрессового ответа, таких как гены белков теплового шока, в исследованиях на других моделях организмов, таких как дрожжи, нематоды и растения. Следовательно, одной причиной, почему может быть получен эффект настоящего изобретения, может быть, например, тот факт, что гены HSP и подобные сначала активируются осмотическим стрессом и впоследствии дождевых червей дополнительно подвергают другому стрессу, рН стрессу, который вызывает последующую активацию путей экспрессии генов стрессового ответа, приводя к заметному увеличению продуцируемых количеств применимых ферментов.

В способе по настоящему изобретению используют живых дождевых червей, т.е. дождевых червей, которые живы. Живые дождевые черви не ограничены и их примеры включают Lumbricus rubellus, Lumbricus terrestris, Eisenia foetida, Allobophora caliginosa, Dendrobaena octaedra, Allobophora japonica Michaelsen, Drawida hattamimizu Hatai, Pheretima divergens Michaelsen, Pheretina communissima, Pheretima agrestis, Pheretima sieboldi Horst, Pheretima hilgendorfi, Pontodrilus matsushimensis Iizuka, Tubifex hattai Nomura и Limnodrilus gotoi Hatai (=L. Socialis Stephenson).

В способе по настоящему изобретению до контакта живых дождевых червей с хлоридом(ами) металлов живых дождевых червей предпочтительно помещают в плоский контейнер, такой как контейнер для хлеба, и оставляют стоять в светлом месте в течение 10-50 часов с последующим удалением загрязнений, прилипших к поверхности тел. Продолжительность времени, в течение которого дождевых червей оставляют стоять в светлом месте, составляет более предпочтительно от 12 до 24 часов. Количество дождевых червей предпочтительно представляет собой количество, при котором дождевые черви группируются до толщины около 30-60 мм, предпочтительно от около 40 до 50 мм. Такой плоский контейнер делают свободным от инородных веществ, таких как песок и ил, и внутри контейнера предпочтительно поддерживают свет ночью путем световой обработки или подобного, так как дождевые черви являются ночными и в темном месте проявляется их дневная активность, приводя к физическому истощению. Посредством такой процедуры дождевые черви проявляют инстинкт самозащиты и экскретируют пищеварительные отходы, остающиеся в пищеварительном тракте, которыми покрывают все тело для предотвращения испарения воды и посредством этого поддерживая их жизненное окружение. Следовательно, путем повторного снятия такой покровной грязи, то есть экскрементов, путем соответствующего способа, отходы пищеварительного тракта и грязь, прилипшая в поверхности тела, могут быть окончательно удалены.

Грязь, прилипшая к поверхности тела дождевых червей, может быть отшелушена посредством, например, покрытия живых дождевых червей нетканым изделием для возможности адсорбции к нему грязи. Путем комбинации такого оставления дождевых червей стоять в светлом месте с последующим удалением грязи, прилипшей к поверхности тела, и контакта дождевых червей с хлоридом(ами) металлов и гидроксикарбоновой кислотой(ами), можно дополнительно ожидать экскрецию и удаление токсичных веществ из организма дождевых червей.

Хлоридом(ами) металлов, применимыми в настоящем изобретении, является(ются) хлорид(ы) по меньшей мере одного металла, выбираемого из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция. То есть хлоридом(ами) металла является(ются) по меньшей мере один, выбираемый из группы, состоящей из хлорида калия, хлорида натрия, хлорида магния и хлорида кальция. Кроме того, хлоридом(ами) металла может быть или их смесь, или смесь таковых и других безвредных компонентов, которые могут быть добавлены к пище. Примеры такой смеси включают пищевую соль, горную соль и морскую соль. Вышеописанные хлорид(ы) металлов могут быть использованы путем распыления их порошка на живых дождевых червей, что вызывает контакт хлорида(ов) металлов с дождевыми червями.

После контакта хлорида(ов) металлов с живыми дождевыми червями, живых дождевых червей приводят в контакт с гидроксикарбоновой кислотой(ами). Контакт с гидроксикарбоновой кислотой(ами) также может быть осуществлен посредством распыления порошка гидроксикарбоновой кислот(ы) на живых дождевых червей. Контакт с гидроксикарбоновой кислотой(ами) проводили непосредственно после контакта с вышеописанным хлоридом(ами) металлов. Кроме того, перед контактом живых дождевых червей с гидроксикарбоновой кислотой(ами), дождевых червей предпочтительно промывали водой. Удаление хлорида(ов) металлов путем промывания водой с последующим контактом живых дождевых червей с гидроксикарбоновой кислотой(ами) позволяет продукцию порошка сухих дождевых червей, обладающего высокой ферментативной активностью. В случаях, когда дождевых червей промывали водой перед контактом с гидроксикарбоновой кислотой(ами), промывку дождевых червей водой осуществляли предпочтительно в течение 30 минут, более предпочтительно в течение 20 минут после начала контакта с хлоридом(ами) металлов. Способ промывки водой не ограничен и могут быть использованы известные способы.

Если живых дождевых червей держат в контакте с порошком гидроксикарбоновой кислот(ы) в течение длительного времени, их жизненные функции теряются и переваренные отходы в пищеварительном тракте не экскретируются. Следовательно, гидроксикарбоновую кислоту(ы) необходимо разводить водой насколько возможно быстро, предпочтительно в течение 30 секунд, более предпочтительно в течение 20 секунд для получения рН от 2 до 5.

Так как гидроксикарбоновая кислота(ы) образует(ют) окружение, некомфортное для дождевых червей, живые дождевые черви пытаются улучшить свое окружение путем экскреции жидкостей организма и экскрементов вследствие инстинкта самозащиты. Кроме того, так как гидроксикарбоновые кислоты обладают бактерицидными свойствами, ожидают, что они играют роль не только в обеспечении экскреции пищеварительных отходов и подобного, остающегося в пищеварительном тракте, как описано выше, но также в уничтожении бактерий, находящихся на дождевых червях.

Кристаллическая гидроксикарбоновая кислота, применимая в способе по настоящему изобретению, не ограничена количеством гидроксигрупп и карбоксильных групп, пока она находится в форме кристаллических тел в условиях эксплуатации. То есть кристаллической гидроксикарбоновой кислотой может быть любая из моногидроксимонокарбоновой кислоты, моногидроксиполикарбоновой кислоты, полигидроксимонокарбоновой кислоты и полигидроксиполикарбоновой кислоты.

Примеры гидроксикарбоновой кислот(ы), применимой в настоящем изобретении, включают гликолевую кислоту, молочную кислоту, уксусную кислоту, β-гидроксипропионовую кислоту, α-гидрокси-н-масляную кислоту, β-гидрокси-н-масляную кислоту, α-гидрокси-н-валериановую кислоту, β-гидрокси-н-валериановую кислоту, яблочную кислоту, α-метил-яблочную кислоту, α-гидроксиглютаровую кислоту, β-гидроксиглютаровую кислоту, лимонную кислоту, малоновую кислоту и янтарную кислоту. Среди них молочная кислота, уксусная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, малоновая кислота и янтарная кислота являются предпочтительными в свете того факта, что они могут быть использованы в пищу и легко получены. Один тип гидроксикарбоновой кислоты может быть использован отдельно или может быть использована смесь 2 или более их типов.

Вода составляет до 65% всех компонентов тканей живого дождевого червя. Хотя защитные функции живого дождевого червя являются эффективными в течение определенной продолжительности времени, смерть живого дождевого червя запускает действие ферментов, так что продолжительность времени, в течение которого живого дождевого червя помещают в неблагоприятное окружение, необходимо тщательно контролировать. Продолжительность времени варьируется в зависимости от условий и обычно находится в диапазоне от 3 до 180 минут.

В настоящем изобретении живых дождевых червей, обработанных гидроксикарбоновой кислотой(ами), промывали водой и затем измельчали в измельченный продукт в форме жидкости или пасты. Промывку предпочтительно проводили чистой водой. Способ промывки не ограничен и может быть использован известный метод для промывки водой. Кроме того, общая продолжительность времени стадий до измельчения, то есть общая продолжительность времени стадий от распыления хлорида(ов) металла на живых дождевых червей до окончательной промывки гидроксикарбоновой кислот(ы) водой составляет предпочтительно не более чем 240 минут.

Способ вышеописанного измельчения не ограничен и, например, измельчение проводят с использованием гомогенизатора, блендера, гомомиксера, гриндера, французского пресса или подобного, обычно при 1-25°С. В свете подавления деградации составляющих компонентов дождевых червей измельчение предпочтительно проводят при низкой температуре, предпочтительно при температуре от 2 до 15°С.

Измельченный продукт, полученный при измельчении дождевых червей, помещают в кювету из нержавеющей стали и подвергают лиофилизации. Хотя ферменты, содержащиеся в живом теле дождевого червя, не действуют на живые клетки, они незамедлительно действуют на мертвые клетки. Следовательно, в вышеуказанном процессе существует риск образования септических газов. С целью предотвращения образования септических газов, измельченный продукт предпочтительно для подавления действия ферментов моментально подвергают замораживанию посредством быстрого охлаждения до -18°С - -35°С, с последующей лиофилизацией.

Следовательно, пульверизация дождевых червей без потери фармакологического действия нуждается в быстром замораживании, но, с другой стороны, слишком быстрое замораживание не является предпочтительным, так как в случаях, когда дождевых червей замораживают слишком быстро, примеси, существующие вместе с белками, которые являются основными компонентами пасты из дождевых червей, могут образовывать незамороженные участки и не могут быть отделены. Следовательно, замораживание проводят при низкой температуре -18°С - -35°С в течение предпочтительно 20-240 часов, более предпочтительно 50-170 часов.

Для лиофилизации важно выбрать условия, в которых примеси могут быть удалены без остатка вместе с водой. Следовательно, лиофилизацию предпочтительно проводят под контролем давления не более чем 50 Па при температуре от -60°С до +90°С при увеличении температуры пошагово в течение 10-60 часов.

Примеры метода лиофилизации включают метод, когда измельченный продукт замораживают, как описано выше при температуре -18°С - -35°С в течение 20-240 часов, и затем температуру повышают в несколько стадий в диапазоне от -60°С до +90°С, и давление снижают в несколько стадий в диапазоне 25-40 Па, при этом лиофилизируя продукт в вакууме в течение 10-60 часов, таким образом получая стерильный бледно-желтый сухой порошок дождевых червей.

Полученный таким образом сухой порошок дождевых червей содержит в 100 г порошка 70-120 мг аргинина, 110-150 мг лизина, 35-60 мг гистидина, 55-80 мг фенилаланина, 50-75 мг тирозина, 100-150 мг лейцина, 60-90 мг изолейцина, 25-40 мг метионина, 70-105 мг валина, 85-135 мг аланина, 75-105 мг глицина, 60-85 мг пролина, 210-300 мг глютаминовой кислоты, 80-110 мг серина, 75-110 мг треонина, 150-220 мг аспарагиновой кислоты, 15-30 мг триптофана и 20-35 мг цистина, хотя их содержание варьируется в зависимости от типа дождевых червей и места и времени сбора дождевых червей.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение далее будет описано более подробно. Настоящее изобретение не ограничено примерами, представленными ниже.

Получение сухого порошка дождевых червей

(Пример 1)

30 кг живых Lumbricus rubellus оставляли стоять в течение 24 часов в светлом месте, и грязь, прилипшую к поверхности тел, отшелушивали, с последующим распределением дождевых червей по плоской чашке с толщиной около 5 см и однородным распылением на них 250 г хлорида натрия. Через 20 минут дождевых червей промывали водой.

Впоследствии 250 г лимонной кислоты распыляли на дождевых червей подобным образом и через 15 секунд после этого полученное разводили путем добавления 30 литров чистой воды. В этот момент рН непосредственно после добавления воды составил 2,25 и рН после полного разведения составил 2,74.

Когда распыляли порошок лимонной кислоты, дождевые черви сразу высвобождали желтую биологическую жидкость. После разведения водой дождевых червей оставляли стоять в таком состоянии в течение 20 минут.

Впоследствии живых дождевых червей удаляли из грязного водного раствора лимонной кислоты и промывали водой с последующим измельчением с использованием гомогенизатора при 10°С для получения пасты дождевых червей. После этого, полученную пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления газов, содержащихся в ней, и переносили в кювету из нержавеющей стали, с последующим моментальным и быстрым охлаждением до -35°С, при такой температуре пасту дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для возможности медленного замораживания.

Замороженную пасту дождевых червей выдерживали при -35°С при давлении 0 Па в течение 2 часов и затем температуру повышали до 25°С с последующей лиофилизацией в вакууме при 40 Па в течение 10 часов; при 40°С при давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°С при давлении 35 Па в течение 12 часов; и , наконец, при температуре 80°С при давлении 25 Па в течение 6 часов. Посредством такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок дождевых червей, имеющий содержание влаги 8 масс.%.

Сравнительный пример 1

30 кг живых Lumbricus rubellus оставляли стоять в течение 24 часов в светлом месте, и грязь, прилипшую к поверхности тел, отшелушивали, с последующим распределением дождевых червей по плоской чашке с толщиной около 5 см и добавлением 30 литров воды на них. После этого дождевых червей оставляли стоять в таком состоянии в течении 20 минут.

Впоследствии живых дождевых червей удаляли из воды и промывали водой с последующим измельчением с использованием гомогенизатора при 10°С для получения пасты дождевых червей. После этого полученную пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления газов, содержащихся в ней, и переносили в кювету из нержавеющей стали с последующим моментальным и быстрым охлаждением до -35°С, при такой температуре пасту дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для возможности медленного замораживания.

Замороженную пасту дождевых червей поддерживали при -35°С при давлении 0 Па в течение 2 часов и затем температуру повышали до 25°С с последующей лиофилизацией в вакууме при 40 Па в течение 10 часов; при 40°С при давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°С при давлении 35 Па в течение 12 часов; и , наконец, при температуре 80°С при давлении 25 Па в течение 6 часов. Посредством такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок дождевых червей, имеющий содержание влаги 8 масс.%.

Сравнительный пример 2

30 кг живых Lumbricus rubellus оставляли стоять в течение 24 часов в светлом месте, и грязь, прилипшую к поверхности тел, отшелушивали с последующим распределением дождевых червей по плоской чашке с толщиной около 5 см и распылением на них 250 г лимонной кислоты. Через 15 секунд после этого к полученному для разведения добавляли 30 литров чистой воды.

Когда распыляли порошок лимонной кислоты, дождевые черви сразу же высвобождали желтую биологическую жидкость. После разведения водой дождевых червей оставляли стоять в таком состоянии в течении 20 минут.

Впоследствии живых дождевых червей удаляли из грязного водного раствора лимонной кислоты и промывали водой с последующим измельчением с использованием гомогенизатора при 10°С для получения пасты дождевых червей. После этого полученную пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления газов, содержащихся в ней, и переносили в кювету из нержавеющей стали с последующим моментальным и быстрым охлаждением до -35°С, при такой температуре пасту дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для возможности медленного замораживания.

Замороженную пасту дождевых червей поддерживали при -35°С при давлении 0 Па в течение 2 часов и затем температуру повышали до 25°С с последующей лиофилизацией в вакууме при 40 Па в течение 10 часов; при 40°С при давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°С при давлении 35 Па в течение 12 часов; и , наконец, при температуре 80°С при давлении 25 Па в течение 6 часов. Посредством такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок дождевых червей, имеющий содержание влаги 8 масс.%.

Сравнительный пример 3

30 кг живых Lumbricus rubellus оставляли стоять в течение 24 часов в светлом месте, и грязь, прилипшую к поверхности тел, отшелушивали с последующим распределением дождевых червей по плоской чашке с толщиной около 5 см и распылением на них 250 г лимонной кислоты. После этого к полученному для разведения добавляли 30 литров чистой воды. Когда распыляли порошок лимонной кислоты, дождевые черви сразу же высвобождали желтую биологическую жидкость. После разведения водой дождевых червей оставляли стоять в таком состоянии в течение 20 минут. Впоследствии живых дождевых червей удаляли из грязного водного раствора лимонной кислоты и промывали водой с последующим распылением 250 г хлорида натрия и оставляли стоять в таком состоянии в течение 20 минут.

Впоследствии живых дождевых червей промывали водой и измельчали с использованием гомогенизатора при 10°С для получения пасты дождевых червей. После этого полученную пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления газов, содержащихся в ней, и переносили в кювету из нержавеющей стали, с последующим моментальным и быстрым охлаждением до -35°С, при такой температуре пасту дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для возможности медленного замораживания.

Замороженную пасту дождевых червей поддерживали при -35°С при давлении 0 Па в течение 2 часов и затем температуру повышали до 25°С с последующей лиофилизацией в вакууме при 40 Па в течение 10 часов; при 40°С при давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°С при давлении 35 Па в течение 12 часов; и , наконец, при температуре 80°С при давлении 25 Па в течение 6 часов. Посредством такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок дождевых червей, имеющий содержание влаги 8 масс.%.

Сравнительный пример 4

30 кг живых Lumbricus rubellus оставляли стоять в течение 24 часов в светлом месте и грязь, прилипшую к поверхности тел, отшелушивали с последующим распределением дождевых червей по плоской чашке с толщиной около 5 см, смешивали 250 г лимонной кислоты с 250 г хлорида натрия и однородно распыляли полученную смесь на дождевых червей. Через 15 секунд после этого к полученному для разведения добавляли 30 литров чистой воды.

Когда распыляли порошок лимонной кислоты и хлорид натрия, дождевые черви сразу же высвобождали желтую биологическую жидкость. После разведения водой дождевых червей оставляли стоять в таком состоянии в течении 20 минут.

Впоследствии живых дождевых червей удаляли из грязного водного раствора лимонной кислоты и промывали водой с последующим измельчением с использованием гомогенизатора при 10°С для получения пасты дождевых червей. После этого полученную пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления газов, содержащихся в ней, и переносили в кювету из нержавеющей стали с последующим моментальным и быстрым охлаждением до -35°С, при такой температуре пасту дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для возможности медленного замораживания.

Замороженную пасту дождевых червей поддерживали при -35°С при давлении 0 Па в течение 2 часов и затем температуру повышали до 25°С с последующей лиофилизацией в вакууме при 40 Па в течение 10 часов; при 40°С при давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°С при давлении 35 Па в течение 12 часов; и , наконец, при температуре 80°С при давлении 25 Па в течение 6 часов. Посредством такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок дождевых червей, имеющий содержание влаги 8 масс.%.

Титрование сухого порошка дождевых червей

Получение образца для измерения

К 1 г каждого сухого порошка дождевых червей, полученного как описано выше, добавляли 20 мл физиологического солевого раствора, полученную смесь встряхивали при 1500 об/мин в течение 1 часа. Затем смесь центрифугировали при 10000×g при 4°С в течение 15 минут и полученную надосадочную жидкость использовали в качестве образца для измерения.

Способ количественной оценки белка

В плане количественной оценки белка расчет проводили в соответствии с методом Бредфорда (M. Bradford, Anal. Biochem., 72-248-254, 1976).

Образец для измерения массы белка получали для вышеуказанного образца для измерения с использованием набора для исследования белка (Bio-Rad Laboratories, Inc.,) и измеряли поглощение при 595 нм. С использованием калибровочной кривой, полученной отдельно с использованием альбумина бычьей сыворотки (Bovine, Sigma-Aldrich Co.), измеряемое значение преобразовывали в массу белка.

Таблица 1   Пример 1 Сравнительный
пример 1 Сравнительный
пример 2 Сравнительный
пример 3 Сравнительный
пример 4 1-е измерение 1,9 12,6 6,2 6,1 3,2 2-е измерение 2,0 11,1 6,1 5,6 2,9 3-е измерение 1,1 11,8 5,8 5,9 3,2 Среднее 1,7 11,8 6,0 5,9 3,1

Метод деградации субстрата синтетического амида

В соответствии со способом, описанным в непатентном документе (Sumi, H., Okamoto T. And Ishii, Y., Titration method for lumbrokinase (Eathworm enzyme) - Fibrinolytic and synthetic amidolytic activities - Clinical Pharmacology and Therapy, 20: 347-351, 2010), измеряли деградационную активность субстрата синтетического амида.

Субстрат синтетического амида получали путем растворения pyroGlu-Gly-Arg-pNA (BIOPHEN CS-61(44), COSMO BIO Co., Ltd), который является синтетическим субстратом для урокиназы, в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 5×10^-3М.

К 0,1 мл образца для измерения, полученного как описано выше, добавляли 0,8 мл боратного солевого буфера (BSB), и полученный раствор инкубировали в течение 2 минут с последующим добавлением 0,1 мл субстрата синтетического амида к раствору и давали возможность реакции прогрессировать при 37°С в течение 5 минут. Впоследствии измеряли поглощение при 405 нм и количество высвобожденной pNA рассчитывали на основании максимального наклона (исходной скорости) в минуту с коэффициентом абсорбции 10,79 мМ^-1·см^-1. Полученные результаты показаны в таблице 2 ниже.

Более того активность деградации субстрата синтетического амида делили на общее количество белка для получения специфической активности, которая показана в таблице 3 ниже.

Таблица 2   Пример 1 Сравнительный
пример 1 Сравнительный
пример 2 Сравнительный
пример 3 Сравнительный
пример 4 1-е измерение 59,2 56,3 72,8 54,9 59,9 2-е измерение 59,5 53,6 79,2 56,0 60,5 3-е измерение 59,5 54,2 77,7 55,6 61,7 4-е измерение 63,0 56,5 82,5 65,8 66,0 5-е измерение 62,1 54,7 80,6 65,8 65,5 6-е измерение 64,9 53,8 79,7 63,0 66,3 Среднее 61,4 54,9 78,8 60,2 63,3

Таблица 3   Активность деградации синтетического амида (нмоль/мл/мин) Количество белка
(мг/мл) Специфическая активность (нмоль/мл/мин/мг) Пример 1 61,4 1,7 36,1 Сравнительный пример 1 54,9 11,8 4,7 Сравнительный пример 2 78,8 6,0 13,1 Сравнительный пример 3 60,2 5,9 10,2 Сравнительный пример 4 63,3 3,1 20,4

Метод фибринового планшета

В соответствии со способом, описанным в непатентном документе (T. Astrup & S. Mullertz, The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity, Arch. Biochem. Biophys., 40: 346-351, 1952), получали фибриновый планшет, и сравнение активности растворения проводили посредством метода фибринового планшета.

Фибриноген (Bovine Fraction I-S, Sigma-Aldrich Co.) растворяли в боратном солевом буфере (рН 7,8, BSB) до конечной концентрации 0,5%. К 10 мл полученного раствора добавляли 0,5 мл тромбина (для клинического применения, Fuji Pharma Co., Ltd) для получения фибринового планшета.

Измерение площади растворения проводили путем помещения 30 мкл каждого образца для измерения на планшет и измерения площади растворенной зоны, которая появлялась после 4 часов инкубации при 37°С. Кроме того, получали калибровочную кривую для трипсина (Bovine, Sigma-Aldrich Co.), который является протеазой, и конверсию единиц проводили для определения специфической активности на основании количества белка в каждом образце для измерения. Результаты показаны в таблице 4 ниже.

Таблица 4   Растворенная площадь (мм²) Активность в единицах трипсина (ЕД/мл) Количество белка
(мг/мл) Специфическая активность (ЕД/мг) Пример 1 223,3 287,2 1,7 168,9 Сравнительный пример 1 211,3 256,5 11,8 21,7 Сравнительный пример 2 272,5 462,8 6,0 77,1 Сравнительный пример 3 259,7 414,2 5,9 70,2 Сравнительный пример 4 171,6 156,0 3,1 50,3

С помощью способа по настоящему изобретению может быть получен сухой порошок дождевых червей высокого качества, из которого удалены токсические вещества. Кроме того, как очевидно из примера 1, сухой порошок дождевых червей, полученный методом получения по настоящему изобретению, содержит высокий титр ферментов.

С другой стороны, как очевидно из сравнительных примеров 1 и 2, ферментативная активность в случае, когда проводили обработку только лимонной кислотой, была всего в 2-4 раза выше, чем таковая в случае, когда обработку проводили водой. Кроме того, как очевидно из результатов сравнительных примеров 2 и 3, в случае, когда сначала проводили обработку лимонной кислотой и затем проводили обработку хлоридом металла, ферментативная активность была практически такой же, как в случае, когда проводили обработку только лимонной кислотой.

Пример 2

30 кг живых Lumbricus rubellus оставляли стоять в течение 24 часов в светлом месте и грязь, прилипшую к поверхности тел, отшелушивали с последующим распределением дождевых червей по плоской чашке с толщиной около 5 см и распылением на них 250 г хлорида магния однородно. Через 20 минут, дождевых червей промывали водой.

Впоследствии 250 г молочной кислоты распыляли на дождевых червей подобным образом и полученное разводили через 15 секунд после этого путем добавления 30 литров чистой воды. Когда распыляли порошок молочной кислоты, дождевые черви сразу же высвобождали желтую биологическую жидкость. После разведения водой дождевых червей оставляли стоять в таком состоянии в течение 20 минут.

Впоследствии живых дождевых червей удаляли из грязного водного раствора молочной кислоты и промывали водой с последующим измельчением с использованием гомогенизатора при 10°С для получения пасты дождевых червей. После этого полученную пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления газов, содержащихся в ней, и переносили в кювету из нержавеющей стали с последующим моментальным и быстрым охлаждением до -35°С, при такой температуре пасту дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для возможности медленного замораживания.

Замороженную пасту дождевых червей выдерживали при -35°С при давлении 0 Па в течение 2 часов и затем температуру повышали до 25°С с последующей лиофилизацией в вакууме при 40 Па в течение 10 часов; при 40°С при давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°С при давлении 35 Па в течение 12 часов; и , наконец, при температуре 80°С при давлении 25 Па в течение 6 часов. Посредством такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок дождевых червей, имеющий содержание влаги 8 масс.%.

Сравнительный пример 5

30 кг живых Lumbricus rubellus оставляли стоять в течение 24 часов в светлом месте и грязь, прилипшую к поверхности тел, отшелушивали с последующим распределением дождевых червей по плоской чашке с толщиной около 5 см, распылением на них 250 мл молочной кислоты таким же образом и разведением полученного через 15 секунд после этого путем добавления 30 литров чистой воды. Когда распыляли молочную кислоту, дождевые черви сразу же высвобождали желтую биологическую жидкость. После разведения водой дождевых червей оставляли стоять в таком состоянии в течение 20 минут.

Впоследствии живых дождевых червей удаляли и промывали водой с последующим распылением на них 250 г хлорида магния однородно, и оставляли дождевых червей стоять в таком состоянии в течение 20 минут.

Впоследствии живых дождевых червей удаляли и промывали водой с последующим измельчением с использованием гомогенизатора при 10°С для получения пасты дождевых червей. После этого полученную пасту из дождевых червей дегазировали путем аспирации для удаления газов, содержащихся в ней, и переносили в кювету из нержавеющей стали, с последующим моментальным и быстрым охлаждением до -35°С, при такой температуре пасту дождевых червей выдерживали в течение 50 часов для возможности медленного замораживания.

Замороженную пасту дождевых червей поддерживали при -35°С при давлении 0 Па в течение 2 часов и затем температуру повышали до 25°С с последующей лиофилизацией в вакууме при 40 Па в течение 10 часов; при 40°С при давлении 35 Па в течение 14 часов; при 65°С при давлении 35 Па в течение 12 часов; и , наконец, при температуре 80°С при давлении 25 Па в течение 6 часов. Посредством такой обработки получали бледно-желтый сухой порошок дождевых червей, имеющий содержание влаги 8 масс.%.

Титрование сухого порошка дождевых червей

Получение образца для измерения

К 1 г каждого из сухих порошков дождевых червей, полученных как описано выше в примере 2 и сравнительном примере 5, добавляли 20 мл физиологического раствора, и полученную смесь встряхивали при 1500 об/мин в течение 1 часа. Затем смесь центрифугировали при 10-000×g при 4°С в течение 15 минут и полученную надосадочную жидкость использовали в качестве образца для измерения.

Способ количественной оценки белка

В отношении количественной оценки белка, расчет проводили в соответствии с методом Бредфорда (M. Bradford, Anal. Biochem., 72: 248-254, 1976).

Образец для измерения массы белка получали для вышеуказанного образца для измерения с использованием набора для анализа белка (Bio-Rad Laboratories, Inc.) и измеряли поглощение при 595 нм. С использованием калибровочной кривой, полученной отдельно с использованием альбумина бычьей сыворотки (Bovine, Sigma-Aldrich Co.,) измеряемое значение преобразовывали в массу белка.

Таблица 5   Пример 2 Сравнительный пример 5 1-е измерение 6,6 7,1 2-е измерение 7,0 7,8 3-е измерение 7,0 7,0 Среднее 6,9 7,3

Метод деградации субстрата синтетического амида

В соответствии со способом, описанным в непатентном документе (Sumi, H., Okamoto T. And Ishii, Y., Titration method for lumbrokinase (Eathworm enzyme) - Fibrinolytic and synthetic amidolytic activities - Clinical Pharmacology and Therapy, 20: 347-351, 2010), измеряли деградационную активность субстрата синтетического амида.

Субстрат синтетического амида получали путем растворения pyroGlu-Gly-Arg-pNA (BIOPHEN CS-61(44), COSMO BIO Co., Ltd), который является синтетическим субстратом для урокиназы, в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 5×10^-3М.

К 0,1 мл образца для измерения, полученного как описано выше, добавляли 0,8 мл боратного солевого буфера (BSB) и полученный раствор инкубировали в течение 2 минут с последующим добавлением к раствору 0,1 мл субстрата синтетического амида и позволяли реакции прогрессировать при 37°С в течение 5 минут. Впоследствии измеряли поглощение при 405 нм, и количество высвобожденной pNA рассчитывали на основании максимального наклона (исходной скорости) в минуту с коэффициентом абсорбции 10,79 мМ^-1·см^-1. Полученные результаты показаны в таблице 6 ниже.

Более того, активность деградации субстрата синтетического амида делили на общее количество белка для получения специфической активности, которая показана в таблице 7 ниже.

Таблица 6   Пример 2 Сравнительный пример 5 1-е измерение 71,1 41,5 2-е измерение 73,7 41,4 3-е измерение 72,0 42,3 4-е измерение 73,6 44,4 5-е измерение 73,7 43,8 6-е измерение 70,6 41,6 Среднее 72,5 42,5

Таблица 7   Активность деградации синтетического амида (нмоль/мл/мин) Количество белка (мг/мл) Специфическая активность (нмоль/мл/мин/мг) Пример 2 72,5 6,9 10,5 Сравнительный пример 5 42,5 7,3 5,8

Метод фибринового планшета

В соответствии со способом, описанным в непатентном документе (T. Astrup & S. Mullertz, The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity, Arch. Biochem. Biophys., 40: 346-351, 1952), получали фибриновый планшет, и проводили сравнение активности растворения посредством метода фибринового планшета.

Фибриноген (Bovine Fraction I-S, Sigma-Aldrich Co.) растворяли в боратном солевом буфере (рН 7,8, BSB) до конечной концентрации 0,5%. К 10 мл полученного раствора добавляли 0,5 мл тромбина (для клинического применения, Fuji Pharma Co., Ltd) для получения фибринового планшета.

Измерение площади растворения проводили путем помещения 30 мкл каждого образца для измерения на планшет и измерения площади растворенной зоны, которая появлялась после 4 часов инкубации при 37°С. Кроме того, получали калибровочную кривую для трипсина (Bovine, Sigma-Aldrich Co.), который является протеазой, и проводили конверсию единиц для определения специфической активности на основании количества белка в каждом образце для измерения. Результаты показаны в таблице 8 ниже.

Таблица 8   Растворенная площадь (мм²) Активность в единицах трипсина (ЕД/мл) Количество белка (мг/мл) Специфическая активность (ЕД/мг) Пример 2 243,4 351,7 6,9 51,0 Сравнительный пример 5 207,4 246,6 7,3 33,8

Как очевидно из таблицы 7 и таблицы 8 и в методе деградации субстрата синтетического амида и методе фибринового планшета, специфическая активность фермента была почти в два раза выше в случаях, когда окружение, неблагоприятное для дождевых червей, получали путем добавления хлорида магния (хлорида металла) и молочной кислоты (гидроксикарбоновой кислоты) в таком порядке, по сравнению со случаями, когда их добавляли в обратном порядке. Следовательно, может быть подтверждено, что, даже в случаях, когда используют хлорид(ы) металла, иной, чем хлорид натрия и гидроксикарбоновую кислоту(ы), иную чем лимонная кислота, может быть получен порошок дождевых червей, обладающий высокой ферментативной активностью путем добавления хлорида(ов) металла и гидроксикарбоновой кислот(ы) в таком порядке.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Сухой порошок дождевых червей, полученный способом по настоящему изобретению, является применимым в качестве средства для регуляции артериального давления, антигиперлипидемического средства, средства для лечения сахарного диабета, тромболитического средства и/или подобного, и сходным с сухими порошками дождевых червей, полученными обычными способами. Кроме того, путем экстракции полученного порошка чистой водой, спиртом или подобным и центрифугирования полученного раствора с последующим фракционированием надосадочной жидкости в соответствии с молекулярной массой, полученный продукт может быть использован в качестве эффективного компонента фармацевтических, косметических или вспомогательных средств.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения сухого порошка дождевых червей. Способ получения сухого порошка дождевых червей включает: контакт живых дождевых червей с хлоридом(ами) по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; последующий контакт указанных живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислот(ы) (или водным раствором) и разведение полученной смеси водой для доведения рН до 2-5, с последующим отстаиванием указанных дождевых червей в течение 3-180 минут, промывкой указанных живых дождевых червей водой, измельчением промытых живых дождевых червей и лиофилизацией полученного измельченного продукта (вариант). Вышеописанный способ позволяет получить порошок с повышенной ферментативной активностью. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 табл., 2 пр.

1. Способ для получения сухого порошка дождевых червей, включающий:
контакт живых дождевых червей с хлоридом(ами) по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; и
последующий контакт указанных живых дождевых червей с порошком гидроксикарбоновой кислот(ы) и разведение полученной смеси водой для доведения рН до 2-5, с последующим оставлением указанных дождевых червей стоять в течение 3-180 минут, промывкой указанных живых дождевых червей водой, измельчением промытых живых дождевых червей и лиофилизацией полученного измельченного продукта.

2. Способ для получения сухого порошка дождевых червей, включающий:
контакт живых дождевых червей с хлоридом(ами) металла(ов), выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; и
последующее погружение указанных живых дождевых червей в водный раствор гидроксикарбоновой кислот(ы), с уровнем рН в пределах 2-5, с последующим оставлением указанных дождевых червей стоять в течение 3-180 минут, промывкой указанных живых дождевых червей водой, измельчением промытых живых дождевых червей и лиофилизацией полученного измельченного продукта.

3. Способ для получения сухого порошка дождевых червей по п.1 или 2, где указанных живых дождевых червей оставляют стоять в светлом месте в течение 10-50 часов и грязь, прилипшую к поверхности тел, отшелушивают перед контактом с указанным хлоридом(ами) металла(ов).

4. Способ для получения сухого порошка дождевых червей по любому из пп.1-3, где указанную лиофилизацию проводят путем замораживания указанного измельченного продукта при -18°С до -35°С в течение 20-240 часов и последующей лиофилизации полученного продукта в вакууме.

5. Способ для получения сухого порошка дождевых червей по любому из пп.1-4, где указанным хлоридом металла является хлорид натрия.

6. Способ для получения сухого порошка дождевых червей по любому из пп.1-5, где указанной гидроксикарбоновой кислотой(ами) является по меньшей мере одна, выбираемая из группы, состоящей из уксусной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, молочной кислоты, малоновой кислоты и янтарной кислоты.