СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА ПАЦИЕНТА НА ДЕЙСТВИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/49 

Описание патента на изобретение RU2543336C2

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при лабораторных исследованиях in vitro действия лекарственных препаратов и других внешних факторов.

В последние годы стали более заметны недостатки ряда методов традиционной медицинской диагностики. В перечне многих актуальных проблем современной медицины значительная часть связана с диагностикой заболеваний иммунной системы, с аллергическими реакциями, с непредсказуемостью действия фармакологических препаратов на организм человека, побочными эффектами, проблемами трансплантологии и т.п. Это привело к формированию нового направления Персонализированной Медицины. О его зрелости свидетельствуют организационные структуры, периодические издания, сайты, регулярные конференции и т.д. В статьях и докладах уделяется большое внимание новым методам in vitro диагностики как более безопасным для пациента.

Для определения иммунного статуса пациента широко используются методы in vitro диагноза, основанные на анализе изображений, определении параметров клеток крови и тканей методами и приборами микроскопии, проточной цитометрии, биохимии и другими средствами.

Новые методы микроскопии (конфокальной, флуоресцентной, нелинейной, интерференционной, комбинационной и др.) позволяют получить в функциональных изображениях значительно большую информацию о морфологии клетки. Однако их общим недостатком является большое время анализа, трудоемкость и большой расход материалов. Кроме того, эти методы дают ограниченную информацию о параметрах органелл клетки в изображении окрашенной клетки и параметры представляются в относительных, а не в абсолютных значениях.

Известно, что интерференционные или фазовые изображения обладают рядом необычных свойств. На экране монитора они представлены в виде двумерного распределения оптической разности хода лучей, нормированного на длину волны света. Это свойство фазовых изображений позволяет сравнивать морфологические параметры, полученные в различных условиях и приборах на неокрашенных клетках и использовать их в медицине, например, для иммунной диагностики и исследования механизма действия препаратов на эритроциты и другие клетки.

В работе Yonng Keun Park, выполненной в лаборатории G Popescu, MIT, США и опубликованной в PNAS, 2008, приведены результаты измерений рефрактерности и флуктуации мембраны отдельных эритроцитов. Эритроциты были выделены из крови пациента, инфицированного паразитом Plasmodium falciparum. Измерения на оригинальном дифракционном фазовом микроскопе показали корреляцию между средним по объему показателем преломления (или рефрактерностью) эритроцита и температурой пациента на различных стадиях лихорадки. Для вычисления показателя преломления здоровых доноров и больных использовались абсолютные значения фазовой толщины. В качестве дополнительных параметров приведены значения концентрации гемоглобина. Благоприятным обстоятельством являлась их оптическая однородность и отсутствие ядер. Поэтому средние по объему значения показателя преломления, приведенные в указанной выше и во многих других работах, не могут быть использованы в качестве единственного значимого параметра морфологии, характеризующего состояние отдельного мононуклеара.

Ближе к заявляемому изобретению является in vitro способ оценки влияния глюкокортикостероидов на моноциты периферической крови по изменению их морфометрических показателей методом компьютерной фазово-интерференционной микроскопии (Терпигорев С.А., Ильченко В.А., Василенко И.А. и др. «Соотношение результатов лечения глюкокортикостероидами с их влиянием на моноциты in vitro при бронхиальной астме» Бюл. Эксп. биол. и мед., 2003, Т.135-6, стр.683-687). Этот способ основан на определении изменений морфометрических показателей моноцитов (диаметра, периметра, высоты, площади, объема) после их инкубации с преднизолоном в концентрации 10-7 и 10-4 ммоль/л в течение 60 минут при комнатной температуре. При снижении показателей (диаметра, периметра и площади) клеток на 10% и более по сравнению с контролем (с необработанными клетками) прогнозируется эффективность глюкокортикостероидной терапии.

Недостатком этого способа является ограниченная достоверность анализа, связанная с использованием в качестве критерия эффективности терапии фиксированного уровня (10% и более) снижения значимых параметров, большое время измерений и тестирования одного типа препаратов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является описанный в RU 2382364 и опубликованный 20.02.2010 способ прогнозирования эффективности лечения глюкокортикостероидами, включающий исследование in vitro методом фазово-интерференционной микроскопии моноцитов периферической крови, определение морфометрических параметров клеток и анализ полученных результатов. Отличительной чертой способа является активация моноцитов больного в течение 15 минут излучением гелий-неонового лазера. В качестве критерия эффективности лечения используется оптическая толщина ядер.

Этот способ прогнозирования методом фазово-интерференционной микроскопии эффективности лечения глюкокортикостероидами включает в себя исследование in vitro моноцитов периферической крови, обработанных преднизолоном, определение морфометрических параметров моноцитов, анализ полученных результатов, при этом перед обработкой преднизолоном моноциты активируют в течение 10-20 мин гелий-неоновым лазером при мощности (0,5-1,0) 103 Вт/см2, регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов, затем обрабатывают преднизолоном и повторно регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов и при увеличении этого показателя на 30% и более прогнозируют эффективность лечения глюкокортикостероидами.

Основным недостатком этого способа, который ограничивает возможность его более широкого применения, является использование в качестве активирующего фактора излучения гелий-неонового лазера без указания дозировки. В качестве значимого параметра используется фазовая толщина, в которую дают вклад кроме ядра также другие органеллы.

Заявляемое изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в повышении точности прогнозирования иммунного отклика пациента на действие фармакологического препарата, на снижение вероятности нежелательных побочных эффектов и на сокращение времени исследования и стоимости диагноза.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе in vitro оценки прогнозирования иммунного ответа пациента на действие внешних факторов, включающем исследование отдельных мононуклеаров периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии, из суспензии мононуклеаров крови донора до действия внешнего фактора выделяют первую пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде зон оптической плотности в проекций отдельных органелл и измеряют последовательно: цитоплазматический индекс, а также значения фазовой толщины, площади, эквивалентных диаметров, фазового объема, рефрактерности у следующих органелл мононуклеара: внешняя граница периферийной части цитоплазмы, плотная часть цитоплазмы, хондриом, ядро и ядрышко, затем у этого же донора из суспензии мононуклеаров выделяют вторую пробу и после действия на мононуклеары внешнего фактора их повторно микроскопируют в интерференционном микроскопе, измеряют вышеуказанные параметры указанных органелл мононуклеара, после чего образуют второй набор значений фазовой толщины, при этом прогнозирование иммунного ответа пациента на действие внешнего фактора осуществляют по количественным изменениям указанных параметров во втором наборе параметров.

В этом способе прогнозирования иммунного ответа пациента также в качестве значимых параметров на границах «зон» используют значения фазовой толщины, площади, эквивалентных диаметров, фазового объема и рефрактерности органелл. Для прогнозирования индивидуального иммунного ответа пациента на действие испытуемого аллергена в качестве внешнего фактора аллергена в этом способе сравнивают параметры второго набора со статистически достоверными параметрами в наборах базы данных, и диагноз производят по коэффициентам корреляции.

В этом способе прогнозирования иммунного ответа реципиента трансплантата в качестве внешнего фактора используют клетки и экстракты из тканей и клеток донора и вероятность отторжения трансплантата прогнозируют путем количественной оценки изменений во втором наборе значимых параметров.

Указанные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.

Настоящее изобретение поясняется конкретным примером исполнения, который, однако, не является единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.

На фиг.1 - схематически показано положение клетки в измерительной камере.

В клетке оптически более плотная часть структуры находится в центре и менее плотная цитоплазма - на периферии. Форма клетки (Т-лимфоцита) предполагается близкой к сфере; схематически изображена оптически неоднородная клетка на полированной кремниевой подложке в измерительной камере на предметном столе микроскопа;

фиг.2 - топограмма - проекция лимфоцита и его органелл: цитоплазмы, разветвленной митохондрии (хондриома), ядра и ядрышка в виде двумерного распределения фазовой толщины. В окружающей лимфоцит среде обозначены окружностями различных диаметров внешняя (d0) и границы (di) других органелл.

фиг.3 - схематически показаны площадь S(hi) и фазовый объем W(hi) в сечении трехмерного изображения h(x, y) горизонтальной плоскостью hi=const. Максимальное значение фазовой толщины hmax. Наибольшие значения W(hi) и S(h) соответствуют hi=0.

фиг.4 - условное деление на окружности - зоны;

фиг.5 - профили фазовой толщины h(x) и h(y) в ортогональных сечениях топограммы h(x, y). Диаметры d и фазовые толщины h (i=0-4) соответствуют предполагаемому положению границ «зон»;

фиг.6 - s-гистограмма и график функции S(h), на которых обозначены значения фазовой толщины, площади и диаметров, которые отождествлялись с указанными границами «зон»: s-гистограмма отображает зависимость s(h) площади пикселей от фазовой толщины и является статистической характеристики фазового изображения h(x, y). Показаны значения площади S на границах «зон» (hi).

фиг.7 - различие в профилях рефрактерности ΔnA-D(r) вдоль радиусов, отличающихся поворотом на 90°, объясняется асимметрией структурных элементов клетки. Максимумы на участке (r2-r3≈2,8-2 мкм) в профилях рефрактерности ΔnA-D(r) связаны с пространственной неоднородностью хондриома. Сравнительно плоские части профиля с рефрактерностью Δn34≈0.03 в интервале радиусов r3-r4≈2-1.25 мкм соответствуют ядру, а более высокие значения (Δn35≈0.05-0,06) в ближней к центру зоне (r≤1.25 мкм) - ядрышку;

фиг.8 - w-гистограмма отображает зависимость плотности фазового объема w(h) клетки от фазовой толщины. Малые (w≈0,01 мкм3/нм) плотности при h≤135 нм соответствуют малой рефрактерности цитоплазмы. Значения Wi обозначают фазовый объем на границах (hi) «зон»;

фиг.9 - из сравнения профилей фазовой толщины видно изменение формы, отсутствие характерных «плеч» и снижение толщины при ФГА-активации лимфоцита;

фиг.10 - из графика функции S(h) видно значительное увеличение площади клетки до S0=75 мкм2 и периферийной цитоплазмы (до 32 мкм2) при сохранение площади (S2) ее плотной части. Характерный для хондриома крутой участок отсутствует, и граница между хондриомом и ядром не видна;

фиг.11 - при ФГА-активации Т-лимфоцит стал оптически более однородным, характерные максимумы, которые идентифицировались с вкладом хондриома, сместились в периферийную часть цитоплазмы;

фиг.12 - в графике функции W(h) видно четырехкратное увеличение фазового объема периферийной цитоплазмы (W0-W1=1,3 мкм) и снижение фазового объема плотной части до W2=5,2 мкм3.

Показанные на фиг.5-12 изменения оптических параметров объясняются влиянием происходящих в клетке процессов и внешних факторов на физические параметры ее органелл. Поэтому изменения морфологии, регистрируемые методами оптической микроскопии, традиционно используются в биофизике клетки и для in vitro диагностики в медицине. Мы предлагаем новый метод определения функционального состояния отдельной клетки, основанный на уникальных свойствах фазовых изображений. В фазовом изображении клетки, полученном на интерференционном микроскопе, применение оригинальных алгоритмов позволяет получить набор значимых биофизических параметров. Эти параметры (фазовая толщина, площади и поперечные размеры органелл, фазовые объемы, показатель преломления и др.) являются физическими параметрами и количественно характеризуют морфологию клетки. Они определяются в абсолютных единицах и могут быть получены на различных типах интерференционных микроскопов.

В основу всех заявленных способов - способа доклинического тестирования фармакологического препарата, способа прогнозирования иммунного ответа пациента на действие внешних факторов, способа оценки функционального состояния лимфоцита человека, способ оценки in vitro индивидуальной реакции на действие фармакологического препарата на организм пациента - лежит общая последовательность действий, заключающаяся в следующем:

1. Из суспензии мононуклеаров (в т.ч. лимфоцитов) в нормальной среде выделяют первую пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе (в т.ч. в когерентном фазовом микроскопе) для получения изображения мононуклеара в виде топограммы - двумерного распределения фазовой толщины, отображающей проекцию отдельных органелл клетки, отличающихся по показателю преломления. Клетка представляет собой сложную структуру из функционально связанных между собой органелл. В проекции клетки при ее сканировании с высоким разрешением можно получить «зоны» - области, отличающиеся по фазовой толщине. В трехмерном изображении клетки ее участкам с более высокими значениями показателя преломления, например ядра, соответствуют большие фазовые толщины.

Набор параметров физических параметров (площадь, диаметр, рефрактерность, фазовый объем и др.) на границах «зон» мы используем в качестве характеристики функционального состояния. Мы обозначаем здесь термином «значимые» такие параметры, изменениям которых можно дать биофизическую или медицинскую интерпретацию. В фазовую толщину каждой «зоны» дают вклад органеллы клетки. На этом основано определение «нормы» в виде набора параметров в базе (банке) данных нормально функционирующей клетки здорового (не больного и не подверженного внешнему воздействию или воздействию лекарственных препаратов) человека. Формирование банка наборов параметров для клеток доноров разного пола, возраста и т.д. людей, позволит количественно сравнивать его набор с наборами, характерными для «нормы» и для различных патологий, и затем по данным корреляционного анализа предлагать диагноз с численной вероятностной оценкой.

В перспективе такой подход может быть использован в проблеме т.н. персонализированной медицины, для индивидуальной оценки аллергенного и фармакологического действия препаратов, трансплантатов и других факторов на конкретного человека. Формирование личного (персонифицированного) банка наборов значимых параметров позволит анализировать динамику изменений, проследить тенденции изменения этих параметров и прогнозировать начало отклонений.

2. Фазовое изображение оптически неоднородной клетки представляет собой двумерное распределение оптической разности хода, которое характеризует локальное значение оптической плотности клетки или т.н. локальную фазовую толщину. Более плотным органеллам, например ядру, соответствуют большие значения фазовой толщины. Границы «зон» в фазовом изображении клетки соответствуют границам органелл и распознаются по заметному изменению фазовой толщины. В сечении горизонтальной плоскостью фазового изображения можно определить площадь органеллы и т.н. фазовый объем отсеченного фрагмента. Под фазовым объемом мы понимаем произведение физического объема на рефрактерность. По значениям фазовой толщины на границах «зон» с помощью гистограмм фазовой толщины и фазового объема и других алгоритмов можно определить значимые параметры в изображении клетки и использовать их набор для характеристики ее функционального состояния.

3. Наборы значимых параметров одиночных мононуклеаров используют для установления уровня нормы и для характеристики изменений функционального состояния мононуклеаров при действии различных факторов и формирования базы (банка) данных.

4. В зависимости от поставленной задачи способ может дополняться другими существенными действиями.

Например, для проведения доклинического тестирования какого-либо фармакологического препарата получают значимые параметры клетки здорового донора, соответствующие норме, а затем у этого же донора из суспензии мононуклеаров выделяют вторую пробу с испытуемым фармакологическим препаратом в среде, повторно микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения второго набора значимых параметров, и тестирование на эффективность испытуемого фармакологического препарата осуществляют по количественным изменениям значимых параметров во втором наборе после действия фармакологического препарата. При сравнении используют величины параметров в характерных точках гистограмм фазовой толщины, а значимые параметры определяют из функций площади, фазового объема и профиля рефрактерности.

Для прогнозирования иммунного ответа пациента на действие внешних факторов так же получают первый набор значимых параметров до внешнего воздействия, затем после действия внешнего фактора на пациента из суспензии его мононуклеаров выделяют вторую пробу, повторно микроскопируют в интерференционном микроскопе, получают второй набор значимых параметров. Прогнозирование иммунного ответа пациента на действие внешнего фактора осуществляют по количественным изменениям значимых параметров второго набора значимых параметров, полученных после действия внешнего фактора. При этом для характеристики мононуклеара в числе набора значимых параметров фазового изображения используют рефрактерность и фазовый объем мононуклеара и его органелл.

Возможно прогнозирование индивидуального иммунного ответа на действие аллергена путем сравнения набора значимых параметров пациента со статистически достоверными наборами значимых параметров в базе данных для характерных патологий, и диагноз производят по количественной оценке коэффициента корреляции.

Аналогичным образом по отношению к способу прогнозирования производят оценку in vitro индивидуальной реакции на действие фармакологического препарата на организм пациента и прогнозирование реакции отторжения трансплантата. Оценку in vitro индивидуальной реакции на действие фармакологического препарата осуществляют по количественным изменениям во втором наборе значимых параметров по сравнению с значимыми параметрами, полученными до действия фармакологического препарата.

Аналогичным образом по отношению к способу прогнозирования производят оценку вероятности отторжения трансплантата. Второй набор значимых параметров получают после введения в среду иммунно-компетентных клеток рецепиента белков и экстрактов ткани донора.

Результаты предварительных исследований Т-лимфоцитов человека показали перспективность ее применения для экспресс-диагностики in vitro состояния отдельной клетки. Для биофизической интерпретации результатов измерений разработана оптическая модель клетки. Зависимость оптических параметров органелл от их функционального состояния объясняется "вариабельной компонентой рефрактерности", обнаруженной ранее на митохондриях и других клетках.

Количественную оценку морфофункционального состояния клеток производят по результатам анализа фазового изображения, полученного с помощью указанных выше или других типов интерференционного микроскопа. Для определения набора значимых параметров изображения клетки используют различные известные алгоритмы и программное обеспечение. При необходимости вычисляют статистические данные, в т.ч. средние по ансамблю клеток величины значимых параметров.

Новые оптические методы, в частности интерференционная микроскопия, начали использоваться в последние годы в биофизике и медицине для исследования структуры клеток и происходящих в них процессов (G. Popescu, Quantitative phase imaging of nanoscale cell structure and dynamics, in: Methods in cell biology, Elsevier Inc. Ed. B. Jena, 2008, V.90, Ch.5, P.87-115; V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V.2010, 58 (3). P.107-1016; V.P. Tychinsky, A.N. Tikhonov, Visualization of individual cells and energy-transducing organelles. Cell Biochemistry and Biophysics, 2010. 58(3). P.117-128; Y. Park, M. Diez-Silva, G. Popescu, G. Lykotrafitis, W. Choi, M. Feld, S. Suresh, Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falcipamm, PNAS. 2008. V.105 (37). P.13730-13735; Z. Yaqoob, T. Yamauchi, W. Choi, Dan Fu, R. Dasari, M. Feld, Single-shot full-field reflection phase microscopy. Optics Express. 2011. V.19. P.7587-7595; В.П. Тычинский, «Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой?», УФН, 2007, Т.177 (5), стр.535-552). Выше отмечались уникальные свойства интерференционных методов, которые состоят в представлении фазового изображения объекта в виде двухмерного распределения оптической разности хода (ОРХ) h(x, y) в плоскости (x, y) и в высокой чувствительности к изменениям ОРХ. Принципиальное значение имеет измерение ОРХ в абсолютных значениях (в долях длины волны). Оцифрованные значения ОРХ обычно интерпретируются как локальные значения фазовой толщины клетки и используются для вычисления показателя преломления n(x, y) (Y. Park, M. Diez-Silva, G. Popescu, G. Lykotrafitis, W. Choi, M. Feld, S. Suresh, Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum, PNAS. 2008. V.105(37), P.13730-13735; Y. Hiramoto, Shumei Shimoda, Yoko Shoji, Refractive index of the protoplasm in sea urchin eggs. Develop.Growth and Differ., 1979), Т. 1(2), С.141-153) или среднего по объему всей клетки значения <n(x, y)>. Из этих и других (V. Manteifel, L. Bakeeva, Т. Каш, Ultrastructural changes in chondriome of human lymphocytes after irradiation with He-Ne laser: appearance of giant mitochondria, J. of Photochemistry and Photobiology, 1997. V.38. P.25-30) работ следовал вывод о принципиальной возможности использования параметров фазового изображения для количественной оценки in vitro функционального состояния живых клеток. Однако отсутствие адекватной методологии, методов и алгоритмов ограничивало число значимых параметров и информативность фазового изображения отдельной живой клетки.

В настоящем изобретении заявляется возможность получения набора значимых параметров. Мы предполагаем, что использование набора значимых параметров позволит разработать новый, более информативный метод in vitro диагностики функционального состояния отдельной клетки.

В качестве экспериментальной модели для проверки метода использовались мононуклеары периферической крови здоровых доноров. Свежевыделенные клетки суспендировали в среде 199 и определяли ее параметры в "норме". Для характеристики "активированного" состояния клетки ее предварительно выдерживали в течение 1 ч при 37°C в среде с поликлональным митогеном-фитогемагглютинином (ФГА; 2 мкг/мл). Суспензию клеток наносили в виде капли на полированную кремниевую подложку изатем под покровным стеклом помещали на предметный стол когерентного фазового микроскопа "Эйрискан" (V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V.2010, 58 (3). P.107-1016; В.П. Тычинский, «Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой?», УФН, 2007, Т.177 (5), стр.535-552). Спейсер толщиной 15 мкм между кремниевой подложкой и покровным стеклом препятствовал деформации клеток. Измерения проводили не более 30 мин с использованием предохранительной шторки для минимизации действия на клетки излучения гелий-неонового лазера (λ=633 нм, 1 мВт).

Положение клетки в измерительной камере схематически показано на фиг.1. Изображение на разработанном в МИРЭА микроскопе "Эйрискан" получали растровым методом (V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V.2010, 58 (3). P.107-1016), в котором значения ОРХ определялись последовательно в каждом пикселе изображения компенсационным методом (В.П. Тычинский, «Динамическая фазовая микроскопия: возможен ли «диалог» с клеткой?», УФН, 2007, Т.177 (5), стр.535-552). В этом методе фаза опорной волны изменялась по линейно-периодическому закону движением зеркала в опорном плече интерферометра. Растровое сканирование изображения и регистрация интерференционного сигнала производились координатно-чувствительным фотоприемником-диссектором ЛИ-620. Этот метод позволил получить сверхдифракционное пространственное разрешение и регистрировать в клетках динамические процессы в реальном времени. Ограниченная шумами чувствительность к изменениям ОРХ была около 1 нм. Авторы считают, что параметры интерференционного микроскопа в данном случае не имели решающего влияния на результаты.

Авторы исходили из предположения, что в фазовом изображении клетки можно выделить "зоны" с различной фазовой толщиной, границы которых соответствуют границам органелл и различаются по показателю преломления. В отдельных случаях преобладающий вклад в фазовую толщину дает только одна органелла. Например, известно, что ядро и окружающая его разветвленная митохондрия (хондриом) являются наиболее плотной частью структуры клетки (см. фиг.2, 3 и 4), и наименее плотная - периферийная часть цитоплазмы (см. фиг.3 и фиг.4). Разработанные авторами алгоритмы обеспечивали получение в фазовых изображениях следующих функций и параметров: а - профиля фазовой толщины h(x) - зависимости фазовой толщины в поперечном сечении клетки; б -зависимости рефрактерности Δn(r) от радиуса в изображении клетки, и численных значений рефрактерности органелл Δn(ri) на границах «зон»; в - гистограмм s(h) -зависимости плотности площади пикселей от фазовой толщины (h) в топограмме h(x, y); r - функции S(h) - зависимости площади в сечении изображения клетки от фазовой толщины; д - гистограммы w(h) - зависимости плотности фазового объема структурного элемента изображения от фазовой толщины; е - функции W(h) - зависимости фазового объема элементов клетки в интервале значений фазовой толщины (0-h). В гистограммах, в профилях фазовой толщины, графиках S(h) и s(h) были определены значения фазовой толщины (hi), которые являются границами "зон". Из оптической модели клетки следовало, что в отдельных «зонах» можно было выделить преобладающий вклад конкретных органелл (периферийной и плотной цитоплазмы, хондриома, ядра и ядрышка). Численные значения функций S(hi) и W(hi) позволили определить площадь частей изображения внутри контура с фиксированной фазовой толщиной (hi) и вычислить диаметры (di) окружностей, равных им по площади (см. фиг.4). Было показано, что при некоторых условиях диаметры di можно отождествить с границами органелл и дать адекватную биофизическую интерпретацию параметрам «зон».

На изображении (топограмме) Т-лимфоцита на фиг.2 границы "зон" показаны в виде окружностей соответствующих диаметров (di). Диаметр d0 мы отождествляем с внешней границей клетки, d1 - с границей периферийной и плотной частей цитоплазмы, d2 - с границей плотной части цитоплазмы с хондриомом (разветвленной гигантской митохондрией), d3 - с границей хондриома с ядром, d4 - с границей ядра и ядрышка. На площадь кольца ΔSij=Si-Sj ограниченную диаметрами di и dj, проецируется часть клетки, которой соответствует фазовый объем ΔWij. На фиг.3 схематически показаны площадь S(h) в сечении трехмерного изображения h(x, y) горизонтальной плоскостью hi=const и часть фазового объема W(hi). Под фазовым объемом части клетки мы понимаем произведение W(hi)=Δn0iV(hi) ее геометрического объема V(hi) и рефрактерности (Δn0i=ni-n0), где ni - показатель преломления органеллы.

Параметры соответствующих "зон", площадь которых ограничена диаметрами di и dj (j=i+1), мы обозначаем двумя индексами границ. Из фиг.2, 3 и 4 следует, что на площадь «зон» (за исключением 1-2) проецируется и дает вклад в фазовую толщину нескольких органелл. Одним из наиболее значимых параметров являются значения рефрактерности (Δn0i) на i-й границе. Для их вычисления было использовано представление фазовой толщины суммой вкладов (V.P. Tychinsky, N. Tikhonov, Interference Microscopy in Cell Biophysics. Principles and methodological aspects of Coherent Phase Microscopy, Cell Biochemistry and Biophysics, V.2010, 58 (3). P.107-1016):

h ( x , y ) = Σ h i ( x , y ) ( 1 ) ,

где hi(x,y)=Hi(x,y)Δn0i, Hi(x, y) - геометрическая толщина i-й границы, и оптической модели клетки в виде системы концентрических сферических слоев.

В профилях фазовой толщины h(x) и h(y) на фиг.5, полученных в диаметральных сечениях топограммы Т-лимфоцита (фиг.2), обозначены диаметры (di) и значения толщины (hi), которые соответствуют границам "зон". Видно, что профили h(x) и h(y) несколько отличаются по форме. Внешнему диаметру клетки (d0) на профиле h(x) соответствует нижнее значение фазовой толщины (h0=0). В фазовую толщину (h0≤h≤hi) первой "зоны" (0-1) дает вклад только периферийная часть цитоплазмы, почти лишенная крупных органелл. С приближением к центру клетки фазовая толщина растет. Это связано с последовательно возрастающими вкладами: плотной части цитоплазмы с ретикулом в интервале высот и диаметров в области (1-2), хондриома (2-3), ядра (3-4) и ядрышка (h4<h<hmax) (4-5). Морфология клетки, размеры и рефрактерность органелл влияют на долю точек в заданном интервале фазовой толщины (h, Δh) и, соответственно, на форму s-гистограммы. Проекции пологих участков h(x, y) соответствует большое число точек и максимум в s-гистограмме для этого интервала фазовых толщин.

Выше отмечалось, что функция S(h), полученная интегрированием s-гистограммы, отображает зависимость площади в сечении клетки от положения плоскости h=const. Часть левого максимума в s-гистограмме на фиг.6 соответствует сравнительно большой площади подложки и не имеет отношения к клетке. Правый его склон отражает вклад рефрактерности (Δn0i) периферийной части цитоплазмы. Известно, что ее показатель преломления мало отличается от n0=1,333 для воды. Максимальный вклад периферийной цитоплазмы в фазовую толщину на границе с плотной цитоплазмой не превышает hi=25 нм. Широкий правый максимум s-гистограммы в интервале 115≤h≤165 нм соответствует вкладу в фазовую толщину более плотной части клетки (хондриома, ядра и ядрышка). Монотонный рост функции S(h) (фиг.6) от нуля в центре (при hmax≈220 нм) до максимального значения S0=40 мкм соответствует увеличению площади сечения у основания (h=0). Значения функции S(hi) в характерных точках (hi) были использованы для определения диаметров (di), эквивалентных по площади окружностей, которые условно отождествлялись с границей i-й «зоны». Увеличение S(h) при отрицательных значениях (h<0) соответствует площади подложки и не связано с клеткой. В фазовую толщину первой "зоны", площадь которой ΔS01=S0-S1=8 мкм2 ограничена внешней (d0≈7,14 мкм, h0=0) и внутренней d1≈6.4 мкм, h1=35 нм) окружностями, проецируется и дает вклад только периферийная часть цитоплазмы клетки. На фиг.6 обозначены значения фазовой толщины, площади и диаметров, которые условно отождествлялись с указанными границами органелл: S2=24 мкм2, h3=115 нм (d3≈5.5 мкм); S3=10 мкм2, h3=165 нм (d3≈3.6 мкм); S4≈2 мкм2, h4=200 нм, (d4≈1,6 мкм). Площади колец ("зон") соответственно были равны, мкм2: ΔS01=8; ΔS12=8; ΔS23=14; ΔS34=6; ΔS45=S4≈2 мкм2. В некоторых случаях граница между хондриомом и ядром (h3) была трудно различима. Из приведенных выше величин следует, что на цитоплазму (ΔS01+ΔS12)=16 мкм2 в топограмме Т-лимфоцита в норме приходится 40% площади всей клетки (S0).

w-гистограмма и функция W(h) (фиг.8) позволили получить дополнительные сведения о морфологии Т-лимфоцита. Понятие фазового объема, по-видимому, не часто используется в биофизике клетки, и мы здесь на конкретных примерах покажем возможность его использования для характеристики состояния Т-лимфоцита. Малые значения (w≈0,01 мкм3/нм) плотности фазового объема в интервале 0≤h≤135 нм отображают малую рефрактерность периферийной цитоплазмы и ретикулума. Увеличение плотности до w≈0,04 мкм3/нм и сохранение высокого уровня в интервале 115≤h≤165 нм объясняется более высокой рефрактерностью и большими геометрическими объемами хондриома и ядра. Снижение плотности в интервале 165≤h≤200 нм связано с малым геометрическим объемом ядрышка, несмотря на его высокую рефрактерность. Функция W(h) позволяет получить численные значения фазового объема W(hi) на границах "зон", мкм3: W0=10; W1=9,7; W2=7,6; W3=3,6; W4=0,8; Соответственно, разность этих значений позволяет оценить фазовые объемы структур, которые проецируются в эти «зоны», мкм3: ΔW01=0,3; ΔW12=2,1; ΔW23=4,0; ΔW34≈2,8; ΔW45=W4≈0,8. В данном случае на цитоплазму Т-лимфоцита в норме приходится (ΔW01+ΔW12)=2,4 мкм3 или ≈ 24% от всего фазового объема. Остальные 76% приходятся на оптически более плотные структуры клетки (ядро и хондриом). Ниже будет показано, что функциональное состояние клетки оказывает заметное влияние на фазовые объемы органелл.

Заметим, что отношение площади цитоплазмы к окрашенной площади ядра ("цитоплазматический индекс") традиционно используется для количественной характеристики ее морфологии. Функции S(h) и W(h) позволяют определить аналогичные "индексы" в фазовых изображениях клетки. По аналогии мы их представляем здесь в виде отношения площадей Is=(ΔS01+ΔS12)/S2 и фазовых объемов (Iw=(ΔW01+ΔW12)/W2. Для Т-лимфоцита в норме эти "индексы" имели значения: Is=0,66 и Iw=0,316.

Следующими значимыми параметрами «фазового портрета» являются рефрактерности органелл. Для их вычисления были использованы оптическая модель и алгоритм, подобный приведенному в (Y. Hiramoto, Shumei Shimoda, Yoko Shoji, Refractive index of the protoplasm in sea urchin eggs. Develop.Growth and Differ., 1979), Т.1 (2), С.141-153). На фиг.7 показаны результаты вычисления профиля рефрактерности Δn(r)A-D и в виде ее зависимости от радиуса r. Четыре профиля были получены в сечениях (A-D), отличающихся поворотом на 90°. Различие в форме и в положении максимумов свидетельствует о заметной асимметрии распределения оптической плотности в Т-лимфоците, несмотря на его близкую к сфере форму. Там же обозначены радиусы ri=di/2, соответствующие границам органелл. Следует обратить внимание на максимумы рефрактерности (Δn23≈0.035-0,05) в интервале радиусов r2-r3≈2,8-2 мкм, которые мы отождествляем с границами третьей «зоны» с преобладающим вкладом хондриома. Из приведенных в статье Т. Кару изображений на электронном микроскопе следует, что пространственная структура хондриома весьма неоднородна. С этим обстоятельством, по-видимому, связано различие в форме профилей в сечениях А-D. Эта асимметрия становилась менее заметна при деэнергизации Т-лимфоцита. Расположенные ближе к центру участки профиля мы отождествляем с вкладом ядра (Δn34=0.03), которому по нашим оценкам соответствует внешняя граница r3≈2,0 мкм, и ядрышку (Δn45≈0.05-0,06) в пределах r4≤1,25 мкм. Эти значения рефрактерности на границах «зон» входят в набор значимых параметров.

Перечисленные выше параметры с разной степенью адекватности количественно отображают морфологию клетки. Важно отметить, что в предлагаемом здесь подходе число значимых параметров в наборе не ограничено указанными здесь алгоритмами и не связано с конкретной оптической моделью клетки. В зависимости от природы объекта, его морфологии и специфических особенностей функционального изображения набор может быть дополнен другими значимыми параметрами. Для сравнения результатов измерений в различных условиях и их интерпретации необходимо, чтобы параметры набора измерялись в стандартных, нормированных физических величинах.

В заявляемых способах регистрируют изменения в значимых параметрах наборов (фазовой толщины (hi), площадей (Si), фазовых объемов (Wi) и рефрактерности органелл (<Δn>)). Первый набор определяют для ансамбля из небольшого числа (10-15) мононуклеаров. Затем действуют на мононуклеары испытуемым препаратом и через определенное время регистрируют фазовые изображения второго ансамбля мононуклеаров. Определяют значимые параметры в наборах отдельных клеток, при необходимости их усредняют, затем их сравнивают и оценивают их изменения. По численным значениям разности усредненных по ансамблям значимых параметров наборов прогнозируют действие на организм пациента испытуемого препарата.

Для проведения исследований забор крови (4-5 мл) производят из локтевой вены и стабилизируют ее в пробирке гепарином в концентрации 25 ЕД на 1 мл крови. Мононуклеары выделяют стандартным методом на градиенте плотности для лимфоцитов Ficoll-Paque (p=1,077 г/см3) производства AmershamBiosciences (Швеция). Кровь разбавляют физраствором 1:1 и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 45 мин. Суспензию Т-лимфоцитов в среде 199 вместе с тестируемый препаратом наносят в виде капли 3-4 мкл на полированную кремниевую подложку, накрывают покровным стеклом и помещают на предметный стол микроскопа. Измерения производят на каком-либо интерференционном микроскопе, например, на когерентных фазовых микроскопах «Эйрискан» или «Цитоскан».

Для проверки метода были выделены Т-лимфоциты 12 доноров. Среди них были 5 здоровых и 7 пациентов с различными системными заболеваниями. Ниже показаны характерные для нормы гистограммы, профиль рефрактерности Т-лимфоцита здорового донора и усредненный по Т-лимфоцитам пяти здоровых доноров их «фазовый портрет».

В таблицах 1 и 2 показаны значимые параметры характерных «фазовых портретов» Т-лимфоцитов здорового донора в норме (таблица 1) и ФГА-активированного Т-лимфоцита (таблица 2). Здесь для обозначения величин параметров на границах органелл использованы индексы: 0 - внешняя граница периферийной части цитоплазмы; 1 - плотная часть цитоплазмы, 2 - хондриом (разветвленная митохондрия); 3 - ядро; 4 - ядрышко. Вариабельность параметров в ансамбле Т-лимфоцитов не превышала ±15%.

В табл.1 приведены характерные значения параметров Т-лимфоцита в норме. Измерения 30 клеток показали сравнительно небольшую вариабельность параметров. Например, в норме максимальная фазовая толщина находилась в пределах h0=200-250 нм, площадь S0=40-50 мкм2, фазовый объем W0=8-12 мкм3, средние значения рефрактерности <Δn>=0,03-0,04. Вариабельность остальных параметров была в тех же пределах.

Таблица 1 Параметр/граница 0 1 2 3 4 5 h, [нм] 0 25 115 165 197 220 d, [мкм] 7,15 6,4 5.5 3.6 2.2 0 S, [мкм2] 40 32 24 10 4 0 W, [мкм3] 10 9,7 7.6 3,6 0,8 0 ΔA, [мкм2] 8 8 14 6 4 0 ΔW, [мкм3] 0,3 2,1 4,0 2,8 0,8 0 <Δn> 0,004 0,015 0,044 0,035 0,05 0,055

Смещение вправо в столбцах значений ΔS, ΔW и <Δn> обозначает, что они относятся к "зоне" между границами.

Далее мы кратко отметим важность адекватной биофизической интерпретации параметров набора в общепринятых терминах. Результатов измерений лимфоцитов в различных средах пока еще очень мало, и мы ниже приводим один пример, из которого следует вывод о зависимости параметров набора от состояния клетки и возможность их биофизической интерпретации.

Из учебников по иммунологии и работы (V. Manteifel, L. Bakeeva, T. Karu, Ultrastructural changes in chondriome of human lymphocytes after irradiation with He-Ne laser: appearance of giant mitochondria, J. of Photochemistry and Photobiology, 1997. V. 38. P. 25-30) известно, что в начальной фазе ФГА-активации (в пределах ≈ 1 ч воздействия) в Т-лимфоцитах происходит переход из состояния покоя (G0) в активированное (S-состояние), и оно сопровождается индукцией транскрипции, трансляцией и секрецией цитокинов. Естественно предполагать, что эти процессы отражаются на параметрах фазового изображения. Результаты измерений ФГА-активированного Т-лимфоцита приведены в табл.2.

Измерения Т-лимфоцита в среде с ФГА (2 мкг/мл) показали заметное снижение фазовой толщины от 220 до ≈ 150 нм и изменение формы профиля (фиг.9). Из функции S(h) на фиг.10 видно значительное увеличение всей площади (до 75 мкм2) клетки и площади периферийной цитоплазмы (до ΔS01=32 мкм2 при 8 мкм2 в норме) при сохранении суммарной площади хондриома и ядра (от S2=28 мкм2). Площадь хондриома ΔS23 снизилась до 8 мкм2 и немного возросла (до S3=20 мкм2) у ядра. Увеличение площади S2 периферийной цитоплазмы связано с большим диаметром клетки (d0≈9,8 мкм). Но более заметные изменения произошли в графике функции W(h) (фиг.12). Видно четырехкратное увеличение фазового объема периферийной цитоплазмы (ΔW01=1,3 мкм3) и снижение фазового объема плотной части (от W2=7,6 до 5,2 мкм3). Общий объем также снизился до W0≈8.5 мкм3. Заметные изменения произошли в профилях рефрактерности ΔnA-D(r) на фиг.11. Различие в профилях рефрактерности менее заметно. Из сравнения с фиг.7 видно, что Т-лимфоцит стал оптически более однородным, снизилась рефрактерность ядра, практически незаметно ядрышко, существенно изменилось положение характерных максимумов. Их высота снизилась и они сместились к области радиусов r≈3,5 мкм, соответствующей периферийной цитоплазме, в отличие от окрестности ядра в норме.

В таблице 2 приведены характерные значения параметров ФГА-активированного Т-лимфоцита.

Таблица 2 Параметр/граница 0 1 2 3 4 5 h, [нм] 0 50 127 141 - 152 d, [мкм] 9,8 7.4 6 5,04 - 0 S, [мкм2] 75 43 28 20 - 0 W, [мкм5] 8.5 7,2 5.2 3.2 - 0 ΔS, [мкм2] 32 15 8 - - 0 ΔW, [мкм5] 1.3 2 2 - - 0 <Δn> =0,005 0,025 0,02 0,018 0,015 -

Сравнение данных в двух таблицах позволяет сделать следующие выводы. При ФГА-активации заметные количественные изменения произошли почти во всех параметрах и в этом смысле их можно отнести к «значимым». Увеличение площади и фазового объема периферийной части цитоплазмы можно объяснить процессами синтеза белков и цитокинов на рибосомах, дроблением хондриома на митохондрии, транспортом субстрата из внешней среды и синтезом АТФ. Причиной увеличения фазового объема периферийной цитоплазмы может быть перемещение в нее митохондрии, имеющих более высокий уровень рефрактерости. Этот вывод согласуется со снижением (до W2=5.2 мкм3) фазового объема плотной части клетки (хондриома и ядра). В норме в фазовую толщину (h2=135 нм) на границе плотной части (h2≤135 нм) преобладающий вклад давали хондриом и ядро. Их вклады в фазовый объем (W2=7,6 мкм) были близки. Снижение фазового объема плотной части при активации объясняется отсутствием вклада хондриома при почти неизменном объеме ядра (W3≈3.2 мкм3). Снижение рефрактерности ядра при ФГА-активации мы объясняем увеличением его диаметра до d3≈6 мкм и двух- трехккратным увеличением геометрического объема. Физической причиной снижения рефрактерности может быть деконденсация хроматина (V. Manteifel, L. Bakeeva, T. Karu, Ultrastructural changes in chondriome of human lymphocytes after irradiation with He-Ne laser: appearance of giant mitochondria, J. of Photochemistry and Photobiology, 1997. V.38. P.25-30), которая связана с РНК-транскрипцией, секрецией цитокинов и другими характерными для S-фазы процессами.

Из сравнения значимых параметров в таблицах следует вывод о зависимости значимых параметров от состава среды и состояния донора.

По-видимому, рефрактерность и фазовый объем "зон" являются основными значимыми параметрами в сложной иерархии диагностических факторов ФП. Это объясняется фундаментальным характером зависимости физических параметров клетки от процессов синтеза АТФ, транскрипции РНК, синтеза аминокислот на рибосомах и т.д. Авторы не исключают также, что на последних фазах активации становятся заметными признаки апоптоза. Известно (V. Tychinsky, A. Kretushev, I. Klemyashov, Т. Vyshenskaya, N. Filippova, N. Rakchlin, A. Shtil, Quantitative real-time analysis of nuclear stress by coherent phase microscopy, J. of Biomedical Optics, 2008. V.13 (6). P.1205-1214; С.В. Бойчук, М.Л. Миннебаев, И.Г. Мустафин, Ключевая роль митохондрий в апоптозе лимфоцитов, Бюл. Эксп. биологии и медицины. 2001, Т.132 (12), С.644-647), что его характеристиками являются снижение метаболической активности хондриома и мембранного потенциала митохондрий.

Следует отметить возможность использования для характеристики состояния также "вторичных" параметров "фазового портрета". Например, для этой цели можно использовать отмеченные выше новые цитоплазматические индексы. При ФГА-активации индекс Is возрос до Is=1,68 при 0,64 в норме, a Iw увеличился до Iw=1,65 при 0,316 в норме.

В рамках настоящего изобретения для иллюстрации "значимости" параметров фазового изображения приведены только результаты измерений ФГА-активированного Т-лимфоцита. Предварительные результаты измерений других клеток крови и в других средах подтвердили "значимость" параметров набора.

Выше неоднократно отмечалось уникальное свойство фазовых изображений - абсолютное, нормированое на длину волны значение ОРХ. Наиболее важным его достоинством набора является большое число значимых параметров и увеличение объема информации в изображении одной клетки. Это имеет фундаментальное значение для биофизики клетки и дает возможность измерить в реальном времени физические параметры органелл клетки, исследовать механизмы действия на нее внешних факторов и т.д. Важным фактором считается возможность количественной характеристики состояния клетки физическими параметрами. Это позволит сравнивать результаты, полученные на различных объектах и приборах. Использование этой методологии позволит существенно уменьшить объем измерений и время диагноза. Эти факторы имеют решающее значение при обстоятельствах, когда время анализа ограничено и приходится искать нетрадиционные подходы к проблеме in vitro диагностики и для исследований индивидуального отклика иммунно-компетентных клеток крови. В методах in vitro диагностики увеличение числа значимых параметров позволит уменьшить число анализируемых клеток, сократить время измерений и расход материалов. Представление значимых параметров в абсолютных величинах позволит сравнивать результаты регистрации в реальном времени структурных изменений и процессов в живой, неокрашенной клетке, полученные на различных интерференционных микроскопах.

Применение предлагаемого способа исследования in vitro отклика иммунно-компетентных клеток (Т-лимфоцитов) перед началом лечения испытуемым препаратом позволяет избежать неоправданного назначения этих препаратов, поскольку даже кратковременное их применение может привести к различным осложнениям. Существенно новым в предлагаемом методе является использование совокупности значимых параметров фазового изображения мононуклеара, что увеличивает достоверность диагноза.

Похожие патенты RU2543336C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЛИМФОЦИТА ЧЕЛОВЕКА 2013
  • Тычинский Владимир Павлович
  • Кретушев Александр Викторович
  • Вышенская Татьяна Владимировна
RU2543340C2
СПОСОБ ОЦЕНКИ in vitro ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА ПАЦИЕНТА НА ДЕЙСТВИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА 2012
  • Тычинский Владимир Павлович
  • Кретушев Александр Викторович
  • Вышенская Татьяна Владимировна
  • Клемяшов Иван Валериевич
RU2526134C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ЭНЕРГИЗАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТА 2014
  • Кретушев Александр Викторович
  • Клемяшов Иван Валериевич
  • Вышенская Татьяна Владимировна
  • Евдокимов Анатолий Аркадиевич
RU2577118C1
Способ оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови 2021
  • Дмитриев Анатолий Федорович
  • Агарков Александр Викторович
  • Агарков Николай Викторович
RU2763845C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕТКИ 2014
  • Иванов Алексей Борисович
  • Тычинский Владимир Павлович
  • Кретушев Александр Викторович
  • Клемяшов Иван Валериевич
  • Вышенская Татьяна Владимировна
RU2569730C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА 2006
  • Чиссов Валерий Иванович
  • Решетов Игорь Владимирович
  • Волченко Надежда Николаевна
  • Славнова Елена Николаевна
  • Тычинский Владимир Павлович
  • Кретушев Александр Викторович
  • Клемяшов Иван Валериевич
RU2306868C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ СТРЕСС-РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2019
  • Дерюгина Анна Вячеславовна
  • Иващенко Марина Николаевна
  • Игнатьев Павел Сергеевич
  • Таламанова Марина Николаевна
  • Белов Андрей Александрович
RU2732759C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ НЕМЕТАСТАТИЧЕСКОГО СВЕТЛОКЛЕТОЧНОГО РАКА ПОЧЕК У БОЛЬНЫХ ПОСЛЕ НЕФРЭКТОМИИ ИЛИ РЕЗЕКЦИИ ПОЧКИ С НОВООБРАЗОВАНИЕМ 2010
  • Юрин Андрей Геннадиевич
RU2426118C1
СПОСОБ ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 1998
  • Архипов С.А.
RU2194279C2
Способ определения синтетической активности полихроматофильных эритробластов и эритроцитов птиц 2023
  • Дерхо Марина Аркадьевна
  • Колесник Евгений Анатольевич
RU2799424C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 543 336 C2

Реферат патента 2015 года СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА ПАЦИЕНТА НА ДЕЙСТВИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для in vitro оценки прогнозирования иммунного ответа пациента на действие внешних факторов. Для этого проводят исследование отдельных мононуклеаров периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии. Из суспензии мононуклеаров крови донора до действия внешнего фактора выделяют первую пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде зон оптической плотности в проекций отдельных органелл и измеряют последовательно: цитоплазматический индекс, а также значения фазовой толщины, площади, эквивалентных диаметров, фазового объема, рефрактерности, у следующих органелл мононуклеара: внешняя граница периферийной части цитоплазмы, плотная часть цитоплазмы, хондриом, ядро и ядрышко. Затем у этого же донора из суспензии мононуклеаров выделяют вторую пробу и после действия на мононуклеары внешнего фактора их повторно микроскопируют в интерференционном микроскопе, измеряют вышеуказанные параметры указанных органелл мононуклеара, после чего образуют второй набор значений фазовой толщины, при этом прогнозирование иммунного ответа пациента на действие внешнего фактора осуществляют по количественным изменениям указанных параметров во втором наборе параметров. Изобретение обеспечивает точность прогнозирования иммунного отклика пациента на действие фармакологического препарата, также обеспечивает возможность снижения вероятности побочных эффектов и на сокращение времени исследования. 1 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 543 336 C2

1. Способ in vitro оценки прогнозирования иммунного ответа пациента на действие внешних факторов, включающий исследование отдельных мононуклеаров периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии, отличающийся тем, что из суспензии мононуклеаров крови донора до действия внешнего фактора выделяют первую пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде зон оптической плотности в проекций отдельных органелл и измеряют последовательно: цитоплазматический индекс, а также значения фазовой толщины, площади, эквивалентных диаметров, фазового объема, рефрактерности, у следующих органелл мононуклеара: внешняя граница периферийной части цитоплазмы, плотная часть цитоплазмы, хондриом, ядро и ядрышко, затем у этого же донора из суспензии мононуклеаров выделяют вторую пробу и после действия на мононуклеары внешнего фактора их повторно микроскопируют в интерференционном микроскопе, измеряют вышеуказанные параметры указанных органелл мононуклеара, после чего образуют второй набор значений фазовой толщины, при этом прогнозирование иммунного ответа пациента на действие внешнего фактора осуществляют по количественным изменениям указанных параметров во втором наборе параметров.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве внешнего фактора при прогнозировании индивидуальной реакции отторжения используются клетки и экстракты из клеток донора и вероятность отторжения прогнозируют путем количественной оценки изменений во втором наборе значимых параметров.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2543336C2

ТЕМНОВА В.В
Индивидуальный подбор иммуномодуляторов у кардиохирургических больных, оперированных в условиях искусственного кровообращения : диссертация .
кандидата медицинских наук, 2006 , 128 c
Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами 1921
  • Богач В.И.
SU10A1

RU 2 543 336 C2

Авторы

Тычинский Владимир Павлович

Кретушев Александр Викторович

Вышенская Татьяна Владимировна

Даты

2015-02-27Публикация

2012-12-24Подача