СПОСОБ ОЦЕНКИ СТРЕСС-РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2020 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к животноводству, касается способа оценки стресс-реакции организма крупного рогатого скота, который может быть использован для увеличения продуктивности крупного рогатого скота (КРС).

В результате интенсификации животноводства, безвыгульным, беспастбищным содержанием, машинным доением и другими, не предусмотренными природой факторами, стало невозможно в полной мере использовать генетически обусловленный потенциал их продуктивности и плодовитости. Значительное снижение этих качеств животного связано с действием на организм стрессоров различной природы. Наиболее значимыми из них является технологический стресс. К технологически стрессорам относятся: отсадка от матерей, пересадка, транспортировка, вакцинация и другие. Избежать стрессовых нагрузок на организм животных в промышленном животноводстве невозможно, поскольку в процессе выращивания возникает необходимость проведения различных зооветеринарных мероприятий.

Стрессы приводят к дополнительным затратам энергии для адаптации организма к новым условиям окружающей среды, ухудшают физиологическое состояние организма, изменяют обменные процессы, вызывают отставание в росте и развитии животных, болезни и снижение продуктивности. Стрессы оказывают негативное влияние на состояние организма животных и развитие на их фоне воспалительных процессов. Поэтому в последние годы большое внимание уделяется выявлению наиболее надежных методов и биомаркеров стресса в животноводстве.

В ветеринарии на сегодняшний день проведение биохимического анализа сыворотки крови и биологических жидкостей позволяет проводить своевременную диагностику болезней. При проведении биохимических исследований используют рефрактометрические, флуориметрические, поляриметрические, нефелометрические, турбидиметрические, электрофоретические, хроматографические методы, а также методы пламенной фотометрии и атомно-абсорбционной спектроскопии для определения элементного состава (Большакова Д.С., Никешина Т.Б. Спектрофотометрические и энзиматические методы биохимического анализа сыворотки крови сельскохозяйственных животных // Ветеринария сегодня. №3(14). С. 12-21). Однако данные исследования проводятся в целях диагностики норма-патология и они не позволяют оценить наличие стрессовой реакции у животных и понижение их резистентности к факторам окружающей среды, что может при продолжении действия стрессора вызвать развитие болезни. Кроме того, для проведения данных исследований требуются высококвалифицированные специалистов, дорогие расходные материалы и продолжительное время, затрачиваемое на каждый анализируемый показатель.

В качестве диагностического метода оценки состояния животного известен способ удаленной диагностики и лечения крупного и мелкого рогатого скота (RU №2535742, кл. А01К, опубл. 20.12.2014 г.), который характеризуется использованием капсулы, вводимой оральным путем в кишечную полость животного. Капсулу выполняют обтекаемой гладкой формы и помещают внутрь микропроцессор управления, датчик водородного показателя рН, датчик температуры, модуль беспроводной передачи данных, блок питания. При этом в капсулу встраивают память внутрь микропроцессора и дополнительно модуль дозировки лекарств, который выполняют с возможностью высвобождения лекарства по расписанию и/или по команде микропроцессора, которую передают от оператора на модуль беспроводной передачи данных. Также в капсулу встраивают модуль забора образцов внутренней среды и/или флоры, собираемые данные с которого анализируют внутри капсулы и передают данные на память микропроцессора капсулы для хранения и последующей передачи оператору.

Недостатком данного изобретения является сложность, трудоемкость и длительность проведения процедуры, которая может проводиться только при наличии высокоспециализированных операторов и не исключает дополнительного анализа полученных данных.

Для быстрой и объективной оценки состояния организма животных в условиях производства необходимы эффективные, простые, безопасные способы оценки стресса, характеризующие состояние внутренней среды организма и ее резистентность при взаимодействии с внешними факторами.

Кровь, как функциональная система объединяет работу всех физиологических систем организма, поэтому большинство ее гомеостатических параметров позволяют судить о состоянии организма в целом.

Известен способ оценки адаптационных реакций крупного рогатого скота (RU №2508551, кл. G01N, опубл. 27.02.2014 г.), который заключается в выделении трех уровней напряжения состояния организма крупного рогатого скота, характеризующих адаптационные реакции по анализу отношения содержания моноцитов к лимфоцитам в лейкограмме периферической крови. Данный метод является доступным с экономической точки зрения, основан на методах микроскопии, но недостатком данного способа является анализ процессов адаптации организма к действию факторов окружающей среды, который не дает объективной информации о наличии стрессовой реакции организма.

К методам микроскопии относится диагностика функционального состояния лимфоцитов: Способ оценки функционального состояния лимфоцитов человека (RU №2543340 С2, кл. G01N 33/49, G01N 21/45 опубл. 27.02.2015 г.). Данный способ позволяет с использованием интерференционного микроскопа по сопоставлению оптической плотности отдельных органелл лимфоцита дать анализ иммунного ответа организма. Данный метод дает информацию об иммунном ответе организма, но не адаптирован к анализу состояния КРС и не позволяет выявить стресс-ответ организма на действие технологического стресса.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ прогнозирования иммунного ответа пациентов на действие внешних факторов (RU №2543336 С2, кл. G01N 33/49, опубл. 27.02.2015 г.). Изобретение может быть использовано для оценки прогнозирования иммунного ответа пациента на действие внешних факторов. Для этого проводят исследование отдельных мононуклеаров in vitro периферической крови пациента методом интерференционной микроскопии. Из суспензии мононуклеаров крови донора до действия внешнего фактора выделяют первую пробу, микроскопируют в интерференционном микроскопе для получения изображения мононуклеара в виде зон оптической плотности в проекций отдельных органелл и измеряют последовательно: цитоплазматический индекс, а также значения фазовой толщины, площади, эквивалентных диаметров, фазового объема, рефрактерности. Затем у этого же донора из суспензии мононуклеаров выделяют вторую пробу и после действия на мононуклеары внешнего фактора их повторно микроскопируют в интерференционном микроскопе, измеряют вышеуказанные параметры. При этом прогнозирование иммунного ответа пациента на действие внешнего фактора осуществляют по количественным изменениям указанных параметров во втором наборе параметров. Изобретение обеспечивает точность прогнозирования иммунного отклика пациента на действие фармакологического препарата, также обеспечивает возможность снижения вероятности побочных эффектов и на сокращение времени исследования.

Данный способ не адаптирован для КРС и основан на анализе лимфоцитов - клеток определяющих иммунные реакции организма.

В задачу нашего изобретение положено создание нового способа оценки стрессовой реакции организма КРС.

Техническим результатом от использования предлагаемого изобретения является сокращение времени исследования, упрощение и удобство его проведения.

Поставленная задача достигается тем, что в способе оценки стрессовой реакции организма крупного рогатого скота, включающем анализ эритроцитов периферической крови методом интерференционной микроскопии путем измерения фазовой высоты и фазового диаметра эритроцитов in vitro, причем анализ эритроцитов проводят до действия внешнего фактора и через 15 минут после действия внешнего фактора, а в качестве внешнего фактора используют раствор 0,1%-ного адреналина-гидрохлорида, и при увеличении фазовой высоты и уменьшении фазового диаметра эритроцитов устанавливают отсутствие стрессовой реакции у крупного рогатого скота, а при увеличении фазовой высоты и увеличении фазового диаметра эритроцитов определяют развитие стрессовой реакции у крупного рогатого скота.

Для экспериментального обоснования данного способа были изучены образцы крови высокопродуктивных голштинизированных коров черно-пестрой породы 2-й лактации (2 недели после отела) в условиях промышленного комплекса.

Коровы содержались в племхозяйстве ОАО «Румянцевское» Дальнеконстантиновского района Нижегородской области. Группы животных были сформированы по принципу пар-аналогов с учетом физиологического состояния. Кормление животных осуществлялось в полном соответствии с нормами РАСХН, а содержание - беспривязное в типовых коровниках в течение всего года. При проведении эксперимента проводили физиолого-биохимическое обследование крови и молока коров. Пробы крови для исследований брали из яремной вены утром до кормления.

Лабораторные исследования проб крови и молока проводили на кафедре физиологии и биохимии животных Нижегородской ГСХА, исследовательском сертификационном центре Нижегородской ГСХА, на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

В процессе исследования изучали эритроциты периферической крови КРС без стрессового воздействия и эритроциты КРС, подвергшихся технологическому стрессу.

Технологический стресс в условиях промышленной технологии, был вызван комплектованием групп животных, взвешиванием, перегоном.

Готовили 40% эритроцитарную взвесь, добавляли адреналин к взвеси клеток в конечной концентрации 1*10^-9 и инкубировали при температуре 37°С в течение 15 минут. Использовали 0,1%-ный ампульный раствор адреналина-гидрохлорида.

Оптико-геометрические показатели эритроцитов оценивали методом лазерной модуляционной интерференционной микроскопии на микроскопе МИМ-340 (Екатеринбург, Россия). В работе использовали лазер с длиной волны 532 нм и объектив с увеличением ^×20, разрешение по поверхности до 15 нм, разрешение по вертикали - 0,1 нм, возможность контроля изделий с глубиной рельефа - до 600 нм. Регистрировали морфологию нативных клеток без предварительной фиксации, что позволяло визуализировать модификацию клеток в режиме реального времени.

Исследовали фазовое изображение эритроцитов коров методом фазово-интерференционной микроскопии и измеряли фазовую высоту клетки, которую определяли как максимальную высоту профиля относительно уровня подложки и фазовый диаметр. У эритроцитов нестрессированных коров, инкубированных с адреналином, наблюдалось увеличение фазовой высоты на фоне снижения фазового диаметра эритроцитов (таблица 1).

У эритроцитов стрессированных коров после воздействия адреналина отмечено увеличение фазовой высоты эритроцитов и фазового диаметра эритроцитов (таблица 2).

Представленные данные свидетельствуют, что повышение фазовой высоты и фазового диаметра эритроцитов при действии адреналина in vitro характерно для крови коров находящихся в состоянии стресса.

Повышение фазовой высоты и снижение фазового диаметра эритроцитов при действии адреналина in vitro характерно для крови коров без стресса.

В соответствии с настоящим изобретением способ оценки стрессовой реакции крупного рогатого скота продемонстрирован на следующих примерах.

Пример 1. Перегон животных из помещений

Животных разделили по принципу аналогов и клинико-физиологического состояния на две группы по 9 голов (контрольная и опытная группа). Условия кормления и содержания всех групп были идентичными. Система содержания - в закрытых помещениях безвыгульная с регулируемым микроклиматом. Выращивание и откорм осуществлялись по принятой на комплексе технологической схеме.

Различие заключалось в том, что у животных опытной группы развивался технологический стресс на фоне перегона животных из помещений.

В качестве показателей стрессовой реакции оценивали развитие окислительного стресса (таблица 3), содержание лейкоцитов в периферической крови и белковый состав сыворотки крови (таблица 4).

Результаты окислительного стресса оценивали по продуктам окисления липидов, рост концентрации которых доказывает резкое усиление окислительного стресса у животных опытной группы в сравнении с контролем.

Физиолого-биохимическая оценка гомеостаза у опытных животных подтвердила наличие технологического стресса: увеличилось содержание лейкоцитов и уменьшилось количество белка в опытной группе по сравнению с контролем (таблица 4).

Воздействие адреналина на оптико-геометрические параметры эритроцитов стрессированных и нестрессированных животных представлены в таблице 5.

Таким образом, у опытной группы животных регистрировалось увеличение фазовой высоты и фазового диаметра эритроцитов, а у контрольной группы увеличение фазовой высоты эритроцитов сочеталось со снижением фазового диаметра.

Пример 2. Транспортировка животных

Животных по принципу аналогов разделили две группы (опытная и контрольная) по 10 голов каждая. Выращивание осуществлялось по принятой на комплексе технологической схеме. Животные опытной группы подвергались воздействию стресс-фактора. В качестве стресс-фактора рассматривали транспортировку автотранспортом в ночное время.

Результаты показали, что у животных без стресса показатели температуры, пульса, дыхания, сокращения рубца и акт жвачки были в пределах физиологической нормы. В опытной группе у животных после технологического стресса отмечалось снижение поедаемости кормов, сокращения рубца сократились до 2 за 2 мин и 3 жвачных цикла за 3 мин. Температура в первые два часа повысилась до 39,6°, учащение пульса до 84 уд./мин. Контрольная дойка показала снижение среднесуточного удоя коров опытной группы на 0,2 л.

Гематологические и биохимические изменения крови показали развитие окислительного стресса, лейкоцитоза, гипопротеинемии, гипоальбуминемии периферической крови животных после стресса (таблица 6).

Молочная продуктивность, качество молока (жир, белок) у коров после стресса были ниже (таблица 7).

Воздействие адреналина на оптико-геометрические параметры эритроцитов стрессированных и нестрессированных животных представлены в таблице 8.

Из представленных примеров видно, что у животных после стресса добавление адреналина к эритроцитам в экспериментах in vitro сопровождалось ростом фазовой высоты и увеличением фазового диаметра, у животных без стресса добавление адреналина к эритроцитам в экспериментах in vitro сопровождалось ростом фазовой высоты и уменьшением фазового диаметра.

Экспериментальные материалы свидетельствуют об информативности использования анализа фазовой высоты и фазового диаметра эритроцитов для оценки стресс-реакции организма. Изобретение может быть успешно использовано при массовом обследовании крупного рогатого скота в диагностических целях и оценке целесообразности применения схем антистрессовой терапии, для определения оптимальной плотности комплектования животными производственных площадей, для анализа степени воздействия на организм коров производственных факторов и ветеринарных обработок. Кроме того, заявленный метод характеризуется простотой, удобством проведения, минимальными временными и материальными затратами.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу оценки стрессовой реакции организма крупного рогатого скота. Способ оценки стрессовой реакции организма крупного рогатого скота, включающий анализ эритроцитов периферической крови методом интерференционной микроскопии путем измерения фазовой высоты и фазового диаметра эритроцитов in vitro, причём анализ эритроцитов проводят до действия внешнего фактора и через 15 мин после действия внешнего фактора, а в качестве внешнего фактора используют раствор 0,1%-ного альбуминного адреналина-гидрохлорида, и при увеличении фазовой высоты и уменьшении фазового диаметра эритроцитов устанавливают отсутствие стрессовой реакции у крупного рогатого скота, а при увеличении фазовой высоты и увеличении фазового диаметра эритроцитов определяют развитие стрессовой реакции у крупного рогатого скота. Вышеописанный способ позволяет сократить время исследования, упростить его проведение. 8 табл., 2 пр.

Способ оценки стрессовой реакции организма крупного рогатого скота, включающий анализ эритроцитов периферической крови методом интерференционной микроскопии путем измерения фазовой высоты и фазового диаметра эритроцитов in vitro, причём анализ эритроцитов проводят до действия внешнего фактора и через 15 мин после действия внешнего фактора, а в качестве внешнего фактора используют раствор 0,1%-ного альбуминного адреналина-гидрохлорида, и при увеличении фазовой высоты и уменьшении фазового диаметра эритроцитов устанавливают отсутствие стрессовой реакции у крупного рогатого скота, а при увеличении фазовой высоты и увеличении фазового диаметра эритроцитов определяют развитие стрессовой реакции у крупного рогатого скота.