СПОСОБ ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к цитологии и может быть использовано в биологии и медицине для цитоморфологического анализа монослойных культур клеток (животных и человека), способных к распластыванию на стекле. Необходимость данного изобретения продиктована потребностями биологии и медицины в разработке новых методов идентификации клеток в клеточных культурах и их цитоморфологического анализа в экспериментальных исследованиях и диагностике.

Прототипом изобретения является метод фазового контраста, используемый для исследования неокрашенных препаратов (Альбертс Б. и др., 1994; Вепринцев Б.Н. и др. / Ред./, 1988)]. Фазово-контрастная микроскопия используется, как правило, для прижизненного исследования клеток в культуре. При исследовании методом фазового контраста структуры с показателем преломления большим, чем у окружающей среды, выглядят более темными, чем последняя, и имеют светлый ореол. В фазово-контрастном микроскопе (или устройстве) используются эффекты интерференции, возникающие при рекомбинации двух наборов волн, которые и создают изображение клеточных структур. Фиксация клеток не приводит к улучшению качества интерференционных изображений, получаемых методом фазового контраста.

К недостаткам обычного метода фазового контраста можно отнести следующие его особенности. Монохромное и достаточно размытое изображение структур клеток, получаемое этим методом, не позволяет выявлять морфологические особенности ядра, вакуолярного аппарата (не дифференцирует элементы эндоплазматической сети), пластинчатого комплекса клеток; светлый ореол вокруг клеток сильно выражен и затрудняет выявление ламеллоподий, ламеллоплазмы и цитоплазматических отростков в краевой зоне распластанных клеток, не позволяет выявлять морфологические особенности клеточной поверхности - микроворсинки и филоподии (Альберте Б. и др., 1994. Ровенский Ю.А., 1979).

Задача изобретения - разработать способ цитоморфологического анализа клеток животных и человека в монослойных культурах.

Цель изобретения - разработать способ цитоморфологического анализа клеток животных и человека в монослойных культурах, позволяющий идентифицировать клетки одновременно по следующим критериям: наличию и расположению в них митохондрий, особенностям вакуолярного аппарата, пластинчатого комплекса, морфологии ядра (эухроматин, гетерохроматин, наличие и расположение ядрышек), а также по особенностям строения краевой зоны распластанных клеток - цитоплазматических отростков, ламеллоподий, филоподий, микроворсинок и ламеллоплазмы.

Сущность предлагаемого способа состоит в предварительной слабой окраске фиксированных монослойных культур основным фуксином и последующем исследовании их с помощью светового микроскопа в оранжево-желто-зеленой области спектра при помощи фазово-контрастного устройства. В отличие от обычного метода фазового контраста неокрашенных цитологических препаратов, дающего монохромную окраску всех структур клетки, предложенный способ цитоморфологического анализа не только увеличивает общую контрастность изображений цитологических объектов исследования, но и позволяет дифференцировать внутриклеточные структуры и морфологические особенности клеточной поверхности по цвету и интенсивности цветной окраски, увеличивая тем самым "разрешение" интерференционного изображения.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Распластанные на покровном стекле клетки фиксируют последовательной обработкой 2,5% раствором глютарового альдегида (приготовленным на растворе Хенкса с феноловым красным) и метанолом соответственно 1 и 7 мин. Фиксированные препараты клеточных культур кратковременно (1-2 мин) обрабатывают 1% раствором основного фуксина. Такая обработка приводит к очень слабому, едва заметному при обычной световой микроскопии, но равномерному окрашиванию ядра и цитоплазмы клеток. Фазово-контрастное устройство (КФ-4У4.2, ЛОМО, Россия) устанавливается под исследуемым препаратом таким образом, чтобы в фазовые кольца попадал не весь световой поток, а преимущественно его дисперсионные составляющие в диапазоне длин волн Это достигается при перемещении конденсора и фазово-контрастного устройства снизу вверх до появления желто-зеленого фона. Тип микроскопа не имеет значения. Слабая (но неравномерная) розовая окраска всех структур клеток основным фуксином не только увеличивает в разной степени их оптическую плотность, усиливая тем самым эффект фазового сдвига (и изменения амплитуды) проходящих световых волн, но и формирует "цветность" (метахромазию) интерференционного изображения. Эффект цветного интерференционного контраста возникает только при одновременном прохождении через клетки световых волн, относящихся к оранжево-желто-зеленой области спектра с небольшим захватом красной и голубой областей спектра (в диапазоне длин световых волн ). Причем в уплощенных (до 1-2 мкм в высоту) распластанных клетках между определенными структурами клетки и цветом устанавливаются определенные соответствия (корреляции): митохондрии дают черную окраску, гранулы лизосомного типа - от желтой до желто-коричневой, вакуолярный аппарат эндоплазматической сети (эндоплазматического ретикулума) - от желтой или желто-зеленой до зеленой, пластинчатый комплекс - коричневую, хроматиновая сеть - от коричневой до красно-коричневой (гетерохроматин - от темно-коричневого до черного), ядрышко и ядерная мембрана (по контуру) - от темно-синей до черной, морфологические образования цитоплазматической мембраны в краевой зоне (контуры ламеллоподий, филоподий, микроворсинок и ламеллоплазмы) - от сине-зеленой до черной. Выявление на клеточной поверхности микроворсинок и филоподий (в краевой зоне) очевидно становится возможным в результате адсорбции красителя на поверхности этих мембранных образований. Смещение в красную или синюю" области спектра приводит к потере эффекта "метахромазии" интерференционного изображения и резкому снижению его качества (при этом изображение клеток становится или преимущественно красным или синим).

Пример. Проведен цитоморфологический анализ монослойных культур перитонеальных клеток интактных мышей линии BALB/c (n=5) через 10 сут после начала их культивирования на предметных стеклах в чашках Петри. Перед началом анализа клетки зафиксированы последовательной обработкой глютаровым альдегидом, метанолом и слабо окрашены основным фуксином. Препараты клеточных культур исследовали на микроскопе Люмам И3, имеющем бинокулярную насадку АУ-26 (об. 90, ок. 10, доп. ув. "1,6") с помощью фазово-контрастного устройства КФ-4У4.2 в оранжево-желто-зеленой области спектра. В распластанных клетках были видны митохондрии (черная окраска), гранулы лизосомного типа (желтые и желто-коричневые), цистерны эндоплазматической сети (желто-зеленые), пластинчатый комплекс (коричневый), четко очерченное ядро (ядерная мембрана - темно-синяя или черная), в ядрах - хроматиновая сеть (красно-коричневая), гетерохроматин (темно-коричневый) и ядрышки (темно-синие), морфологические образования цитоплазматической мембраны в краевой зоне - контуры ламеллоподий, филоподий, микроворсинок и ламеллоплазмы (от темной-зеленой до черной). Четко структурированная эндоплазматическая сеть выявлялась только в зрелых эпителиоидных клетках с высокой степенью распластанности.

Цитоморфологический анализ (при подсчете 10000 клеток) позволил дифференцировать в культурах макрофаги (99,5%), фибробласты (0,01%), эпителиоидные клетки и их переходные формы разной степени дифференцировки (0,49%).

Предлагаемое изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Окраска фиксированного препарата основным фуксином дает одноцветное изображение, выявляющее контуры ядра и цитоплазмы клетки, но не позволяющее дифференцировать многие клеточные структуры и строение краевой зоны распластанных клеток - цитоплазматических отростков, ламедлоподий, филоподий, микроворсинок и ламеллоплазмы.

Предлагаемое изобретение, используя один краситель и фазово-контрастное устройство для получения подобранного к данному красителю проходящего пучка света в области , дает возможность получить многоцветное изображение, причем определенные органеллы и структуры клетки устойчиво приобретают свою окраску, что облегчает их дифференцировку от других элементов, увеличивая таким образом информативность получаемого изображения. Ранее такой принцип не использовался в световой микроскопии и впервые разработан автором.

Способ может быть использован в медицине, а именно для цитологического анализа монослойных культур клеток человека и животных. Фиксированные клетки слабо окрашивают основным фуксином и исследуют на световом микроскопе с помощью фазово-контрастного устройства в оранжево-желто-зеленой области спектра (в диапазоне длин волн ), дифференцируя определенные структуры клеток по морфологии и по цвету, при этом митохондрии дают черную окраску, гранулы лизосомного типа - от желтой до желто-коричневой, цистерны эндоплазматической сети - от желтой до желто-зеленой, пластинчатый комплекс - коричневую, ядерная мембрана (по контуру) и ядрышко - от темно-синей до черной, хроматиновая сеть - от коричневой до красно-коричневой; морфологические образования цитоплазматической мембраны в краевой зоне (контуры ламеллоподий, филоподий, микроворсинок и ламеллоплазмы) - от темно-зеленой до черной. Способ дает возможность получить многоцветное изображение, причем определенные органеллы и структуры клетки устойчиво приобретают свою окраску, что облегчает возможность их дифференцировки.

Способ цитоморфологического анализа клеточных культур с помощью фазово-контрастного устройства, отличающийся тем, что фиксированные клетки слабо окрашивают основным фуксином и исследуют на световом микроскопе в оранжево-желто-зеленой области спектра (в диапазоне длин волн ), дифференцируя определенные структуры клеток по морфологии и по цвету, при этом митохондрии дают черную окраску, гранулы лизосомного типа - от желтой до желто-коричневой, цистерны эндоплазматической сети - от желтой до желто-зеленой, пластинчатый комплекс - коричневую, ядерная мембрана (по контуру) и ядрышко - от темно-синей до черной, хроматиновая сеть - от коричневой до красно-коричневой; морфологические образования цитоплазматической мембраны в краевой зоне (контуры ламеллоподий, филоподий, микроворсинок и ламеллоплазмы) - от темно-зеленой до черной.